CN110368399A - 一种反义肽核酸-dna四面体载体复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种反义肽核酸-dna四面体载体复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种反义肽核酸‑DNA四面体载体复合物，其中，反义肽核酸和DNA四面体的摩尔比为1:1；所述反义肽核酸是靶向金黄色葡萄球菌基因的反义肽核酸。本发明还提供了所述复合物在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的用途。本发明的复合物可以有效抑制“超级细菌”MRSA的增殖，安全可靠，具有很好的应用前景。

Description

一种反义肽核酸-DNA四面体载体复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及载药体系领域，具体涉及一种反义肽核酸-DNA四面体载体复合物及其制备方法和应用。
背景技术
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，该菌株来源于北京朝阳医院，编号为18908的临床实验株，该菌株是临床上常见的毒性较强的细菌，其具有不均一耐药性，以及广谱耐药性，是一种临床上常见的感染病菌。这类菌株所导致的临床感染治疗失败率较高，被称作“超级细菌”。
在目前的研究中，治疗MRSA感染的药物的靶标多是一些常见的细胞因子，如黏附性因子，影响细胞壁合成因子等，采用这类靶标的药物特点是，容易使其产生耐药性，所以需要从新的角度选择药物作用靶点。
反义肽核酸是一种人工合成的DNA类似物，可根据碱基互补配对原则特异性的抑制基因的表达。由于其为电中性，且不存在磷酸基团，所以不存在电性相斥的现象，导致与DNA/RNA结合能力更强，不被核酸酶和蛋白酶水解，从而避免了天然DNA和RNA寡核苷酸作为靶向探针可能导致许多脱靶效应的现象。但是，正是由于反义肽核酸(asPNA)不带电荷，无法像核酸一样通过内吞作用进入细胞，难以发挥药效活性，如何将反义肽核酸送入细胞内是本领域一直期望解决解决的难题。
目前，科研人员尝试了多种方法，然而，结果并不尽如人意，现有许多载体均难以将反义肽核酸载入细胞内，发挥药效。目前仅见到采用细胞穿膜肽连接反义肽核酸，将其送入细胞内发挥药效的报道，但是效果仍然不佳，体外实验中，在细胞穿膜肽和反义肽核酸的浓度达到微摩尔级别时才能起效，且药效活性弱，另外，细胞穿膜肽本身具有一定的细胞毒性，浓度达到微摩级别时可能会对动物体或人体有害，使得该载体搭载asPNA用于对抗细菌感染时存在非常大的安全隐患。
DNA四面体(TDNs)，是由四条特别设计过的无义序列的单链DNA(ssDNA)S1、S2、S3、S4通过自组装形成的具有三维结构的DNA纳米材料，四条单链序列遵循“碱基互补配对原则”，合成方法简单，产率高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新型的复合物，可以用于抑制包括超级细菌MRSA在内的金黄色葡萄球菌。
本发明提供了一种反义肽核酸-DNA四面体载体复合物，所述反义肽核酸是靶向金黄色葡萄球菌基因的反义肽核酸；组成所述DNA四面体的单链DNA序列如SEQ ID NO.1-4所示。
进一步地，所述反义肽核酸和DNA四面体的摩尔比是1∶1。
进一步地，所述金黄色葡萄球菌基因是ftsZ基因。
进一步地，所述反义肽核酸的序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述反义肽核酸在复合物中与S3单链的第27-38位碱基由氢键互补配对连接，所述S3单链的序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了前所述复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述反义肽核酸与组成DNA四面体的每条单链加入到pH值为8的缓冲溶液中，95℃维持10min，再冷却至4℃维持20min，即得。
进一步地，所述缓冲溶液含有10mM Tris-HCl和50mM MgCl2。
本发明还提供了前述复合物在制备抗金黄色葡萄球菌的药物中的应用。
进一步地，所述金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
前述的应用中，所述复合物在所述药物中的浓度不低于250nM，优选地，为750nM。
本发明还提供了一种抗金黄色葡萄球菌的药物，它由前述的复合物作为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。
本发明具有以下有益效果：
本发明的复合物可以成功被超级细菌MRSA摄取，并显著抑制其内部ftsZ基因的表达，抑制细菌增殖。
本发明采用特定序列的DNA四面体，与反义肽核酸形成复合物，其可以有效进入细胞内，只需纳摩尔级别的浓度即可实现有效抑制MRSA的繁殖，相比细胞穿膜肽载药而言，十分高效。
本发明的复合物对动物无细胞毒性，安全可靠。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为携带PNA的四面体载体系统(P-TDNs)的构建流程图。
图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。
图3为原子力显微镜验证P-TDNs的粒径大小结果图。
图4为透射电镜验证P-TDNs的形态结果图。
图5为ftsz-asPNA和P-TDNs的粒径结果图。
图6为ftsz-asPNA、ssDNA(S1)和P-TDNs的电位测试结果图。
图7为荧光示踪定位技术检测MRSA对P-TDNs的摄取结果图。
图8为流式细胞术检验MRSA对P-TDNs的摄取结果图。
图9为采用比浊法测定P-TDNs抑制MRSA生长的结果。
图10为P-TDNs对MRSA的生长抑制率结果图。
图11为加入P-TDNs后MRSA的生长曲线图。
图12为Q-PCR检测ftsz基因以及其下游相关基因的变化结果。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。
具体实施方式
实施例携带PNA的四面体载体系统(P-TDNs)的构建
1.合成
按表1所述序列合成单链DNA(S1、S2、S3、S4)和PNA(ftsz-asPNA)，所述PNA是靶向金黄色葡萄球菌ftsZ基因的PNA。
每条ssDNA单链(S1、S2、S3、S4)和ftsz-asPNA单链以相同摩尔浓度浓度加入含有TM buffer(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)的EP管中，涡旋混匀，离心，然后置于PCR仪内，将温度迅速升高到95℃维持10min，再快速降温到4℃维持20min，合成P-TDNs，浓度约为1000nM，其构建过程如图1所示。
所述DNA单链的序列及ftsz-asPNA序列如表1所示，由于ftsz-asPNA的序列刚好与S3序列的第27-38位碱基反向互补，在复合物中，前者可与后者通过氢键相连，实现碱基互补配对，与其他单链一起组成四面体。
表1序列
2.鉴定
(1)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证P-TDNs的分子量与合成情况
①制备聚丙烯酰胺凝胶；
②上样和电泳：将1μl 6×loading buffer分别与5μl的样品和marker混合均匀，然后加入对应的电泳槽中，在恒压为100V条件下电泳1h；
③GelRed染色及曝光：将聚丙烯酰氨凝胶放置于以GelRed和蒸馏水按照1∶50的比例混合的混合液中，避光，摇床15-25min，然后曝光，其结果见图2。
图2中，泳道1-10分别为P-TDNs、P-TDNs、S2+S3+S4+asPNA、S3+asPNA、S2、marker、S3、S2+S3+asPNA、S2+S3+S4+asPNA和S2+S3+S4+asPNA，从左到右的样品分子量大小分别为420bp、420bp、210bp、60bp、40bp、50bp、130bp、210bp、210bp左右，由图2可知，P-TDNs成功合成且多以二聚体(大小为420bp左右)的形式存在。
(2)采用原子力显微镜(AFM)验证P-TDNs的粒径大小
将稀释20倍和50倍的样品，斡旋，离心，然后滴在硅片上，待样品干燥后，镜检，其结果如图3所示，P-TDNs的粒径大小在8nm左右(虚线标记)。
(3)采用透射电镜验证P-TDNs的形态
取出铜片，将样品滴到铜片上，烘烤5-6min，重复2-3次，镜检，其结果见图4。
由图4可知，P-TDNs的形状呈现为近似三角形，且存在一定数量的多聚体(均为虚线标记)。
(4)粒径和电位检测
采用动态光散射仪检测ftsz-asPNA(ssPNA)和P-TDNs的粒径，其平均粒径分别为1.138nm、5.506nm，结果如图5所示。
采用zeta电位仪检测ftsz-asPNA、ssDNA(S1)和P-TDNs的电位，结果如图6所示。
以上结果表明，P-TDNs的制备成功。
以下以实验例的方式进一步说明本发明的复合物P-TDNs的抗菌能力。
实验例1耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对P-TDNs的摄取
(1)流式细胞术
在96孔板中接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞悬液，将培养板置于孵育箱中，在37℃预培养6h，然后在600nm处测定菌液OD值，接着将菌液稀释5倍后接种于24孔板，然后实验组加入S1链连有cy5(cyanine-5，CAS号：146368-15-2)的P-TDNs(P-TDNs制备方法同实施例)，所加入的P-TDNs的浓度分别为750nM、500nM和250nM，在37℃、50r/min、避光条件下培养过夜，收集细胞于2ml EP管中，12000r/min离心5min，弃上清，用PBS洗涤，接着12000r/min离心5min，重复洗涤离心2-3次，最后将所得细胞转移至流式管中，上机检测，检测结果见图7。
由图7可知，用cy5荧光标记的P-TDNs被MRSA成功摄取，并随着P-TDNs浓度的增加，摄取率增加。
(2)荧光示踪定位技术
为了证明P-TDNs被细菌成功吸收，MRSA用CY5-修饰的S1(Cy5-S1)代替S1合成P-TDNs(Cy5-P-TDNs)和三个P-TDN进行处理。评估浓度：250、500和750nM。将不同浓度的Cy5-P-TDN与1×106CFU/mLMRSA在Luria-Bertani(LB)液体培养基中于37℃温育12小时，同时以50rpm/min振荡。然后，以100∶1的比例加入SYTO 9染料15分钟，之后将菌株离心并收集，用PBS重新洗涤三次(12000rpm，5分钟)，并重悬于PBS中。最后，10将μL样品加入载玻片中并盖上盖玻片。干燥后，通过共聚焦激光扫描显微镜(A1R MP+；Nikon，Tokyo，Japan)对照组为单链CY-5-ssDNA，浓度为500nM，检测结果见图7。
由图8可知，通过计算STYO9标记的MRSA与cy5荧光标记的P-TDNs的重叠率，可进一步验证P-TDNs被MRSA成功摄取，并随着P-TDNs浓度的增加，摄取率增加。
结论：P-TDNs可被MRSA有效摄取，在P-TDNs的浓度低至750nM时，能达到30％以上的摄取率。
实验例2P-TDNs对MRSA的抑制
(1)比浊法测定抑菌率
活化MRSA菌株3代；
对P-TDNs合成原液进行过滤除菌；
抗菌活性的测定(比浊法)：TDN携带的asPNA被靶向抑制细菌ftsZ基因的转录。MRSA临床培养物在LB培养基中于37℃从单个菌落培养过夜。将菌株以3×106CFU/mL的初始密度接种，并在96孔板中用不同浓度的P-TDN处理，确保每孔具有相同体积的培养物和相同体积的LB培养基。然后，将96孔板置于生化培养箱中(37℃，24小时)。将不含P-TDN的LB培养基和TMbuffer用作阳性对照，并使用具有P-TDN的无细菌培养基(不足部分加入TM buffer，确保培养基的量一定)作为阴性对照。测量600nm处的光密度，并使用所述抗菌率计算公式计算抑制率。公式如下：
由图9和图10可知，随着P-TDNs浓度的增加，其对MRSA的抑制越强，当P-TDNs浓度为750nM时，对MRSA的抑制明显优于ftsz-asPNA单链。
(2)生长曲线的测定
MRSA临床培养物在37℃下在LB培养基中的生化培养箱中从单个菌落生长，直至达到早期对数期(OD600nm＝0.2-0.3)。将细菌溶液稀释至1×106CFU/mL的浓度。然后，分别用250 500 750nM的P-TDN和ftsZ-asPNA处理稀释的细胞悬浮液，然后在96孔板中的LB培养基中温育。使用自动分光光度计测量细胞生长，并在24小时内获得光密度读数(600nm)。每小时测量OD600nm值一次，并且每15分钟摇动板一次。
由图11可知，当P-TDNs浓度越高时，其MRSA达到对数期的时间就越长，且生长速度明显低于阳性对照组，尤其是当P-TDNs浓度为750nM时，对MRSA的抑制最为明显。
以上实验表明，P-TDNs可以有效抑制MRSA的增殖。
实验例3验证P-TDNs抑制MRSA生长的作用机制
由于实施例中的P-TDNs中的asPNA是针对ftsZ基因设计的，本实验例使用qPCR检测ftsZ基因表达情况。
菌株在LB培养基中生长，并用各种浓度的P-TDN处理12小时。使用具有基因组DNA消除器的RNeasy Plus Mini试剂盒提取来自菌株的总RNA。将提取的RNA样品溶解在不含RNase的水中，并使用cDNA合成试剂盒进行cDNA制备。通过qPCR根据以下程序进行每个靶mRNA的扩增：初始活化步骤在94℃下3分钟和40个循环的94℃下5秒和60℃下34秒A熔解曲线生成以测试引物二聚体形成和不正确的引发。将16s cDNA和FMN结合谷氨酸合酶cDNA的扩增用作对照以分析qPCR实验的效率。在对照中使用单纯asPNA。
由图12可知，分别以常用基因16s RNA和金黄色葡萄球菌特异性基因Sa442作为内参基因与目的基因ftsZ做对照，可以看出经不同浓度的P-TDNs处理后，ftsZ基因的表达均受到了一定程度的抑制，且随着浓度的增加抑制作用更大；所有P-TDNs处理组的ftsZ基因表达量均低于ftsz-asPNA单链处理组别。
以上结果表明，本发明的P-TDNs相比ftsz-asPNA单链，可以显著提升ftsZ基因表达的抑制效率，来实现抗菌作用。
综上，本发明的反义肽核酸-DNA四面体载体复合物可以加强反义肽核酸的基因表达抑制作用，能有效抑制超级细菌MRSA的增殖。将其制备为抗菌药物，特别是耐药革兰氏阳性菌抗菌药物，具有十分重要的产业价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种反义肽核酸-DNA四面体载体复合物及其制备方法和应用
<130> GY007-18P1677
<150> 2018103319784
<151> 2018-04-13
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> S1
<400> 1
atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60
gaa 63
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> S2
<400> 2
cacgattcag acttaggaat gttcgacatg cgagggtcca ataccgacga t 51
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> S3
<400> 3
actactatgg cgggtgataa aacgtgacta tgtttgaaat cgacgggaag agcatgccca 60
tcc 63
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> S4
<400> 4
acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60
ccg 63
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> ftsz-asPNA
<400> 5
ttcaaacata gt 12

Claims (10)

1.一种反义肽核酸-DNA四面体载体复合物，其特征在于：所述反义肽核酸与DNA四面体载体的摩尔比是1:1，所述反义肽核酸是靶向金黄色葡萄球菌基因的反义肽核酸；组成所述DNA四面体的单链DNA序列如SEQ ID NO.1-4所示。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌基因是ftsZ基因。
3.如权利要求2所述的复合物，其特征在于：所述反义肽核酸的序列如SEQ ID NO.5所示。
4.如权利要求3所述的复合物，其特征在于：所述复合物是四面体结构，所述反义肽核酸在复合物中与S3单链的第27-38位碱基由氢键互补配对连接，所述S3单链的序列如SEQID NO.3所示。
5.权利要求3或4所述复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述反义肽核酸与组成DNA四面体的每条单链按相同的摩尔量加入到pH值为8的缓冲溶液中，95℃维持10min，再冷却至4℃维持20min，即得。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液含有10mM Tris-HCl和50mM MgCl2。
7.权利要求1-4中任一所述复合物在制备抗金黄色葡萄球菌的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述复合物在所述药物中的浓度不低于250nM，优选地，所述复合物在药物中的浓度为750nM。
10.一种抗金黄色葡萄球菌的药物，其特征在于：它由权利要求1-4中任一所述的复合物作为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。
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