CN105106973B - 肿瘤血管特异性趋化ctl纳米系统及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肿瘤血管特异性趋化CTL纳米系统及其制备与应用。本发明所提供的系统，是由核心和外壳组成的纳米粒子；所述外壳由适配体、交联剂和纳米脂质体组成；所述适配体的序列如SEQ ID No.1所示；所述适配体通过所述交联剂与所述纳米脂质体连接；所述核心为IP‑10，所述IP‑10为下述B1)或B2)的蛋白质：B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；B2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质。实验证明，可利用本发明的基因传递系统治疗肿瘤或制备抗肿瘤药物或疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域中肿瘤血管特异性趋化CTL纳米系统及其制备与应用。
背景技术
肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一。肿瘤抗原特异性细胞毒性的T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)过继疗法一直是肿瘤免疫治疗的研究热点和难点之一。多年来对肿瘤特异性CTL过继治疗的研究往往在细胞实验中取得良好的效果,但是动物实验或临床疗效欠佳。重要的原因就是体内能够靶向到肿瘤部位的肿瘤特异性CTL的细胞数量有限，且由于免疫逃逸机制，到达肿瘤部位的特异性CTL靶向识别和杀伤肿瘤细胞的生物活性受到较大抑制，难以高效彻底地清除肿瘤细胞。因此为了使过继的CTL能够更有效地靶向肿瘤细胞并提高其在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞的生物活性必须寻找新的有效方法。
IP-10是属于CXC类的趋化因子，不但具有抗肿瘤血管作用，而且可以定向募集T淋巴细胞并促进其活化和增殖，引起肿瘤内淋巴细胞浸润，显示出强大的抗肿瘤潜力。而IP-10靶向募集足够量的肿瘤特异性CTL到肿瘤部位的前提是肿瘤微环境中(而非仅仅IP-10肿瘤局部注射部位)要有足够浓度的IP-10。目前主要通过转基因技术或者直接肿瘤局部多点注射等方法使肿瘤富集IP-10，前者存在靶向性问题，后者仅能提高注射部位的浓度。
肿瘤血管生成对大多数实体瘤的生长和转移具有重要意义，肿瘤细胞诱导的新生血管结构存在缺陷，分布方式无序，也无完整的微循环功能，与宿主正常组织的血管存在较大差异，属于未分化成熟的血管。泛血管内皮标记因子相比有CD31、CD34、Ⅷ因子相关抗原等，Endoglin/CD105是新生血管的标志物。
核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)从合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中筛选并富集的对某些靶点具有高特异性和高结合率的小分子DNA或RNA片段。本实验室前期工作中已筛选出能够特异与小鼠血管内皮细胞表面CD105分子的结合并具有高亲和力的适配体，命名为Endoglin-Aptamer。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤并提高肿瘤药物对肿瘤的靶向性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了基因传递系统(ENG-Apt/IP-10-LPs)，也叫肿瘤血管特异性趋化CTL纳米系统，其名称为基因传递系统1。
本发明所提供的基因传递系统，为基因传递系统1，是由核心和外壳组成的纳米粒子；
所述外壳由适配体、交联剂和纳米脂质体组成；
所述适配体的序列如SEQ ID No.1所示，其名称为Endoglin-Aptamer(ENG-Apt)；
所述适配体通过所述交联剂与所述纳米脂质体连接；
所述核心为IP-10，所述IP-10为下述B1)或B2)的蛋白质：
B1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；
B2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质。
上述B2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述B2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签序列得到。
上述基因传递系统1中，所述交联剂可为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Mal)。所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺可为美国AVANTI公司产品。
上述基因传递系统1中，所述纳米脂质体由磷脂双分子层制成。
上述基因传递系统1中，可在所述IP-10的N端和/或C端连上常用标签的氨基酸序列。
上述基因传递系统1中，所述常用标签可为His、Myc或His-Myc标签。
上述基因传递系统1中，所述适配体、所述IP-10和所述纳米脂质体的摩尔比为1：3：15。所述纳米脂质体可含有有所述交联剂。
为解决上述技术问题，本发明还提供了基因传递系统2。
本发明所提供的基因传递系统2，也叫肿瘤血管特异性趋化CTL纳米系统，是由与所述IP-10相关的生物材料和所述外壳组成的纳米粒子；所述生物材料包裹于所述外壳中。
上述基因传递系统2中，所述生物材料下述为C1)至C16)中的任一种：
C1)编码所述IP-10的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C9)含有C1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
C10)含有C2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
C11)含有C3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
C12)含有C4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
C13)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
C14)含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
C15)含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C16)含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
其中，C5)至C8)所述的重组微生物均为胞外分泌所述IP-10的重组微生物。
上述基因传递系统2中，C2)所述的含有编码所述IP-10的核酸分子的表达盒，不但可包括启动IP-10基因转录的启动子，还可包括终止IP-10基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述IP-10基因表达盒的重组载体。
上述基因传递系统2中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述基因传递系统2中，C1)所述核酸分子为如下B11)或B21)或B31)所示的核酸分子：
B11)序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子；
B21)与B11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述IP-10的cDNA分子或基因组DNA分子；
B31)在严格条件下与B11)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述IP-10的cDNA分子或基因组DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.3的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述基因传递系统2中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述基因传递系统2中，可在C1)所述核酸分子的5′端和/或3′端连上常用标签的编码序列。
上述基因传递系统2中，所述适配体、所述质粒和所述纳米脂质体的摩尔比为1：3：15。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述基因传递系统的制备方法。
本发明所提供的所述基因传递系统的制备方法，包括用所述外壳包被所述核心或所述生物材料，得到所述系统。
上述方法中，所述方法还包括所述外壳的制备；
所述外壳的制备包括：制备PEG修饰的纳米脂质体；用所述适配体修饰所述PEG修饰的纳米脂质体得到所述外壳。
上述方法中，所述PEG修饰的纳米脂质体的制备法可包括：用POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、cholesterol、PEG2000-DSPE(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000])、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(MAL-PEG2000-DSPE)和α-tocopherol制备得到所述PEG修饰的纳米脂质体。
上述方法中，所述方法还包括对所述基因传递系统进行均一化和/或纯化的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于制备所述系统的成套试剂。
本发明所提供的用于制备所述系统的成套试剂，为下述b1)或b2)：
b1)由所述适配体和所述IP-10组成的成套试剂；
b2)由所述适配体和所述生物材料组成的成套试剂。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述系统在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用；或所述成套试剂在制备所述系统中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了利用所述系统制备的治疗和/或预防肿瘤药物。
本发明中，所述肿瘤可为实体肿瘤。所述肿瘤具体可为黑色素瘤。
本发明中，所述系统的粒径可为40-200nm。所述40-200nm具体可为80-130nm，如110nm。
本发明中，所述系统可按照所述基因传递系统的制备方法制备。
实验证明，本发明所提供的基因传递系统(ENG-Apt/IP-10-LP)能明显延长荷瘤小鼠的生存时间：在ENG-Apt/IP-10-LP治疗的荷瘤小鼠存活率中位生存时间分别为PBS、IP-10、LP-IP-10治疗的荷瘤小鼠中位生存时间的1.8倍、1.1倍和1.6倍；在ENG-Apt/IP-10-LP治疗的荷瘤BalB/c裸鼠存活率为20％时距第1次治疗的时间分别为PBS、LP-IP-10和IP-10治疗的荷瘤小鼠存活率为20％时距第1次治疗的时间的1.7倍、1.1倍和1.5倍。
实验证明，本发明所提供的基因传递系统(ENG-Apt/IP-10-LP)对肿瘤有明显的抑制作用，可降低肿瘤的生长速度：在接种第18天，ENG-Apt/IP-10-LP治疗后的肿瘤体积分别为PBS、LP-IP-10和IP-10的0.12倍、0.19倍和、0.14倍。
实验证明，本发明所提供的基因传递系统(ENG-Apt/IP-10-LP)可靶向至肿瘤细胞：ENG-Apt/IP-10-LP可以与293T-mE结合，但不可以与293T结合，当用ENG-Aptamer封闭293T-mE细胞表面受体后，ENG-Apt/IP-10-LP不可以与293T-mE结合，ENG-Apt/IP-10-LP可以与293T-mE结合，但不可以与LP-IP-10结合。
实验证明，本发明的基因传递系统(ENG-Apt/IP-10-LP)可增加肿瘤组织的CD8+T细胞的频率：将ENG-Apt/IP-10-LP处理的荷瘤小鼠肿瘤组织制成的肿瘤细胞悬液中CD8+T细胞的频率分别为PBS、LP-IP-10、ENG-Apt/LP和IP-10处理的荷瘤小鼠肿瘤组织制成的肿瘤细胞悬液中CD8+T细胞的频率的7.5倍、1.7倍、7.2倍和4.5倍。
实验证明，可利用本发明的基因传递系统(ENG-Apt/IP-10-LP)治疗肿瘤或制备抗肿瘤药物或疫苗。
附图说明
图1为纳米脂质体(LP)、ENG-Apt/LP、LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP的透射电镜图。其中，A为纳米脂质体；B为ENG-Apt/LP；C为LP-IP-10；D为ENG-Apt/IP-10-LP。
图2为纳米脂质体(LP)、LP-IP-10、ENG-Apt/LP和ENG-Apt/IP-10-LP的粒径。其中，A为纳米脂质体；B为ENG-Apt/LP；C为LP-IP-10；D为ENG-Apt/IP-10-LP。
图3为LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP装载质粒GV143IP-10的验证实验。其中，泳道MARKER表示DNA分子量marker，泳道1为GV143IP-10，泳道2为LP-IP-10，泳道3为ENG-Apt/IP-10-LP，泳道4为脂质体破裂后的LP-IP-10，泳道5为脂质体破裂后的ENG-Apt/IP-10-LP，泳道6为LP+10％Trition X100，泳道7为pDNA+10％Trition X100。
图4为293T-mE和293T细胞与LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP的结合实验。其中，A为293T-mE和293T细胞与ENG-Apt/IP-10-LP的结合实验及未标记ENG–Aptamer封闭293T-mE细胞表面受体后ENG-Apt/IP-10-LP与293T-mE结合结果图。B为293T-mE细胞分别与LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP结合结果图。ENG-Apt/mIP-10-LP表示ENG-Apt/IP-10-LP，LP-mIP-10表示LP-IP-10。DAPI染细胞核，蓝色荧光；DiI标记脂质体，红色荧光；FITC标记适配体，绿色荧光，MERGE表示带有荧光的纳米材料与不同细胞结合合并的荧光图片。
图5为不同处理的荷瘤小鼠肿瘤中CD8+T细胞的频率。其中，ENG-Apt/IP-10-LPs表示ENG-Apt/IP-10-LP治疗荷瘤小鼠后各组小鼠肿瘤组织局部CD8+T细胞频率，Lipo-IP-10表示LP-IP-10治疗荷瘤小鼠后各组小鼠肿瘤组织局部CD8+T细胞频率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的293T-mE细胞(上海创翼生物科技有限公司)稳定表达CD105分子。
下述实施例中的293T细胞为人胚肾上皮细胞(CHEN G,TENG Z,SU X,etal.Unique Biological Degradation Behavior of Stober Mesoporous SilicaNanoparticles from Their Interiors to Their Exteriors[J].Journal ofbiomedical nanotechnology,2015,11(4):722-9.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的GV143 IP-10为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号为GOSE32927。GV143 IP-10含有IP-10基因，IP-10基因的序列为序列表中SEQ ID No.3，表达SEQ ID No.2所示的蛋白质。
下述实施例中的棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，POPC)、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Mal)均美国AVANTI公司产品。
下述实施例中的雌性C57小鼠为北京维通利华实验动物有限公司产品。
下述实施例中的C57小鼠血清为上述雌性C57小鼠的血清。
下述实施例中的小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞(XU F,LIU J,LIU D,etal.LSECtin expressed on melanoma cells promotes tumor progression byinhibiting antitumor T-cell responses[J].Cancer research,2014,74(13):3418-28.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的巯基修饰的ENG-Aptamer溶液为将巯基修饰的ENG-Apt溶于Tris-Hcl缓冲液(pH＝6.5)中得到的巯基修饰的ENG-Apt浓度为100nM的溶液。巯基修饰的ENG-Apt为：5’-FITC-CCC CCG ATG CTT TCG CTT TTC CTT TCG CTT TTG TTC GCT TCG TCC CTGGTT CCT TTC TTG TTT TTT-HS-3’，序列如SEQ ID No.1所示。
实施例1、负载IP-10基因的ENG-Aptamer修饰的纳米脂质体(ENG-Apt/IP-10-LP)的制备
本发明所提供的基因传递系统，是由核心和外壳组成的纳米粒子，为负载IP-10基因的ENG-Apt修饰的纳米脂质体(ENG-Apt/IP-10-LP)；
外壳由适配体(Endoglin-Aptamer，ENG-Apt)、交联剂和纳米脂质体组成；
适配体的序列如SEQ ID No.1所示；适配体通过交联剂与纳米脂质体连接；所述交联剂为DSPE-PEG2000-Mal；
核心为含有IP-10基因的载体GV143 IP-10，GV143 IP-10表达SEQ ID No.2所示的IP-10，GV143 IP-10中IP-10基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3，编码SEQ ID No.2所示的IP-10。
1、ENG-Apt/IP-10-LP的制备
S1、纳米脂质体(LP)的制备
将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，POPC)7.87mg、胆固醇(cholesterol)3.2mg、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)2.8mg、双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)0.38mg、和α-生育酚0.017mg(POPC、胆固醇、DSPE-PEG2000、DDAB和DSPE-PEG2000的摩尔比为51.8：40：5：3：0.2)加入到5ml的圆底烧瓶中，将烧瓶接到旋转蒸发仪上，旋转蒸发仪以转速为200rpm/min旋转并打开真空泵抽真空。待看到圆底烧瓶表面产生一层水汽后，将瓶身降至水浴锅中于35℃下水浴，旋转10min后即可关闭真空并停止旋转，得到盛有反应后试剂的圆底烧瓶；将盛有反应后试剂的圆底烧瓶放至真空干燥箱中干燥2h去除有机溶剂后，加入1ml的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH6.5，50mmol/l)，得到混合液；将混合液水浴(35℃-45℃)超声5min，得到白色悬液；将白色悬液加入脂质体挤出器的玻璃注射器中，依次过200nm聚碳酸酯膜20次、100nm聚碳酸酯膜20次和50nm聚碳酸酯膜21次，得到纳米脂质体。
S2、包裹IP-10基因的PEG化纳米脂质体(LP-IP-10)的制备
按照1滴/秒的速度向步骤S1得到的200μl脂质体中滴加浓度为2μg/μl的GV143IP-10水溶液(GV143 IP-10水溶液为将质粒GV143 IP-10溶于去离子水得到的溶液)20μl，得到脂质体-质粒混合液；向脂质体-质粒混合液中逐滴滴加70％(体积百分比浓度)的乙醇水溶液，边滴加边旋转弹匀避免局部乙醇浓度过高，得到脂质体-质粒-乙醇混合液，脂质体-质粒-乙醇混合液中乙醇的体积百分比浓度为35％；向脂质体-质粒-乙醇混合液中逐滴滴加200mM的CaCl2水溶液，边滴加边旋转弹匀避免局部CaCl2浓度过高，得到脂质体-质粒-乙醇-CaCl2混合液，脂质体-质粒-乙醇-CaCl2混合液中CaCl2的浓度为4mM；将脂质体-质粒-乙醇-CaCl2混合液水浴(65℃)超声5min，得到混合液F；将混合液F转移至冻存管内，进行5个循环的反复冻融，得到包裹IP-10基因的PEG化纳米脂质体(LP-IP-10)，每个循环的冻融环境及时间分别为液氮10min，37℃水浴2min，室温4min。
S3、DSPE-PEG2000-Aptamer的制备
将16.8μl 10mg/ml的磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Mal)储存液于离心管中，在室温下自然吹干形成脂膜，用20μl的Tris-HCl缓冲液(pH6.5，10mmol/l)重悬脂膜，在65℃下水浴5-10min，形成即胶束液；向胶束液中加入巯基修饰的ENG-Aptamer溶液15μl混合均匀后封口4℃孵育过夜，得到混合液I；向混合液中加入与DSPE-PEG2000-Mal等摩尔的β-半胱胺，室温下孵育30min，封闭未反应的马来酰亚胺，得到DSPE-PEG2000-ENG-Aptamer。
S4、负载IP-10基因的ENG-Aptamer修饰的纳米脂质体(ENG-Apt/IP-10-LP)的制备
向步骤S2得到的包裹IP-10基因的PEG化纳米脂质体中加入步骤S3得到的DSPE-PEG2000-ENG-Aptamer，得到混合液R，混合液R中包裹IP-10基因的PEG化纳米脂质体与DSPE-PEG2000-ENG-Aptamer的比例关系为400mol：1mol；将混合液R在55℃水浴中反应30min，得到反应液；将反应液进行透析，得到负载IP-10基因的ENG-Aptamer修饰的纳米脂质体(ENG-Apt/IP-10-LP)。透析时间为4小时，2小时更换一次透析液，透析袋的截留分子量为10000，透析液为由去离子水、Tris-HCl、氯化钠组成的液体，透析液中氯化钠的浓度为140mmol/L，Tris-HCl的浓度为25mmol/L，透析液的pH为7.0)。
按照上述方法，将步骤S2得到的包裹IP-10基因的PEG化纳米脂质体替换为步骤S1得到的纳米脂质体，其他步骤均不变，得到ENG-Aptamer修饰的纳米脂质体(ENG-Apt/LP)。
透射电镜下观察上述纳米脂质体(LP)、LP-IP-10、ENG-Apt/LP和ENG-Apt/IP-10-LP，结果如图1所示。其中，A为纳米脂质体；B为ENG-Apt/LP；C为LP-IP-10；D为ENG-Apt/IP-10-LP。纳米脂质体(LP)、ENG-Apt/LP、LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP的粒径如图2所示。其中，A为纳米脂质体；B为ENG-Apt/LP；C为LP-IP-10；D为ENG-Apt/IP-10-LP。结果显示，每种纳米粒子的粒径分布均呈现正态分布，纳米脂质体的粒径在85nm左右；ENG-Apt/LP的粒径在89nm左右；LP-IP-10的粒径在103nm左右，ENG-Apt/IP-10-LP的粒径在113nm左右。
将GV143IP-10及上述LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP进行琼脂糖凝胶电泳(图3)，结果显示GV143IP-10(图3中泳道1)有条带，LP-IP-10(图3中泳道2)和ENG-Apt/IP-10-LP(图3中泳道3)均在加样孔由明亮条带；而将LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP的脂质体破裂后进行琼脂糖凝胶电泳(图3)，结果显示，LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP的脂质体破裂后(图3中泳道4和5)，表明，LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP均成功装载了质粒GV143IP-10。泳道6为LP+10％Trition X100，该泳道无条带有效排除处理因素的干扰，泳道7为pDNA+10％Trition X100，该泳道无条带说明Trition X-100对质粒没有明显的干扰。
2、ENG-Apt/IP-10-LP的稳定性检测
将ENG-Apt/IP-10-LP分别在C57小鼠血清、含20％胎牛血清的DMEM培养基和双抗的DMEM培养基中于37℃条件下分别孵育10min、0.5h、1.5h、4h、6h和8h后，进行琼脂糖凝胶电泳检测ENG-Apt/IP-10-LP的稳定性。结果显示，ENG-Apt/IP-10-LP在双抗的DMEM培养基中进行孵育时，几乎均无质粒释放，ENG-Apt/IP-10-LP在小鼠血清及含20％胎牛血清的DMEM培养基中GV142IP-10都保持低释放，表明ENG-Apt/IP-10-LP表现出较好的稳定性。
实施例2、负载IP-10基因的ENG-Aptamer修饰的纳米脂质体对肿瘤细胞的靶向作用
将实施例1的ENG-Apt/IP-10-LP分别用绿色荧光FITC(异硫氰酸荧光素)和红色荧光DiI标记，分别得到FITC标记的ENG-Apt/IP-10-LP与DiI标记标记的ENG-Apt/IP-10-LP；将FITC标记的ENG-Apt/IP-10-LP与DiI标记标记的ENG-Apt/IP-10-LP分别与293T-mE在37℃下孵育45min，在显微镜下观察，结果如图4中A所示。另外将293T-mE替换为293T细胞其他步骤均不变作为对照。
将非荧光标记的ENG-Aptamer预先与293T-mE孵育30min，再分别加入FITC标记的ENG-Apt/IP-10-LP与DiI标记标记的ENG-Apt/IP-10-LP，在37℃下孵育45min，在显微镜下观察，结果如图4中A所示。另外将293T-mE替换为293T细胞其他步骤均不变作为对照。
另外取DiI标记的ENG-Apt/IP-10-LP与LP-IP-10分别与293T-mE细胞在37℃下孵育45min，在显微镜下观察，结果如图4中B所示。
其中，图4中A为荧光显微镜下观察ENG-Apt/IP-10-LP与293T及293T-mE的结合及通过非荧光标记的ENG-Aptamer封闭293T-mE细胞表面受体后，细胞与ENG-Apt/IP-10-LP结合的荧光图片，结果表明，ENG-Apt/IP-10-LP可以与293T-mE结合，但不可以与293T结合，当用ENG-Aptamer封闭293T-mE细胞表面受体后，ENG-Apt/IP-10-LP不可以与293T-mE结合。图4中B为荧光显微镜下观察ENG-Apt/IP-10-LP及LP-IP-10与293T-mE细胞孵育后的图片，结果显示，ENG-Apt/IP-10-LP可以与293T-mE结合，但不可以与LP-IP-10结合，表明基因传递系统(ENG-Apt/IP-10-LP)可靶向至肿瘤细胞。图4中，DAPI：染细胞核，蓝色荧光；DiI：标记脂质体，红色荧光；FITC：标记适配体，绿色荧光，MERGE表示带有荧光的纳米材料与不同细胞结合合并的荧光图片。
实施例3、负载IP-10基因的ENG-Aptamer修饰的纳米脂质体对肿瘤的治疗作用
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
分别将实施例1的IP-10、LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP用PBS溶解或悬浮，得到IP-10浓度均为100ng/μl的IP-10注射液、LP-IP-10注射液和ENG-Apt/IP-10-LP注射液。
取23只4-6周龄的雌性C57小鼠，每只于右侧腹股沟皮下接种3×105个小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞，得到荷瘤小鼠，将接种当天记为接种第0天。分别在接种第7、10、13和16天对每只荷瘤小鼠的尾静脉中注射200μL上述ENG-Apt/IP-10-LP注射液进行治疗，得到ENG-Apt/IP-10-LP治疗的荷瘤小鼠。
按照上述方法，分别将ENG-Apt/IP-10-LP注射液替换为PBS、IP-10注射液和LP-IP-10注射液，其他步骤均不变，分别得到PBS治疗的荷瘤小鼠、IP-10治疗的荷瘤小鼠、LP-IP-10治疗的荷瘤小鼠。
分别在接种第6、9、12、15和18天测量上述不同处理的荷瘤小鼠的肿瘤长径和短径，根据公式TV＝1/2×a×b2计算肿瘤体积(表1)，并从接种第1天开始记录荷瘤小鼠的存活时间，统计存活率(表2)。
表1、不同处理的荷瘤小鼠的肿瘤体积的变化(mm3)
| 注射液名称 | 第6天 | 第9天 | 第12天 | 第15天 | 第18天 |
| ENG-Apt/IP-10-LP | 65.5±14.4 | 158.2±94.9 | 428.5±158.2 | 772.6±336.9 | 772±329 |
| PBS | 73.8±22.1 | 530.5±311.1 | 1602±420 | 4019±835 | 6263±650 |
| LP-IP-10 | 67.5±14.1 | 290.8±85.2 | 1328.3±200 | 2300±446 | 3972±539 |
| IP-10 | 68.3±12.8 | 385.4±211 | 1291.7±213 | 3372±513 | 5638.7±878 |
结果显示，在接种第18天，ENG-Apt/IP-10-LP治疗后的肿瘤体积分别为PBS、LP-IP-10和IP-10的0.12倍、0.19倍和、0.14倍。表明，ENG-Apt/IP-10-LP对肿瘤有明显的抑制作用，可降低肿瘤的生长速度。
表2、荷瘤小鼠在不同的存活率时距接种肿瘤的时间(天)
结果显示，ENG-Apt/IP-10-LP能明显延长荷瘤BalB/c裸鼠的生存时间：在ENG-Apt/IP-10-LP治疗的荷瘤BalB/c裸鼠存活率为50％时距第1次治疗的时间分别为PBS、LP-IP-10和IP-10治疗的荷瘤小鼠存活率为50％时距第1次治疗的时间的1.8倍、1.1倍和1.6倍；在ENG-Apt/IP-10-LP治疗的荷瘤BalB/c裸鼠存活率为20％时距第1次治疗的时间分别为PBS、LP-IP-10和IP-10治疗的荷瘤小鼠存活率为20％时距第1次治疗的时间的1.7倍、1.1倍和1.5倍。
将每个处理各随机选取三只荷瘤小鼠进行以下实验，实验重复三次：
ENG-Apt/IP-10-LP治疗的荷瘤小鼠在接种第19天时的肿瘤取出，并分离肿瘤单个细胞，得到ENG-Apt/IP-10-LP的肿瘤细胞悬液。用流式细胞仪检测得到ENG-Apt/IP-10-LP的肿瘤细胞悬液中CD8+T细胞的频率(图5)，CD8+T细胞频率的具体检测方法如下：将肿瘤细胞悬液调整丰度至1×107/ml，取肿瘤细胞悬液100μl，加入抗鼠CD8单克隆抗体(0.5μl)，4℃避光条件下孵育30min，PBS洗涤细胞，1200rpm离心5min，重复一次，用500μl PBS重悬细胞，上流式仪进行检测。
按照上述方法，将ENG-Apt/IP-10-LP治疗的荷瘤小鼠分别替换为PBS、LP-IP-10、ENG-Apt/LP和IP-10治疗的荷瘤小鼠，其他步骤均不变，分别得到PBS、LP-IP-10、ENG-Apt/LP和IP-10的肿瘤细胞悬液中的CD8+T细胞的频率。
结果显示，ENG-Apt/IP-10-LP、PBS、LP-IP-10和IP-10的肿瘤细胞悬液中CD8+T细胞的频率分别为15.8、2.1、9.5和3.5。ENG-Apt/IP-10-LP的肿瘤细胞悬液中CD8+T细胞的频率分别为PBS、LP-IP-10和IP-10的7.5倍、1.7倍和4.5倍。与PBS、LP-IP-10和IP-10相比，ENG-Apt/IP-10-LP处理的荷瘤小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞频率明显升高，差异具有统计学意义。
实验证明，本申请的ENG-Apt/IP-10-LP可明显抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存时间。
Claims (10)
1.基因传递系统，是由核心和外壳组成的纳米粒子；
所述外壳由适配体、交联剂和纳米脂质体组成；
所述适配体的序列如SEQ ID No.1所示；
所述适配体通过所述交联剂与所述纳米脂质体连接；
所述核心为IP-10，所述IP-10为编码SEQ ID No.2所示蛋白质的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述核酸分子为序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述系统按照包括以下步骤的方法制备：用所述外壳包被所述核心，得到所述系统。
4.根据权利要求3所述系统，其特征在于：所述方法还包括所述外壳的制备；
所述外壳的制备包括：用PEG修饰所述纳米脂质体得到PEG修饰的纳米脂质体；用所述适配体修饰所述PEG修饰的纳米脂质体得到所述外壳。
5.权利要求1所述系统的制备方法，包括用权利要求1所述系统中所述的外壳包被权利要求1所述系统中所述的核心，得到所述系统。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括所述外壳的制备；
所述外壳的制备包括：用PEG修饰所述纳米脂质体得到PEG修饰的纳米脂质体；用所述适配体修饰所述PEG修饰的纳米脂质体得到所述外壳。
7.用于制备权利要求1所述系统的成套试剂，为由权利要求1所述系统中所述的适配体和所述IP-10组成的成套试剂。
8.权利要求1-4任一所述的系统在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。
9.权利要求7所述成套试剂在制备权利要求1所述系统中的应用。
10.利用权利要求1-4任一所述系统制备的治疗和/或预防肿瘤药物。
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