CN103232531A - 一种癌细胞靶向性结构分子及其应用 - Google Patents
一种癌细胞靶向性结构分子及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103232531A CN103232531A CN2013100693674A CN201310069367A CN103232531A CN 103232531 A CN103232531 A CN 103232531A CN 2013100693674 A CN2013100693674 A CN 2013100693674A CN 201310069367 A CN201310069367 A CN 201310069367A CN 103232531 A CN103232531 A CN 103232531A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sirna
- molecule
- rgd
- mpa
- vegfr2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种癌细胞靶向性结构分子及其应用。它是将如式（Ⅰ）所示的分子与含有羧基结构和马来酐亚胺基团的连接分子反应，使氨基和羧基脱水缩合，而得到癌细胞靶向性结构分子。本发明提供的癌细胞靶向性结构分子，能与含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子相连，可经血管途径直接给药，特异性结合表达整合素家族αvβ3受体的肿瘤细胞，或肿瘤组织内新生血管内皮细胞，通过受体介导内吞有效地穿透细胞膜，将核苷酸分子送入细胞质内。
式（Ⅰ），其中n为1～10。
Description
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种癌细胞靶向性结构分子及其应用。
背景技术：
由于小干扰RNA（siRNA）分子可以通过沉默靶mRNA表达而抑制特异性靶蛋白的功能，因而利用siRNAs有望成为多种因基因突变或过表达引起疾病的新治疗策略（Davidson BL,McCray PB Jr.Current prospects for RNA interference-based therapies.Nat Rev Genet.2011;12(5):329-40）。然而，缺乏有效的递送系统限制了siRNA分子进入靶细胞内发挥作用而应用于临床。最近，进行优化设计和化学修饰，显著降低了siRNA分子的免疫应答，减少了脱靶效应，增加了对核苷酶的稳定性（D.V.Morrissey,J.A.Lockridge,L.Shaw,K.Blanchard,K.Jensen,W.Breen,K.Hartsough,L.Machemer,S.Radka,V.Jadhav,N.Vaish,S.Zinnen,C.Vargeese,K.Bowman,C.S.Shaffer,L.B.Jeffs,A.Judge,I.MacLachlan,B.Polisky,Potent andpersistent in vivo anti-HBV activity of chemically modified siRNAs,Nat.Biotechnol.2005;23:1002–1007.）。一些化学修饰的siRNAs已经进入I-II期临床试验的研究，临床适应症为粘膜组织、眼部、呼吸道病毒（RSV）感染和肾性疾病（P.K.Kaiser,R.C.A.Symons,S.M.Shah,E.J.Quinlan,H.Tabandeh,D.V.Do,G.Reisen,J.A.Lockridge,B.Short,R.Guerciolini,Q.D.Nguyen,RNAi-based treatment for neo-vascular age-related macular degeneration by Sirna-027,Am.J.Ophthalmol.2010；150：33–39；M.E.Kleinman,K.Yamada,A.Takeda,V.Chandrasekaran,M.Nozaki,J.Z.Baf fi,R.J.C.Albuquerque,S.Yamasaki,M.Itaya,Y.Z.Pan,B.Appukuttan,D.Gibbs,Z.L.Yang,K.Kariko,B.K.Ambati,T.A.Wilgus,L.A.DiPietro,E.Sakurai,K.Zhang,J.R.Smith,E.W.Taylor,J.Ambati,Sequence-and target-independent angiogenesis suppression by siRNA viaTLR3,Nature2008；452：591-5U1；J.DeVincenzo,R.Lambkin-Williams,T.Wilkinson,J.Cehelsky,S.Nochur,E.Walsh,R.Meyers,J.Gollob,A.Vaishnaw,A randomi zed,double-blind,placebo-controlled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010；107：8800–8805；M.R.Zamora,M.Budev,M.Rolfe,J.Gottlieb,A.Humar,J.DeVincenzo,A.Vaishnaw,J.Cehelsky,G.Albert,S.Nochur,J.A.Gollob,A.R.Glanville,RNA interference therapy in lung transplant patients infected with respiratorysyncytial virus,Am.J.Respir.Crit.Care Med2011；183：531–538）。初步的临床试验结果表明，基于RNAi技术的药物有可能成为一种新的治疗方案，广泛用于临床治疗因基因突变或过表达引起的疾病。
新生血管在肿瘤的生长和增殖中起着至关重要的作用（Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications.N Engl J Med1971;285:1182–6.）。而整合素αvβ3受体在血管生成和肿瘤细胞转移中有主要作用，目前被认为是治疗肿瘤的一个有效靶点。含Arg-Gly-Asp（RGD）模体的结构分子对高表达整合素受体的新生血管内皮细胞有高的亲和力（Ruoslahti E.RGDand other recognition sequences for integrins.Annu Rev Cell Dev.1996;12:697-715）。RGD肽和肿瘤相关的整合素αvβ3受体之间的高亲和力作用使得RGD肽做为配体在整合素靶点药物开发和siRNA递送中得到了广泛的应用（Han HD,Mangala LS,Lee JW,Shahzad MM,Kim HS,Shen D,Nam EJ,Mora EM,Stone RL,Lu C,Lee SJ,Roh JW,Nick AM,Lopez-Berestein G,SoodAK.Targeted gene silencing using RGD-labeled chitosan nanoparticles.Clin Cancer Res.2010;16(15):3910-22；Yonenaga N,Kenjo E,Asai T,Tsuruta A,Shimizu K,Dewa T,Nango M,OkuN.RGD-based active targeting of novel polycation liposomes bearing siRNA for cancer treatment.JControl Release.2011Oct13）。
在肿瘤的治疗中，血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2、也被称为KDR、FLK1）是备受关注的治疗靶点。目前化学合成的多种小分子VEGFR2抑制剂已被应用于临床试验中（Hurwitz H,Fehrenbacher L,Novotny W,Cartwright T,Hainsworth J,Heim W,et al.Bevacizumab plus irinotecan,fluorouracil,and leucovorin for metastatic colorectal cancer.N Engl JMed2004;350(23):2335–42；Sandler A,Gray R,Perry MC,Brahmer J,Schiller JH,Dowlati A,etal.Paclitaxel-carboplatin alone or with bevacizumab for non-small-cell lung cancer.N Engl J Med2006;355(24):2542–50）。VEGFR2是一种酪氨酸激酶受体，包括三个部分：胞外结构域，跨膜结构域和胞质内酪氨酸激酶结构域。VEGFR2结合VEGF后激活下游多条信号传导途径：促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、磷酸肌醇3-激酶（PI3K）、AKT、磷脂酶Cγ、小GTP酶类等而发挥促血管生成作用（Brown,L.F.,Detmar,M.,Claffey,K.,Nagy,J.A.,Feng,D.,Dvorak,A.M.,Dvorak,H.F.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor:amultifunctional angiogenic cytokine.EXS1997；79,233-269；Herbert,S.P.,Stainier,D.Y.Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.Nat Rev MolCell Biol2011；12,551-564），这些激酶在血管的生成中均有着重要作用。因而，设计靶向VEGFR2的小干扰RNA分子并且有效的沉默VEGFR2基因的表达，可阻断VEGF/VEGFR2通路，有效地抑制肿瘤内新生血管的生成，在肿瘤的治疗中有着光明的应用前景。
有效发挥siRNA分子体内疗效的瓶颈问题：限制siRNA应用于临床的关键技术是在体内可以有效地穿透细胞膜进入胞浆内发挥作用。研究表明即使在毫摩尔的浓度下，裸siRNA也不能穿透细胞膜进入细胞质（Whitehead,K.A.,Langer,R.&Anderson,D.G.Knocking downbarriers:advances in siRNA delivery.Nat.Rev.Drug Discov.2009；8,129–138）。这主要是由siRNA分子的物理化学特性所决定：较大的分子量(～14,000Da)、阴性电荷和亲水性，阻止其通过被动扩散穿透多种类型的细胞膜进入细胞质发挥RNAi的作用（Semple SC,Akinc A,ChenJ,Sandhu AP,Mui BL et al.Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.Nat Biotechnol.2010;28(2):172-176;Behlke,M.A.Chemical modification of siRNAs for in vivo use.Oligonucleotides2008;18,305–320）。目前的解决方法包括：阳离子脂质体及病毒载体囊化包裹、高压注射以及对siRNA分子的直接修饰（如化学、脂质、类固醇、抗体-鱼精蛋白、聚合物等的修饰），然而这些方法还存在制备困难或靶向性差等缺陷。在体内应用siRNA，一个必须考虑的因素就是靶向性，如靶向性给予siRNA分子进入特定的细胞类型，如肿瘤细胞，减少了非特异性细胞的结合和治疗所必须的剂量，限制临床应用的副作用。（McNamara JO 2nd,Andrechek ER,Wang Y,Viles KD,Rempel RE,et al.Cell type–specific delivery of siRNAs withaptamer-siRNA chimeras.Nat Biotechnol.2006;24(8):1005-1015；Eguchi A,Meade BR,ChangYC,Fredrickson CT,Willert K,Puri N,Dowdy SF.Efficient siRNA delivery into primary cells by apeptide transduction domain–dsRNA binding domain fusion protein.Nat Biotechnol.2009;27(6):567-571）。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种能连接含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子，高效、稳定、靶向性进入癌细胞的靶向性结构分子。
本发明的癌细胞靶向性结构分子，其特征在于，是将如式（Ⅰ）所示的分子与含有羧基结构和马来酐亚胺基团的连接分子反应，使氨基和羧基脱水缩合，而得到癌细胞靶向性结构分子
式（Ⅰ）
其中n为1～10。
所述的癌细胞靶向性结构分子，优选，其结构式如式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）
其中n为1～10。
进一步优选，所述的n为1。
优选，是将上述的癌细胞靶向性结构分子的马来酐亚胺基团与巯基乙醇、巯基丙醇、巯基丁醇、巯基戊醇或巯基己醇的巯基反应形成硫醚键，再将巯基乙醇HO-CH2-CH2-SH、巯基丙醇HO-CH2-CH2-CH2-SH、巯基丁醇HO-CH2-CH2-CH2-CH2-SH、巯基戊醇HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-SH或巯基己醇HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-SH上的羟基与核苷酸类分子的3’端的核苷酸单元内戊糖2位的磷酸基团反应连接形成的分子用于制备肿瘤靶向性治疗药物或示踪剂。
本发明的癌细胞靶向性结构分子能与含巯基（-SH)（巯基乙基-CH2-CH2-SH、巯基丙基-CH2-CH2-CH2-SH、巯基丁基-CH2-CH2-CH2-CH2-SH、巯基戊基-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-SH或巯基己基-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-SH修饰）修饰的核苷酸分子，通过巯基和马来酐亚胺基团反应形成硫醚键从而使癌细胞靶向性结构分子能与含巯基修饰的核苷酸分子连接。所述的核苷酸分子包括siRNA和单链寡核苷酸分子；单链寡核苷酸分子包括反义寡核苷酸、miRNA、以及其他可以和核酸类结构分子结合后起调控功能的核酸类似物。
所述的含RGD模体的寡肽cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-)，该含RGD模体的寡肽cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-)能特异性结合表达整合素家族αvβ3受体的细胞，如肿瘤细胞，不结合正常组织细胞表面，因此可以特异性结合表达整合素家族αvβ3受体的肿瘤细胞，或肿瘤组织内新生血管内皮细胞，通过受体介导内吞有效地穿透细胞膜，通过将含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子与本发明的癌细胞靶向性结构分子相连，从而将核苷酸分子送入细胞质内，在肿瘤诊断、肿瘤治疗、及靶向性给药载体设计方面，可得到广泛的应用，因此可将本发明的癌细胞靶向性结构分子在制备抗肿瘤药物中应用。
针对不同的靶标基因设计不同的siRNA，从而沉默靶标基因，本领域技术人员可根据本领域的公知常识将针对不同靶标基因的siRNA连入本发明的癌细胞靶向性结构分子中，用于沉默靶标基因。
因此，本发明的第二个目的是提供上述癌细胞靶向性结构分子在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的癌细胞靶向性结构分子，能与含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子相连，可经血管途径直接给药，特异性结合表达整合素家族αvβ3受体的肿瘤细胞，或肿瘤组织内新生血管内皮细胞，通过受体介导内吞有效地穿透细胞膜，将核苷酸分子送入细胞质内。癌细胞靶向性结构分子与含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子相连的分子，可抗生物体内核苷酸酶的降解，增加了在生物体内的稳定性；癌细胞靶向性结构分子与含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子相连的分子的分子量适中，避免了siRNA分子因分子量小在生物体内被迅速代谢的缺陷，延长了作用时间。癌细胞靶向性结构分子与含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子相连的分子细胞转染效率高。整合素αvβ3为肿瘤新生血管内皮细胞表面特异性表达的受体，其配体RGD小分子肽可靶向性结合到该受体上，并介导整个分子被内吞进表达整合素αvβ3受体的新生血管内皮细胞或肿瘤细胞内，该分子结构不需要穿过血管壁即可到达靶细胞，提高了siRNA分子组织细胞的靶向性和转染效率。癌细胞靶向性结构分子与含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子相连的分子体内副作用小。利用本发明的癌细胞靶向性结构分子与含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子相连的分子，避免了使用病毒类和常见阳离子脂等转染剂的毒副作用。整个分子结构合成简单、稳定，容易大量制备。该分子结构可较易进入临床应用。本发明设计的癌细胞靶向性结构分子，RGD已被实验证明无免疫原性，MPA结构类似于PEG，PEG早已获得临床使用批准，整个分子结构从理论上看应无大的副作用，避免了阳离子脂、病毒或纳米粒介导siRNA分子转染用于人体时，必需先获批所用载体的临床使用证明及通过相关规定等的烦琐。
所以，本发明提供的癌细胞靶向性结构分子，可用于经系统途径给药，使得其能携带核酸类结构分子靶向性进入细胞，发挥核酸类结构分子对基因的调控或沉默功能，可直接进行疾病的治疗。
附图说明：
图1.是实施例1的癌细胞靶向性结构分子（RGD-PEG-MPA）的合成路线图，以及将本发明的癌细胞靶向性结构分子与含巯基（-SH)修饰的核苷酸分子相连的合成路线图；
图2.是合成的癌细胞靶向性结构分子（RGD-PEG-MPA）的纯化和鉴定结果图。
A-C：由美国Peptide International公司提供的对RGD-PEG-MPA结构进行纯化和鉴定的结果图。
图3.是凝胶电泳分析RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2以及RGD-PEG-MPA-siRNAVEGFR2结构鉴定结果图。
A：合成的RGD-PEG-MPA-ssRNA的电泳图。Lane1：RGD-PEG-MPA与意义链RNA反应后溶液的电泳图；Lane2：没有加RGD-PEG-MPA的意义链RNA按Lane1相同处理后的溶液的电泳图；
B：纯化并形成双链后的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。RNA在20%的聚丙烯酰胺凝胶中的电泳，并用花青染料SYBR Gold染色。
C：未修饰巯基RNA的高相液相图谱。
D：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2的高相液相图谱。
E：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（小鼠VEGFR2）的质谱分析。
图4.用激光共聚焦显微镜观察RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（Cy5标记的siRNA）细胞的靶向性。
A：MS1；B：HUVEC。
图5.是流式细胞仪检测MS1细胞和HUVEC细胞表面αvβ3受体的表达。
A：MS1-实验组；B：MS1-RGD竞争组；C:HUVEC-实验组；D：HUVEC-RGD竞争组。
图6.检测RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2细胞毒性。
1，RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2处理组；2RGD-PEG-MPA-control siRNA处理组；3：Lipofectamine2000/si VEGFR2处理组；4：未加入任何物质的对照组。
图7.RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2介导的细胞水平基因沉默.
A:RT-qPCR检测转染RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2后MS1细胞中VEGFR2m RNA的表达水平。1：未处理组；2：Control siRNA处理组；3：lipofectamine2000/siVEGFR2complexes（小鼠）处理组；4：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（小鼠）处理组。
B：RT-qPCR检测转染RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2后HUVEC细胞中VEGFR2m RNA的表达水平。1：未处理组；2：control siRNA处理组；3：lipofectamine2000/siVEGFR2complexes（人）处理组；4：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（人）处理组。
C：Western Blot。1：未处理组；2：control siRNA处理组；3：lipofectamine2000/siVEGFR2complexes（人）处理组；4：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（人）处理组。
D：Western Blot检测转染RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（人）后HUVEC细胞中VEGFR2蛋白的表达水平。1：未处理组；2：control siRNA处理组；3：lipofectamine2000/siVEGFR2complexes（人）处理组；4：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（人）处理组。
图8.RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子（斑马鱼）能够靶向抑制斑马鱼新生血管的发育和生成。
A：ddH2O；B:Control siRNA；C:siRNA VEGFR2（斑马鱼）；D：RGD-PEG-MPA-siRNAVEGFR2（斑马鱼）。其中DA：背主动脉；PCV：后主静脉；ISV：体节间血管；DLAV：背部纵向血管；PAV：脊索旁血管。
图9.斑马鱼新生血管发育和生成情况（相对荧光强度分析）。
1:ddH2O；2：Control siRNA；3：siRNA VEGFR2（斑马鱼）；4：RGD-PEG-MPA-siRNAVEGFR2（斑马鱼）。
图10.RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子在肿瘤裸鼠内的肿瘤组织靶向性。
A：系统给药后RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5（小鼠）分子在肿瘤裸鼠内的组织靶向分布；
B：系统给药后RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5（小鼠）分子在裸鼠组织器官中的分布。
图11.经尾静脉给药后RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（小鼠）分子对肿瘤生长的抑制作用。
A：肿瘤生长曲线变化。
B：Luciferase表达量变化（肿瘤体积以及肿瘤细胞活性越强，Luciferase荧光强度越强）。
图12.经尾静脉给药后RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2介导肿瘤内的基因沉默。
A：RT-qPCR检测肿瘤组织中VEGFR2mRNA的表达水平。
1：RGD-MPA处理组;2：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2处理组;3:Saline处理组。
B：Western Blot。1：RGD-MPA处理组;2：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2处理组;3:Saline处理组。
C：量化肿瘤组织中VEGFR2蛋白的表达水平。
1：RGD-MPA处理组;2：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2处理组;3:Saline处理组。
图13：ELISA测定RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子系统给药后小鼠血清中细胞因子的水平。
A：给药后24h血清中INF-α和IL-6的水平。
B：治疗结束后血清中INF-α和IL-6的水平
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、合成RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子。
合成路线如图1所示，具体步骤如下：
1.1、RGD-PEG-MPA（肿瘤靶向性结构分子）
RGD-PEG-MPA的合成步骤如图1所示，其是由含RGD模体的寡肽cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-（图1中的A）的Lys上的氨基与8-氨基-3,6-二氧杂辛酸（图1中的B，PEG）的羧基脱水缩合，得到RGD-PEG（图1中的C），然后RGD-PEG的氨基与3-Maleimidopropionic Acid（
简称MPA，图1中的D）的羧基脱水缩合，得到RGD-PEG-MPA（图1中的E，即肿瘤靶向性结构分子）。RGD-PEG-MPA的具体合成委托美国Peptide International公司合成（签有保密协议）。其鉴定和纯化如图2A-C。
1.2、合成巯基（-SH)修饰的意义链RNA
其中siRNA为特异性抑制小鼠或人血管内皮生长因子受体2（VEGFR2，Kdr）基因的siRNA，所述针对小鼠的siRNA对应的靶序列是小鼠血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因，沉默VEGFR2基因的特异性siRNA（siRNA mVEGFR2，或者siVEGFR2）序列如下：
有义链：5'-CGGAGAAGAAUGUGGUUAA dTdT-3'
反义链：3'-dTdT GCCUCUUCUUACACCAAUU-5'
小鼠阴性对照siRNA序列：
有义链：5’-CGUGAUUGCGAGACUCUGAdTdT-3’
反义链：3'-dTdTGCACUAACGCUCUGAGACU-5'
沉默人血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因的特异性siRNA（siRNA hVEGFR2）序列如下：
有义链：5’-GGUAAAGAUUGAUGAAGAAdTdT-3’
反义链：3-‘dTdT CCAUUUCUAACUACUUCUU-5’
人阴性对照siRNA序列：
有义链：5’-CCUGGAGAAUCAGACGACAAGUAUU-3’
反义链：3’-GGACCUCUUAGUCUGCUGUUCAUAA-5’
以本专业公知的方法在siRNA意义链3’端的核苷酸单元内戊糖2位的磷酸基团上通过巯基己醇HO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-SH修饰巯基己基-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-SH（图1中的F）。
由此得到巯基（-SH)修饰的有义链RNA。
siRNA分子委托广州锐博生物科技有限公司合成。
1.3、合成RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子：
步骤1.2的3’-巯基修饰的有义链RNA（20nm）同过量的步骤1.1的RGD-PEG-MPA（400nm20eq）溶于1ml0.1M HEPES缓冲溶液中，4℃均匀混合震荡12小时。经20%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，溶液中巯基修饰的有义链RNA转化为RGD-PEG-MPA-ssRNA，其电泳图如图3A所示。超滤浓缩后反相色谱纯化，冻干后得到白色粉末状固体RGD-PEG-MPA-ssRNA。
等量反义链RNA（50μM）和RGD-PEG-MPA-ssRNA（50μM），溶于退火缓冲液（10mMTris-HCl pH7.4,50mM NaCl,and1mM EDTA），95℃加热3分钟，恢复至室温，经超滤除去过量盐分，冻干得RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（如图1中的G，RGD-PEG-MPA-siRNA）分子，其电泳图如图3B所示。
按照上述方法分别合成针对小鼠血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因和人血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子，即为本实施例的细胞靶向性分子修饰的PLN结构分子。
1.4、RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子结构的鉴定
通过SDS-PAGE方法鉴定纯化所得RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子的纯度，纯度达到99%以上，见图3B；
通过HPLC色谱法鉴定RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子的。色谱条件：流动相A:0.1M TEA A缓冲液（PH＝7.4）;流动相；B:100%乙腈；0-30min流动相B0－50%；色谱柱：Agela Venusil ASB C84*250mm；流速1ml/min。如图3C所示为未修饰巯基RNA，保留时间（RT）＝15.133分钟；图3D所示为RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2，保留时间＝22.273。
通过MS方法鉴定RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子的结构，从MS结果得到的分子量可以判断，合成得到的产物同理论设计的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2结构一致，计算分子量为7976.4，实测分子量为7977.9，见图3E。
以下实验中，针对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）是针对人血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子，而针对小鼠胰岛血管内皮细胞MS1则是针对小鼠血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因的RGD-PEG-MPA-siRNAVEGFR2分子。
2、RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子的细胞靶向性
常规方法培养表达αvβ3受体的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和胰岛血管内皮细胞MS1。
实验组：取上述两种细胞悬液100μl（1×105个细胞/ml），分别加入LM609(1μl，1mg/ml)，孵育30min，PBS离心洗涤后重悬为100μl，加入1μl，0.5mg/ml羊抗小鼠FITC荧光标记物(针对MS1细胞)（MULTISCIENCES，GAM0041）或1μl，1mg/ml羊抗大鼠PE荧光标记物(针对HUVEC细胞)（RD，AAFO02）。4℃孵育1h，离心洗涤后用美国B＆D公司FACSVantageSE产流式细胞仪检测细胞表面αvβ3受体的表达。
RGD竞争组：分别取上述的两种细胞悬液100μl（1×105个细胞/ml），先加入10倍浓度(1μl，20mg/ml)的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子，37℃孵育30min。然后每个组再加入LM609(1μl，1mg/ml)，孵育30min，PBS离心洗涤后，加入1μl，0.5mg/ml羊抗小鼠FITC荧光标记物(针对MS1细胞)或1μl，1mg/ml羊抗大鼠PE荧光标记物(针对HUVEC细胞)。4℃孵育1h，离心洗涤后用美国B＆D公司FACSVantageSE流式细胞仪检测细胞表面αvβ3受体的表达。
结果显示，在MS1细胞中，实验组有3.33%的整合素αvβ3受体，图5-A，而加入RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2的RGD竞争组则阳性表达率下降为2.18%，图5-B；在HUVEC细胞中，实验组整合素αvβ3受体的表达高达97.98%，图5-C，而加入RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2的RGD竞争组则阳性表达率下降为1.29%，图5-D。结果说明了RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子可以有效地与细胞膜表面的整合素αvβ3受体结合。且在HUVEC细胞膜表面含有丰富的整合素αvβ3受体表达。
常规方法培养表达αvβ3受体的人脐静脉内皮细胞HUVEC和胰岛血管内皮细胞MS1。分别接种2×105个HUVEC或3×105个MS1细胞至共聚焦培养皿中，补加含10%FBS的DMEM至2ml，37℃，5%CO2孵育箱过夜。次日，再分别往其中加入10μl体积、浓度为20μM的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-cy5分子（cy5标记的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子），然后在培养箱中继续培养12h，离心洗涤细胞后用DAPI染色，甲醇固定。共聚焦显微镜下观察RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-cy5在MS1和HUVEC细胞浆中均匀分布。结果如图4所示，结果说明了RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-cy5可以有效地结合靶细胞，通过受体介导进入胞浆中。
3、CCK-8检测细胞毒性检测
在96孔板中常规培养MS1细胞，每孔100μl细胞培养液且含有约6×103个细胞于37℃，5%CO2孵育箱过夜。次日加入1μl，浓度为20μM的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子；用lipofectamine2000为阳性对照组，转染相同量的裸siRNA VEGFR2分子。培养一定时间后，向各孔中加入10μl的CCK-8溶液，孵育后用酶标仪(Bio-RAD,USA)测定450nm处的OD值。以未加入任何物质的MS1细胞按照相同处理方法的OD值作为空白对照（Untreated），RGD-PEG-MPA-control siRNA（按照RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2相同方法处理的，只是siRNA不同，siRNA阴性对照见1.2）处理组为阴性对照组。
结果如图6所示，从图6可以看出，与对照组lipofectamine2000/siRNA VEGFR2复合物相比，RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2细胞毒性低，细胞活力好，而lipofectamine2000/siRNAVEGFR2复合物组细胞毒性较大，细胞的活力较低。
4、RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子的基因沉默效率
4.1RT-qPCR
常规方法培养表达αvβ3受体的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和小鼠胰岛血管内皮细胞MS1。分别接种2×105个HUVEC或3×105个MS1细胞至共聚焦培养皿中，补加含10%FBS的DMEM至2ml，37℃，5%CO2孵育箱过夜。次日，分别往其中加入10μl体积的浓度为20μM的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2，培养箱中继续培养48h。用lipofectamine2000转染组为阳性对照组，转染等量的裸siRNA VEGFR2分子。按Trizol（Invitrogen）试剂说明书方案提取细胞总RNA，按TOYOBO公司试剂说明书方案进行RT-PCR反应。
使用针对小鼠VEGFR2cDNA的引物序列为：
mVEGFR2-F：5’-AGAATGCGGGCTCCTGACTA-3’
mVEGFR2-R：5’-CCATGCTCAGTGTCTCTGACA-3’
18s rRNA-F：5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’
18s rRNA-R：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’
PCR反应条件：95℃5min；95℃15s、60℃15s、72℃32s读板，40cycles；
融解曲线分析：温度60℃-95℃。
针对人VEGFR2cDNA的引物序列以及PCR条件为：
hVEGFR2-F：5’-GCCAGTCTTCTAGGCATATCC-3’
hVEGFR2-R：5’-CTCCCCAGGTACTGCTACTT-3’
GAPDH-F：5’-AACGGATTTGGTCGTATTGG-3’
GAPDH-R：5’-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’
PCR反应条件：95℃10min；95℃30s、95℃5s、60℃30s读板，40cycles；
融解曲线分析：温度60℃-95℃。
定量PCR用的SYBR Green PCR Master Mix，购自TOYOBO公司
定量PCR仪：
7500Sequence Detection System。
结果显示：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子处理组基因沉默为67%，而阳性对照组脂质体lipo2000基因沉默效率约为80%，如图7-A。沉默效率较低的原因可能与MS1细胞膜表达αvβ3受体数量低有关。在HUVEC细胞中转染RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（靶向人siRNA）后，靶基因沉默效率为80%，如图7-B。因为RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2进入细胞质发挥作用是通过细胞膜表面的αvβ3受体介导的，αvβ3的受体表达量较低直接影响RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2进入细胞质的量，决定了基因沉默效率的高低。
4.2Western Blot
4.2.1提取HUVEC细胞总蛋白：
4.2.2测定蛋白含量（BCA法）
4.2.3Western Blot
制备SDS-PAGE凝胶（10%分离胶，5%积层胶）。采用半干法转膜，调电压至15V，转膜4.5h。4℃5%脱脂牛奶封闭过夜，加一抗（CST，1：500倍，4℃过夜），二抗（Abmart，1:5000，37℃摇床中孵育1h），显影（ECL法）。
结果显示：对胶片中各组VEGFR2和GAPDH条带进行灰度扫描，以VEGFR2和GAPDH的灰度比值作为各组VEGFR2蛋白的相对表达量。将空白转染组的VEGFR2蛋白的相对表达量设为100。RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2组和lipofectamine2000/siVEGFR2组VEGFR2蛋白下调约75%。证明了RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2和lipofectamine2000/siVEGFR2一样可以有效地介导基因沉默和蛋白质表达水平的下调，如图7C、7D。
5、RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（斑马鱼）分子抑制斑马鱼体内血管生成和发育
沉默斑马鱼血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）基因的特异性siRNA（siRNAhVEGFR2）序列如下：
有义链：5'-CUGAAAACAAUGUUGUGAA dTdT-3'
反义链：3'-dTdTGACUUUUGUUACAACACUU-5
按照上述方法制备RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（斑马鱼）
由南方医科大学生命科学研究院斑马鱼平台提供绿色荧光蛋白标记血管的转基因（Flk1:GFP）斑马鱼。根据Wester field方法养殖：照明14h/黑暗10h交替进行，雌雄分开喂养，定时给予饲料。将其与去色素（Albino）斑马鱼交配，以免黑色素的形成而方便观察。取卵前一天，雌雄以1：1的比例放入交配缸内，次日晨取胚胎。
受精卵发育到4.3小时，在体式显微镜下挑选发育正常的胚胎，移入6孔板中，每孔20枚卵。实验分为四个组：ddH2O，siRNA VEGFR2，siRNA control和RGD-PEG-MPA-siRNAVEGFR2（斑马鱼）组。通过显微注射给予不同的药物（约为2nl）。置于28.5摄氏度培养箱内继续培养。每天换水两次，剔除死卵，并计数。在受精卵发育到72小时，存活的胚胎已孵出仔鱼，通过共聚焦显微镜观察斑马鱼血管发育情况。
用激光扫描共聚焦显微镜检测斑马鱼血管生成情况。将72hpf的斑马鱼仔鱼先用麻醉剂MS-222（0.02%）麻醉，用镊子严格将鱼按侧面朝上的位置拨正，再包埋到1.2%低熔点胶中。待胶冷却后，加入含有0.02%的MS-222的Hank’s溶液，以防拍摄过程中鱼自发运动。采用蔡司（Zeiss）公司的LSM510META激光共聚焦显微进行拍摄。拍摄时，首先使用5倍空气镜，寻找视野；之后，使用20倍水镜，波长为488nm的单光子，按照激光强度最佳为原则，行X，Y，Z三个方向的逐层扫描，拍摄目的血管的连续图像（图8），拍摄的层间距为3μm，拍摄斑马鱼8至12体节血管。每组取幼鱼3条观察统计。
采用强度为20%的激光扫描，其余方法同前。以Adobe Photoshop7.0软件记录多层扫描投射荧光集合（Z-stack Projection）。以灰度平均值记为荧光亮度，结果以各组荧光亮度与对照组之比进行统计分析
结果显示：通过激光扫描共聚焦显微镜观测了RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子对斑马鱼躯干部血管的影响。选择观察这一区域，是因为相比头面部血管，躯干部血管比较简单和规则，对这些血管的研究也比较透彻（图8-A）。显微注射RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子处理组，躯干部的主要血管都受到广泛的影响(图8-D)，表现为PAV以及ISV血管的特异性消失以及斑马鱼发育畸形。而control siRNA处理组和siRNA VEGFR2处理组均无明显的变化（图8-B和8-C）。通常PAV血管以及ISV血管在受精后36小时左右形成。本实验中，我们选择受精后72h的斑马鱼观测，避免了该血管延迟生长的可能性。与其他实验组相比，我们观测到受精后72h，RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子处理组的斑马鱼PAV血管部分或者完全丧失，如图8-D示。同时对荧光强度的统计也有类似的结果，图9。因此，我们推测RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子可以特异性地抑制了PAV和ISV血管的生成。
6、RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2在肿瘤裸鼠体内的靶向性
6.1建立小鼠肿瘤模型。培养肿瘤细胞系表达荧光素酶luc+的非小细胞肺癌A549细胞，收集指数生长期细胞，用PBS重悬细胞后经裸鼠皮下接种，建立非小细胞肺癌移植小鼠瘤模型。
6.2RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5分子（针对小鼠胰岛血管内皮细胞MS1的）在裸鼠体内的分布以及药物代谢动力学研究。经肺癌移植瘤裸鼠尾静脉给予1nmRGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5分子(溶解于150μl的生理盐水中)，采用吸入麻醉剂麻醉裸鼠，经腹腔内给予肿瘤裸鼠150mg/kg的luciferin-D，观察肿瘤的存在部位以及肿瘤生长状况。然后在不同时间点（10min、0.5h、1h）采用IVIS Spectrum Imaging System将动物成像，观察Cy5标记的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5分子在体内分布情况。24小时后，处死裸鼠，并取出各个脏器（心脏、脾脏、肾脏、肺、肝脏、肌肉以及脑），在活体成像仪下观察RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5分子在体内组织器官中的分布情况。
结果显示:经小鼠尾静脉给予RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5分子后，RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5分子可特异性靶向肿瘤部位，见图10-A和10-B。在肾脏和肝脏组织中也有分布，这与RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5分子本身在体内的代谢过程特性有关；在心脏、脑、肺、肌肉中未见标记的RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2-Cy5分子分布。
7、RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2经尾静脉后抑制肿瘤的生长
7.1实验分组以及给药。同6.1建立小鼠肿瘤模型，实验分为3组，RGD-PEG-MPA-siRNAVEGFR2组8只（每三天给药（RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子）一次，每次给药剂量为2nm，溶解于150μl的生理盐水），RGD-MPA组5只（每三天给药（RGD-MPA分子，2mg/ml）一次，每次给药剂量为150μl），untreated组5只（每三天给予生理盐水一次，每次给药剂量为150μl）。
7.2测量肿瘤体积以及荷瘤鼠体重变化。待肿瘤生长到可触摸时用游标卡尺定期测量肿瘤体积，当体积长到约为50mm3时开始给药。每3天给药一次，一共6次。定期测量荷瘤鼠体重和肿瘤体积，体积计算公式：V=ab2×0.5(a为长直径，b为短直径)。
结果显示：从NSCLC移植物裸鼠模型治疗结果来看，如图11，RGD-PEG-MPA-siRNAVEGFR2（图11中的RGD-MPA-siRNA）组经尾静脉给药后，接种的肿瘤体积显著减小，证明了RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子可以显著抑制肿瘤的生长，各组动物肿瘤体积减少程度的结果见表1。
表1：不同给药组的肿瘤体积（Mean±SD）
**vs.untreated group,P<0.001
8．RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2分子经尾静脉给药后介导的肿瘤内的基因沉默
8.1RT-qPCR
最后一次给药后48小时，处死各给药组(saline,RGD-MPA，RGD-PEG-MPA-siRNAVEGFR2组)裸鼠，获得肿瘤组织后提取组织总RNA，经紫外分光光度计测定OD值检测符合RNA质量要求后进行RT-qPCR实验。
结果显示：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（图12中的RGD-MPA-si VEGFR2）可以有效地介导肿瘤内的VEGFR2mRNA表达量下调，如图12A所示。
8.2Western Blot
最后一次给药两天后，处死各给药组(saline,RGD-MPA，RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（图12中的RGD-MPA-si VEGFR2）组)裸鼠，获得肿瘤组织后提取组织总蛋白，经Western Blot和ECL发光显影得到如图12-B、C所示结果。
结果显示：RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2可以有效地介导肿瘤内的VEGFR2蛋白表达量下调，如图12B、C所示。
9ELISA测定血清中细胞因子的水平
取9只4-6周龄体重约为20g的BALB/c nu/nu，分别给予生理盐水(n=3)；RGD(～0.045mg/kg；n=3);RGD-PEG-MPA-siVEGFR2(～0.71mg/kg(1nmol)；n=3)分别经尾静脉给药，24小时后，取血，静置后3000转15min离心取血清，用ELISA测定血清中INF-α和IL-6的水平。肿瘤裸鼠最后给予药物后48小时，处死小鼠并取血，静置后3000转15min离心取血清，用ELISA测定血清中INF-α和IL-6的水平。
结果显示：给予药物24小时后，RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2（图13中的RGD-MPA-siRNA）组与RGD-MPA以及saline组血清中细胞因子INF-α和IL-6的水平相比无显著性差异，说明RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2无免疫刺激性，证明了RGD-PEG-MPA-siRNAVEGFR2体内应用的安全性，如图13A所示。最后一次给药后48小时，RGD-MPA组血清中INF-α和IL-6的水平，与正常裸鼠对照组相比无差异，说明RGD-MPA长期给药也不会引起免疫刺激。而saline组血清中INF-α和IL-6两个细胞因子含量较高，预测可能肿瘤发展后期引起自身的免疫应答。RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2给药组血清中INF-α和IL-6含量与前两组之间相比有差异，可能是由于长期给药后刺激免疫系统进一步抑制肿瘤的生长有关，如图13B所示。
实施例中的各图中的RGD-MPA-siRNA、RGD-MPA-siRNA VEGFR2均为RGD-PEG-MPA-siRNA VEGFR2组。
Claims (5)
1.一种癌细胞靶向性结构分子，其特征在于，是将如式（Ⅰ）所示的分子与含有羧基结构和马来酐亚胺基团的连接分子反应，使氨基和羧基脱水缩合，而得到癌细胞靶向性结构分子
式（Ⅰ）
其中n为1～10。
2.根据权利要求1所述的癌细胞靶向性结构分子，其特征在于，所述的癌细胞靶向性结构分子，其结构式如式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）
其中n为1～10。
3.根据权利要求2所述的癌细胞靶向性结构分子，其特征在于，所述的n为1。
4.权利要求1、2或3所述的癌细胞靶向性结构分子在制备肿瘤靶向性治疗药物或示踪剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是将权利要求1、2或3所述的癌细胞靶向性结构分子的马来酐亚胺基团与巯基乙醇、巯基丙醇、巯基丁醇、巯基戊醇或巯基己醇的巯基反应形成硫醚键，再将巯基乙醇、巯基丙醇、巯基丁醇、巯基戊醇或巯基己醇上的羟基与核苷酸类分子的3’端的核苷酸单元内戊糖2位的磷酸基团反应连接形成的分子用于制备肿瘤靶向性治疗药物或示踪剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310069367.4A CN103232531B (zh) | 2013-03-05 | 2013-03-05 | 一种癌细胞靶向性结构分子及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310069367.4A CN103232531B (zh) | 2013-03-05 | 2013-03-05 | 一种癌细胞靶向性结构分子及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103232531A true CN103232531A (zh) | 2013-08-07 |
| CN103232531B CN103232531B (zh) | 2015-01-07 |
Family
ID=48880610
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310069367.4A Expired - Fee Related CN103232531B (zh) | 2013-03-05 | 2013-03-05 | 一种癌细胞靶向性结构分子及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103232531B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107142260A (zh) * | 2016-08-11 | 2017-09-08 | 武汉泽智生物医药有限公司 | 沉默内皮细胞生长因子受体2表达的siRNA及其用途 |
| CN107226844A (zh) * | 2017-06-26 | 2017-10-03 | 武汉泽智生物医药有限公司 | 增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子及其应用 |
| CN108623694A (zh) * | 2017-03-24 | 2018-10-09 | 北京市肿瘤防治研究所 | 血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽f56的衍生物及应用 |
| CN114748640A (zh) * | 2022-05-06 | 2022-07-15 | 南方医科大学珠江医院 | 一种pH响应性的siRNA递送系统 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060223184A1 (en) * | 2005-04-05 | 2006-10-05 | Frutos Anthony G | Supports useful in incorporating biomolecules into cells and methods of using thereof |
| WO2009045536A2 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Receptor targeted oligonucleotides |
| US20100004316A1 (en) * | 2006-09-29 | 2010-01-07 | University Of Utah Research Foundation | Multifunctional carriers for the delivery of nucleic acids and methods of use thereof |
-
2013
- 2013-03-05 CN CN201310069367.4A patent/CN103232531B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060223184A1 (en) * | 2005-04-05 | 2006-10-05 | Frutos Anthony G | Supports useful in incorporating biomolecules into cells and methods of using thereof |
| US20100004316A1 (en) * | 2006-09-29 | 2010-01-07 | University Of Utah Research Foundation | Multifunctional carriers for the delivery of nucleic acids and methods of use thereof |
| WO2009045536A2 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Receptor targeted oligonucleotides |
| WO2009045536A3 (en) * | 2007-10-05 | 2009-07-23 | Univ North Carolina | Receptor targeted oligonucleotides |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107142260A (zh) * | 2016-08-11 | 2017-09-08 | 武汉泽智生物医药有限公司 | 沉默内皮细胞生长因子受体2表达的siRNA及其用途 |
| CN108623694A (zh) * | 2017-03-24 | 2018-10-09 | 北京市肿瘤防治研究所 | 血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽f56的衍生物及应用 |
| CN108623694B (zh) * | 2017-03-24 | 2021-09-17 | 北京市肿瘤防治研究所 | 血管内皮细胞生长因子受体拮抗肽f56的衍生物及应用 |
| CN107226844A (zh) * | 2017-06-26 | 2017-10-03 | 武汉泽智生物医药有限公司 | 增强整合素受体亲和力及靶细胞摄取能力的结构分子及其应用 |
| CN114748640A (zh) * | 2022-05-06 | 2022-07-15 | 南方医科大学珠江医院 | 一种pH响应性的siRNA递送系统 |
| CN114748640B (zh) * | 2022-05-06 | 2024-02-09 | 南方医科大学珠江医院 | 一种pH响应性的siRNA递送系统 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103232531B (zh) | 2015-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101963885B1 (ko) | 세포투과성이 향상된 펩티드 핵산 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물 | |
| US7534878B2 (en) | Composition and methods of RNAi therapeutics for treatment of cancer and other neovascularization diseases | |
| US7893244B2 (en) | Composition and methods of RNAi therapeutics for treatment of cancer and other neovascularization diseases | |
| CN103232531B (zh) | 一种癌细胞靶向性结构分子及其应用 | |
| CN104231050A (zh) | 一种抑制肿瘤转移和治疗白血病的多肽和多肽复合物、其制备方法及其应用 | |
| JP7186721B2 (ja) | Ｉｇｆ－１ｒ阻害のためのｐ－エトキシ核酸 | |
| JP2023052819A (ja) | Ｂｃｌ２阻害のためのｐ－エトキシ核酸 | |
| AU2018254485A1 (en) | P-ethoxy nucleic acids for IGF-1R inhibition | |
| AU2018255352B2 (en) | P-ethoxy nucleic acids for STAT3 inhibition | |
| CN116162595A (zh) | 工程化迁移体及其制备方法和用途 | |
| CN114787355A (zh) | 具有血脑屏障穿透能力的肽-核酸复合物及包含该肽-核酸复合物的组合物 | |
| CN116271073A (zh) | 一种靶向β-arrestin2药物抑制剂及其制备方法和应用 | |
| EA044637B1 (ru) | Р-этокси нуклеиновые кислоты для ингибирования bcl2 | |
| EA042663B1 (ru) | Р-этокси нуклеиновые кислоты для ингибирования stat3 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150107 |