CN114787355A - 具有血脑屏障穿透能力的肽-核酸复合物及包含该肽-核酸复合物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有血脑屏障穿透能力的具有新型结构的核酸复合物和包含所述核酸复合物的组合物，并且更具体地涉及其中生物活性核酸与修饰为总体带正电荷的载体肽核酸互补结合的核酸复合物，以及包含所述核酸复合物的用于穿透血脑屏障的组合物。根据本发明的核酸复合物可以以优异的效率穿透血脑屏障，并且尤其是，药物与所述核酸复合物的缀合增加了所述药物的血脑屏障穿透能力，并因此在疾病的治疗或诊断中是非常有用的。

Description

具有血脑屏障穿透能力的肽-核酸复合物及包含该肽-核酸复 合物的组合物
技术领域
本发明涉及具有血脑屏障渗透性的具有新型结构的核酸复合物和包含所述核酸复合物的组合物，并且更具体地涉及其中生物活性核酸和被修饰为具有整体正电荷的载体肽核酸彼此互补结合的核酸复合物，以及包含所述核酸复合物的用于渗透血脑屏障的组合物。
背景技术
血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是一种由脑中血管的内皮细胞与星形胶质细胞之间的紧密连接构成的结构，其进一步加强所述连接，并起到防止血管中的物质通过血管壁容易地到达脑实质内部的作用。因此，许多被开发用于治疗脑疾病的药物的问题在于它们不能很好地穿过血脑屏障。血脑屏障渗透机制尚未阐明，并且即使当中枢神经系统受损时，药物也不能到达中枢神经系统中的靶区域，而尚未开发出有效的治疗方法。
最近，为了促进更安全和更有效地使用药物，不仅适用于药物的剂型，而且有效地将药物递送至体内作为药物目的地的部位的方法也受到关注。特别地，对在需要时有效地将所需量的药物输送到所需位置的药物递送系统(drug delivery system，DDS)的实际应用存在需求。能够通过血脑屏障递送药物的载体的开发也在积极进行中，但是没有开发出能够渗透血脑屏障的DDS。
同时，与传统药物不同，核酸药物抑制靶特异性信使RNA(mRNA)的表达，使得有可能解决其中不可能用靶向蛋白质的传统药物治疗的研究领域(Kole R.等人NatureRev.Drug Discov.2012；11；125-140,Wilson C.等人Curr.Opin.Chem.Bio.2006；10:607-614)。
尽管基于寡核酸的基因表达控制具有优异的效果和多种应用，但为了开发基于核酸的治疗剂，仍有许多障碍需要克服。例如，存在核酸酶等对寡核酸造成损害的风险，并且由于寡核酸的电特性(电荷)和大小，不可能通过被动扩散实现细胞膜渗透。为了解决上述问题，已经努力通过修饰核酸来获得生物稳定性，并且对于修饰的人工核酸，可以增加与靶核酸的亲和力而不损失生物活性。肽核酸(PNA)是一种修饰的人工核酸，其具有与具有互补核苷酸序列的RNA和DNA强烈结合的特性，并且特别地，其对核酸酶具有抗性并且具有高生物稳定性，因此与基于各种寡核苷酸的治疗剂相关的研究正在进行中。然而，这种电中性的肽核酸的缺点在于其难以引入细胞(Joergensen M.等人Oligonucleotides 2011,21；29-37)。由于核酸在用作药物时的性能和优点，因此使用核酸的各种临床试验正在进行中，并且尽管基于核酸的治疗剂的应用日益增加，但用于引入细胞或血脑屏障渗透的载体的使用受到极大限制。此外，单独的寡核酸具有非常低的细胞膜渗透性。特别地，由于DNA或RNA带负电荷，其不能通过细胞的疏水性磷脂双层，因此通过简单扩散或血脑屏障渗透的细胞内递送是困难的。在中枢神经系统中，已经提出了使用病毒载体的方法(韩国专利申请公开号2009-159988)，但是该方法在安全性方面存在问题并且尚未投入实际使用。
因此，开发具有低细胞毒性和低免疫活性的基于非病毒寡核酸的核酸载体的重要性不断增加，因此，正在开发使用阳离子脂质、脂质体、稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)、聚合物和细胞穿透肽的细胞导入技术(Zhi D.等人Bioconjug.Chem.2013,24；487-519，BuyensK.等人J.Control Release,2012,158；362-70，ROSSI,J.J.等人Gene Ther.2006,13:583-584，Yousefi A.等人J.Control Release,2013,170；209-18，Trabulo S.等人Curr.Pharm.Des.2013,19；2895-923)。这样的核酸递送技术通过直接键合赋予功能部分，并且包括形成复合物的步骤，但是具有与脂质体结构的内体逃逸效率和生物毒性相关的问题。有必要改善寡核酸导入功能并解决与生产程序和副作用相关的问题。
在这点上，诸位发明人发现，其中生物活性核酸和被修饰为具有整体正电荷的载体肽核酸彼此互补结合的核酸复合物的细胞渗透性可以得到很大改善，并且使用所述核酸复合物可以非常有效地调节靶基因的表达，并提交了关于具有低细胞毒性和改善的细胞渗透和对生物活性核酸的基因表达控制能力的新核酸构建体的专利(PCT/KR2017/008636)。
因此，诸位发明人对构建体的功能进行了持续的研究，努力开发出具有优异血脑屏障渗透性的核酸复合物，并且已经确定其中生物活性核酸和被修饰为具有整体正电荷的载体肽核酸彼此互补结合的核酸复合物能够以优异的效率穿过血脑屏障，从而完成本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种其中生物活性核酸和被修饰为具有整体正电荷的载体肽核酸彼此互补结合的核酸复合物，一种包含所述核酸复合物的用于渗透血脑屏障的组合物，以及一种使用所述核酸复合物治疗和诊断疾病的组合物。
本发明的另一目的是提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用根据本发明的具有血脑屏障渗透性的核酸复合物和/或包含所述核酸复合物的组合物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于血脑屏障渗透的组合物，其包含具有以下结构式(1)的结构的核酸复合物：
[结构式(1)]
[A≡C(+)]
其中结构式(1)，
A表示具有能够与靶基因或靶基因序列结合的序列的生物活性核酸，
C表示能够与所述生物活性核酸结合的载体肽核酸；
“≡”表示所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的互补结合，
由A表示的生物活性核酸是肽核酸并且具有整体负电荷，
由C(+)表示的载体肽核酸具有整体正电荷，
由A≡C(+)表示的结构式(1)的核酸复合物具有整体正电荷，以及
所述载体肽核酸包含至少一个γ-或α-主链修饰的肽核酸单体，使得所述载体肽核酸具有整体正电荷，且所述γ-或α-主链修饰的肽核酸单体包含比具有带负电荷的氨基酸的单体的数量更多的具有带正电荷的氨基酸的单体，因此所述载体肽核酸具有整体正电荷。
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗疾病的药物组合物，其包含具有结构式(1)的结构的核酸复合物。
此外，本发明提供了一种用于诊断疾病的组合物或试剂盒，其包含具有结构式(1)的结构的核酸复合物。
此外，本发明提供了一种治疗疾病的方法，其包括向需要治疗的患者施用具有结构式(1)的结构的核酸复合物和/或包含所述核酸复合物的药物组合物。
此外，本发明提供了具有结构式(1)的结构的核酸复合物和/或包含所述核酸复合物的药物组合物用于预防或治疗疾病的用途。
此外，本发明提供了具有结构式(1)的结构的核酸复合物和/或包含所述核酸复合物的药物组合物在制造用于预防或治疗疾病的药物中的应用。
此外，本发明提供了具有结构式(1)的结构的核酸复合物和/或包含所述核酸复合物的药物组合物在制造用于预防或治疗疾病的药物中的用途。
附图说明
图1a示出了在施用核酸复合物后第1天对作为脑组织前区的前额皮质、侧脑室和室旁核的共聚焦显微术分析的结果。
图1b示出了在施用核酸复合物后第1天对作为脑组织后区的海马体、中脑和小脑的共聚焦显微术分析的结果。
图1c示出了在施用核酸复合物后第3天对作为脑组织前区的前额皮质、侧脑室和室旁核的共聚焦显微术分析的结果。
图1d示出了在施用核酸复合物后第3天对作为脑组织后区的海马体、中脑和小脑的共聚焦显微术分析的结果。
图2a示出了在施用核酸复合物后第1天在脑的每个组织中荧光表达分布的比较结果。
图2b示出了在施用核酸复合物后第3天在脑的每个组织中荧光表达分布的比较结果。
图3a示出了在施用包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物后第1天对作为脑组织前区的前额皮质、侧脑室和室旁核的共聚焦显微术分析的结果。
图3b示出了在施用包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物后第1天对作为脑组织后区的海马体、中脑和小脑的共聚焦显微术分析的结果。
图3c示出了在施用包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物后第3天对作为脑组织前区的前额皮质、侧脑室和室旁核的共聚焦显微术分析的结果。
图3d示出了在施用包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物后第3天对作为脑组织后区的海马体、中脑和小脑的共聚焦显微术分析的结果。
图4a示出了在施用包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物后第1天在脑的每个组织中荧光表达分布的比较结果。
图4b示出了在施用包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物后第3天在脑的每个组织中荧光表达分布的比较结果。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。一般来说，本文所用的命名法是本领域熟知的，并且是典型的。
本发明的一个方面涉及一种用于渗透血脑屏障的组合物，其包含具有以下结构式(1)的结构的核酸复合物。
[结构式(1)]
[A≡C(+)]
在结构式(1)中，
A表示具有能够与靶基因或靶基因序列结合的序列的生物活性核酸，
C表示能够与所述生物活性核酸结合的载体肽核酸，
“≡”表示所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的互补结合，
由A表示的生物活性核酸是肽核酸并且具有整体负电荷，
由C(+)表示的载体肽核酸具有整体正电荷，
由A≡C(+)表示的结构式(1)的核酸复合物具有整体正电荷，以及
所述载体肽核酸包含至少一个γ-或α-主链修饰的肽核酸单体，使得所述载体肽核酸具有整体正电荷，且所述γ-或α-主链修饰的肽核酸单体包含比具有带负电荷的氨基酸的单体的数量更多的具有带正电荷的氨基酸的单体，因此所述载体肽核酸具有整体正电荷。
在本发明中，生物活性核酸或载体肽核酸可以包含促进内体逃逸的物质，所述物质另外结合到每个核酸的5'末端或3'末端。具体地，核酸复合物还包含促进生物活性核酸和载体肽核酸的内体逃逸的物质，因此具有以下结构式(2)的结构。
结构式(2)
[mA≡mC(+)]
在结构式(2)中，
“m”表示促进生物活性核酸和载体肽核酸的内体逃逸的物质。
在本发明中，“促进内体逃逸的物质”通过增加内体内的渗透压或使内体膜不稳定而促进生物活性核酸从内体逃逸。这意味着生物活性核酸更有效且更快速地移动到细胞核或细胞质中，以接触并作用于靶基因(D.W.Pack,A.S.Hoffman,S.Pun,P.S.Stayton,“Design and development of polymers for gene delivery,”Nat.Rev.Drug.Discov.,4,581-593(2005))。
在本发明中，促进内体逃逸的物质是选自以下的至少一种：肽、脂质纳米颗粒、复合物纳米颗粒(polyplex nanoparticle)、聚合物纳米球、无机纳米颗粒、阳离子脂质基纳米颗粒、阳离子聚合物和pH敏感性聚合物。
在本发明中，作为促进内体逃逸的物质，具有GLFDIIKKIAESF(SEQ ID NO:5)序列的肽可通过接头与生物活性核酸连接，并且组氨酸(10)可通过接头与载体肽核酸连接，但本发明不限于此。
在本发明中，脂质纳米颗粒可以选自脂质、磷脂、棕榈酸鲸蜡酯、泊洛沙姆18、吐温85、三硬脂酸甘油酯和吐温80。
在本发明中，复合物纳米颗粒可以是聚(酰胺基胺)或聚乙烯亚胺(PEI)。
在本发明中，聚合物纳米球可以选自聚己内酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(d,l-丙交酯)、壳聚糖和PLGA-聚乙二醇。
在本发明中，无机纳米颗粒可选自Fe2O3、Fe3O4、WO3和WO2.9。
在本发明中，阳离子脂质基纳米颗粒可选自1-(氨基乙基)亚氨基双[N-(油酸半胱氨酰-1-氨基-乙基)丙酰胺]、PTA的N-烷基化衍生物和3,5-双十二烷氧基苯甲脒。
在本发明中，阳离子聚合物可选自乙烯基吡咯烷酮-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸共聚物硫酸二乙酯、聚异丁烯和聚(N-乙烯基咔唑)。
在本发明中，pH敏感性聚合物可以选自多酸、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)和水解的聚丙烯酰胺。
在本发明中，“生物活性核酸”是具有能够结合其表达有待降低的目的靶基因的互补序列、特别是能够结合目的靶基因的mRNA的互补序列的核酸，或是包含促进待表达的靶基因表达的序列的核酸。它是指参与基因表达控制如抑制或促进目的基因表达的核酸。生物活性核酸可以是具有与其表达有待降低或增加的靶基因互补的序列的核酸，或是具有与单链RNA序列如前体mRNA、miRNA、mRNA等互补的序列的核酸。
特别地，本发明中的“生物活性核酸”在体外或体内结合靶基因和包含所述靶基因的核苷酸序列，并因此激活或抑制基因的内在功能(例如转录物表达或蛋白质表达)，或调节前体mRNA的剪接(例如外显子跳跃)。核苷酸序列可以是基因调节序列、基因编码序列或剪接调节序列。基因调节序列可以选自启动子、转录增强子、5'非翻译区、3'非翻译区、病毒包装序列和选择标记物。基因编码序列可以是外显子或内含子，并且可以位于距离基因转录起始位点(例如起始位点的上游或下游)10、5、3或1kb或500、300或200bp内。此外，剪接调节序列可包括与外显子跳跃、隐蔽剪接、假剪接位点激活、内含子保留或选择性剪接失调相关的序列。
在本发明中，“载体肽核酸”是其中一些或所有碱基与生物活性核酸互补结合从而赋予其功能的核酸，并且如本文所用的载体肽核酸可包括肽核酸(PNA)和与其类似的修饰核酸，优选肽核酸，但本发明不限于此。
在本发明中，“核酸复合物”使得生物活性材料能够穿透到体内，最终进入细胞，并且特别地具有将生物活性物质递送通过血脑屏障进入体内的能力。
在本发明中，生物活性核酸和载体肽核酸各自包含2至50、优选5至30、更优选10至25、并且最优选15至17个核酸单体。
此外，生物活性核酸可由天然核碱基和/或修饰的核酸单体构成，并且载体肽核酸可由其中部分或全部核苷酸序列与生物活性核酸互补的序列构成。
特别地，载体肽核酸可以包含至少一个通用碱基，并且载体肽核酸可以仅由通用碱基构成。
在本发明中，生物活性核酸可以选自DNA、RNA、修饰的核酸(如PNA(肽核酸)、PMO(磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸)、LNA(锁核酸)、GNA(乙二醇核酸)和TNA(苏糖核酸))、反义寡核苷酸、适配体、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)、核酶和DNA酶，并且生物活性核酸优选选自DNA、RNA和修饰的核酸(如PNA(肽核酸)、PMO(磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸)、LNA(锁核酸)、GNA(乙二醇核酸)和TNA(苏糖核酸))。
在本发明中，当用于生物活性核酸的单体是PNA时，生物活性核酸被称为生物活性肽核酸，而当使用其他单体时，它们以相同的方式提及。
在本发明中，生物活性核酸和载体肽核酸可以进一步包含至少一个选自磷酸二酯、2'O-甲基、2'甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯和硫代磷酸酯的官能团。
在本发明中，载体肽核酸可由其中部分或全部核苷酸序列与生物活性核酸互补的序列构成。特别地，载体肽核酸可以包含至少一个通用碱基，并且载体肽核酸可以仅由通用碱基构成。
在本发明中，核酸复合物中的生物活性核酸和载体肽核酸各自在电特性方面可以具有整体正电荷(阳离子)、负电荷(阴离子)或不带电荷(中性)。
当表示电特性时使用的术语“整体”是指从外部角度看整个生物活性核酸或载体肽核酸的总体电特性，而不是单个碱基的电特性。例如，即使生物活性核酸中的一些单体是带正电荷的，当带负电荷的单体的数量较大时，考虑“整体”电特性时生物活性核酸是带负电荷的，并且即使载体肽核酸中的一些碱基和/或主链是带负电荷的，当带正电荷的碱基和/或主链的数量较大时，考虑“整体”电特性时载体肽核酸是带正电荷的。
因此，本发明的核酸复合物可以具有整体正电荷。在核酸复合物中，优选的是，在查看整体电特性时生物活性核酸带负电荷，并且在查看整体电特性时载体肽核酸带正电荷，但本发明不限于此。
在本发明中，生物活性核酸和载体肽核酸的电特性可以使用修饰的肽核酸单体来赋予，并且修饰的肽核酸单体可以包含选自赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物的至少一种带正电荷的氨基酸作为带正电荷的载体肽核酸，并且可以包含带负电荷的氨基酸如谷氨酸(Glu，E)或带负电荷的氨基酸类似物作为带负电荷的载体肽核酸。
在本发明中，载体肽核酸可以包含至少一个γ-或α-主链修饰的肽核酸单体，使得所述载体肽核酸具有整体正电荷。
γ-或α-主链修饰的肽核酸单体可以在其主链中包含至少一个选自赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物的带正电荷的氨基酸，以获得正电荷。
在本发明中，除主链修饰外，还可使用核碱基修饰的肽核酸单体对肽核酸单体进行修饰以使其带电荷。优选地，在核碱基中包括胺、三唑或咪唑部分以获得正电荷，或在碱基中包括羧酸以获得负电荷。
在本发明中，载体肽核酸的修饰的肽核酸单体可以进一步在主链或核碱基中包含负电荷，但是修饰的肽核酸单体优选包含比带负电荷的单体数量更多的带正电荷的单体，因此载体肽核酸具有整体正电荷。
优选地，根据本发明的核酸复合物具有整体正电荷。
在根据本发明的核酸复合物中，至少一种选自疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适配体和荧光/发光标记的物质可以与生物活性核酸和/或载体肽核酸结合，并且优选地，至少一种选自疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适配体和用于成像的荧光/发光标记的物质与载体肽核酸结合。
在本发明中，至少一种选自疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适配体、淬灭剂、荧光标记和发光标记的物质可通过简单的共价键合或接头介导的共价键合与生物活性核酸和/或载体肽核酸结合，但本发明不限于此。优选地，与核酸载体结合的细胞渗透性、溶解度、稳定性、转运和成像相关物质(例如疏水部分等)独立于控制靶基因表达的生物活性核酸而存在。
在本发明中，如上所述，生物活性核酸和载体肽核酸的互补结合形式主要基于反平行结合或平行结合。互补结合形式被配置为使得生物活性核酸在靶序列(与生物活性核酸互补的序列)的存在下释放。
反平行结合和平行结合是根据DNA-DNA或DNA-PNA结合模式中的5'方向和3'方向确定的。反平行结合是DNA-DNA或DNA-PNA结合的典型方法。以根据本发明的核酸复合物为例，5'至3'方向的生物活性核酸和3'至5'方向的载体肽核酸彼此结合。平行结合是其中结合亲和力稍微低于反平行结合的结合形式，并且生物活性核酸和载体肽核酸二者以5'至3'方向或3'至5'方向彼此结合。
在根据本发明的核酸复合物中，优选的是，生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合亲和力低于生物活性核酸与生物活性核酸所靶向的基因(特别是靶基因的mRNA)之间的结合亲和力。结合亲和力是基于解链温度Tm确定的。
使生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度，Tm)低于生物活性核酸与生物活性核酸所靶向的基因(特别是靶基因的mRNA)之间的结合亲和力的具体方法的例子可包括生物活性核酸与载体肽核酸的平行结合或部分特异性结合，但本发明不限于此。
在另一个例子中，载体肽核酸可以包含至少一个选自以下的肽核碱基：接头、通用碱基和具有与生物活性核酸的相应碱基不互补的碱基的肽核碱基，但本发明不限于此。
在本发明中，通用碱基是与天然碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶无选择性地且以低于互补结合亲和力的结合亲和力配对的碱基，并且是选自肌苷PNA、吲哚PNA、硝基吲哚PNA和脱碱基PNA中的至少一种，优选肌苷PNA。
在本发明中，提供了核酸的结合形式和电特性的组合以控制核酸复合物的功能，并且核酸的结合形式和电特性的组合使得能够控制粒度和作用时间，并改善细胞渗透性、溶解度和特异性。
在本发明中，可以通过调节生物活性肽核酸与载体肽核酸之间的结合亲和力来控制在靶基因的存在下生物活性肽核酸与靶序列结合的时间点(生物活性核酸的链置换到靶序列的时间点，以及生物活性核酸的靶标特异性释放和结合的时间点)。
在根据本发明的核酸复合物中，生物活性核酸的链置换到靶基因的时间点和生物活性核酸的靶标特异性释放和结合的时间点可以通过改变用于复合物的非特异性结合的载体肽核酸的非特异性碱基、通用碱基和接头的存在、数量和位置来控制。可以通过上述条件和肽复合物的互补结合形式(如平行结合或反平行结合)的组合进行控制。
本发明的另一方面涉及用于诊断或治疗疾病的组合物，其包含具有以下结构式(1)的结构并具有血脑屏障渗透性的核酸复合物。
[结构式(1)]
[A≡C(+)]
在结构式(1)中，
A表示具有能够与靶基因或靶基因序列结合的序列的生物活性核酸，
C表示能够与所述生物活性核酸结合的载体肽核酸；
“≡”表示所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的互补结合，
由A表示的生物活性核酸是肽核酸并且具有整体负电荷，
由C(+)表示的载体肽核酸具有整体正电荷，
由A≡C(+)表示的结构式(1)的核酸复合物具有整体正电荷，以及
所述载体肽核酸包含至少一个γ-或α-主链修饰的肽核酸单体，使得所述载体肽核酸具有整体正电荷，且所述γ-或α-主链修饰的肽核酸单体包含比具有带负电荷的氨基酸的单体的数量更多的具有带正电荷的氨基酸的单体，因此所述载体肽核酸具有整体正电荷。
如本文所用，术语“血脑屏障”和“BBB”可互换使用，并且用于指当血管穿行过脑组织时存在于血管中的可渗透屏障，其紧密调节并严格限制血液与脑组织之间的交换。血脑屏障的组分包括形成所有血管最深内层的内皮细胞、与BBB在结构上相关的相邻内皮细胞之间的紧密连接、内皮细胞的基底膜、和附近星形胶质细胞的扩展足突(其覆盖几乎所有暴露的血管外表面)。BBB防止血液中的大多数物质，例如大多数大分子(如Ig、抗体、补体、白蛋白和药物)以及小分子进入脑组织。
如本文所用，术语“疾病”和“障碍”可互换使用，并且是指身体状况或一些器官中妨碍或破坏功能的表现和/或引起诸如不适、功能障碍、痛苦等症状，或甚至杀死受折磨的人或引起与其接触的人死亡的任何变化。
在本发明中，生物活性核酸可以包含用于治疗或诊断疾病的物质，所述物质另外结合到所述核酸的5'末端或3'末端。
在本发明中，另外结合的物质可以包含活性剂。活性剂可以是已知不穿过血脑屏障的物质，或者它可以是不能渗透血脑屏障的物质。并且，活性剂可以是仅以少量渗透血脑屏障并因此在不存在渗透助剂的情况下不能以有效量被递送的物质。
活性剂可以是药物活性剂、诊断活性剂或其组合。
可以与本发明的生物活性核酸连接的用于治疗脑疾病的物质可以不受限制地使用，只要它常规用于治疗这样的疾病即可。它可包括例如神经保护剂，如NMDA(N-甲基-d-天冬氨酸)受体抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、抗淀粉样蛋白剂等，其例子可包括多奈哌齐、加兰他敏、他克林、美金刚等。此外，它可以是例如替莫唑胺、含卡莫司汀的格立得植入剂(Gliadel wafer)、美法仑、普瑞巴林、Depakote或甲氨蝶呤。
此外，可与本发明的生物活性核酸连接的用于治疗脑疾病的物质可以不受限制地使用，只要其常规用于治疗脑肿瘤即可，并且在现有抗癌药中，难以穿过血脑屏障的多柔比星、紫杉醇等可与生物活性核酸连接并用于治疗脑肿瘤。
药剂与本发明的生物活性核酸的连接可以通过本领域已知的方法，例如共价键合或接头介导的共价键合进行。为此，必要时，本发明的生物活性核酸可以在不丧失其活性的范围内被化学修饰。
本发明的再另一方面涉及用于诊断脑疾病的组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包含具有结构式(1)的结构并具有血脑屏障渗透性的核酸复合物。
在本发明中，可另外与核酸复合物连接的用于诊断脑疾病的物质可包括造影剂，优选可静脉内施用的血管造影剂，例如碘化物造影剂或钆造影剂。特别地，它更优选是用于脑正电子发射断层摄影术(PET)的放射性示踪剂，如[11C]25B-NBOMe、[18F]阿坦色林、[11C]卡芬太尼、[11C]DASB、[11C]DTBZ或[18F]氟丙基-DTBZ、[11C]ME@HAPTHI、[18F]氟必利(fallypride)、[18F]氟比他班、[18F]氟贝他吡、[18F]或[11C]氟马西尼、[18F]氟美他酚(flutemetamol)、[18F]氟多巴、[18F]去甲氧基氟必利、[18F]麦氟威、[18F]MPPF、[18F]尼芬(nifene)、[11C]雷氯必利、[18F]司托哌隆、[18F]或[11C]N-甲基螺环哌啶酮、[11C]维拉帕米、匹兹堡化合物B、18F-THK5105、18F-THK5117、和18F-THK5351。
本发明的又另一方面涉及用于预防或治疗脑疾病的药物组合物，其包含具有结构式(1)的结构并具有血脑屏障渗透性的核酸复合物。
本发明的再又另一方面涉及一种预防或治疗脑疾病的方法，其包括向受试者施用具有结构式(1)的结构并具有血脑屏障渗透性的核酸复合物。
本发明的另一方面涉及具有结构式(1)的结构并具有血脑屏障渗透性的核酸复合物在制造用于预防或治疗脑疾病的药物中的用途。
在本发明中，所述疾病优选是脑疾病，但不限于此。
在本发明中，所述脑疾病优选选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、卢·格里克氏症、克罗伊茨费尔特-雅各布病、尼曼-皮克病、中风、麻痹、痴呆、血栓形成、栓塞、短暂性脑缺血发作、小动脉闭塞、脑出血、脑梗死、头部损伤、脑循环代谢紊乱、脑功能性昏迷、脑癌和脑肿瘤，但不限于此。
在本发明中，术语“用于治疗的组合物”可以与“药物组合物”互换使用，并且所述组合物包含本发明的核酸复合物作为活性成分，所述核酸复合物包含生物活性核酸和与所述核酸结合的载体肽核酸，并且可以采取其中用于治疗靶疾病的治疗性药物另外与所述核酸复合物结合的形式。
根据本发明的用于治疗的组合物可以根据标准药学实践配制成有待被递送通过血脑屏障的剂型。除了活性成分之外，这些配制品还可以包含添加剂，如适合于药学上可接受形式的配制品的载体、赋形剂、佐剂或稀释剂。
术语“药学上可接受的”是指不损害化合物的生物活性或特性的特性。
术语“载体”定义为促进将核酸复合物添加到细胞或组织中的化合物。例如，二甲亚砜(DMSO)是常用的载体，其促进将许多有机化合物引入活生物体的细胞或组织中。
术语“稀释剂”定义为使目的化合物的生物活性形式稳定并且也在溶解所述化合物的水中稀释的化合物。溶解在缓冲溶液中的盐在本领域中用作稀释剂。常用的缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水，因为它模拟人体液的盐度。由于缓冲盐可以在低浓度下控制溶液的pH，因此缓冲稀释剂很少改变化合物的生物活性。
包含根据本发明的核酸复合物的物质可以作为单独的药物组合物或与其他活性成分组合(如在组合疗法中)或与合适的载体或赋形剂组合施用于患者。
适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效实现其预期目的的量的活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量是有效延长待治疗的受试者的寿命或有效预防、减轻或减轻疾病症状的化合物的量。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
如本文所用，术语“预防”是指通过施用用于治疗的包含核酸复合物的组合物来预防疾病发作或抑制其进展的任何动作。
如本文所用，术语“改善”是指通过施用用于治疗的包含核酸复合物的组合物来至少降低与待治疗疾病的状态相关的参数(例如症状的程度)的任何动作。
如本文所用，术语“治疗”是指通过施用用于治疗的包含核酸复合物的组合物来改善或消除疾病症状的任何动作。
可以将包含根据本发明的核酸复合物的组合物以药学有效量应用以治疗脑疾病或抑制(或减轻)脑疾病的症状。药物有效量可以根据以下各种因素而变化，如脑疾病的类型、患者的年龄和体重、症状的特征和程度、当前施用的疗法、疗法类型的数量、施用的形式和途径等，并且可以由本领域的专家容易地确定。可以将本发明的组合物与上述药理学或生理学组分一起应用或依序应用，并且还可以与另外的常规治疗剂组合应用，或者可以与常规治疗剂依序或同时应用。这些应用可以执行一次或多次。
在本发明中，“受试者”是指患有病症或疾病或处于患上病症或疾病的风险中的哺乳动物，优选人，所述病症或疾病可通过施用根据本发明的核酸复合物来减轻、抑制或治疗。
此外，用于人体的本发明化合物的剂量可以根据患者的年龄、体重和性别、剂型、健康状况和疾病的严重程度而变化，并且基于体重为70kg的成人患者，通常可以将所述化合物以0.001至1,000mg/天，并且优选0.01至500mg/天的剂量施用，并且可以根据医生或药剂师的判断以规则的时间间隔一天施用一次或一天施用数次。
可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中估计包含如本文所述的核酸复合物的组合物的毒性和治疗功效，以便确定例如LD50(使50％群体致死的剂量)、ED50(对50％群体具有治疗效果的剂量)或IC50(对50％群体具有治疗抑制作用的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD50和ED50(或IC50)之间的比率。展现出高治疗指数的化合物是优选的。从细胞培养测定获得的数据可用于估计用于人类的剂量范围。这些化合物的剂量优选落在包括ED50(或IC50)而毒性很小或没有毒性的循环浓度范围内。
如本文所用，术语“施用(administering)”或“施用(administration)”是指通过任何合适的方法将本发明的药物组合物引入受试者的动作，并且施用途径可以变化，并且可以是口服或肠胃外的，只要所述药物组合物能够到达靶组织即可。
可以将本发明的药物组合物以药物有效量施用。在本发明中，术语“药物有效量”是足以以适用于医学治疗或预防的合理益处/风险比治疗或预防疾病的量，并且有效剂量水平可取决于以下因素来确定，所述因素包括疾病的严重程度、药物活性、患者的年龄、体重、健康状况、性别和药物敏感性、本发明组合物的施用时间、施用途径、排泄率、治疗持续时间和与本发明组合物组合或同时使用的药物、以及医学领域熟知的其他因素。
可以将根据本发明的药物组合物作为单独的治疗剂或与其他治疗剂组合施用，可以与常规治疗剂依序或同时施用，并且可以施用一次或多次。考虑到所有上述因素，重要的是以能够获得最大效果而没有副作用的最小量施用组合物。
本发明的药物组合物的剂量可以由本领域技术人员考虑使用目的、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别和疾病史、或用作活性成分的物质的类型来确定。例如，可以将本发明的药物组合物在一天内以10至100mg/kg，优选地10至30mg/kg的量施用于包括人在内的哺乳动物。本发明的组合物的剂量可分成多剂量以实现每天1至3次或每天数次的施用频率，但不特别限于此。
在下文中，将参考实施例对本发明进行更详细的描述。对于本领域技术人员而言将明显的是，这些实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不受限于这些实施例。
实施例1：生物活性核酸、载体肽核酸及使用二者产生复合物
在本发明中，为了评价核酸复合物对血脑屏障渗透性的影响，使用生物活性核酸(反义PNA)和载体核酸(载体PNA)的复合物，在所述生物活性核酸中血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸(反义PNA)用甲氨蝶呤(MTX)和荧光物质(cy3)标记。已知甲氨蝶呤(MTX)穿过血脑屏障，但它是具有非常低的生物利用度的脑疾病治疗剂。甲氨蝶呤具有低生物利用度，但是能够渗透血脑屏障，因此用作脑肿瘤的治疗剂，使得可以评价由于核酸复合物而增加其血脑屏障渗透性的效果。在阳性对照组中，使用其中甲氨蝶呤仅用荧光材料标记的合成材料。
本实施例中使用的基于PNA的生物活性核酸和载体肽核酸的核苷酸序列、单体修饰和结构如下表1所示。
本发明中使用的所有肽核酸均由Panagene(Korea)通过HPLC纯化合成。
用于本发明的生物活性肽核酸和载体肽核酸的序列信息如下表1所示。
[表1]
用于确认血脑屏障渗透性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
Figure BDA0003664532000000101
(化合物＝MTX)
进行用于赋予电特性的单体修饰，使得通过在肽核酸的主链中包括赖氨酸(Lys，K，(+))以获得正电荷和包括谷氨酸(Glu，E，(-))以获得负电荷来构建修饰的肽主链。
生物活性核酸和载体肽核酸在DMSO下杂交，并且结果是，构建了由生物活性核酸和载体肽核酸构成的复合物。
实施例2：使用核酸复合物分析血脑屏障渗透性
使用根据实施例1构建成具有下表2所示结构的核酸复合物在小鼠模型中分析核酸复合物的血脑屏障渗透性。
实施例2-1：向动物模型施用生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物
为了确认核酸复合物的血脑屏障渗透性，购买6周龄雄性ICR小鼠(OrientBio，韩国)并适应1周，然后将核酸复合物以20mg/kg(n＝6)施用于其尾静脉。在阳性对照组(n＝6)中，向尾静脉施用荧光物质标记的甲氨蝶呤，而在阴性对照组(n＝6)中，将与实验组相同浓度的DMSO用盐水稀释，并通过相同途径施用。
本实施例中使用的核酸复合物组合示于下表2中。
[表2]
用于在动物模型中确认血脑屏障渗透的核酸复合物组合
分类 核酸复合物
POLIGO<sup>TM</sup>_1 SEQ ID NO:1和2
实施例2-2：动物模型中脑组织的分离与分析
实验在实施例2-1的条件下进行，并在第1天和第3天分别观察实验组和对照组中的组织。通过腹膜内施用阿佛丁(5mg/kg)麻醉小鼠模型，随后通过用盐水和4％多聚甲醛灌注来洗涤和固定脑组织。分离固定的脑组织并通过将其置于30％糖水中脱水24小时，然后使用OCT进行包埋过程。将脑组织的整个区域冷冻切片成30μm切片。为了观察从大脑皮质到脑干的整个脑组织，将组织广泛地分成总共六个区域，即前额皮质、侧脑室、室旁核、海马体、中脑和小脑，并固定在载玻片上，并且将细胞核用DAPI染色15分钟，然后使用共聚焦显微镜进行分析。
当静脉内施用药物时，药物通过血液进入脑组织的循环路径通常随时间从脑后部朝前部扩散。因此，为了确定所施用的物质是否通过本系统扩散，将脑组织从前到后分为六个主要区域并进行分析。此外，为了观察随时间的扩散程度，在第1天和第3天分别观察各组，并分析其数值。
如图1所示，确认了cy3的荧光表达出现在施用核酸复合物的实验组中，其与仅施用已知穿过血脑屏障的甲氨蝶呤的组相比显示出高荧光表达。因此，确认了甲氨蝶呤的血脑屏障渗透性和生物利用度由于核酸复合物而增加。
当在第1天和第3天分别观察各组并分析其数值时，在第1天，确定在作为脑组织后区的中脑和小脑中核酸复合物的荧光值(图1b)高于在作为脑组织前区的前额皮质和室旁核中核酸复合物的荧光值(图1a)，并且在第3天，确认荧光扩散到作为脑组织前区的前额皮质，因此荧光表达高(图1c和图1d)。因此，确认核酸复合物沿血管循环系统和脑组织区域渗透和扩散。
然后，对于施用核酸复合物的所有实验组，根据施用日期对组织中的荧光分布进行数值分析，并比较施用核酸复合物后在脑的每个组织中的荧光表达分布。
结果是，在第1天，在各种脑区域中，核酸复合物的荧光表达分布被确定为在作为脑后区的中脑和小脑中是高的(图2a)。发现与仅施用MTX的阳性对照组相比，施用核酸复合物的组中整个脑中的荧光值增加了约2至3倍。在第3天，在脑区域中，荧光表达分布被确定为甚至在作为脑前区的前额皮质中是高的(图2b)。与第1天的结果一样，确认了施用核酸复合物的组的荧光值是仅施用MTX的阳性对照组的约1.5至2倍。此外，确认在所有脑组织区域中，第3天的荧光表达高于第1天的荧光表达。通过对荧光强度进行数值分析，提高了实验结果的准确性。
实施例3：包含促进内体逃逸的物质的生物活性肽核酸和载体肽核酸以及使用二者产生复合物
在本发明中，为了评价核酸复合物对血脑屏障渗透性的影响，构建并使用了包含促进内体逃逸的物质的生物活性核酸(反义PNA)和包含促进内体逃逸的物质的载体核酸(载体PNA)的复合物，在所述生物活性核酸中血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸(反义PNA)用苯丁酸氮芥和荧光物质(cy3)标记。苯丁酸氮芥是已知不能穿过血脑屏障的药物。
本实施例中使用的基于PNA的生物活性核酸和载体肽核酸的核苷酸序列、单体修饰和结构如下表3所示。
本发明中使用的所有肽核酸均由Panagene(Korea)通过HPLC纯化合成。
用于本发明的生物活性肽核酸和载体肽核酸的序列信息如下表3所示。
[表3]
用于确认血脑屏障渗透性的包含促进内体逃逸的物质的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
Figure BDA0003664532000000121
(化合物＝苯丁酸氮芥)
进行用于赋予电特性的单体修饰，使得通过在肽核酸的主链中包括赖氨酸(Lys，K，(+))以获得正电荷和包括谷氨酸(Glu，E，(-))以获得负电荷来构建修饰的肽主链。
生物活性核酸和载体肽核酸在DMSO下杂交，并且结果是，构建了由生物活性核酸和载体肽核酸构成的复合物。
实施例4：使用包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物分析血脑屏障渗透性
使用根据实施例3构建成具有下表4所示结构的核酸复合物在小鼠模型中分析核酸复合物的血脑屏障渗透性。
实施例4-1：向动物模型施用生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物
为了确认包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物的血脑屏障渗透性，购买6周龄雄性ICR小鼠(OrientBio，韩国)并适应1周，然后将核酸复合物以20mg/kg(n＝6)施用于其尾静脉。在对照组(n＝2)中，将与实验组相同浓度的DMSO用盐水稀释，并施用于尾静脉。
本实施例中使用的核酸复合物组合示于下表4中。
[表4]
用于在动物模型中确认血脑屏障渗透的包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物组合
分类 核酸复合物
POLIGO<sup>TM</sup>_2 SEQ ID NO:3和4
实施例4-2：动物模型中脑组织的分离与分析
实验在实施例4-1的条件下进行，并在第1天和第3天分别观察实验组和对照组中的组织。通过腹膜内施用阿佛丁(5mg/kg)麻醉小鼠模型，随后通过用盐水和4％多聚甲醛灌注来洗涤和固定脑组织。分离固定的脑组织并通过将其置于30％糖水中脱水24小时，然后使用OCT进行包埋过程。将脑组织的整个区域冷冻切片成30μm切片。为了观察从大脑皮质到脑干的整个脑组织，将组织广泛地分成总共六个区域，即前额皮质、侧脑室、室旁核、海马体、中脑和小脑，并固定在载玻片上，并且将细胞核用DAPI染色15分钟，然后使用共聚焦显微镜进行分析。
当静脉内施用药物时，药物通过血液进入脑组织的循环路径通常随时间从脑后部朝前部扩散。因此，为了确定所施用的物质是否通过本系统扩散，将脑组织从前到后分为六个主要区域并进行分析。此外，为了观察随时间的扩散程度，在第1天和第3天分别观察各组，并分析其数值。
如图3所示，确认了cy3的荧光表达出现在施用包含促进内体逃逸的物质的核酸复合物的实验组中，表明不能穿过血脑屏障的常规药物尽管被标记也由于核酸复合物而成功地渗透脑。
此外，当在第1天和第3天分别观察各组并分析其数值时，在第1天，确定在作为脑组织后区的中脑和小脑中的核酸复合物的荧光值(图3b)高于在作为脑组织前区的前额皮质和侧脑室中的核酸复合物的荧光值(图3a)。在第3天，与第1天相比，荧光值被确定为甚至在作为前区的前额皮质中是高的(图3c)，但是荧光值在作为脑后区的中脑和小脑中显著降低(图3d)。由此，确认核酸复合物沿血管循环系统和脑组织区域渗透和扩散。
然后，对于施用核酸复合物的所有实验组，根据施用日期对组织中的荧光分布进行数值分析，并比较施用核酸复合物后在脑的每个组织中的荧光表达分布。
结果是，在第1天，在各种脑区域中，核酸复合物的荧光表达分布被确定为在作为脑后区的中脑和小脑中是高的。当对这些结果进行数值分析时，发现与对照组相比，施用核酸复合物的组中脑前区的荧光值增加了2或3倍，脑后区的荧光值最大增加了10倍(图4a)。在第3天，在脑区域中，荧光表达分布被确定为甚至在作为脑前区的前额皮质中是高的。当对这些结果进行数值分析和比较时，发现与对照组相比，施用核酸复合物的组中脑前区的荧光值增加了至少10倍，脑后区的荧光值增加了2.5倍(图4b)。通过对荧光强度进行数值分析，改善了实验结果的准确性。
实用性
根据本发明的其中生物活性核酸和被修饰为具有整体正电荷的载体肽核酸彼此互补结合的核酸复合物能够以优异的效率穿过血脑屏障。特别地，当药物与核酸复合物结合时，药物的血脑屏障渗透性增加，因此本发明对于疾病的治疗或诊断是非常有用的。
尽管已在上文详细地公开了本发明的具体实施方案，但是对于本领域的普通技术人员将显而易见的是描述仅仅是优选的示例性实施方案，而不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围应由所附权利要求及其等同物限定。
序列表自由文本
附有电子文件。
<110> 海阳制药
<120> 具有血脑屏障穿透能力的肽-核酸复合物及包含该肽-核酸复合物的组合物
<130> PP-B2459
<150> KR 2019-0128465
<151> 2020-10-16
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物活性核酸1
<400> 1
atgattctgc cctcc 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体肽核酸1
<400> 2
tactaagacg ggagg 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物活性核酸
<400> 3
atgattctgc cctcc 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体肽核酸
<400> 4
tactaagacg ggagg 15
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 5
Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe
1 5 10

Claims (22)

1.一种用于渗透血脑屏障的组合物，其包含具有以下结构式(1)的结构的核酸复合物：
[结构式(1)]
[A≡C(+)]
其中结构式(1)，
A表示具有能够与靶基因或靶基因序列结合的序列的生物活性核酸，
C表示能够与所述生物活性核酸结合的载体肽核酸；
“≡”表示所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的互补结合，
由A表示的生物活性核酸是肽核酸并且具有整体负电荷，
由C(+)表示的载体肽核酸具有整体正电荷，
由A≡C(+)表示的结构式(1)的核酸复合物具有整体正电荷，以及
所述载体肽核酸包含至少一个γ-或α-主链修饰的肽核酸单体，使得所述载体肽核酸具有整体正电荷，且所述γ-或α-主链修饰的肽核酸单体包含比具有带负电荷的氨基酸的单体的数量更多的具有带正电荷的氨基酸的单体，因此所述载体肽核酸具有整体正电荷。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物活性核酸或所述载体肽核酸包含促进内体逃逸的物质，所述物质另外结合到每个核酸的5'末端或3'末端。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中促进内体逃逸的所述物质是选自以下的至少一种：肽、脂质纳米颗粒、复合物纳米颗粒、聚合物纳米球、无机纳米颗粒、阳离子脂质基纳米颗粒、阳离子聚合物和pH敏感性聚合物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述肽是GLFDIIKKIAESF(SEQ ID NO:5)或组氨酸(10)。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物活性核酸包含用于治疗或诊断疾病的物质，所述物质另外结合到所述核酸的5'末端或3'末端。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物活性核酸和所述载体肽核酸各自包含2至50个核酸单体。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体肽核酸包含其中部分或全部核苷酸序列与所述生物活性核酸互补的序列。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中包含其中部分核苷酸序列互补的序列的所述载体肽核酸包含至少一个通用碱基。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述带正电荷的氨基酸是选自以下的至少一种：赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述带负电荷的氨基酸是谷氨酸(Glu，E)、天冬氨酸(Asp，D)或氨基酸类似物。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物活性核酸和所述载体肽核酸通过在每个核酸的5'方向和3'方向上平行结合或反平行结合而结合。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度，Tm)低于所述生物活性核酸与所述生物活性核酸所靶向的基因之间的结合亲和力。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述生物活性核酸和所述载体肽核酸通过平行结合或部分特异性结合而结合，所以所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度，Tm)低于所述生物活性核酸与所述生物活性核酸所靶向的基因之间的结合亲和力。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述载体肽核酸具有选自接头、通用碱基和具有与所述生物活性核酸的相应碱基不互补的碱基的肽核碱基的至少一个肽核碱基，所以所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的结合亲和力(解链温度，Tm)低于所述生物活性核酸与所述生物活性核酸所靶向的基因之间的结合亲和力。
15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的分离时间点以及所述生物活性核酸与所述生物活性核酸所靶向的基因之间的结合时间点能够通过调节所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的结合亲和力来控制。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述通用碱基是与包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶的天然碱基无选择性地且以低于互补结合亲和力的结合亲和力配对的碱基，并且是选自肌苷PNA、吲哚PNA、硝基吲哚PNA和脱碱基PNA的至少一种。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一种选自疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适配体、淬灭剂、荧光标记和发光标记的物质与所述生物活性核酸和/或所述载体肽核酸结合。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述至少一种选自疏水部分、亲水部分、靶抗原特异性抗体、适配体、淬灭剂、荧光标记和发光标记的物质通过简单的共价键合或接头介导的共价键合与所述生物活性核酸和/或所述载体肽核酸结合。
19.根据权利要求5所述的组合物，其中所述疾病是脑疾病。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述脑疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、卢·格里克氏症、克罗伊茨费尔特-雅各布病、尼曼-皮克病、中风、麻痹、痴呆、血栓形成、栓塞、短暂性脑缺血发作、小动脉闭塞、脑出血、脑梗死、头部损伤、脑循环代谢紊乱、脑功能性昏迷、脑癌和脑肿瘤。
21.根据权利要求19所述的组合物，其是用于预防或治疗所述脑疾病的药物组合物。
22.根据权利要求19所述的组合物，其是用于诊断所述脑疾病的组合物。
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