CN104968359A

CN104968359A - 用于血脑屏障运输的多肽

Info

Publication number: CN104968359A
Application number: CN201380069981.9A
Authority: CN
Inventors: 萨尔瓦多·博罗斯戈麦斯; 弗兰塞斯克·哈维尔·里韦罗蒙索; 安娜·卡斯坎特西雷拉
Original assignee: SAGETIS BIOTECH SL
Current assignee: SAGETIS BIOTECH SL
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-10-07
Also published as: WO2014076655A1; AR093479A1; AU2013346420A1; RU2015122666A; HK1213789A1; US20150376237A1; JP2016539076A; MX2015005948A; EP2919798A1; TW201427994A; KR20150100655A; GB201220474D0; CA2890704A1

Abstract

本发明提供穿过血脑屏障(BBB)的多肽。因此，这些多肽是BBB运输剂。这些多肽在单独或与治疗剂或诊断剂偶合时通常能够以治疗上或诊断上有用或生理上显著的有效量穿过该BBB。

Description

用于血脑屏障运输的多肽

技术领域

本发明是关于试剂至脑的递送。更具体而言，本发明是关于可穿过血脑屏障(BBB)的多肽及其在穿过BBB运输试剂中、通常在治疗和/或诊断神经疾病中的用途。

背景技术

BBB通过限制诸如细菌及大分子或亲水性分子等微观物体进入大脑组织中来起极有效保护脑的作用。此在研发靶向中枢神经系统的药物时是所需考虑的主要问题。为到达大脑组织中的靶细胞，经外周施用的药物必须能够藉助自身或通过使用载体作为运输系统穿过BBB。BBB阻碍许多潜在的重要诊断及治疗剂递送至脑，且因此呈现诊断和/或治疗脑病症的主要障碍。

已采用众多种不同策略来帮助克服BBB所施加的限制，且这些策略大致分为三类：1)侵入性程序(例如藉助手术直接心室内施用药物)；2)药理学方式(例如通过提高多肽的脂溶性)；及3)基于载体的方式(即通过利用或改变穿过BBB运输药物的已知载体机制来提供高特异性且有效的药物递送)。

2007年，Demeule及同事设计出一系列能够穿过BBB的19聚体多肽[1]。显示这些多肽中的最佳者(称为“血管肽(angiopep)-2”)经由涉及LDL受体相关蛋白(LRP1)的结合机制[2]在脑细胞中展现转胞吞作用(分子穿过细胞内部进行运输)，该LDL受体相关蛋白是低密度脂蛋白受体(“LDLR”)家族的成员。

LDLR主要负责经由胞吞作用将携载胆固醇的粒子摄取至细胞中[3]。其一级配体是5个能够运输包含胆固醇在内的不同脂肪分子的主要脂蛋白群中之一者的低密度脂蛋白(LDL)。在人类中约65％-70％的血浆胆固醇是以LDL形式进行循环。每一LDL粒子皆含有单一载脂蛋白B100分子(apoB-100)，这些分子负责脂肪酸的循环，从而保持其在水性血流环境中可溶。LDLR亦紧密结合至极低密度脂蛋白的含有多拷贝载脂蛋白E(apoE)的β-迁移形式(b-VLDL)。

LDLR是具有约840个氨基酸的模块化跨膜蛋白，其代表一整类通常表示为LDLR家族的受体。每一LDLR家族成员皆含有一或若干个以相似模式排列的以下结构域：A型LDL受体(亦表示为“LA”、“CR”或“配体结合重复序列”)；表皮生长因子样(EGF样)及YWTD(或β-螺旋桨)模块(图1，[4])。LDLR的胞外结构域(图2，[4])在功能上分为2个区域：由位于N末端的7个邻接LDL-A模块(LA1-LA7)组成的配体结合区域及与EGF前体同源的随后区域。模块LA3至LA7为结合LDL所必需[5]。包含2个EGF样模块、一个β-螺旋桨结构域及第三EGF样模块的EGF区域负责LDL粒子在较低胞内pH下的释放及受体至细胞表面的再循环二者。

迄今为止，尽管已知此知识，但在寻找穿过BBB的运输剂时选择仍有限。业内仍需要穿过BBB递送治疗及诊断剂的其他经改良试剂及方法。

发明内容

本发明提供穿过BBB的多肽。因此，这些多肽是BBB运输剂。这些多肽在单独或与治疗剂或诊断剂偶合时通常能够以治疗或诊断上有用或生理上显著的有效量穿过BBB。

尽管本发明不受限于理论，但本发明多肽已经设计以结合LDLR中使本发明多肽通过胞吞作用纳入脑中的LA结构域。鉴于能够穿过BBB，故本发明多肽尤其可用作穿过BBB运输其他试剂并将试剂(通常为药物或诊断剂)递送至脑的载体。

本发明提供穿过血脑屏障(BBB)的多肽，其中该多肽为以下各项、包括其、基本上由其组成或由其组成：

(a)长度小于59个氨基酸的调节子多肽，其包括SEQ ID NO:2的7个或更多个连续氨基酸，且包括K48及R49(相对于SEQ IDNO:1编号)，任选地包括：(i)T43、V44、I45、H46、G47和/或(ii)E50、V51、T52、L53及H54(相对于SEQ ID NO:1编号)；任选地包括P43及L55(相对于SEQ ID NO:1编号)；且任选地包括(i)P37、M38、A39、R40、E41和/或(ii)H56、P57、D58及H59(相对于SEQ ID NO:1编号)；

(b)长度小于100个氨基酸的RAP多肽，其包括来自SEQ IDNO:4的至少20个连续氨基酸；

(c)长度小于100个氨基酸的挠性多肽，其包括挠性环且其中该多肽包括以下序列：X₁ X₂ E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K DE X₁₀ X₁₁或R G K R X₇ X₈ X₉ K D E，其中X₁＝A、F、S或T；X₂＝G、K、R或S；X₃＝S或T；X₄＝N或S；X₅＝A、I或T；X₆＝I、T或V；X₇＝D、E或G；X₈＝S、T或Y；X₉＝F、T或Y；X₁₀＝G或N；X₁₁＝K或R；或

(d)长度小于100个氨基酸的刚性多肽，其包括α螺旋且包括以下共有序列：(K/R)A(A/E/Q)K A(A/E/Q)A(K/R)，任选地包括G D(A/E)_α(K/R)A(A/E/Q)K A(A/E/Q)A(K/R)A X_βG Y，其中任选地，_α为1-10，且_β为1-25。

优选地，调节子多肽包括以下序列或由其组成：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。

优选地，RAP多肽包括以下序列或由其组成：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

优选地，挠性多肽包括以下序列或由其组成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。

优选地，刚性多肽包括以下序列或由其组成：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16。

亦提供包括与SEQ ID No.2至16中的每一个具有至少85％、90％或95％序列同一性的序列或由其组成的多肽。

在一些实施方案中，多肽是以重组方式产生。在其他实施方案中，多肽是以化学方式合成。

本发明亦提供用于穿过血脑屏障(BBB)运输试剂的偶联物，其包括：(a)如上文所阐述的多肽；及(b)试剂；其中该偶联物能够穿过BBB。

在一些实施方案中，试剂为诊断剂或治疗剂。在一些实施方案中，多肽是经由连接体偶联至试剂。在一些实施方案中，多肽直接偶联至试剂。在一些实施方案中，偶联物包括纳米颗粒。在一些实施方案中，试剂可在运输穿过BBB后自多肽释放。

本发明亦提供包括如前述实施方案中任一个的多肽或偶联物及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

本发明亦提供如上文所定义的多肽、偶联物或药物组合物，其用于疗法中。在一个实施方案中，治疗用途在于治疗神经疾病，任选地脑瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、卒中和/或与BBB的功能障碍相关的疾病。

本发明亦提供如上文所阐述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于诊断方法中。在一个实施方案中，诊断用途在于诊断神经疾病。

本发明亦提供编码如上文所阐述的多肽的经分离的多核苷酸。

附图简述

参照下列图式来阐述本发明。

图1：LDLR家族成员。

图2：LDLR的胞外结构域，其由7个配体结合重复序列(LA/CR)、3个EGF样模块及一个β-螺旋桨单元构成。

图3：LDLR中的LA结构域折叠(PDB:2FCW)

图4：LA-RAP(D3)界面(A-D)与其他LA模块界面的比较。

图5：血管肽的阶层式分群，其是基于一组针对每一构成AA定义的113种物理化学性质。

图6：经由同源建模获得的血管肽-2的一般折叠。

图7：AP2结构的从头预测。

图8：AP2(作为单一结构域结合剂)与LA模块之间可能的相互作用。

图9：AP2(作为双结构域结合剂)与LA模块之间可能的相互作用。

图10：调节子根据其同源模型(PDB代码：3N40)的一般折叠。圆圈突出显示折叠的结构化部分。

图11：调节子(作为单一结构域结合剂)与LA模块之间可能的相互作用。

图12：调节子(作为双结构域结合剂)与LA模块之间可能的相互作用。仅显示第二结合区域。

图13：如在调节子整体模型中所观察到的调节子_构建体1的预测结构。

图14：藉助从头方法计算的调节子_构建体1的预测结构。

图15：调节子_构建体4在基于同源性的调节子模型上的预测结构。

图16：调节子_构建体4在藉助从头方法计算的模型上的预测结构。

图17：RAP D3结构域与LDLR之间的相互作用。

图18：RH_构建体1基于RAP-LDLR复合物晶体结构(2FCW)的模型。

图19：藉助从头方法计算的RH_构建体1的预测结构。

图20：RH_构建体2基于RAP-LDLR复合物晶体结构(2FCW)的模型。

图21：RH_构建体3基于RAP-LDLR复合物晶体结构(2FCW)的模型。

图22：活体外BBB模型的示意图，该模型涉及牛脑内皮细胞与星状细胞的共培养。

图23：条形图，其显示未经修饰的纳米颗粒不会穿过BBB，而经调节子(SEQ ID No.1)修饰的纳米颗粒确实穿过BBB(NP＝纳米颗粒)。

图24：条形图，其显示根据荧光标记肽活体外BBB模型穿过测试的穿过百分比。

发明详述

本发明是基于可穿过BBB的多肽的令人惊奇的鉴别。在鉴别可穿过BBB的新多肽的尝试中，发明人选择低密度脂蛋白受体(LDLR)作为靶标且编译已知与LDLR的配体结合(“LA”)结构域相互作用的所有多肽的数据库。发明人评价了所有这些多肽的结构及活性。许多多肽-LDLR相互作用是使用不同实验条件来鉴别，但发明人能够鉴别出对能够与LDLR的LA结构域相互作用且因此能够穿过BBB的多肽至关重要的结构及药效特征。

为研发并完善结构及药效模型，发明人研究了若干已知穿过BBB的肽(即血管肽，Demeule等人，参见上文)及调节子。已知这些血管肽通过与LDLR相互作用穿过BBB，但尚未获得这些多肽的结构信息且因此发明人对血管肽建模以进行结构比较。亦已知调节子穿过BBB且已知其结构，但未知调节子穿过BBB的机制。鉴于已鉴别出通过BBB所需要的关键结构及药效特征，发明人研发出含有这些关键特征且因此亦能够穿过BBB的本发明多肽。

本发明多肽共享共同特征。其皆能够穿过BBB，其皆是通过相同方法鉴别，且其皆经设计以结合至LDLR的LA结构域。本发明多肽可分为四个亚群：“调节子多肽”、“RAP多肽”、“挠性多肽”及“刚性多肽”。本发明多肽通常包括下文所阐述的序列或由其组成。

调节子多肽

HKKWQFNSPFVPRADEPARKGKVHIPFPLDNITCRVPMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH(SEQ ID NO:1)：调节子

调节子能够穿过BBB。至今未知其结构及作用机制。

通过使用P62包膜糖蛋白(论述于下文实例中)同源建模调节子序列，发明人发现，调节子包括刚性β-发夹结构及非结构化挠性长链。发明人鉴别出β-发夹结构与LDLR相互作用且发现此相互作用需要2种关键残基，即位于β-发夹结构的U-小弯处的K48及R49(相对于SEQ ID NO:1编号)。因此，本发明的调节子多肽包括K48及R49(相对于SEQ ID NO:1编号)。本发明的调节子多肽能够穿过BBB。此通过例如图23来显示，该图展示使用如图22中所绘示且如Cecchelli等人，Adv Drug Deliv Rev.1999年4月5日；36(2-3):165-178.(参考文献6)所阐述的BBEC/大鼠星状细胞共培养活体外模型，经调节子(SEQ ID No.1)修饰的纳米颗粒能够穿过BBB。图23亦证实未经修饰的纳米颗粒不会穿过BBB。

全长调节子多肽长度为59个AA(SEQ ID NO:1)。本发明的调节子多肽是全长调节子的片段，且因此其产生更容易且更廉价。而且，使用较短多肽来达成穿过BBB的相同或较佳通过允许向患者施用更小重量的多肽。因此，本发明调节子多肽的长度小于59个氨基酸，且因此可包括SEQ ID NO:1的以下数量的连续氨基酸：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58个。

除K48及R49的外，本发明的调节子多肽优选包括(a)T43、V44、I45、H46及G47和/或(b)E50、V51、T52、L53及H54(相对于SEQ ID NO:1编号)，此乃因这些氨基酸残基参与β-发夹结构的形成。除K48及R49的外，本发明的调节子多肽优选包括(a)P42、T43、V44、I45、H46及G47和/或(b)E50、V51、T52、L53、H54及L55(相对于SEQ ID NO:1编号)，此乃因这些氨基酸残基帮助形成与LDLR的LA结构域相互作用的较大β-发夹结构基序。尽管不受限于理论，但发明人认为此较大β-发夹结构进一步改良与LDLR的相互作用。

调节子_构建体1

PTVIHGKREVTLHL(SEQ ID NO:2)：调节子_构建体1

本发明的优选调节子多肽是“调节子_构建体1”(SEQ IDNO:2)。调节子_构建体1是SEQ ID NO:1中形成β-发夹结构的14个氨基酸残基的片段。

本发明亦提供调节子_构建体1的片段，其包括SEQ ID NO:2的7个或更多个连续氨基酸，例如7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基，其中该片段包括K48及R49(相对于SEQ ID NO:1编号)，且保留穿过BBB的能力。

其他优选片段缺少一或多个来自SEQ ID NO:2C端的氨基酸(例如1、2、3、4、5或6个氨基酸)和/或一或多个来自SEQ ID NO:2N端的氨基酸(例如1、2、3、4、5或6个氨基酸)，同时保留穿过BBB的能力；且其中该片段包括SEQ ID NO:2的7个或更多个连续氨基酸并包括K48及R49(相对于SEQ ID NO:1编号)。因此，调节子_构建体1的氨基酸片段可包括具有SEQ ID NO:2以下数量的连续氨基酸残基的氨基酸序列：7、8、9、10、11、12或13个。

本发明的调节子多肽亦包含SEQ ID NO:2的变体。调节子_构建体1的变体通常是由与SEQ ID NO:2具有以下同一性的氨基酸序列组成：85％或更大，例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

调节子_构建体4

PMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH(SEQ ID NO:3)：调节子_构建体4

本发明的另一优选调节子多肽是“调节子_构建体4”(SEQID NO:3)。调节子_构建体4是包括SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:1的23个氨基酸残基的片段。由于额外残基(相对于SEQ ID NO:2)形成平行链，且这些平行链形成可与LDLR相互作用的β-折叠，故确定SEQ ID NO:4尤其适宜。

本发明亦提供调节子_构建体4的片段，其包括SEQ ID NO:3的7个或更多个连续氨基酸，通常为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基，其中该片段包括K48及R49(相对于SEQ ID NO:1编号)，且保留穿过BBB的能力。

优选地，除K48及R49的外，本发明的调节子_构建体4多肽包括(a)P37、M38、A39、R40、E41、P42、T43、V44、I45、H46及G47和/或(b)E50、V51、T52、L53、H54、L55、H56、P57、D58及H59(相对于SEQ ID NO:1编号)。

其他优选片段缺少一或多个来自SEQ ID NO:3C端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸)和/或一或多个来自SEQ ID NO:3N端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，同时保留穿过BBB的能力，且其中该片段包括SEQ ID NO:3的7个或更多个连续氨基酸并包括K48及R49(相对于SEQ ID NO:1编号)。因此，调节子_构建体4的片段可包括具有SEQ ID NO:3以下数量的连续氨基酸残基的氨基酸序列：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个。

本发明的调节子多肽亦包含SEQ ID NO:3的变体。调节子_构建体4的变体通常是由与SEQ ID NO:3具有以下同一性的氨基酸序列组成：85％或更大，例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

RAP多肽

MAPRRVRSFLRGLPALLLLLLFLGPWPAASHGGKYSREKNQPKPSPKRESGEEFRMEKLNQLWEKAQRLHLPPVRLAELHADLKIQERDELAWKKLKLDGLDEDGEKEARLIRNLNVILAKYGLDGKKDARQVTSNSLSGTQEDGLDDPRLEKLWHKAKTSGKFSGEELDKLWREFLHHKEKVHEYNVLLETLSRTEEIHENVISPSDLSDIKGSVLHSRHTELKEKLRSINQGLDRLRRVSHQGYSTEAEFEEPRVIDLWDLAQSANLTDKELEAFREELKHFEAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLRHAESVGDGERVSRSREKHALLEGRTKELGYTVKKHLQDLSGRISRARHNEL(SEQ ID NO:48)：受体相关蛋白

已知受体相关蛋白(在本文中称为RAP、SEQ ID NO:48)能够藉助其D3结构域结合至LDLR且已对RAP蛋白实施一些结构研究。已知RAP与LDLR之间的相互作用是经由与2个A型LDL受体(LA)模块相互作用的2个RAPα-螺旋来发生。单一α-螺旋含有相互作用的必需残基(包含K256)，而认为另一螺旋稳定复合物。发明人研发出3种新RAP多肽，其称为“RH_构建体1”(SEQ ID NO:4)、“RH_构建体2”(SEQ ID NO:5)及“RH_构建体3”(SEQ IDNO:6)。发明人将RH_构建体1鉴别为穿过BBB的核心片段。因此，“RH_构建体2”及“RH_构建体3”包括“RH_构建体1”的序列。“RH_构建体3”亦包括“RH_构建体2”。

本发明的RAP多肽是全长RAP的片段，且因此产生容易且廉价。而且，使用较短多肽来达成穿过BBB的相同或较佳通过允许向患者施用更小重量的多肽。本发明RAP多肽的长度小于100个氨基酸，其长度通常为99、98、97、96、95、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16或15个氨基酸。

本发明的RAP多肽形成α-螺旋，且能够穿过BBB。

RH_构建体1

ELKHFEAKIEKHNHYQKQLE(SEQ ID NO:4)：RH_构建体1

RH_构建体1(SEQ ID NO:4)是RAP的20个氨基酸残基的片段，其鉴别为RAP-D3与LDLR相互作用的最小单元。

本发明的RAP多肽亦包含SEQ ID NO:4的变体。SEQ ID NO:4的变体优选是由与SEQ ID NO:4具有以下同一性的氨基酸序列组成：85％或更大，例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

RH_构建体2

DKELEAFREELKHFEAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLRHAESV(SEQ ID NO:5)：RH_构建体2

本发明的另一优选RAP多肽是RH_构建体2。RH_构建体2(SEQ ID NO:5)是RAP的41个氨基酸残基的片段，其包括SEQ IDNO:4且进一步利于形成α-螺旋。

本发明的RH_构建体2多肽包括SEQ ID NO:4的20个或更多个连续氨基酸，通常为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸残基。

其他优选片段缺少一或多个来自SEQ ID NO:5C端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸)和/或一或多个来自SEQ ID NO:5N端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸)，同时保留穿过BBB的能力，且其中该片段包括SEQ ID NO:4的20个或更多个连续氨基酸。

本发明的RAP多肽亦包含SEQ ID NO:5的变体。RH_构建体2的变体通常是由与SEQ ID NO:5具有以下同一性的氨基酸序列组成：85％或更大，例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

RH_构建体3

DKELEAFREELKHFEAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLRHAESVGDGERVSRSREKHALLEGRTKELGYTVKKHLQDLSGRISRARH(SEQ ID NO:6)：RH_构建体3

本发明的另一优选RAP多肽是RH_构建体3。RH_构建体3(SEQ ID NO:6)是RAP的84个氨基酸的片段，其包括SEQ ID NO:5(且因此亦包括SEQ ID NO:4)。RH_构建体3包含包括2个α-螺旋的RAP D3结构域的大部分。除RH_构建体2多肽的α-螺旋(包含与LDLR相互作用所必需的残基)外，RH_构建体3包括与LDLR相互作用且稳定复合物的含有Arg296的第二α-螺旋。

本发明的RH_构建体3多肽包括SEQ ID NO:4的20个或更多个连续氨基酸，通常为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或81个氨基酸残基。

其他优选片段缺少一或多个来自SEQ ID NO:6C端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸)和/或一或多个来自SEQ ID NO:6N端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸)，同时保留穿过BBB的能力，且其中该片段包括SEQ IDNO:4的20个或更多个连续氨基酸。

本发明的RAP多肽亦包含SEQ ID NO:6的变体。RH_构建体3的变体通常是由与SEQ ID NO:6具有以下同一性的氨基酸序列组成：85％或更大，例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

挠性多肽

“挠性多肽”包括挠性环。发明人在“AP2双结合剂模型”中鉴别出与LDLR的LA结构域相互作用的特征(参见下文实例)。本发明的挠性多肽含有这些特征且与LDLR的LA模块相互作用。

发明人将“RGKRX₇X₈X₉KDE”基序鉴别为对与LDLR的LA结构域的相互作用至关重要，且因此本发明的挠性多肽包括氨基酸序列：

X₁ X₂ E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀ X₁₁(SEQID NO:23)；或

R G K R X₇ X₈ X₉ K D E(SEQ ID NO:24)

其中：

·X₁优选与位置14处的氨基酸形成疏水性分子内相互作用以促进双倍Kunitz型折叠。

·X₂优选具有形成挠性环的高倾向。

·E促进与LA模块R103的H-键合的分子间相互作用。

·X₃优选是具有形成挠性环的高倾向的极性残基。

·X₄优选是具有形成挠性环的高倾向的极性残基。

·X₅优选促进与LA模块V106的疏水性分子间相互作用。

·X₆优选促进与LA模块T126的疏水性分子间相互作用。

·R G K R视为与LA模块相互作用所必需。

·X₇优选具有形成挠性环的高倾向。

·X₈优选是具有形成挠性环的高倾向的极性残基。

·X₉优选促进与氨基酸X₁的疏水性分子内相互作用以促进双倍Kunitz型折叠。

·K是视为与LA模块相互作用所必需的AP2残基。

·D促进与LA模块Q104的H-键合的分子间相互作用。

·E是视为与N端分子内相互作用并促进双倍Kunitz型折叠所必需的AP2残基。

·X₁₀优选是具有形成挠性环的高倾向的极性残基。

·X₁₁优选是与LA模块的D110形成H-键合的分子间相互作用的极性残基。

优选地，X₁＝A、F、S或T

X₂＝G、K、R或S

X₃＝S或T

X₄＝N或S

X₅＝A、I或T

X₆＝I、T或V

X₇＝D、E或G

X₈＝S、T或Y

X₉＝F、T或Y

X₁₀＝G或N

X₁₁＝K或R

本发明的挠性多肽可包括SEQ ID NO:24以及(SEQ ID NO:23的)X₁ X₂ E X₃ X₄ X₅ X₆ X₁₀和/或X₁₁中之一或多个。本发明的挠性多肽可包括：

X₂ E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀ X₁₁(SEQ IDNO:25)

E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀ X₁₁(SEQ ID NO:26)

X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀ X₁₁(SEQ ID NO:27)

X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀ X₁₁(SEQ ID NO:28)

X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀ X₁₁(SEQ ID NO:29)

X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀ X₁₁(SEQ ID NO:30)

R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀ X₁₁(SEQ ID NO:31)

X₁ X₂ E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀(SEQ IDNO:32)

X₂ E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀(SEQ IDNO:33)

E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀(SEQ ID NO:34)

X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀(SEQ ID NO:35)

X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀(SEQ ID NO:36)

X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀(SEQ ID NO:37)

X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀(SEQ ID NO:38)

R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀(SEQ ID NO:39)

X₁ X₂ E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E(SEQ ID NO:40)

X₂ E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E(SEQ ID NO:41)

E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E(SEQ ID NO:42)

X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E(SEQ ID NO:43)

X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E(SEQ ID NO:44)

X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E(SEQ ID NO:45)

X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E(SEQ ID NO:46)

R G K R X₇ X₈ X₉ K D E(SEQ ID NO:47)。

较短多肽产生廉价且容易。而且，使用较短多肽来达成穿过BBB的相同或较佳通过允许向患者施用更小重量的多肽。

本发明挠性多肽的长度小于100个氨基酸，其长度通常为99、98、97、96、95、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸。优选地，本发明挠性多肽的长度为15-24(即15、16、17、18、19、20、21、22、23或24)个氨基酸，更优选为18-21个氨基酸(即18、19、20或21个氨基酸)。

最优选地，本发明挠性多肽的长度为19个氨基酸。

本发明的挠性多肽亦包含上文所列示的挠性多肽的变体。本发明的挠性多肽通常是由与上文所列示挠性多肽中之一或多个具有以下同一性的氨基酸序列组成：85％或更大，例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

优选地，本发明的挠性多肽包括以下各项或由其组成：SEQID NO:7、8、9、10或11及其片段或变体。

本发明的优选刚性多肽是SEQ ID NO:7(“挠性_1”)、SEQID NO:8(“挠性_2”)、SEQ ID NO:9(“挠性_3”)、SEQ ID NO:10(“挠性_4”)或SEQ ID NO:11(“挠性_5”)及其片段和/或变体。

“挠性_1”

T G E S N T V R G K R G S Y K D E N R(SEQ ID NO:7)：挠性_1

在一些实施方案中，本发明的挠性多肽(i)由SEQ ID NO:7组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:7；(iii)与SEQ ID NO:7具有至少85％的同一性，即85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ ID NO:7的10个或更多个连续氨基酸，即10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个连续氨基酸。本发明挠性_1多肽的长度小于100个氨基酸。

“挠性_2”

F R E S N T I R G K R E T T K D E N R(SEQ ID NO:8)：挠性_2

在一些实施方案中，本发明的挠性多肽(i)由SEQ ID NO:8组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:8；(iii)通常与SEQ IDNO:8具有至少85％的同一性，优选与SEQ ID NO:8具有至少91％的同一性，即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ ID NO:8的9个或更多个连续氨基酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个连续氨基酸。本发明挠性_2多肽的长度小于100个氨基酸。

“挠性_3”

T K E T S A T R G K R E T T K D E G K(SEQ ID NO:9)：挠性_3

在一些实施方案中，本发明的挠性多肽(i)由SEQ ID NO:9组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:9；(iii)通常与SEQ IDNO:9具有至少85％的同一性，优选与SEQ ID NO:9具有至少91％的同一性，即91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ ID NO:9的9个或更多个连续氨基酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个连续氨基酸。本发明挠性_3多肽的长度小于100个氨基酸。

“挠性_4”

A R E T S I V R G K R D Y F K D E G K(SEQ ID NO:10)：挠性_4

在一些实施方案中，本发明的挠性多肽(i)由SEQ ID NO:10组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:10；(iii)与SEQ ID NO:7具有至少85％的同一性，即85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ ID NO:10的9个或更多个连续氨基酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个连续氨基酸。本发明挠性_4多肽的长度小于100个氨基酸。

“挠性_5”

S S E S N I T R G K R E Y T K D E G R(SEQ ID NO:11)：挠性_5

在一些实施方案中，本发明的挠性多肽(i)由SEQ ID NO:11组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:11；(iii)通常与SEQ IDNO:11具有至少85％的同一性，优选与SEQ ID NO:11具有至少90％的同一性，即90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ ID NO:11的10个或更多个连续氨基酸，即10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个连续氨基酸。本发明挠性_5多肽的长度小于100个氨基酸。

刚性多肽

发明人所鉴别的适用于BBB运输的又一组多肽称为“刚性多肽”。本发明的“刚性多肽”如此命名的原因在于，其二级结构包括α-螺旋且其设计是基于RAP-LA复合物的共结晶。鉴于已鉴别出RAP的主要相互作用基序(论述于下文实例中)，发明人进而分析了此基序以提供能够穿过BBB的其他多肽。本发明的刚性多肽代表优于全长RAP的改良，此乃因其更短且因此产生廉价且容易。而且，使用较短多肽来达成穿过BBB的相同或优选通道允许向患者施用更小重量的多肽。

本发明的刚性多肽包括具有以下共有序列的氨基酸序列或由其组成：

(K/R)A(A/E/Q)K A(A/E/Q)A(K/R)

优选地，本发明的刚性多肽包括具有以下共有序列的氨基酸或由其组成：

G D(A/E)_α(K/R)A(A/E/Q)K A(A/E/Q)A(K/R)A X_βG Y

其中优选地，_α为1-10，且_β为1-25

本发明刚性多肽的长度小于100个氨基酸，其长度通常为99、98、97、96、95、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个氨基酸。本发明刚性多肽的长度优选为10-45个氨基酸，即10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个氨基酸。

本发明的刚性多肽亦包含上文所列示的刚性多肽的变体。本发明的刚性多肽优选由以下氨基酸序列组成：与上文所列示刚性多肽之一或多个具有95％或更大的同一性，例如至少95％、96％、97％、98％、98.5％或99％的同一性。

本发明的优选刚性多肽是选自由以下组成的群：SEQ ID NO:12(“刚性_1”)、SEQ ID NO:13(“刚性_2”)、SEQ ID NO:14(“刚性_3”)、SEQ ID NO:15(“刚性_4”)或SEQ ID NO:16(“刚性_5”)及其片段和/或变体。

“刚性_1”

GDAAAAKAAKAAAKAAADGY(SEQ ID NO:12)：刚性_1

“刚性_1”多肽(SEQ ID NO:12)鉴别为单一结构域结合剂(即可与LDLR的单一LA模块相互作用)。在一些实施方案中，本发明的刚性多肽(i)由SEQ ID NO:12组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:12；(iii)通常与SEQ ID NO:12具有至少85％的同一性，优选与SEQ ID NO:12具有至少95％的同一性，即95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ ID NO:12的16个或更多个连续氨基酸，即16、17、18、19或20个连续氨基酸。本发明刚性_1多肽的长度小于100个氨基酸(如上文所论述)。

“刚性_2”

GDAAAARAAKAAARAAADGY(SEQ ID NO:13)：刚性_2

“刚性_2”多肽(SEQ ID NO:13)鉴别为单一结构域结合剂。在一些实施方案中，本发明的刚性多肽(i)由SEQ ID NO:13组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:13；(iii)通常与SEQ ID NO:13具有至少85％的同一性，优选与SEQ ID NO:13具有至少95％的同一性，即95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ IDNO:13的11个或更多个连续氨基酸，即11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸。本发明刚性_2多肽的长度小于100个氨基酸(如上文所论述)。

“刚性_3”

GDAAAAKAAKAAAKAAAAAAKAAKAAAKAAADGY(SEQ ID NO:14)：刚性_3

“刚性_3”多肽(SEQ ID NO:14)鉴别为双结构域结合剂(即可同时与LDLR的两个LA模块相互作用)。在一些实施方案中，本发明的刚性多肽(i)由SEQ ID NO:14组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:14；(iii)与SEQ ID NO:14具有至少85％的同一性，即85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ ID NO:14的7个或更多个连续氨基酸，即7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个连续氨基酸。本发明刚性_3多肽的长度小于100个氨基酸(如上文所论述)。

“刚性_4”

GDAAEAKAEKAEAKAEAAEAKAEKAEAKAAAEGY(SEQID NO:15)：刚性_4

“刚性_4”多肽(SEQ ID NO:15)鉴别为双结构域结合剂。在一些实施方案中，本发明的刚性多肽(i)由SEQ ID NO:15组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:15；(iii)与SEQ ID NO:15具有至少85％的同一性，即85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ ID NO:15的7个或更多个连续氨基酸，即7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个连续氨基酸。本发明刚性_4多肽的长度小于100个氨基酸(如上文所论述)。

“刚性_5”

GDAAEAKAQKAQAKANAAKAKAQKAQAKAAANGY(SEQ ID NO:16)：刚性_5

“刚性_5”多肽(SEQ ID NO:16)鉴别为推定的双结构域结合剂。在一些实施方案中，本发明的刚性多肽(i)由SEQ ID NO:16组成；(ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO:16；(iii)与SEQ ID NO:16具有至少85％的同一性，即85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％；和/或(iv)含有SEQ ID NO:16的7个或更多个连续氨基酸，即7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个连续氨基酸。本发明刚性_5多肽的长度小于100个氨基酸(如上文所论述)。

用于穿过血脑屏障的分析

本发明的多肽及偶联物可穿过BBB。BBB可是活体内或可是离体或活体外BBB模型，如业内已知。测试多肽或偶联物是否可穿过BBB的分析亦为业内所熟知。

本领域技术人员将了解，使用大脑源细胞的适宜活体外BBB模型包含：(i)经分离脑微血管；(ii)初代或低传代脑微血管内皮细胞培养物；(iii)牛脑内皮细胞培养物(BBEC)；及(iv)永生脑内皮细胞，例如RBE4细胞系、RBEC1细胞系及TR-BBB13细胞系。

业内已知可用作BBB模型的使用非大脑源细胞的活体外BBB模型包含MDCK(Madin-Darby犬肾)细胞及CaCo-2细胞。

活体内BBB模型包含：(i)颈动脉注射技术，其中将测试化合物与经放射性标记的参考化合物一起注射至动物的总颈动脉中且在注射后数秒分析脑；(ii)原位输注技术，其涉及在对脑进行颈动脉输注后对脑内药物含量进行取样的较长实验时段；(iii)静脉内注射技术，其中对股静脉或尾静脉插入导管且将测试化合物与血浆容量标记一起注射并在不同时间点收集动脉血；及(iv)大脑内微透析，其涉及通过将灌注有生理溶液的透析纤维植入脑中来对脑间隙液直接取样，进入脑间隙液的化合物藉此将渗透至生理溶液中且可藉助适当技术(HPLC、毛细管电泳)进行分析。

因此，本领域技术人员的直接任务是确定所给出化合物是否能够以治疗上有用或生理上显著的量穿过血脑屏障。

可用于确认多肽或偶联物能够穿过BBB的适宜活体外BBB运输分析的实例是牛脑内皮细胞培养物(BBEC)。在BBEC模型中，自牛脑灰质分离细胞且然后通常在先前包覆有大鼠尾胶原的表面上生长。为改良该模型，可将BBEC与初代星状细胞(通常来自新生大鼠)或C6大鼠神经胶质瘤细胞共培养。图22绘示星状细胞与牛脑微血管内皮细胞的共培养。这些共培养分析提供与活体内BBB明显相似之处。Cecchelli等人(参考文献6)阐述涉及牛脑微血管内皮细胞与大鼠初代星状细胞的共培养的较佳BBEC分析。已显示，此分析提供合法活体外BBB模型，其具有较强的活体内与活体外关联。在此模型(具体而言如参考文献6的第168-172页所阐述)中且如图22中所绘示，在膜上培养牛脑内皮细胞并在培养皿底部培养大鼠初代星状细胞。

如图22中所显示，两个细胞群共享培养基，从而允许体液互换而无需直接细胞接触。图22阐释在包覆有胶原的插入物(Millicell CM，0.4-mm孔径，Millipore)上培养的铺满牛脑内皮细胞的结构。牛脑微血管内皮细胞形成紧密堆积、非重叠且抑制接触的小细胞单层。在这些培养条件下，牛脑微血管内皮细胞同时保留内皮(因子VIII相关抗原、血管收缩素转化酶)及BBB特征。用于实施此BBB运输分析的试剂盒(“CT BovialBBB Pack”)可自Cellial(Lens,France；www.cellial.com)购得。

运输的渗透性及一般机制可通过业内已知的方法来阐明。例如，在参考文献6中，将Ringer-HEPES(150mM NaCl、5.2mMKCl、2.2mM CaCl、0.2mM MgCl、6mM NaHCO、2.8mM葡萄糖、5mM HEPES)添加至6孔板的下隔室中(2.5ml/孔)。然后将一过滤器转移至6孔板的含有Ringer的第一孔中，且将含有经标记或未经标记药物的Ringer置于上隔室中。在添加药物后的不同时间，将过滤器转移至6孔板的另一孔中以最小化下隔室至上隔室的可能通道。在37℃下在摇床上实施培育。振荡会最小化细胞单层表面上水性边界层的厚度且影响亲脂性溶质的渗透性。自每一下隔室及储备溶液取一等份试样且通过HPLC(针对未经标记药物)或在液体闪烁计数器中(针对经标记药物)测量每一样品中药物的量。渗透率计算可如Siflinger-Birnboim等人，J Cell.Physiol.132；111-117(参考文献45)所阐述来实施。

可使用上文所阐述的分析或业内已知的另一适宜分析来确认本发明的多肽及偶联物能够穿过血脑屏障。

用于结合至LDLR的分析

本发明的多肽及偶联物经设计以藉助其LA结构域结合至LDLR。不论多肽是否结合至LDLR，皆可使用本领域技术人员所熟知的标准技术来测试LA结构域，例如免疫分析(例如ELISA分析)、放射性配体结合分析、表面等离振子共振分析(例如Biacore^TM方法)或具有及不具有测试多肽下的结构分析(例如X射线)。通常，本发明多肽结合至LDLR的LA结构域，且解离常数(K_d)为至少1微摩尔，例如至少10^-6M，K_d优选为1纳摩尔，例如至少10^-9M。

可在竞争分析中使用抗LDLR抗体来测试多肽或偶联物是否通过结合LDLR穿过BBB。抗LDLR抗体与结合LDLR的多肽及偶联物竞争LDLR结合，且因此减少结合LDLR并通过BBB的多肽或偶联物的量。因此，LDLR介导的BBB穿过可如上文所阐述通过在抗LDLR抗体(其阻断与受体的结合)存在或不存在下实施BBB运输分析并比较BBB至肽及偶联物的渗透率来确定。在抗LDLR抗体存在下穿过BBB的通道减少指示多肽或偶联物通过LDLR介导穿过BBB。

据阐述神经胶质瘤细胞在其表面上过表达LRP1(LDLR)受体且此已通过使神经胶质瘤细胞(U87MG)接触经Alexa 488标记的abcam LRP1抗体(1:500稀释)来确认。使用DAPI实施配置并进行拍照。此可藉助共焦显微镜及牛内皮细胞(BBB试剂盒)来重复。因此，神经胶质瘤细胞表达LRP1及包括例如神经胶质瘤细胞的活体外BBB模型。可在竞争分析(如上文所阐述)中使用与神经胶质瘤细胞共培养的BBEC来确认多肽或偶联物是否通过结合LDLR穿过BBB。

本发明的多肽

多肽包括通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基。术语“多肽”可与术语“肽”及“蛋白质”互换使用。

本发明多肽可呈多种形式，例如天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、非脂化、磷酸化、非磷酸化、肉豆蔻酰化、非肉豆蔻酰化、单体、多聚体、微粒或变性。

本发明多肽可通过多种方式来制备，包含重组表达、自细胞培养物纯化及化学合成。重组表达的多肽是优选的，杂合及融合多肽是最优选的。

本发明多肽可以下列形式提供：纯化或实质上纯化形式，即实质上不含其他多肽，例如不含天然多肽，尤其不含其他宿主细胞多肽，且通常至少约50％纯(以重量计)、且通常至少约90％纯、即小于约50％、且优选小于约10％(例如5％)的组合物是由其他表达的多肽构成。因此，组合物中的多肽是自表达该分子的整个有机体分离。

本发明多肽通常是经分离或纯化。

术语“多肽”是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可为直链或具有支链，其可包括经修饰氨基酸，且其可杂有非氨基酸。该术语亦涵盖已经天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或诸如与标记组份偶联等任何其他操作或修饰。亦包含例如含有氨基酸(包含例如非天然氨基酸)之一或多种类似物的多肽以及业内已知的其他修饰。多肽可作为单一链或缔合链出现。

本发明多肽的变体优选包含多肽序列的个别取代、缺失或添加以使氨基酸经化学相似的氨基酸取代。阐述功能相似的氨基酸的表已为业内所熟知。

偶联物

在一方面中，本发明提供连接至试剂的本发明多肽(即“调节子多肽”、“RAP多肽”、“挠性多肽”或“刚性多肽”；例如包括SEQ ID No.2至16中的任一个)。连接至试剂的此多肽称为偶联物，此为业内通用术语。本发明的偶联物能够穿过BBB。通常，该试剂是运输穿过BBB的试剂，例如用于诊断或疗法中的试剂。

该试剂通常为治疗剂或诊断剂。

该试剂可为药物、多肽、酶、抗生素、抗癌剂、放射性试剂、抗体、细胞毒素、可检测标记或抗血管生成化合物。

在一些实施方案中，试剂为异源多肽，例如本发明提供含有本发明多肽及不同多肽的融合蛋白。本领域技术人员将理解，在本发明多肽为较长多肽的片段时，“异源蛋白”并非该较长多肽的交互序列。

在一些实施方案中，试剂包括用作治疗和/或诊断剂的载体的纳米颗粒或是该纳米颗粒的一部分。本发明多肽通常连接至纳米颗粒的表面。优选地，纳米颗粒为生物可降解的。治疗剂或诊断剂通常溶解于、包埋于、囊封于或附接至纳米颗粒基质。生物可降解的纳米颗粒、尤其那些经诸如聚(乙二醇)(PEG)等亲水性聚合物包覆者因其循环时段延长且可靶向递送的具体位点而可用作药物递送装置(Mohanraj及Chen Trop.J.Pharm.Res.5,561-573(2006))。使用纳米颗粒作为释放载体具有诸多优点。纳米颗粒的粒径及表面特征可易于操作以达成治疗剂或诊断剂在全身通过后的被动及主动靶向二者。具体而言，其在运输期间及在定位位点处控制并持续治疗剂的释放，从而改变治疗剂的器官分布及治疗剂的随后清除以增加治疗功效并通过最小化与其他器官的相互作用来减少副作用。受控释放及粒子降解特征可通过选择基质成份容易地调节。治疗剂或诊断剂的负载相对较高且可将治疗剂或诊断剂纳入系统中而不发生任何化学反应；此是保持治疗剂或诊断剂活性的重要因素。

在一实施方案中，纳米颗粒是如共同待决申请案PCT/IB2012/052320中所阐述的纳米颗粒，其中该纳米颗粒包括嵌段共聚物和任选地一或多种治疗剂或诊断剂，其中：

(i)嵌段共聚物包括嵌段A及D；

(ii)嵌段A是由包括单体单元B及C的第一聚合物组成，其中B是总碳原子数≤30的脂肪二羧酸，且C是二羟基或二氨基单体；且

(iii)嵌段D是由包括烃链的第二聚合物组成，该烃链含有酯或醚键且羟基数≥10。

治疗剂或诊断剂可存在于纳米颗粒内或纳米颗粒表面上。治疗剂或诊断剂与纳米颗粒之间的相互作用通常为非共价相互作用，例如氢键合、静电相互作用或物理囊封。然而，在替代性实施方案中，治疗剂或诊断剂与纳米颗粒是通过共价键或连接体连接。

在一些实施方案中，本发明提供本发明多肽偶联至一或多种试剂的多聚体。

这些偶联物通常能够以治疗或诊断上有用的有效量或以生理上显著的量穿过BBB。所需治疗剂或诊断剂的量将根据试剂、欲诊断或治疗的个体及病况而定，且可容易地由本领域技术人员来确定。

通常，本发明的偶联物保留本发明多肽穿过BBB的能力，即，与偶联试剂前的本发明多肽相比，该偶联物具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％穿过BBB的能力。穿过BBB的能力可使用包含上文所列示的分析在内的任何适宜BBB运输分析来评价。

试剂为治疗剂的偶联物

在一实施方案中，本发明多肽所连接的试剂为治疗剂。该治疗剂通常为药物。

在某些实施方案中，治疗剂可是分子量通常小于1000道尔顿(dalton)的小分子药物。在其他实施方案中，治疗剂可是诸如抗体或抗体片段、白介素、干扰素或其他蛋白质的“生物制品”。

在一实施方案中，本发明提供含有本发明多肽及异源(治疗)多肽的融合蛋白。

典型治疗剂包含(i)化学治疗剂，其可作为微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂发挥作用；(ii)蛋白毒素，其可以酶促方式发挥作用；(iii)放射性同位素；(iv)抗生素；(v)镇痛药；(vi)抗精神病药物；及(vii)抗抑郁剂。在CNS内、优选在脑中有活性的治疗剂较佳。这些治疗剂包含(i)精神作用药物，包含抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激剂、抗焦虑药及抑郁剂；及(ii)治疗脑肿瘤(例如脑瘤)的抗肿瘤药物。

试剂为诊断剂的偶联物

在一实施方案中，本发明多肽所连接的试剂为诊断剂。诊断剂是可用于确定疾病、病症、病况或病理的存在或程度的试剂；优选地，神经疾病是经诊断。典型诊断剂为x射线造影制剂、放射性同位素、标记及染料。

诊断剂通常包括以下各项或由其组成：染料、化学发光染料、放射性成像剂、金属螯合络合物、标记(例如荧光标记、酶-底物标记)、抗体或其抗体片段。

如本文所使用的术语“标记”是指可附接至本发明多肽且起以下作用的试剂：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以更改由第一或第二标记提供的可检测信号，例如FRET(荧光共振能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或增加与其结合的亲和力；(iv)藉助电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响迁移率(例如电泳迁移率)或细胞渗透率，或(v)提供捕获部分，以调节配体亲和力、抗体/抗原结合或离子错合。

在一些实施方案中，诊断剂是异源多肽，例如本发明提供含有本发明多肽及异源(诊断)多肽的融合蛋白。该异源多肽可经标记。异源多肽可为能够选择性结合至靶标的抗体、抗体片段、受体或其他多肽，例如疾病病理学特征改变的蛋白质。例如，可使用选择性结合至类淀粉斑的经标记抗体或片段来诊断阿尔茨海默病，同时可使用选择性结合至肿瘤标记的经标记抗体或片段来诊断肿瘤的存在。

本发明多肽至试剂的连接

本发明多肽可通过业内已知的任何适宜方式连接(即偶联)至试剂。通常，连接将通过化学偶联或(试剂为多肽时)通过表达包括本发明多肽及试剂的融合蛋白来实施。

在一些实施方案中，本发明多肽经由“连接体”偶联至试剂。连接体具有至少两个反应位点。连接体的一个反应位点结合至多肽的残基，且另一反应位点结合至试剂。连接体是可用于将一或多种试剂连接至本发明多肽以形成偶联物的双官能基或多官能基部分。偶联物可使用具有用于结合至试剂及本发明多肽的反应官能基的连接体方便地制备。在一些例如偶联物包括本发明多肽及异源蛋白(即试剂)的实施方案中，连接体可是定位于本发明多肽的C端及试剂N端的另一多肽序列，或反之亦然。在这些情形下，偶联物可通过表达本发明多肽、异源蛋白(即试剂)及呈杂合或融合蛋白形式的多肽连接体方便地制备。

在其他实施方案中，本发明多肽直接偶联至试剂(即本发明多肽并不经由连接体偶联至试剂)。

在一些实施方案中，试剂是异源多肽。在这些情形下，本发明多肽通常经由肽键偶联至试剂。肽键可根据(例如)多肽化学领域中所熟知的液相合成方法(参见E.Schroder及K.Luibke，“Thepolypeptides”，第1卷，第76-136页，1965,Academic Press)来制备。

本发明多肽与异源多肽之间的肽键(和任选地多肽连接体)可通过表达呈杂合或融合多肽形式的偶联物来形成。

包括本发明多肽及为异源多肽的试剂的偶联物可由式NH₂-F-A-{-X-L-}_n-B-G-COOH表示，其中：X是本发明多肽的氨基酸序列；L是可选连接体的氨基酸序列；A是可选氨基酸序列；B是可选氨基酸序列；F是编码试剂的可选氨基酸序列；G是编码试剂的可选氨基酸序列；n是1或更大的整数(例如2、3、4、5、6等)。通常，n为1、2或3。包括为异源多肽的试剂的本发明偶联物包括F和/或G。F及G可为相同试剂或不同试剂。

对于{-X-L-}的每一n实例，连接体氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，当n＝2时，杂合体可为…X₁-L₁-X₂-L_2…、…X₁-L₁-X_2…、…X₁-X₂-L_2…等。连接体氨基酸序列-L-通常将较短(例如20个或更少氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。实例包括有利于克隆的短多肽序列、多甘氨酸连接体(即包括Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)及组氨酸标签(即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。那些本领域技术人员将明了其他适宜连接体氨基酸序列。可用连接体是GSGGGG(SEQ ID NO:17)或GSGSGGGG(SEQ ID NO:18)，其中Gly-Ser二肽是自BamHI限制性位点形成，从而有助于克隆及操作，且(Gly)₄四肽是典型多甘氨酸连接体。尤其用作最终L_n的其他适宜连接体是Leu-Glu二肽或SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，例如当X仅通过肽键直接附接至另一X和/或B时，L不存在。

-A-是可选N端氨基酸序列。此通常将较短(例如40个或更少氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。实例包含引导蛋白质输送的前导序列或有利于克隆或纯化的短多肽序列(例如组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。那些本领域技术人员将明了其他适宜N端氨基酸序列。若X₁缺少其自身N端甲硫氨酸，则-A-优选为提供N端甲硫氨酸(例如Met-Ala-Ser)或单一Met残基的寡肽(例如具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。

-B-是可选C端氨基酸序列。此氨基酸序列通常将较短(例如40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。实例包含引导蛋白质输送的序列、有利于克隆或纯化的短多肽序列(例如包括组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)或增强蛋白质稳定性的序列。那些本领域技术人员将明了其他适宜C端氨基酸序列。

在一些实施方案中，试剂在穿过BBB后自本发明多肽释放。此可经由脑中的酶活性或因应脑中的生理化学的差异来达成。

本发明多肽的产生

在一实施方案中，本发明提供用于产生本发明多肽及偶联物的方法，该方法包括以下步骤：在诱导多肽表达的条件下培养经编码本发明多肽或偶联物的核酸转化的宿主细胞。

本发明可使用异源宿主来表达。异源宿主可为原核(例如细菌)或真核。其可为大肠杆菌(E.coli)，但其他适宜宿主包含桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙氏杆菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙氏杆菌(Salmonella typhimurium)、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis))、酵母菌等。改变密码子通常有助于优化这些宿主中的表达效率而不影响所编码的氨基酸。

术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指已引入重组表达载体的细胞。应理解，这些术语不仅欲指具体个体细胞而且亦指该细胞的子代。术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。通常，其是指转录调控序列与转录序列的功能性关系。例如，若启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其他表达系统中的转录，则其可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接至所转录序列的启动子转录调控序列与所转录序列在物理上邻接，即其为顺式作用。然而，诸如增强子等一些转录调控序列无需与其所增强转录的编码序列在物理上邻接或定位接近。

本发明亦提供用于产生本发明多肽或偶联物的方法，该方法包括以化学方式合成多肽或偶联物的步骤。本发明的多肽及偶联物可采用那些本领域技术人员已知的有机化学反应、条件及试剂通过若干途径来制备，包含：(1)使经修饰多肽的半胱氨酸基团与连接体反应，以经由共价键形成多肽-连接体中间体，然后与活化试剂反应；及(2)使试剂的亲核基团与连接体反应，以经由共价键形成试剂-连接体中间体，然后与经修饰多肽的半胱氨酸基团反应。可藉助多种经修饰多肽、试剂及连接体采用偶联方法(1)及(2)来制备本发明的偶联物。

含有多肽及偶联物的药物组合物

在另一方面中，本发明提供含有一或多种本发明的多肽和/或偶联物与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起调配的组合物，例如药物组合物。本发明的药物组合物可任选地在组合疗法中施用，即与其他试剂组合施用。例如，组合疗法可包含本发明偶联物与至少一种其他药物的组合。

如本文所使用，“药学上可接受的载体”包含任何及所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及生理上相容的类似试剂。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。

药物组合物优选无菌且在制造及储存条件下稳定。

组合物可调配成溶液、微乳液、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇及诸如此类)及其适宜混合物。可(例如)通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散液情形下通过维持所需粒径及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情形下，优选将等渗剂(例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠)纳入组合物中。通过向组合物中纳入延迟吸收试剂(例如，单硬脂酸盐及明胶)可使可注射组合物的吸收延长。

根据施用途径，多肽或偶联物可包覆于材料中以尤其在施用后保护其免受活化。

本发明的药物组合物可包含一或多种医药上可接受的盐。“医药上可接受的盐”是指保留母体化合物的期望生物活性且不赋予任何不期望毒理学效应的盐(例如，参见Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的实例为业内所知。

为控制渗透性，可包含生理盐，例如钠盐。氯化钠(NaCl)是优选的，其可以介于1mg/ml与20mg/ml之间、例如约10±2mg/ml的NaCl存在。其他可存在的盐包含氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。

组合物通常将具有介于200mOsm/kg与400mOsm/kg之间、优选介于240-360mOsm/kg之间的渗透压，且优选将介于290-310mOsm/kg范围内。

组合物可包含一或多种缓冲液。典型缓冲液包含：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(尤其含有氢氧化铝辅剂)；或柠檬酸盐缓冲液。缓冲液通常将包含于5-20mM范围内。

组合物的pH通常将介于5与8.1之间，且更通常介于6与8之间，例如介于6.5与7.5之间或7.0与7.8之间。

组合物通常不含麸质。

本发明的药物组合物亦可包含医药上可接受的抗氧化剂。医药上可接受的抗氧化剂的实例包含：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠及诸如此类；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚及诸如此类；及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及诸如此类。

组合物可包含温度保护剂。可将液体温度保护剂添加至组合物中以降低其冰点，例如使冰点降低至0℃以下。因此，该组合物可储存在0℃以下但在其冰点以上，以抑制热崩解。温度保护剂亦容许冷冻组合物同时保护矿物盐辅剂免于冷冻及解冻后的聚结或沉降，且亦可在高温(例如40℃以上)下保护组合物。适宜温度保护剂应对人类施用安全、容易与水混溶/可溶于水且不应破坏组合物中的其他组份。实例包含甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。适宜PEG可具有介于200-20,000Da范围内的平均分子量。在优选实施方案中，聚乙二醇可具有约300Da的平均分子量(‘PEG-300’)。

通过灭菌程序及通过包含各种抗细菌及抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及诸如此类)二者可确保防止微生物存在。亦可期望这些组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠及诸如此类。

可使用例如以下不同种类赋形剂的组合使多肽及偶联物于制剂中稳定：(1)二糖(例如蔗糖、海藻糖)或多元醇(例如山梨醇、甘露醇)通过优先排除起稳定剂作用且亦能够起冻干期间的低温保护剂作用，(2)表面活性剂(例如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20)通过最小化界面(如液体/冰、液体/材料表面和/或液体/空气界面)上蛋白的相互作用起作用，及(3)缓冲液(例如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸)有助于控制并维持制剂pH。因此，除本发明的方法外，可使用这些二糖多元醇、表面活性剂及缓冲液来进一步稳定本发明的多肽及偶联物并防止例如其聚集。

无菌可注射溶液可通过以下步骤来制备：将所需量的活性化合物纳入具有上文所列示的一种成份或成份的组合(视需要)的适宜溶剂中，然后进行无菌微滤。通常，通过将活性化合物纳入含有基本分散介质及来自那些上文所列举者的所需其他成份的无菌载体中来制备分散液。在使用无菌粉末来制备无菌可注射溶液的情形下，优选制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，其可自其先前经无菌过滤的溶液产生由活性成份加任一期望额外成份构成的粉末。

可偶联至本发明多肽以产生单一剂型的试剂的量将根据所治疗个体及具体施用模式而变化。通常，该量将是产生治疗效应的量。通常，以100％计，此量将介于约0.01％至约99％活性成份范围内，优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的多肽或偶联物与药学上可接受的载体的组合。

医学用途及治疗方法

本发明的多肽及偶联物可用于疗法中。具体而言，其可用于将治疗剂递送至脑。欲治疗的疾病将根据本发明多肽所运输的治疗剂而定，但脑疾病优选。因此，可治疗的疾病包含神经疾病，任选地脑瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、卒中和/或与BBB的功能障碍相关的疾病。

剂量及施用

调节剂量方案以提供最佳期望反应(例如治疗反应)。举例而言，可施用单一浓注剂，可经一段时间施用若干分开剂量或可如治疗状况紧急程度所指示按比例减少或增加剂量。以剂量单元形式来调配肠胃外组合物尤其有利于方便施用及剂量一致性。如本文所使用的剂量单元形式是指适于作为单一剂量用于欲治疗个体的物理离散单位；各单位含有产生期望治疗效应的预定量的多肽或偶联物以及所需医药载体。本发明剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于下列因素：(a)多肽或偶联物的独特特征及欲达成的具体治疗效应，及(b)复合该多肽或偶联物以治疗个体敏感性的技术中的固有限制条件。

另一选择为，本发明的多肽或偶联物可以持续释放制剂形式来施用，在该情形下需要较不频繁的施用。剂量及频率根据施用患者的多肽或偶联物的半衰期而变化。施用的剂量及频率可根据治疗为预防性抑或治疗性而变化。在预防应用中，以相对较不频繁的间隔经长时间段施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要在相对较短的间隔下相对较高的剂量直至减缓或终止疾病进展，且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防方案。

本发明药物组合物中多肽或偶联物的实际剂量值可变化以便获得可有效达成对具体患者有期望治疗反应的量的活性成份、组合物及施用模式，而对患者无毒。所选剂量值将根据多种药物代谢动力学因素而定，包含所采用的本发明具体组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用多肽或偶联物(或试剂)的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的多肽或偶联物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康情况及先前病史以及已为医疗业内所熟知的类似因素。

本发明多肽或偶联物的“治疗有效量”优选可降低疾病症状的严重程度，增加无疾病症状期的频率及持续时间或预防因感病性所致的损伤或残疾。

本发明的组合物可使用业内已知多种方法中之一或多个经由一或多个施用途径来施用。如本领域技术人员应了解，给药途径和/或模式应根据期望结果而变化。优选施用途径包含颅内、鼻内、眼内、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所使用的词组“肠胃外施用”意指除经肠及局部施用外的施用模式，通常通过注射，且包含(但不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。

另一选择为，本发明的多肽或偶联物可经由非注射用途径施用，例如局部、表皮或黏膜施用途径，例如经鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或局部。

本发明的多肽及偶联物能够穿过血脑屏障。因此，这些多肽及偶联物通常是经由需要穿过BBB的通道的途径施用，即外周施用。需要穿过BBB的通道的常用施用途径是静脉内、肌内、动脉内及腹膜内。

多肽或偶联物可利用保护化合物免于快速释放的载体来制备，例如控制释放制剂，包含植入物、经皮贴片及微囊封递送系统。可使用生物可降解的生物兼容聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。许多用于制备这些制剂的方法已获得专利权或通常已为那些本领域技术人员所知。例如，参见Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker公司，New York,1978。

本发明的多肽、偶联物或药物组合物可利用业内已知的医学装置来施用。

诊断用途及诊断方法

本发明的多肽及偶联物可用于诊断中。具体而言，其可用于将诊断剂递送至脑。欲诊断或监测的疾病将根据本发明多肽所运输的诊断剂而定，但脑疾病优选。因此，可诊断或监测的疾病包含神经疾病，任选地脑瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、卒中、和/或与BBB的功能障碍相关的疾病。

核酸

本发明亦提供包括编码本发明多肽的核酸(例如核酸组合、载体或载体组合)的组合物。本发明亦提供包括编码本发明偶联物(尤其其中试剂为多肽)的核酸(例如核酸组合、载体或载体组合)的组合物。

核酸可经优化以改良表达。

编码本发明多肽或偶联物的核苷酸序列可根据遗传密码来设计。因此，在本发明的上下文中，该核苷酸序列可编码一或多条本文所揭示的多肽序列。

本发明亦提供可与这些核酸杂交的核酸。杂交反应可在具有不同“严谨性”条件下实施。增加杂交反应严谨性的条件为业内众所周知并公开(例如[13]的第7.52页)。相关条件的实例包含(按严谨性递增的顺序)：培育温度为25℃、37℃、50℃、55℃及68℃；缓冲液浓度为10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC(其中SSC为0.15M NaCl及15mM柠檬酸盐缓冲液)及其使用其他缓冲液系统的等效物；甲酰胺浓度为0％、25％、50％及75％；培育时间为5分钟至24小时；1、2或更多个洗涤步骤；洗涤培育时间为1、2、或15分钟；及洗涤溶液为6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去离子水。杂交技术及其优化为业内所熟知[7、8、9等]。

核酸可在低严谨性条件下与靶标杂交；在其他实施方案中，其在中等严谨性条件下杂交；在优选实施方案中，其在高严谨性条件下杂交。低严谨性杂交条件的实例性设定为50℃及10×SSC。中等严谨性杂交条件的实例性设定为55℃及1×SSC。高严谨性杂交条件的实例性设定为68℃及0.1×SSC。

本发明包含包括编码本发明多肽或偶联物的核酸序列的互补序列的核酸(例如用于反义或探测或用作引物)。

本发明核酸可采用多种形式(例如单链、双链、载体、引物、探针、标记等)。本发明核酸可为环形或具有支链，但通常将为直链。除非另外指明或需要，否则本发明中利用核酸的任何实施方案既可利用双链形式亦可利用构成该双链形式的两条互补单链形式中的每一个。引物及探针与反义核酸一样通常为单链。

优选提供呈以下形式的编码本发明多肽或偶联物的核酸：呈纯化或实质上纯化形式，即实质上不含其他核酸(例如不含天然核酸)，尤其不含宿主细胞核酸，通常为至少约50％纯(以重量计)，且通常至少约90％纯。

编码本发明多肽或偶联物的核酸可以许多方式整体或部分地制备，例如通过化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)，通过使用核酸酶(例如限制酶)消化较长核酸，通过连接来自基因组或cDNA文库等的较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)。

术语“核酸”在一般意义上包含任何长度核苷酸的聚合形式，这些核酸含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。其包含DNA、RNA、DNA/RNA杂合体。其亦包含DNA或RNA类似物，例如那些含有经修饰骨架(例如多肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或经修饰碱基者。因此，本发明包含mRNA、tRNA、rRNA、核糖酶、DNA、cDNA、重组核酸、具有支链的核酸、质体、载体、探针、引物等。在本发明核酸采用RNA形式时，其可具有或可不具有5'帽。

编码本文所阐述的多肽或偶联物的核酸可是载体的一部分。

术语“补体”或“互补”当对于核酸使用时是指Watson-Crick碱基配对。因此，C的补体是G，G的补体是C，A的补体是T(或U)，且T(或U)的补体是A。亦可使用诸如I(肌苷嘌呤)等碱基来互补例如嘧啶(C或T)。

编码本发明多肽或偶联物的核酸可用于例如：产生多肽；作为杂交探针用于检测生物样品中的核酸；产生核酸的额外拷贝；产生核糖酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为三链形成寡核苷酸。

本发明提供用于产生编码本发明多肽或偶联物的核酸的方法，其中核酸是使用化学方式部分或整体地合成。

本发明提供包括编码本发明多肽或偶联物的核苷酸序列的载体(例如克隆或表达载体)及经这些载体转化的宿主细胞。

如本文所使用，术语“优化”意指核苷酸序列已经改变以使用密码子编码氨基酸序列，这些密码子优选用于产生细胞或有机体，通常为真核细胞，例如毕赤酵母属(Pichia)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人类细胞。优化核苷酸序列经改造以完全或尽可能多地保留最初由起始核苷酸序列(亦称为“亲代”序列)编码的氨基酸序列。本文亦设想这些序列在其他真核细胞中的优化表达。由优化核苷酸序列编码的氨基酸序列亦视为优化。

序列同一性

就序列比较而言，一个序列通常将用作参考序列与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列及参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定其他参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数。在比较两条序列的同一性时，这些序列不必邻接，但任何空位将产生罚分，此会降低整体同一性百分数。对于blastn，预设参数为空位开放罚分＝5及空位延伸罚分＝2。对于blastp，预设参数为空位开放罚分＝11及空位延伸罚分＝1。

本文中所指的序列同一性百分数是分别根据以下文献中所阐述的BLAST算法来测定：Altschul等人，Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；及Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410,1990。用于实施BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下各值作为默认值：字长(W)11、预期值(E)10、M＝5、N＝-4及两条链的比较值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下各值作为默认值：字长3及预期值(E)10以及BLOSUM62分值矩阵(参见Henikoff及Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)比对(B)50、预期值(E)10、M＝5、N＝-4及两条链的比较值。

概述

如在本文件中所使用的术语“氨基酸序列”应包含对本文所揭示的每一序列及其片段、同源物、衍生物及变体的提及。

术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如“包括”X的组合物可唯一地由X组成或可包含额外物项，例如X+Y。

术语“由……组成”意指“包含且限于”。

术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可包含额外成份、步骤和/或部分，但仅在这些额外成份、步骤和/或部分在材料上不变更所主张组合物、方法或结构的基本及新颖特征时如此。

术语“约”关于数值x意指x±10％。

除非另有说明，否则本发明实践将采用本领域技术人员已知的常规化学、生物化学、分子生物学、免疫学及药理学方法。这些技术于文献中充分解释。参见[10-17]。

现将参照以下非限制性实例来进一步阐述本发明。

实施例

LA-相互作用多肽数据库的编译

为编译LA-相互作用多肽数据库，发明人收集了已知能够与LDLR家族成员的LA结构域相互作用的所有多肽的结构信息。

这些结构数据允许发明人推导出化学实体与LA结构域相互作用必须具有的重要特征。考虑下列LDLR家族成员(参见图1)：

1.LDLR(低密度脂蛋白受体)是所有家族成员的原型；

2.VLDLR(极低密度脂蛋白受体)；

3.ApoER2(载脂蛋白E-受体2，亦称为LRP8)；

4.MEGF7(表皮生长因子样蛋白7，亦称为LRP4)；

5.LRP1(LDL受体相关蛋白1，亦称为LRP)；

6.LRP1B(LDL受体相关蛋白1B)；

7.LRP2(LDL受体相关蛋白2，亦称为巨蛋白(Megalin))。

表1：LDLR-家族LA结构域的相互作用伴侣[参考文献18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30及31]。*单一或双结合剂代表同时与配体相互作用的LA模块的数目。

在表1中我们报告每一LDLR家族成员的所有结合伴侣(配体)，此可参见文献。与LDLR成员的LA模块相互作用的配体的群在本文中称为“LA-相互作用多肽数据库”。

重要相互作用模式的合理化

对于LDLR家族的相互作用伴侣LA结构域发现的信息可分为2部分：一部分是关于活性数据且另一部分是关于结构信息。

在文献中，极少数活性数据集是使用相当实验条件获得，且因此通常不推荐使用这些数据来建立预测模型。然而，发明人能够提取并利用来自这些结构数据的某些重要信息。

发明人发现这些结构数据非常不均一：

·一些配体仅结合至单一LA结构域，而一些其他配体与2个模块建立相互作用(利用亲合力效应)。

·一些配体(例如小血管肽多肽)与初级结构彼此靠近定位的残基相互作用，而其他配体与彼此距离极远且构成氨基酸序列的不同部分的残基相互作用。

·一些配体与挠性结构区域(例如环)相互作用，而其他配体与刚性结构区域(例如α-螺旋)相互作用。

尽管发现LA-相互作用多肽数据库中的配体非常不均一，但发明人令人惊奇地发现，所有LDLR家族成员的所有LA模块的折叠高度保守。举例而言，发明人发现，复合物中介于LDLR的2个LA结构域之间的LA4模块与受体相关蛋白(RAP)共结晶，如Fisher及同事所阐述[21](参见图3)。每一LA模块具有位于N末端附近的短β-发夹、3个二硫键及高度保守的钙结合位点。钙离子藉助4个高度保守的酸性残基(D147、D151、D157、E158)侧链及2个骨架羰基(W144及D149)配位于八面体几何结构中[32]。所有这些酸性基团与芳香族残基(LA4上的W144及LA3上的F105)一起普遍存在于以高亲和力结合至RAP的所有LRP1LA模块对中[33]。在所研究复合物的所有结构中，主要结合要素在于强静电相互作用，其中在带正电荷的赖氨酸(配体)与保守酸性基团之间形成多个H-键，从而在钙离子周围形成带负电荷的冠(受体)。此外，受体中的保守芳香族残基利用疏水性相互作用稳定于赖氨酸链的非极性区域中，如Blacklow综述[34]中对若干相互作用蛋白伴侣所显示(参见图4)。

与LA结构域形成H-键或疏水性相互作用的所有配体残基的完整列表显示于表2中。具有表2条目的结构具有2个相互作用结构域。(例如：2FCW代表RAP与LDLR的LA4结构域之间的相互作用，而2FCW2代表RAP与同一受体的LA3结构域之间的相互作用)。

表2：与LA结构域形成H-键或疏水性相互作用的配体的残基。具有上标*的残基为与LA模块的高度保守的酸性冠系统复合的必需赖氨酸。具有上标**的残基为长链H-键供体残基。具有上标^{^}的残基与受体的W144形成疏水性相互作用。具有上标^！的残基与L143形成疏水性相互作用。具有上标^#的残基与P150形成疏水性相互作用。标记有“(b)”的疏水性相互作用仅涉及骨架原子。

在表3中将所观察到的最为保守的药效特征系统化。

表3：最为保守的药效特征.*这些残基相对于参考2FCW中的那些略有移位。

2.3能够穿过BBB的已知多肽的建模

除自相互作用多肽数据库收集的信息外，发明人亦分析了已知能够穿过BBB的多肽。具体而言，发明人选择研究血管肽及调节子。未获得这些多肽的结构信息，且因此发明人建立模型来处理这些多肽。

在2007年由Demeule及同事[1、2]介绍的血管肽是迄今为止唯一已知能够利用涉及LDLR的机制穿过BBB的多肽。已知调节子多肽穿过BBB。

血管肽

抑肽酶是含有Kunitz型结构域的LRP及LRP2的6500-Da蛋白酶抑制剂配体。血管肽是显示高于抑肽酶的转胞吞作用能力的源自Kunitz结构域的多肽家族。在表4中，发明人报告不同血管肽的转胞吞作用及分布体积值。发明人将血管肽-2(AP2)鉴别为最有希望的多肽，此乃因其具有良好转胞吞作用水平及较高实质/总脑分布体积比率。

对于这些多肽的每一构成AA，这些多肽的第一分析的实施考虑Cai及同事[35]所报导的113种物理化学性质。然后使用聚合式阶层式分群方法以下列方式对多肽分群：

·将每一AA之间的相异性计算为113维空间中的正规化欧几里德距离(euclidean distance)。

·将每一多肽之间的距离计算为处在相同位置的AA之间的距离的和。

分群结果显示于图5中。发明人发现，这些多肽可分为3个主群：(A)血管肽5及8；(B)血管肽76、78、79、AP2、AP1、AP5、AP7；及(C)血管肽90及91。仅使用AA物理化学性质获得的此分群反映转胞吞作用的显著变化：群(A)具有低转胞吞作用百分比；群(B)具有中等值(但对于AP1。AP5及AP7的数据丢失)；群(C)具有最高转胞吞作用值。

表4：血管肽多肽的分布体积*这些值是根据原始公开案图来推断。

对不同氨基酸对转胞吞作用的效应的其他理解在传统上自结构分析获得，但目前尚未获得血管肽的结构信息。因此，发明人使用抑肽酶的结晶Kunitz结构域作为模板遵循同源模型策略建立了血管肽的假设结构(PDB代码2ZJX)。与血管肽AP2的比对显示于下文中，其仅因同源建模程序的功能而丢失最后一个氨基酸(Y)：

AP2 1 TFFYGGSRGKRNNFKTEE 18

2ZJX_A32 TFVTGGARAKBNNFKSAE 49

发明人出于以下原因选择抑肽酶作为模板：

·获得72％的序列同一性，此远高于同源建模的常用临限值35％。

·存在两个赖氨酸(其可能为与LDLR相互作用所必需)。

·潜在地充分定向并暴露与LDLR结合所必需的残基。

通过同源建模获得的AP2的一般折叠显示于图6中。

使用用于折叠预测的从头方法[36、37、38]来确认AP2的同源模型。发明人发现，此从头模型给出与同源模型相似的折叠(参见图7)。

在使用同源建模时，除AP2外，其他血管肽亦显示Kunitz样折叠。基于这些结果，发明人提出血管肽具有Kunitz样折叠。

对AP2-LDLR相互作用建模

然后发明人对AP2与LDLR之间的相互作用建模。考虑到两种主要假设：(A)AP2作为LDLR的单一结构域结合剂(即其结合至单一LA结构域，如对复合物：2FCW、1N7D、2FYL所观察到)；及(B)AP2作为双结构域结合剂(即其结合至2个LA结构域，如对2KNY、1V9U、2KRY、3A7Q所观察到)。所有比对皆是使用LDLR-RAP复合物结构(PDB 2FCW)作为模板来实施。发明人将此视为最佳结构是出于以下若干原因：(i)其为结晶结构；(ii)其具有良好分辨率(1.26A)；及(iii)配体与受体之间相互作用的数目高于其他实验结构中的数目。

作为单一结构域结合剂的AP2

以若干方式严格(仅转译及转体动作)比对AP2的同源结构与RAP-LDLR结晶复合物的RAP关键残基(参见表3)。重叠等效残基的数目最大化的模型_1(表5)视为最适宜：

表5：AP2同源模型至RAP-LDLR复合物(PDB代码2FCW)的迭加.评估范围：1(差)-5(极佳)。

模型_1优化RAP-LDLR相互作用的3个关键残基的迭加：K256，其是必需相互作用赖氨酸；K253及R296，其起LDLR的保守酸性残基的H-键供体作用。(*此构建体是使用RAP K256上的AP2K15及RAP K270上的AP2K10(等效于另一LA模块中的K256)通过对接作为双结构域结合剂的AP2来建立)。

利用力场MMFF94[39]来最小化模型_1。最终最小化结构显示于图8中。

作为双结构域结合剂的AP2

若干实验观察已显示，一些多肽结合至一对LA模块而非单一模块[22、33]。此现象的合理解释在于，亲合力效应在配体与LDLR家族蛋白的结合中起主要作用[21]。在Fisher及同事所解开的晶体结构中，每一个别LA模块与RAP之间的接触界面较小(<400A2)，因此其提出单一模块将不足以提供高亲和力结合。

出于这些原因，发明人亦考虑AP2是否为双结构域结合剂。通过迭加K15(AP2)与K256(RAP)及K10(AP2)与K270(RAP)来比对AP2与RAP(表5的模型_6)。使用MMFF94[39]力场最小化该模型，从而获得图9中所显示的最终结构。

AP2相互作用特征

在两种模型(AP2作为单一及双结构域结合剂)中，3个重要残基(R8、K10及R11)与一个LA模块强烈相互作用，从而与在所有LDLR家族成员中保守的酸性受体残基形成H-键。此外，在模型_6(AP2双结构域结合剂)中，K15与另一LA模块的酸性冠残基形成H-键。所有这些残基(赖氨酸及精氨酸)皆存在于LA结构域的若干已知配体中(表2)。

发明人发现，可在多肽的N端残基与E17的侧链之间建立分子内H-键。此相互作用可限制多肽的挠性且促进AP2-LA相互作用。此可解释血管肽-79远低于AP2的P/B体积分布比率。该2种多肽确实极为相似，但血管肽-79缺少距C端两个氨基酸的谷氨酸(参见图5)。相似地，发明人发现，所有P/B体积分布比率大于0.50的多肽皆在C末端具有酸性残基。唯一例外是血管肽-91，其P/B比率＝0.49。无法检测所预测血管肽-2结构与导致BBB渗透变化的氨基酸变化之间的其他关系。

总的，发明人提供血管肽的新结构模型。5种残基鉴别为对与LA模块的相互作用至关重要，且另一残基用于稳定血管肽的折叠。

利用这些新数据，发明人研发出结合至LDLR且穿过BBB的新多肽。这些多肽分为2个主群(1)一些是基于调节子序列且预期具有β-发夹结构折叠；(2)其他是基于与LDLR相互作用的RAP。

调节子

目标

分析具有或不具有调节子肽(SEQ ID No.1)的纳米颗粒穿过活体外BBB(血脑屏障)模型。

材料及方法

BBB模型

为提供用于研究脑微血管功能的活体外系统，发明人已研发出逼真地模拟活体内BBB的共培养方法，该方法是通过在插入物一侧上培养脑微血管内皮细胞且在另一侧上培养神经胶细胞(星状细胞)来实施。在过滤器上的上隔室中培养内皮细胞且在6孔板塑料上的下隔室中培养星状细胞。

在这些条件下，内皮细胞保留内皮标记(因子VIII相关抗原、非血栓形成表面、产生前列环素、血管收缩素转化酶活性)及BBB的特征(存在紧密接合、缺乏胞饮小泡等)。

●星状细胞培养物

新鲜星状细胞的初代培养物是自Innoprot提供(参考编号P10202)。将其于初始烧瓶中维持48h。将细胞接种于板P100中的AM-a培养基(Innoprot，参考编号1831)中。当80％-90％汇合时，将星状细胞接种于6孔板(125.000个细胞/孔(2ml))中。48-72h后建立共培养。

●牛脑微血管内皮细胞(BBMVEC细胞)

将来自Cell Applications公司的内皮细胞冷冻于氮中。在实施“包覆”方法(来自Cell Applications的附接因子溶液，30min 37℃+来自Sigma的1μg/ml纤连蛋白，10min 37℃)后，将细胞解冻且接种于板P100中的BBMVEC(Cell Applications)的培养基中。在60％-70％细胞汇合时，在实施包覆方法(对于插入物为150000-200000个细胞)后将细胞接种于插入物(6孔板的1,0μm孔，Millipore，PIRP30R48)中。48-72h后建立共培养。

●BBB模型的建立

抽出星状细胞培养基，且在含有星状细胞的孔中添加BBMVEC培养基。将插入物转移至含有星状细胞的孔中。然后获得上隔室(腔室隔室)中的内皮细胞及下隔室(近腔室隔室)中的星状细胞。

●TEER(经上皮的电阻)的测量

在共培养建立72h后，测量腔室与近腔室隔室之间的电阻(每一测量为一式三份)。

当TEER值大于150Ω×cm²时视为良好BBB模型(其中形成紧密接合)。

转胞吞作用实验

在TEER值为230Ω×cm²的2种BBB模型中实施转胞吞作用实验，测试经调节子肽(SEQ ID No.1)修饰的纳米颗粒及未经调节子肽修饰的纳米颗粒以及不含细胞(NP未经修饰)的一插入物空白。

制备样品：存于Ringer溶液中的250μg NP/ml。将所有样品超声波处理10min。在插入物中添加1.5ml样品且在孔(6孔板)中添加2.5ml Ringer溶液。

结果

在37℃下搅动60min后，收集上及下隔室中的样品且利用NTA分析进行分析。

	空白	NP经修饰	NP未经修饰
				上	3.42×10⁸个粒子/ml	3.05×10⁸个粒子/ml	3.94×10⁸个粒子/ml
下	3.61×10⁸个粒子/ml	2.9×10⁸个粒子/ml	0.61×10⁸个粒子/ml
				穿过％	105,555556	95,0819672	15,4822335

这些数据以图表形式显示于图23中。

结论

在良好BBB模型(TEER 230Ω×cm²)中，极少未经修饰的纳米颗粒穿过屏障，而通过空白(不含BBB的插入物)来看，所有未经修饰的粒子穿过屏障。

在纳米颗粒经肽修饰的情形下，几乎所有纳米颗粒(95％)皆穿过BBB。因此，调节子肽在穿过BBB的机制中具有重要作用。

调节子构建体

调节子能够穿过BBB。如上所述，使用牛脑内皮微血管细胞与大鼠初代星状细胞的共培养物作为活体外BBB模型，发明人发现，经调节子修饰的纳米颗粒可穿过BBB，而未经包覆的纳米颗粒不穿过BBB。阴性对照不穿过BBB，从而确认BBB在经修饰纳米颗粒穿过其的同时保持完整。这些实验数据显示于图23中。因此，图23显示调节子(SEQ ID No.1)能够穿过BBB运输纳米颗粒。

调节子是由59个AA(SEQ ID NO:1)构成，且因此大于血管肽(其含有19个AA)。在血管肽与调节子之间未遇到序列相似性(根据BLAST比较方法)。此外，尚未得知关于调节子的结构信息。为研究调节子藉助LDLR的可能的转胞吞作用，发明人实施结构研究，从而容许产生调节子的同源模型。

发明人发现，用于调节子同源建模的最佳模板是P62包膜糖蛋白(PDB代码3N40_P)，其具有68％的高序列同一性，如下文所显示：

调节子同源模型的一般折叠显示于图10中。发明人所获得的同源模型结构可分为2部分：(1)刚性β-发夹结构(于图10中圈出)；及(2)非结构化挠性长链。

发明人注意到，恰好在β-发夹结构的U-小弯处有2个与LDLR的潜在相互作用所必需的残基(K48及R49)。

对调节子-LDLR相互作用建模

与AP2一样，发明人对调节子与LDLR之间的相互作用建模。在此情形下，发明人注意到，关于调节子与LDLR LA模块之间的相互作用业内仍无有效证据。而且，考虑到两种主要假设：(1)调节子作为LDLR的单一结构域结合剂；及(2)作为双结构域结合剂。所有比对皆是使用调节子的同源模型及LDLR-RAP复合物结构(PDB 2FCW)作为模板来实施。

作为单一结构域结合剂的调节子

调节子与LA模块结合的主要假设在于多肽与其结构化部分(于图10中圈出)相互作用。如上文所提及，此区域对应于β-发夹结构(β-链、U-小弯、β-链)，且在U-小弯中具有2种为其他分子结合至LA模块所必需的AA(赖氨酸及精氨酸)。该2种残基的侧链针对可能的相互作用暴露且充分定向。出于此原因，产生以下模型重叠：(1)调节子U-小弯赖氨酸(K48)与RAP的必需相互作用赖氨酸(K256)及(2)U-小弯精氨酸(R49)与RAP的2种不同残基：R296(模型_1)及K253(模型_2)。

因K48及R49二者与LA模块的酸性保守残基形成H-键，故两种模型皆经正面评估(参见表6)。

表6：调节子同源模型至RAP-LDLR复合物(PDB代码2FCW)的迭加.评估范围：1(差)-5(极佳)。

即使调节子K48及R49与LA模块的重要关键残基的相互作用极强且结构上充分拟合，但发明人认为，该2种残基本身的相互作用并不足以结合整个调节子(59个残基)。此假设是基于相对于总调节子表面极小的相互作用表面积(图11)。发明人认为，调节子的挠性环参与结合，且因此将调节子视为双结构域结合剂。

作为双结构域结合剂的调节子

处理呈刚性结构的调节子，其无法以与AP2相同的方式同时与2个LA模块相互作用。模板不允许两个必需赖氨酸具有恰当距离以建立双结合剂模型。为对可能的替代性调节子-LA模块相互作用模式建模，发明人将调节子“切割”成不同小块，以利用那些小块来建立亚组模型。

除包含K48及R49(如上文所提及)的序列外，发明人鉴别出2个可与LA模块相互作用(始终基于赖氨酸/精氨酸模式)的其他主要区域：一个包含K2-K3基序，且另一个包含残基R13、R19及K20、K22。这些区域中最有利者为后者，此乃因其具有大于前者的相互作用表面。此外，其亦具有类似于AP2的挠性Kunitz结构域的残基组成及构型。如前文所述，迭加是通过与LDLR-RAP复合物迭加、然后最小化系统来实施。在最小化结构中，以下调节子残基与LA模块建立H-键：R13、D15、K20(参见图12)。在应用分子动力学模拟时，R19及K22与LA模块开始形成H-键。

基于调节子的挠性，发明人提出，其通过使用发夹结构区域以及自残基R13跨越至K20的部分起双LA模块结合剂作用。

调节子结构的说明

根据上文所阐述的同源建模方式，发明人提出调节子结构为挠性长环，其中仅结构化部分为定位于C端区域附近的β-发夹结构(图10)。该发夹结构由以下残基形成：

·TVIHGKREVTLH(SEQ ID NO:20)

β-发夹结构是自2条β-链及1个U-小弯制造。该2条β-链定位于以下区域中：

·TVIHG(SEQ ID NO:21)

·EVTLH(SEQ ID NO:22)

该U-小弯是自2种必需AA制造：

·KR

较短调节子序列

因此，发明人提出调节子使用其发夹结构区域与LDLR相互作用。发明人设计出两条用于穿过BBB的多肽，其包含调节子的C端部分。设计2个构建体：

调节子_构建体1

序列：PTVIHGKREVTLHL(SEQ ID NO:2)

长度：14个AA。

“调节子_构建体1”多肽包含调节子的最小结构化区域。其结构仅包含β-发夹结构区域(参见图13)。为验证此较短多肽中β-发夹结构的保守性，发明人使用从头方法来预测调节子_构建体1的结构。观察到β发夹结构(参见图14)。

调节子_构建体4

序列：PMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH(SEQ ID NO:3)

长度：23个AA。

“调节子_构建体4”多肽包含调节子_构建体1的全序列及β-发夹结构两端的额外序列。包含调节子C端的所有氨基酸。发明人提出，由于额外序列代表理论上可形成β-折叠的平行环，故调节子_构建体4是尤其适宜的多肽。(参见图15)。发明人使用从头方法来预测调节子_构建体4的结构且获得整个多肽的延长β发夹结构(参见图16)。

RAPα-螺旋

如上文所提及，已知RAP的D3结构域能够结合至LDLR。该相互作用是藉助RAP的2个α-螺旋与2个A型LDL受体(LA)模块发生。单一α-螺旋含有相互作用的必需残基，包含LYS256，而另一者似乎用于稳定复合物。发明人设计出3条基于RAP-D3序列的新多肽。

RH_构建体1

序列：ELKHFEAKIEKHNHYQKQLE(SEQ ID NO:4)

长度：20个AA。

发明人将RH_构建体1多肽鉴别为RAP-D3与LDLR相互作用的最小单元(参见图18)。发明人使用从头方法来预测RH_构建体1的结构且观察到从头至尾的完整α-螺旋结构(参见图19)。

RH_构建体2序列：

DKELEAFREELKHFEAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLRHAESV

(SEQ ID NO:5)

长度：41个AA。

发明人鉴别出RH_构建体2多肽对应于RAP的完整α-螺旋，包含与LDLR相互作用的必需残基。在此处，发明人采用RH_构建体1的较长区段以利于形成α-螺旋，且包含额外区域以帮助BBB移位。该从头预测方法无法用于此多肽，此乃因多肽经优化的长度为9至30个残基，但RH_构建体2具有41个残基。为证实α-螺旋的稳定性，发明人实施100ps的短分子动力学模拟。根据模拟，α-螺旋相对稳定(参见图20)。

RH_构建体3

序列：

DKELEAFREELKHFEAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLRHAESVGDGERVSRSREKHALLEGRTKELGYTVKKHLQDLSGRISRARH(SEQ ID NO:6)

长度：84个AA。

包含大部分RAP D3结构域的RH_构建体3多肽是由2个α-螺旋形成。除RH_构建体2多肽的α-螺旋(包含与LDLR相互作用所必需的残基)外，此构建体是由与LDLR相互作用以稳定复合物的含有Arg296的第二α-螺旋构成。

而且，从头预测方法无法应用于RH_构建体3，此乃因其含有30个以上的残基。为证实α-螺旋的稳定性，发明人实施100ps的短分子动力学模拟。根据模拟，α-螺旋似乎稳定(参见图21)。

其他新多肽的设计

发明人设计出与AP2及RAP模板序列不同的其他新多肽。

根据所编译的相互作用多肽数据库(表2)，发明人区分开2种与LDLR成员相互作用的类型：

1.一些多肽利用位于不同挠性区域中的残基(例如：1V9U、2KRI、3A7Q、1N7D)与LDLR相互作用。

2.其他多肽利用位于α-螺旋中的残基与LDLR相互作用(例如：2FCW、2FCW2、2KNY、2FYL、2FYL2)。

发明人设计出针对两种相互作用类型的多肽：在本文中称为“挠性”及“刚性”多肽。

挠性多肽

能够结合至LDLR的LA模块的挠性多肽的设计主要是基于AP2双结合剂模型中所鉴别出的重要相互作用特征。下列AP2残基因将其视为在促进与LA结构域的相互作用中发挥功能而在发明人模型中保持固定：R8、G9、K10、R11、K15、E17。

所有“挠性”多肽皆具有下列设计标准：

·保持必需AP2残基维持与LA模块的相互作用(R8、G9、K10、R11、K15、E17)。

·修饰AP2非必需残基以：

ο最大化分子间相互作用

ο最大化分子内相互作用

ο形成具有采用挠性-环二级结构高倾向的多肽

ο形成具有可溶于水高可能性的多肽

遵循Costantini及同事[40]所确定的标准来建立AA二级结构倾向，该标准是流行Chou-Fasman方法[41、42]的改良版本。

发明人所设计的挠性多肽列表呈现于表7中。

表7：用于结合LA模块的挠性多肽。突出显示的氨基酸是那些自AP2双结合剂模型保守者。挠性1是SEQ ID NO:7；挠性2是SEQ ID NO:8；挠性3是SEQ ID NO:9；挠性4是SEQ ID NO:10；挠性5是SEQ ID NO:11。

作为实例，发明人详述了所有挠性_1残基的设计：

·选择T1来促进与Y14的疏水性分子内相互作用以促进双倍Kunitz型折叠。

·选择G2作为具有形成挠性环高倾向的残基。

·选择E3来促进与LA模块的R103H-键合的分子间相互作用。

·选择S4作为具有形成挠性环高倾向的极性残基。

·选择N5作为具有形成挠性环高倾向的极性残基。

·选择T6来促进与LA模块的V106的疏水性分子间相互作用。

·选择V7来促进与LA模块的T126的疏水性分子间相互作用。

·R8是视为与LA模块相互作用所必需的AP2残基。

·G9是视为与LA模块相互作用所必需的AP2残基。

·K10是视为与LA模块相互作用所必需的AP2残基。

·R11是视为与LA模块相互作用所必需的AP2残基。

·选择G12作为具有形成挠性环高倾向的残基。

·选择S13作为具有形成挠性环高倾向的极性残基。

·选择Y14来促进与T1的疏水性分子内相互作用以促进双倍Kunitz型折叠。

·K15是视为与LA模块相互作用所必需的AP2残基。

·选择D16来促进与LA模块的Q104 H-键合的分子间相互作用。

·E17是视为与N端分子内相互作用并促进双倍Kunitz型折叠所必需的AP2残基。

·选择N18作为具有形成挠性环高倾向的极性残基。

·选择R19作为与LA模块的D110形成H-键合的分子间相互作用的极性残基。

刚性多肽

发明人的“刚性”多肽设计策略是基于共结晶RAP LA复合物而非AP2。RAP是106个AA形成3个相连接的刚性α-螺旋的大多肽。RAP利用来自其2个最大α-螺旋的残基与2个LA模块相互作用。

发明人设计出可用作单一或双结构域结合剂的形成单一α-螺旋的较小多肽。RAP的主要相互作用基序鉴别为“K**K***Y”，且第二赖氨酸为必需氨基酸。其他2个残基起重要羧酸盐及受体的羰基部分的H-键供体基团作用。因此，发明人提出第一赖氨酸及酪氨酸残基可交换为赖氨酸或精氨酸残基，这些赖氨酸或精氨酸残基亦是H-键供体且带正电荷，从而允许其以最佳方式与酸性受体残基相互作用。RAP模拟物的其他残基应为具有形成α-螺旋高倾向的AA。

Alias及同事成功地使用“Ac-YGDAAAE-X-EAAAAG-NH2”模式获得α-螺旋多肽[43]。多丙氨酸基序确保形成α-螺旋结构，且提出天门冬氨酸残基增加多肽溶解度并提出酪氨酸残基有助于多肽浓度的光谱量化[44]。

发明人所设计的双结构域结合剂大于Alias及同事的多肽，且即使多丙氨酸残基确保形成α-螺旋结构，但丙氨酸为引起溶解度问题的非极性残基。为避开这些溶解度问题，发明人选择在α螺旋结合表面的相对侧将丙氨酸残基突变成谷氨酸残基。选择谷氨酸的原因在于其负电荷，由此增加多肽溶解度且朝向带负电荷的受体表面潜在地定向多肽带正电荷的侧(其是配体的结合位点)。此外，谷氨酸残基具有形成α-螺旋的高倾向。最后，亦考虑存在于RAPα-螺旋中的残基(刚性_5)。

发明人所设计的所有刚性多肽显示于表8中。

表8：所提出的用于LA模块结合的刚性多肽。TPSA是所计算的拓扑极性表面积，其帮助理解多肽的极性。刚性1是SEQ IDNO:12；刚性2是SEQ ID NO:13；刚性3是SEQ ID NO:14；刚性4是SEQ ID NO:15；刚性5是SEQ ID NO:16。

使用上文所阐述的从头方法[36]来预测发明人所设计的所有刚性多肽的结构。从头模型预测所有所提出多肽的α-螺旋结构。观察到两种趋势(考虑长度相同的多肽)：

·丙氨酸数目越少，多肽具有α-螺旋结构的机会越低。

·丙氨酸残基越多，多肽不溶的可能性越大。

荧光标记的肽活体外BBB模型穿过测试

材料及设备

材料

-Ringer-Hepes缓冲液(RH缓冲液)：

NaCl 150mM；KCL 5.2mM；CaCl₂2.2mM；MgCl₂0.2mM；NaHCO₃6mM；Hepes 5mM；葡萄糖2.8mM。调节至pH 7.2-7.4且经由0.22μm过滤器孔径过滤。

-DMEM/F12

-荧光黄-CH，Sigma，参考编号L0259

设备

-细胞培养物培育器(37℃，加湿气氛，95％空气及5％ CO2)

-无菌细胞培养柜

-具有盖子的Millicell 24孔接收机托盘，Millipore参考编号PSMW010R5。

-Corning 96孔固体黑色平底聚苯乙烯TC处理的微量板。

-水浴，37℃

-抽吸系统

-自动微量移液器

-荧光剂

活体外BBB模型的建立

如图22中所阐释实施共培养方法。将混合神经胶细胞的小鼠初代培养物接种于24孔板上且将牛脑内皮细胞培养于存于另一板中的胶原包覆的插入物上。3天后，将插入物移动至含有星状细胞的板中且再培养3天。为评价活体外BBB的完整性，在实验当天测量转内皮电阻(TEER)。高于200Ω/cm²的TEER值视为可接受。

过滤测试

随后实施以下程序以测试膜是否可防止肽自上隔室穿过至下隔室。在20μg/ml荧光团下在插入物的腔室侧施加肽且置于填充有Ringer-Hepes缓冲液(Ringer-Hepes缓冲液的组成是如上文所阐述)的孔中。培育1h后，收集来自上及下隔室的样品且使用荧光剂测量。两个隔室中的肽浓度相等指示肽的扩散不受膜的限制。

穿过测试程序

在DMEM/F12培养基中在20μg/ml的最终荧光团浓度下制备每一测试肽溶液(将以一式三份研究的每一条件考虑在内)。使用经荧光标记的不规则肽样品作为阴性对照。将20μM荧光黄(LY)添加至每一样品中。LY是呈现低大脑渗透的亲水性小分子，且因此其内皮渗透系数揭露内皮细胞单层的完整性。选择与测试肽所携载的荧光标记的Em/Ex光谱兼容的分子示踪剂至关重要以防止FRET样事件。

将插入物移动至每孔含有0.8ml培养基的新24孔板，且在37℃下加热。将400μl预热样品溶液添加至每一插入物中。收集每一溶液的等份试样(t＝0上)，储存在4℃下，且防止其暴露于光以及培养基(t＝0下)。在37℃及5％CO₂下培育60min后收集上及下溶液(t＝60上及t＝60下)。

将来自每一条件(测试肽及阴性对照)的所有样品(t＝0上、t＝0下、t＝60上及t＝60下)平铺于黑色96孔微量板以及相应标准曲线中。使用多孔板读数器测量荧光。

然后实施肽的质量平衡以检查可能的吸收或累积现象。质量平衡值给出实验结束时所回收化合物的百分比，且如下文所显示来计算：

渗透率计算

亦测定LY及所测试肽的内皮渗透系数值。使用清除率原理获得非浓度依赖型运输参数。通过用所运输化合物的量除以供体室浓度及所计算的总清除体积来计算培育时间之间清除体积的增量，如下文所显示：

[C]l代表初始腔室示踪剂/肽浓度，[C]a代表近腔室示踪剂/肽浓度，且Va代表近腔室的体积。在实验期间，清除体积随时间以线性方式增加。针对时间绘制平均清除体积，且通过线性回归分析估计斜率以提供估计的平均值及标准偏差。共培养清除率曲线的斜率表示为PSt，其中PS代表渗透率×表面积产物(以微升/分钟表示)。仅覆盖有胶原的过滤器的清除率曲线的斜率表示为PSf。如下文中所显示来计算内皮单层的PS值(PSe)：

用PSe值除以过滤器的表面积(对于细胞培养插入物millicell24为0.7cm²)以产生内皮渗透系数(Pe，以厘米/分钟表示)。

计算每一样品的LY Pe及测试肽/无规则肽Pe系数。若LY Pe系数值介于0.2-0.8×10^-3cm.min^-1之间，则屏障在实验后视为完整且测试肽及对照的渗透率值主要归因于跨细胞通量。

结果

使用此方法，荧光肽穿过模型BBB且具有下列百分比：

调节子

HKKWQFNSPFVPRADEPARKGKVHIPFPLDNITCRVPMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH(SEQ ID NO:1)。

BBB穿过百分比：3.73％

调节子多肽

序列：PTVIHGKREVTLHL(SEQ ID NO:2)

BBB穿过百分比：11.43％

RAP多肽

序列：ELKHFEAKIEKHNHYQKQLE(SEQ ID NO:4)

BBB穿过百分比：8.27％

挠性多肽

序列：TGESNTVRGKRGSYKDENR(SEQ ID NO:7)

BBB穿过百分比：8.17％

刚性多肽

序列：GDAAAAKAAKAAAKAAADGY(SEQ ID NO:12)

BBB穿过百分比：7.51％

这些数据以图表形式表示于图24中。

结论

发明人已研发出经受受体介导的BBB转胞吞作用的多肽。本发明多肽与试剂的偶联使得可穿过BBB将试剂运输至脑中，此运输原本为BBB所排斥。本发明多肽与治疗剂和/或诊断剂的偶联使得可将治疗剂和/或诊断剂运输至脑，由此提供新的且经改良的治疗及诊断可能性。

序列的说明	SEQ ID NO:
		调节子	1
调节子_构建体1	2
		调节子_构建体4	3
RH_构建体1	4
		RH_构建体2	5
RH_构建体3	6
		挠性_1	7
挠性_2	8
		挠性_3	9
挠性_4	10
		挠性_5	11
刚性_1	12
		刚性_2	13
刚性_3	14
		刚性_4	15
刚性_5	16
		连接体	17
连接体	18
		连接体	19
调节子发夹	20
		β链	21
β链	22
		挠性多肽共有序列	23
挠性多肽共有序列	24

挠性多肽共有序列	25
		挠性多肽共有序列	26
挠性多肽共有序列	27
		挠性多肽共有序列	28
挠性多肽共有序列	29
		挠性多肽共有序列	30
挠性多肽共有序列	31
		挠性多肽共有序列	32
挠性多肽共有序列	33
		挠性多肽共有序列	34
挠性多肽共有序列	35
		挠性多肽共有序列	36
挠性多肽共有序列	37
		挠性多肽共有序列	38
挠性多肽共有序列	39
		挠性多肽共有序列	40
挠性多肽共有序列	41
		挠性多肽共有序列	42
挠性多肽共有序列	43
		挠性多肽共有序列	44
挠性多肽共有序列	45
		挠性多肽共有序列	46
挠性多肽共有序列	47
		受体相关蛋白	48

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Claims

1.一种用于穿过血脑屏障(BBB)的多肽，其中该多肽是：

(a)长度小于59个氨基酸的调节子多肽，其包括SEQ IDNO:2的7个或更多个连续氨基酸，且包括K48及R49(相对于SEQ ID NO:1编号)；

(b)长度小于100个氨基酸的RAP多肽，其包括来自SEQID NO:4的至少20个连续氨基酸；

(c)长度小于100个氨基酸的挠性多肽，其包括挠性环且其中该多肽包括以下序列：

X₁ X₂ E X₃ X₄ X₅ X₆ R G K R X₇ X₈ X₉ K D E X₁₀ X₁₁或

R G K R X₇ X₈ X₉ K D E

其中X₁＝A、F、S或T；X₂＝G、K、R或S；X₃＝S或T；X₄＝N或S；X₅＝A、I或T；X₆＝I、T或V；X₇＝D、E或G；X₈＝S、T或Y；X₉＝F、T或Y；X₁₀＝G或N；X₁₁＝K或R；或

(d)长度小于100个氨基酸的刚性多肽，其包括α螺旋且包括以下共有序列：

(K/R)A(A/E/Q)K A(A/E/Q)A(K/R)，任选地

G D(A/E)_α(K/R)A(A/E/Q)K A(A/E/Q)A(K/R)A X_βG Y

其中优选地，_α为1至10，且_β为1至25。

2.根据权利要求1(a)所述的调节子多肽，包括：

(a)(i)T43、V44、I45、H46、G47和/或(ii)E50、V51、T52、L53及H54(相对于SEQ ID NO:1编号)；和任选地

(b)P43及L55(相对于SEQ ID NO:1编号)；和任选地

(c)(i)P37、M38、A39、R40、E41和/或(ii)H56、P57、D58及H59(相对于SEQ ID NO:1编号)。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中该多肽：

(a)是包括以下序列或由其组成的调节子多肽：SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3；

(b)是包括以下序列或由其组成的RAP多肽：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6；

(c)是包括以下序列或由其组成的挠性多肽：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11；

(d)是包括以下序列或由其组成的刚性多肽：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQID NO:16。

4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽是以重组方式产生。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中该多肽是通过化学合成产生。

6.一种用于运输试剂穿过血脑屏障(BBB)的偶联物，其包括：

(a)根据前述权利要求中任一项所述的肽；及

(b)试剂，

其中该偶联物能够穿过该BBB。

7.根据权利要求6所述的偶联物，其中该试剂为药物、多肽、酶、抗生素、抗癌剂、放射性试剂、抗体、细胞毒素、可检测标记或抗血管生成化合物。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的偶联物，其中该试剂是治疗剂。

9.根据权利要求8所述的偶联物，其中该试剂是小分子药物。

10.根据权利要求6或权利要求7所述的偶联物，其中该试剂是诊断剂，任选地其中该诊断剂为染料、化学发光染料、放射性成像剂、金属螯合络合物、荧光标记、酶-底物标记、抗体或其抗体片段。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的偶联物，其中该多肽是经由连接体偶联至该试剂。

12.根据权利要求6至10中任一项所述的偶联物，其中该多肽是直接偶联至该试剂。

13.根据权利要求6至12中任一项所述的偶联物，其包括纳米颗粒。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的偶联物，其中该试剂可在运输穿过该BBB后自该多肽释放。

15.一种药物组合物，其包括：根据前述权利要求中任一项所述的多肽或偶联物，及药学上可接受的载体。

16.根据前述权利要求中任一项所述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于疗法中。

17.根据权利要求16所述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于治疗神经疾病，任选地脑瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、卒中和/或与BBB的功能障碍相关的疾病。

18.根据前述权利要求中任一项所述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于诊断方法中。

19.根据权利要求18所述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于诊断神经疾病。

20.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至5中任一项所述的多肽。