KR20150100655A - 혈액 뇌 장벽 수송을 위한 폴리펩티드 - Google Patents

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사게티스 바이오테크, 에스엘
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Abstract

본 발명은 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과하는 폴리펩티드를 제공한다. 그러므로, 상기 폴리펩티드는 BBB 수송제이다. 폴리펩티드는 전형적으로 단독으로 또는 치료제 또는 진단제에 커플링되었을 때, 치료상 또는 진단상 유용하거나, 또는 생리학상 유의한 유효 수준으로 BBB를 통과할 수 있다.

Description

혈액 뇌 장벽 수송을 위한 폴리펩티드 {POLYPEPTIDES FOR BLOOD BRAIN BARRIER TRANSPORT}
본 발명은 작용제를 뇌로 전달하는 것에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과할 수 있는 폴리펩티드, 및 전형적으로 신경계 질환의 치료 및/또는 진단에서 BBB를 가로질러 작용제를 수송하는 데 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.
BBB는 미세 물체, 예컨대, 박테리아 및 큰 분자 또는 친수성 분자의 뇌 조직으로의 유입을 제한함으로써 뇌를 매우 효과적으로 보호하는 작용을 한다. 이는 중추 신경계를 표적화하는 약물을 개발할 때 고려해야 하는 중요한 문제이다. 뇌 조직에서 표적 세포에 도달하기 위해서, 말초적으로 투여된 약물은 그 스스로 또는 수송 시스템으로서 운반체를 사용하여 BBB를 통과할 수 있어야 한다. BBB는 잠재적으로 중요한 진단제 및 치료제의 뇌로의 전달을 방해하는 바, 이에 뇌 장애의 진단 및/또는 치료에서 주된 장애물이 된다.
다수의 다른 전략법 사용이 BBB에 의해 부과된 한계를 극복하는 데 도움이 되어 왔고, 이러한 전략법은 광범위하게 3가지 카테고리: 1) 침습적 절차 (예컨대, 수술에 의한 약물의 직접적인 뇌실내 투여); 2) (예컨대, 폴리펩티드의 지질 가용성을 증가시킴으로써 수행되는) 약리학적 접근법; 및 3) 운반체 기반 접근법 (즉, BBB를 가로질러 약물을 수송하는 공지된 운반체 메카니즘을 사용하거나, 변형시킴으로써 고도로 특이적이고, 효과적으로 약물을 전달함으로써 수행되는 것)으로 나뉜다.
2007년, 드뮐(Demeule)과 동료들은 BBB를 통과할 수 있는 일련의 19량체 폴리펩티드를 디자인하였다 [1]. 이들 폴리펩티드 중, "안지오펩-2(angiopep-2)"로 불리는 최상의 폴리펩티드는 저밀도 지단백질 수용체 ("LDLR") 패밀리의 구성원인 LDL 수용체 관련 단백질 (LRP1)을 포함하는 결합 메카니즘을 통해 뇌 세포에서 트랜스사이토시스 (분자를 세포 내부로 수송)를 보이는 것으로 나타났다 [2].
LDLR은 주로 세포내이입을 통해 콜레스테롤 운반 입자를 세포 내로 흡수시키는 것을 담당한다 [3]. 그의 주요 리간드는, 콜레스테롤을 비롯한 상이한 지방 분자를 수송할 수 있는 5가지 주요 지단백질 군 중 하나인 저밀도 지단백질 (LDL)이다. 인간에서 대략 65-70%의 혈장 콜레스테롤은 LDL 형태로 순환한다. 각각의 LDL 입자는, 지방산을 혈류 수성 환경에서 가용성인 상태로 유지시켜 주면서, 지방산 순환을 담당하는 단일 아포지단백질 B100 분자 (아포B-100)를 함유한다. LDLR은 또한, 다중 카피의 아포지단백질 E (아포E)를 함유하는 베타-이동 형태의 초저밀도 지단백질 (b-VLDL)에 밀착 결합한다.
LDLR은 통상 LDLR 패밀리로 지칭되는 전 부류의 수용체를 대표하는 ~840개의 아미노산으로 이루어진 모듈 막횡단 단백질이다. 각 LDLR 패밀리 구성원은 유사 패턴으로 배열된 하나 또는 수개의 하기 도메인: LDL 수용체 A형 ("LA," "CR" 또는 "리간드 결합 반복부"로도 지칭); 표피 성장 인자 유사 (EGF 유사) 및 YWTD (또는 β-프로펠러) 모듈을 함유한다 (도 1, [4]). LDLR의 엑토도메인 (도 2, [4])은 기능상 2개의 영역: N 말단 단부의 7개의 인접한 LDL-A 모듈 (LA1-LA7)로 이루어진 리간드 결합부, 및 EGF 전구체에 상동성인 후속 영역으로 나뉜다. 모듈 LA3 내지 LA7은 LDL에의 결합에 필수적이다 [5]. 2개의 EGF 유사 모듈인, β-프로펠러 도메인 및 제3 EGF 유사 모듈을 포함하는 EGF 영역은 더 낮은 엔도솜 pH에서의 LDL 입자 방출, 및 수용체의 다시 세포 표면으로의 재순환, 둘 모두를 담당한다.
현재까지 이러한 지식에도 불구하고, BBB를 가로질러 작용제를 수송하는 것을 고려해 볼 때, 선택은 한정되어 있다. 관련 기술분야에서는 추가의 개선된 작용제 및 BBB를 가로질러 치료제 및 진단제를 전달하는 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 BBB를 통과하는 폴리펩티드를 제공한다. 그러므로, 상기 폴리펩티드는 BBB 수송제이다. 폴리펩티드는 전형적으로 단독으로, 또는 치료제 또는 진단제와 커플링되었을 때, 치료상 또는 진단상 유용하거나, 또는 생리학상 유의한 유효 수준으로 BBB를 통과할 수 있다.
비록 본 발명은 이론으로 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 폴리펩티드는 세포내이입에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 뇌내로 내재화시키는 LDLR의 LA 도메인에 결합하도록 디자인되었다. BBB를 통과할 수 있는 바, 본 발명의 폴리펩티드는 특히 BBB를 가로질러 다른 작용제를 수송하기 위한, 및 작용제, 전형적으로 약물 또는 진단제를 뇌로 전달하기 위한 운반체로서 유용하다.
본 발명은
(a) 길이가 59개 미만의 아미노산 길이이고, 서열 2의 7개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하고, (서열 1에 대해 넘버링된) K48 및 R49를 포함하고, 임의적으로, (서열 1에 대해 넘버링된) (i) T43, V44, I45, H46, G47 및/또는 (ii) E50, V51, T52, L53 및 H54; 임의적으로 (서열 1에 대해 넘버링된) P43 및 L55; 및 임의적으로 (서열 1에 대해 넘버링된) (i) P37, M38, A39, R40, E41 및/또는 (ii) H56, P57, D58, 및 H59를 포함하는 레귤론 폴리펩티드;
(b) 길이가 100개 미만의 아미노산 길이이고, 서열 4로부터의 20개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 RAP 폴리펩티드;
(c) 길이가 100개 미만의 아미노산 길이이고, 가요성 루프를 포함하며, 하기 서열: X1 X2 E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 X11 또는 R G K R X7 X8 X9 K D E (여기서, X1 = A, F, S 또는 T; X2 = G, K, R 또는 S; X3 = S 또는 T; X4 = N 또는 S; X5 = A, I 또는 T; X6 = I, T 또는 V; X7 = D, E 또는 G; X8 = S, T 또는 Y; X9 = F, T 또는 Y; X10 = G 또는 N; X11 = K 또는 R)를 포함하는 가요성 폴리펩티드; 또는
(d) 길이가 100개 미만의 아미노산 길이이고, 알파 나선을 포함하며, 하기 컨센서스 서열: (K/R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R), 임의적으로 G D (A/E)α (K/R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R) A Xβ G Y (여기서, 임의적으로 α는 1-10이고, β는 1-25임)를 포함하는 강성 폴리펩티드
이거나, 그를 포함하거나, 본질적으로 그로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진, 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과하기 위한 폴리펩티드를 제공한다.
바람직하게, 레귤론 폴리펩티드는 서열 2 또는 서열 3을 포함하거나, 그로 이루어진다.
바람직하게, RAP 폴리펩티드는 서열 4, 서열 5 또는 서열 6을 포함하거나, 그로 이루어진다.
바람직하게, 가요성 폴리펩티드는 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 또는 서열 11을 포함하거나, 그로 이루어진다.
바람직하게, 강성 폴리펩티드는 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16을 포함하거나, 그로 이루어진다.
서열 2 내지 16 각각에 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 그로 이루어진 폴리펩티드 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 재조합적으로 제조된 것이다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 화학적으로 합성된 것이다.
본 발명은 또한 (a) 상기 기술된 폴리펩티드; 및 (b) 작용제를 포함하며; 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과할 수 있는, BBB를 가로질러 작용제를 수송하기 위한 접합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 작용제는 진단제 또는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 링커를 통해 작용제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 작용제에 직접적으로 접합된다. 일부 실시양태에서, 접합체는 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 BBB를 가로질러 수송된 후, 폴리펩티드로부터 방출가능하다.
본 발명은 또한 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 접합체, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한, 상기 정의된 폴리펩티드, 접합체, 또는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 치료학적 용도는 신경계 질환, 임의적으로, 뇌 종양, 뇌 전이, 정신분열증, 간질, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 졸중, 및/또는 BBB의 기능 장애와 관련된 질환을 치료하는 것이다.
본 발명은 또한 진단 방법에서 사용하기 위한, 상기 기술된 폴리펩티드, 접합체, 또는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 진단학적 용도는 신경계 질환의 진단이다.
본 발명은 또한 상기 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 하기 도면을 참조로 하여 기술된다.
도 1: LDLR 패밀리 구성원.
도 2: 7개의 리간드 결합 반복부 (LA/CR), 3개의 EGF 유사 모듈 및 β-프로펠러 단위로 이루어진 LDLR의 엑토도메인.
도 3: LDLR (PDB: 2FCW)에서 LA 도메인 폴딩.
도 4: LA-RAP(D3) 인터페이스와 다른 LA 모듈 인터페이스 비교 (a-d).
도 5: AA를 구성하는 각각에 대하여 정의된, 한 세트의 113개의 물리화학적 특성을 기초로 한 안지오펩의 계층적 클러스터링.
도 6: 상동성 모델링을 통해 수득된 안지오펩-2의 일반적 폴딩.
도 7: AP2 구조의 순이론적 예측.
도 8: (단일 도메인 결합제로서) AP2와 LA 모듈 사이의 가능한 상호작용.
도 9: (이중 도메인 결합제로서) AP2와 LA 모듈 사이의 가능한 상호작용.
도 10: 레귤론의 그의 상동성 모델 (PDB 코드: 3N40)에 따른 일반적 폴딩. 동그라미는 폴딩의 구조화된 부분을 강조 표시한 것이다.
도 11: (단일 도메인 결합제로서) 레귤론과 LA 모듈 사이의 가능한 상호작용.
도 12: (이중 도메인 결합제로서) 레귤론과 LA 모듈 사이의 가능한 상호작용. 오직 제2 결합 영역만 제시되어 있다.
도 13: 전체 레귤론 모델에서 관찰되는 바와 같은, 레귤론_구축물1의 예측 구조.
도 14: 순이론적 방법으로 계산된 레귤론_구축물1의 예측 구조.
도 15: 상동성 기반 레귤론 모델에 기초한 레귤론_구축물4의 예측 구조.
도 16: 순이론적 방법으로 계산된 모델에 기초한 레귤론_구축물4의 예측 구조.
도 17: RAP D3 도메인과 LDLR 사이의 상호작용.
도 18: RAP-LDLR 복합체 (2FCW)의 결정 구조에 기초한 RH_구축물1의 모델.
도 19: 순이론적 방법으로 계산된 RH_구축물1의 예측 구조.
도 20: RAP-LDLR 복합체 (2FCW)의 결정 구조에 기초한 RH_구축물2의 모델.
도 21: RAP-LDLR 복합체 (2FCW)의 결정 구조에 기초한 RH_구축물3의 모델.
도 22: 소 뇌 내피 세포 및 성상세포의 공배양물을 포함하는, BBB의 시험관내 모델의 개략적 대표도.
도 23: 가식되지 않은(un-decorated) 나노입자는 BBB를 통과하지 못한 반면, 레귤론 (서열 1)으로 가식된 나노입자는 BBB를 통과하였다는 것을 보여주는 막대 도표 (NP = 나노입자).
도 24: 형광 표지된 펩티드 시험관내 BBB 모델 통과 시험에 따른 통과 비율(%)을 보여주는 막대 도표.
본 발명은 BBB를 통과할 수 있는 폴리펩티드에 대한 놀라운 확인에 기초하는 것이다. BBB를 통과할 수 있는 신규 폴리펩티드를 확인하기 위한 시도로 본 발명자들은 표적으로서 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR)를 선택하였고, LDLR의 리간드 결합 ("LA") 도메인와 상호작용하는 것으로 공지된 모든 폴리펩티드의 데이터베이스를 컴파일링하였다. 본 발명자들은 상기 폴리펩티드들 모두의 구조 및 활성을 평가하였다. 상이한 환경 조건하에서 다수의 폴리펩티드-LDLR 상호작용을 확인하였고, 본 발명자들은 폴리펩티드가 LDLR의 LA 도메인과 상호작용할 수 있고, 이로써 BBB를 통과하는 데 중요한 구조상 및 약리작용단 특징을 확인할 수 있었다.
구조상 및 약리작용단 모델을 개발하고 개선시키기 위해, 본 발명자들은 BBB를 통과하는 것으로 이미 알려져 있는 수개의 펩티드, 즉, 안지오펩 [Demeule et al., 상기 문헌] 및 레귤론을 분석하였다. 안지오펩은 LDLR과의 상호작용에 의해 BBB를 통과하는 것으로 알려져 있지만, 상기 폴리펩티드에 대한 어떤 구조상의 정보도 이용가능하지 않은 바, 이에 본 발명자들은 안지오펩을 모델링함으로써 구조 비교를 수행할 수 있었다. 레귤론은 또한 BBB를 통과하는 것으로 알려져 있으며, 그의 구조도 알려져 있지만, 레귤론이 BBB를 통과하는 메카니즘에 대해서는 알려져 있지 않다. BBB를 통과하는 데 필요한 중요한 구조상 및 약리작용단 특징을 확인함으로써, 본 발명자들은 상기의 중요한 특징을 포함하고, 이로써 또한 BBB를 통과할 수도 있는 본 발명의 폴리펩티드를 개발하게 되었다.
본 발명의 폴리펩티드는 공통된 특징을 공유한다. 이들 폴리펩티드는 모두 BBB를 통과할 수 있으며, 같은 방법에 의해 확인된 것이고, 모두 LDLR의 LA 도메인에 결합하도록 디자인된 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 4개의 군: "레귤론 폴리펩티드," "RAP 폴리펩티드," "가요성 폴리펩티드" 및 "강성 폴리펩티드"로 세분된다. 본 발명의 폴리펩티드는 전형적으로 하기 서열을 포함하거나, 그로 이루어진다.
레귤론 폴리펩티드
Figure pct00001
레귤론은 BBB를 통과할 수 있다. 그의 구조 및 작용 메카니즘은 아직까지는 알려져 있지 않다.
(하기 실시예에서 논의되는) P62 외피 당단백질과 레귤론 서열의 상동성을 모델링함으로써 본 발명자들은 레귤론이 강성 β-헤어핀 구조 및 구조화되지 않은 가요성 장쇄를 포함한다는 것을 발견하게 되었다. 본 발명자들은 β-헤어핀이 LDLR과 상호작용하고, 이러한 상호작용은 β-헤어핀의 U턴 부위에 (서열 1에 대해 넘버링된) 2개의 중요한 잔기, K48 및 R49를 필요로 한다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 본 발명의 레귤론 폴리펩티드는 (서열 1에 대해 넘버링된) K48 및 R49를 포함한다. 본 발명의 레귤론 폴리펩티드는 BBB를 통과할 수 있다. 이는 예를 들어, 도 22에 도시되어 있고, [Cecchelli et al., Adv Drug Deliv Rev. 1999 Apr 5;36(2-3): 165-178] (참고 문헌 6)에 기술되어 있는 바와 같은 BBEC/래트 성상세포 공배양물 시험관내 모델을 사용하였을 때, 레귤론 (서열 1)로 가식된 나노입자가 BBB를 통과할 수 있다는 것을 입증하는 도 23에 제시되어 있다. 도 23은 또한 가식되지 않은 나노입자는 BBB를 통과하지 못한다는 것을 확인시켜 준다.
전장의 레귤론 폴리펩티드의 길이는 59개의 AA 길이이다 (서열 1). 본 발명의 레귤론 폴리펩티드는 전장 레귤론의 단편인 바, 이에 제조하기가 더 쉽고, 더 저렴하다. 또한, 같은 정도로 또는 더 우수하게 BBB를 통과할 수 있도록 하기 위해 더 짧은 단쇄의 폴리펩티드를 사용하게 되면, 더 작은 중량의 폴리펩티드를 환자에게 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 레귤론 폴리펩티드의 길이는 59개 미만의 아미노산 길이이고, 따라서, 본 발명의 레귤론 폴리펩티드는 서열 1의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 또는 58개의 연속하는 아미노산을 포함할 수 있다.
K48, 및 R49 이외에도, 본 발명의 레귤론 폴리펩티드는 바람직하게 (서열 1에 대해 넘버링된) (a) T43, V44, I45, H46 및 G47, 및/또는 (b) E50, V51, T52, L53 및 H54를 포함하는 데, 이는 상기 아미노산 잔기가 β-헤어핀 형성에 관여하기 때문이다. K48 및 R49 이외에도, 본 발명의 레귤론 폴리펩티드는 더욱 바람직하게 (서열 1에 대해 넘버링된) (a) P42, T43, V44, I45, H46 및 G47, 및/또는 (b) E50, V51, T52, L53, H54 및 L55를 포함하는 데, 이는 상기 아미노산 잔기가, LDLR의 LA 도메인과 상호작용하는 더 큰 β-헤어핀 모티프 형성에 도움을 주기 때문이다. 비록 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 더 큰 β-헤어핀이 LDLR과의 상호작용을 추가로 개선시킨다고 믿고 있다.
레귤론 _ 구축물1
PTVIHGKREVTLHL (서열 2): 레귤론_구축물1
본 발명의 바람직한 레귤론 폴리펩티드는 "레귤론_구축물1" (서열 2)이다. 레귤론_구축물1은 β-헤어핀을 형성하는, 서열 1의 14개의 아미노산 잔기 단편이다.
본 발명은 또한 서열 2의 7개 이상의 연속하는 아미노산, 예컨대, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의 아미노산 잔기를 포함하는 레귤론_구축물1의 단편으로서, 여기서, 단편은 (서열 1에 대해 넘버링된) K48 및 R49를 포함하고, BBB를 통과할 수 있는 능력을 보유하는 것인, 레귤론_구축물1의 단편을 제공한다.
다른 바람직한 단편은 BBB를 통과할 수 있는 능력을 보유하면서, 서열 2의 C 말단으로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산, 및/또는 N 말단으로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산이 결핍되어 있고; 여기서, 단편은 서열 2의 7개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하고, (서열 1에 대해 넘버링된) K48 및 R49를 포함한다. 따라서, 레귤론_구축물1의 아미노산 단편은 서열 2의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개의 연속하는 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 레귤론 폴리펩티드는 또한 서열 2의 변이체를 포함한다. 레귤론_구축물1의 변이체는 전형적으로 서열 2와 85% 이상의 동일성, 예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
레귤론_구축물4
PMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH (서열 3): 레귤론_구축물4
본 발명의 또 다른 바람직한 레귤론 폴리펩티드는 "레귤론_구축물4" (서열 3)이다. 레귤론_구축물4는 서열 2를 포함하는, 서열 1의 23개의 아미노산 잔기 단편이다. 서열 4는, (서열 2와 비교하여) 추가 잔기가 LDLR과 상호작용할 수 있는 베타-시트를 형성하는 평행 가닥을 형성하기 때문에, 특히 적합한 것으로 확인된 것이다.
본 발명은 또한 서열 3의 7개 이상의 연속하는 아미노산, 전형적으로 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 아미노산 잔기를 포함하는 레귤론_구축물4의 단편으로서, 단편은 (서열 1에 대해 넘버링된) K48 및 R49를 포함하고, BBB를 통과할 수 있는 능력을 보유하는 것인, 레귤론_구축물4의 단편을 제공한다.
바람직하게, 본 발명의 레귤론_구축물4 폴리펩티드는 K48 및 R49 이외에도, (서열 1에 대해 넘버링된) (a) P37, M38, A39, R40, E41, P42, T43, V44, I45, H46, 및 G47, 및/또는 (b) E50, V51, T52, L53, H54, L55, H56, P57, D58, 및 H59를 포함한다.
다른 바람직한 단편은 BBB를 통과할 수 있는 능력을 보유하면서, 서열 3의 C 말단으로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산, 및/또는 N 말단으로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산이 결핍되어 있고; 여기서, 단편은 서열 3의 7개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하고, (서열 1에 대해 넘버링된) K48 및 R49를 포함한다. 따라서, 레귤론_구축물4의 단편은 서열 3의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 연속하는 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 레귤론 폴리펩티드는 또한 서열 3의 변이체를 포함한다. 레귤론_구축물4의 변이체는 전형적으로 서열 3과 85% 이상의 동일성, 예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
RAP 폴리펩티드
Figure pct00002
수용체 관련 단백질 (본원에서 RAP로 지칭, 서열 48)은 그의 D3 도메인을 통해 LDLR과 결합할 수 있는 것으로 알려져 있으며, RAP 단백질에 대한 일부 구조 연구는 이미 수행된 바 있다. RAP와 LDLR 사이의 상호작용은 2개의 LDL 수용체 A형 (LA) 모듈과 상호작용하는 2개의 RAP 알파-나선을 통해 일어나는 것으로 알려져 있다. 단일 알파-나선은 K256을 비롯한, 상호작용에 필수적인 잔기를 함유하는 반면, 나머지 다른 한 나선은 복합체를 안정화시키는 것으로 여겨진다. 본 발명자들은 "RH_구축물1" (서열 4), "RH_구축물2" (서열 5) 및 "RH_구축물3" (서열 6)으로 명명되는, 3개의 신규 RAP 폴리펩티드를 개발하였다. 본 발명자들은 코어 단편으로 BBB를 통과하기 위한 RH_구축물1을 확인하였다. 따라서, "RH_구축물2" 및 "RH_구축물3"은 "RH_구축물1"의 서열을 포함한다. "RH_구축물3"은 또한 "RH_구축물2"를 포함한다.
본 발명의 RAP 폴리펩티드는 전장 RAP의 단편인 바, 이에 제조하기가 더 쉽고, 더 저렴하다. 또한, 같은 정도로 또는 더 우수하게 BBB를 통과할 수 있도록 하기 위해 더 짧은 단쇄의 폴리펩티드를 사용하게 되면, 더 작은 중량의 폴리펩티드를 환자에게 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 RAP 폴리펩티드의 길이는 100개 미만의 아미노산 길이이고, 전형적으로 99, 98, 97, 96, 95, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 또는 15개의 아미노산 길이이다.
본 발명의 RAP 폴리펩티드는 알파-나선을 형성하고, BBB를 통과할 수 있다.
RH_ 구축물1
Figure pct00003
"RH_구축물1 (서열 4)은, LDLR과 상호작용하기 위한 RAP-D3의 최소 단위로서 확인된, RAP의 20개의 아미노산 잔기 단편이다.
본 발명의 RAP 폴리펩티드은 또한 서열 4의 변이체를 포함한다. 서열 4의 변이체는 바람직하게 서열 4와 85% 이상의 동일성, 예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
RH_ 구축물2
Figure pct00004
본 발명의 또 다른 바람직한 RAP 폴리펩티드는 RH_구축물2이다. RH_구축물2 (서열 5)는 서열 4를 포함하는, RAP의 41개의 아미노산 잔기 단편이며, 이는 추가로 α-나선 형성을 촉진한다.
본 발명의 RH_구축물2 폴리펩티드는 서열 4의 20개 이상의 연속하는 아미노산, 전형적으로 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 아미노산 잔기를 포함한다.
다른 바람직한 단편은 BBB를 통과할 수 있는 능력을 보유하면서, 서열 5의 C 말단으로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 아미노산, 및/또는 N 말단으로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 아미노산이 결핍되어 있고; 여기서, 단편은 서열 4의 20개 이상의 연속하는 아미노산을 포함한다.
본 발명의 RAP 폴리펩티드은 또한 서열 5의 변이체를 포함한다. RH_구축물2의 변이체는 전형적으로 서열 5와 85% 이상의 동일성, 예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
RH_ 구축물3
Figure pct00005
본 발명의 또 다른 바람직한 RAP 폴리펩티드는 RH_구축물3이다. RH_구축물3 (서열 6)은 서열 5를 포함하는 (따라서, 서열 4 또한 포함하는) RAP의 84개의 아미노산 단편이다. RH_구축물3은 2개의 α-나선을 포함하는, RAP D3 도메인 대부분을 포함한다. LDLR과의 상호작용에 필수적인 잔기를 비롯한, RH_구축물2 폴리펩티드의 α-나선 이외에도, RH_구축물3은 LDLR과 상호작용하고, 복합체를 안정화시키는, Arg296을 함유하는 제2 α-나선을 포함한다.
본 발명의 RH_구축물3 폴리펩티드는 서열 4의 20개 이상의 연속하는 아미노산, 전형적으로 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 또는 81개의 아미노산 잔기를 포함한다.
다른 바람직한 단편은 BBB를 통과할 수 있는 능력을 보유하면서, 서열 6의 C 말단으로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 아미노산 잔기, 및/또는 N 말단으로부터 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개의 아미노산 잔기가 결핍되어 있고; 여기서, 단편은 서열 4의 20개 이상의 연속하는 아미노산을 포함한다.
본 발명의 RAP 폴리펩티드은 또한 서열 6의 변이체를 포함한다. RH_구축물3의 변이체는 전형적으로 서열 6과 85% 이상의 동일성, 예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
가요성 폴리펩티드
"가요성 폴리펩티드"는 가요성 루프를 포함한다. 본 발명자들은 LDLR의 LA 도메인과 상호작용하는 "AP2 이중 결합제 모델"에서 특징을 확인하였다 (하기 실시예 참조). 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 LDLR의 LA 모듈과 상호작용하는 상기 특징을 함유한다.
"RGKRX7X8X9KDE" 모티프는 본 발명자들에 의해 LDLR의 LA 도메인과 상호작용하는 데 중요한 것으로 확인되었고, 따라서, 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
X1 X2 E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 X11 (서열 23); 또는
R G K R X7 X8 X9 K D E (서열 24)
여기서,
· X1은 바람직하게 14번 위치의 아미노산과 소수성 분자내 상호작용을 형성하여 이중 쿠니츠형(Kunitz-type) 폴딩을 촉진시킨다.
· X2는 바람직하게 가요성-루프를 형성하는 성향이 높다.
· E는 LA 모듈의 R103과의 H-결합 분자간 상호작용을 촉진시킨다.
· X3은 바람직하게 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 극성 잔기이다.
· X4는 바람직하게 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 극성 잔기이다.
· X5는 바람직하게 LA 모듈의 V106과의 소수성 분자간 상호작용을 촉진시킨다.
· X6은 바람직하게 LA 모듈의 T126과의 소수성 분자간 상호작용을 촉진시킨다.
· R G K R은 LA 모듈과의 상호작용에 필수적인 것으로 간주된다.
· X7은 바람직하게 가요성-루프를 형성하는 성향이 높다.
· X8은 바람직하게 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 극성 잔기이다.
· X9는 아미노산 X1과의 소수성 분자내 상호작용을 촉진시킴으로써 이중 쿠니츠형 폴딩을 촉진시킨다.
· K는 LA 모듈과의 상호작용에 필수적인 것으로 간주되는 AP2 잔기이다.
· D는 LA 모듈의 Q104와의 H-결합 분자간 상호작용을 촉진시킨다.
· E는 N 단부와 분자내에서 상호작용하고, 이중 쿠니츠형 폴딩을 촉진시키는 데 필수적인 것으로 간주되는 AP2 잔기이다.
· X10은 바람직하게 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 극성 잔기이다.
· X11은 바람직하게 LA 모듈의 D110과의 H-결합 분자간 상호작용을 형성하는 극성 잔기이다.
바람직하게, X1 = A, F, S 또는 T
X2 = G, K, R 또는 S
X3 = S 또는 T
X4 = N 또는 S
X5 = A, I 또는 T
X6= I, T 또는 V
X7 = D, E 또는 G
X8 = S, T 또는 Y
X9 = F, T 또는 Y
X10 = G 또는 N
X11 = K 또는 R.
본 발명의 가요성 폴리펩티드는 서열 24 및 (서열 23의) X1 X2 E X3 X4 X5 X6 X10 및/또는 X11 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 하기를 포함할 수 있다:
Figure pct00006
더 짧은 단쇄의 폴리펩티드는 제조하는 데 더 저렴하고, 더 쉽다. 또한, 같은 정도로 또는 더 우수하게 BBB를 통과할 수 있도록 하기 위해 더 짧은 단쇄의 폴리펩티드를 사용하게 되면, 더 작은 중량의 폴리펩티드를 환자에게 투여할 수 있다.
본 발명의 가요성 폴리펩티드의 길이는 100개 미만의 아미노산 길이, 전형적으로 99, 98, 97, 96, 95, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개의 아미노산 길이다. 바람직하게, 본 발명의 가요성 폴리펩티드의 길이는 15-24개의, 즉, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게 18-21개의 아미노산 길이, 즉, 18, 19, 20 또는 21개의 아미노산 길이이다.
가장 바람직하게, 본 발명의 가요성 폴리펩티드의 길이는 19개의 아미노산 길이이다.
본 발명의 가요성 폴리펩티드는 또한 상기 열거된 가요성 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 전형적으로 상기 열거된 가요성 폴리펩티드 중 하나 이상의 것과 85% 이상의 동일성, 예컨대, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
바람직하게, 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 서열 7, 8, 9, 10 또는 11, 및 그의 단편 또는 변이체를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 강성 폴리펩티드는 서열 7 ("flex_1"), 서열 8 ("flex_2"), 서열 9 ("flex_3"), 서열 10 ("flex_4") 또는 서열 11 ("flex_5") 뿐만 아니라, 그의 단편 및/또는 변이체이다.
"flex_1"
Figure pct00007
일부 실시양태에서, 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 (i) 서열 7로 이루어지고/거나; (ii) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 서열 7과 85% 이상, 즉, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 7의 10개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 flex_1 폴리펩티드의 길이는 100개 미만의 아미노산 길이이다.
"flex_ 2 "
Figure pct00008
일부 실시양태에서, 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 (i) 서열 8로 이루어지고/거나; (ii) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 전형적으로 서열 8과 85% 이상, 바람직하게, 서열 8과 91% 이상의 동일성, 즉, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 8의 9개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 flex_2 폴리펩티드의 길이는 100개 미만의 아미노산 길이이다.
"flex_3"
Figure pct00009
일부 실시양태에서, 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 (i) 서열 9로 이루어지고/거나; (ii) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 전형적으로 서열 9와 85% 이상, 바람직하게, 서열 9와 91% 이상의 동일성, 즉, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 9의 9개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 flex_3 폴리펩티드의 길이는 100개 미만의 아미노산 길이이다.
"flex_4"
Figure pct00010
일부 실시양태에서, 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 (i) 서열 10으로 이루어지고/거나; (ii) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 전형적으로 서열 7과 85% 이상, 즉, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 10의 9개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 flex_4 폴리펩티드의 길이는 100개 미만의 아미노산 길이이다.
"flex_5"
Figure pct00011
일부 실시양태에서, 본 발명의 가요성 폴리펩티드는 (i) 서열 11로 이루어지고/거나; (ii) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 전형적으로 서열 11과 85% 이상, 바람직하게, 서열 11과 90% 이상, 즉, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 11의 10개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 flex_5 폴리펩티드의 길이는 100개 미만의 아미노산 길이이다.
강성 폴리펩티드
본 발명자들에 의해 BBB 수송에 적합한 것으로 확인된 추가의 폴리펩티드 군은 "강성 폴리펩티드"로 명명된다. 본 발명의 "강성 폴리펩티드"는 그의 2차 구조가 α-나선을 포함하기 때문에 상기와 같이 명명되며, 그의 디자인은 공결정화된 RAP-LA 복합체에 기초하였다. (하기 실시예에서 논의되는) RAP의 주요 상호작용 모티프를 확인하였는 바, 이어서, 본 발명자들은 이를 분석하여 BBB를 통과할 수 있는 추가의 폴리펩티드를 제공하였다. 본 발명의 강성 폴리펩티드는 훨씬 더 짧은 단쇄이고, 따라서, 제조하는 데 더 저렴하고, 더 쉽기 때문에, 전장 RAP에 비해 개선을 나타낸다. 또한, 같은 정도로 또는 더 우수하게 BBB를 통과할 수 있도록 하기 위해 더 짧은 단쇄의 폴리펩티드를 사용하게 되면, 더 작은 중량의 폴리펩티드를 환자에게 투여할 수 있다.
본 발명의 강성 폴리펩티드는 하기 컨센서스 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다:
(K/R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R).
바람직하게, 본 발명의 강성 폴리펩티드는 하기 컨센서스 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다:
G D (A/E)α (K/R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R) A Xβ G Y
여기서, 바람직하게, α는 1-10이고 β는 1-25이다.
본 발명의 강성 폴리펩티드의 길이는 100개 미만의 아미노산 길이, 전형적으로 99, 98, 97, 96, 95, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개의 아미노산 길이다. 본 발명의 강성 폴리펩티드의 길이는 바람직하게 10-45개의 아미노산 길이, 즉, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45개의 아미노산 길이다.
본 발명의 강성 폴리펩티드는 또한 상기 열거된 강성 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 본 발명의 강성 폴리펩티드는 바람직하게 상기 열거된 강성 폴리펩티드 중 하나 이상의 것과 95% 이상의 동일성, 예컨대, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 강성 폴리펩티드는 서열 12 ("rigid_1"), 서열 13 ("rigid_2"), 서열 14 ("rigid_3"), 서열 15 ("rigid_4") 또는 서열 16 ("rigid_5") 뿐만 아니라, 그의 단편 및/또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"rigid_1"
Figure pct00012
"rigid_1" 폴리펩티드 (서열 12)는 단일 도메인 결합제로서 (즉, LDLR의 단일 LA 모듈과 상호작용할 수 있는 것으로서) 확인된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 강성 폴리펩티드는 (i) 서열 12로 이루어지고/거나; (ii) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 전형적으로 서열 12와 85% 이상, 바람직하게, 서열 12와 95% 이상, 즉, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 12의 16개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 rigid_1 폴리펩티드의 길이는 (상기 논의된 바와 같이) 100개 미만의 아미노산 길이이다.
"rigid_2"
Figure pct00013
"rigid_2" 폴리펩티드 (서열 13)는 단일 도메인 결합제로서 확인된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 강성 폴리펩티드는 (i) 서열 13으로 이루어지고/거나; (ii) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 전형적으로 서열 13과 85% 이상, 바람직하게, 서열 13과 95% 이상, 즉, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 13의 11개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 rigid_2 폴리펩티드의 길이는 (상기 논의된 바와 같이) 100개 미만의 아미노산 길이이다.
"rigid_3"
Figure pct00014
"rigid_3" 폴리펩티드 (서열 14)는 이중 도메인 결합제로서 (즉, LDLR의 2개의 LA 모듈과 동시에 상호작용할 수 있는 것으로서) 확인된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 강성 폴리펩티드는 (i) 서열 14로 이루어지고/거나; (ii) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 전형적으로 서열 14와 85% 이상, 즉, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 14의 7개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 rigid_3 폴리펩티드의 길이는 (상기 논의된 바와 같이) 100개 미만의 아미노산 길이이다.
"rigid_4"
Figure pct00015
"rigid_4" 폴리펩티드 (서열 15)는 이중 도메인 결합제로서 확인된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 강성 폴리펩티드는 (i) 서열 15로 이루어지고/거나; (ii) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 전형적으로 서열 15와 85% 이상, 즉, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 15의 7개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 rigid_4 폴리펩티드의 길이는 (상기 논의된 바와 같이) 100개 미만의 아미노산 길이이다.
"rigid_5"
Figure pct00016
"rigid_5" 폴리펩티드 (서열 16)는 추정 이중 도메인 결합제로서 확인된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 강성 폴리펩티드는 (i) 서열 16으로 이루어지고/거나; (ii) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하고/거나; (iii) 서열 16과 85% 이상, 즉, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 가지고/거나; (iv) 서열 16의 7개 이상의 연속하는 아미노산, 즉, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개의 연속하는 아미노산을 함유한다. 본 발명의 rigid_5 폴리펩티드의 길이는 (상기 논의된 바와 같이) 100개 미만의 아미노산 길이이다.
혈액 뇌 장벽 통과에 대한 검정
본 발명의 폴리펩티드 및 접합체는 BBB를 통과할 수 있다. BBB는 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 생체내 존재할 수 있거나, 또는 BBB의 생체외 또는 시험관내 모델일 수 있다. 폴리펩티드 또는 접합체가 BBB를 통과할 수 있는지 여부를 시험하는 검정은 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
통상의 기술자는 뇌 기원의 세포를 사용하는 적합한 시험관내 BBB 모델이 (i) 단리된 뇌 모세혈관; (ii) 초기 계대 또는 계대수가 낮은 뇌 모세혈관 내피 세포 배양물; (iii) 소 뇌 내피 세포 배양물 (BBEC); 및 (iv) 무한증식 뇌 내피 세포, 예컨대, RBE4 세포주, RBEC1 세포주 및 TR-BBB13 세포주를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
관련 기술분야에서 BBB의 모델로서 유용한 것으로 알려져 있는, 비-뇌 기원의 세포를 사용하는 시험관내 BBB 모델은 MDCK (마딘-다비 개과 신장(Madin-Darby canine kidney) 세포 및 CaCo-2 세포를 포함한다.
BBB의 생체내 모델로는 (i) 시험 화합물을 방사성 표지된 참조 화합물과 함께 동물의 총 경동맥 내로 주사하고, 주사 후 수초 경과 후 뇌를 분석하는, 경동맥 주사 기법; (ii) 뇌의 경동맥 관류 후, 뇌내 약물 수준을 샘플링하는 보다 장시간의 실험 기간을 포함하는, 계내 관류 기법; (iii) 대퇴부 정맥 또는 꼬리 정맥에 캐뉼러를 삽입하고, 혈장 부피 마커와 함께 시험 화합물을 주사하고, 다양한 시점에 동맥혈을 수집하는, 정맥내 주사 기법; 및 (iv) 뇌 간질액 내로 유입되는 화합물이 생리학적 용액으로 투과되고, 적절한 기법 (HPLC, 모세혈관 전기영동)에 의해 검정될 수 있는 것인, 생리학적 용액으로 관류되는 투석 섬유를 뇌내로 이식하여 뇌 간질액을 직접 샘플링하는 것을 포함하는 뇌내 미세투석을 포함한다.
따라서, 통상의 기술자가 주어진 화합물이 치료상 유용한 양 또는 생리학상 유의한 양으로 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있는지 여부를 측정하는 것은 간단한 작업이다.
폴리펩티드 또는 접합체가 BBB를 통과할 수 있는지 확인하는 데 사용될 수 있는 적합한 시험관내 BBB 수송 검정의 예는 소 뇌 내피 세포 배양물 (BBEC)이다. BBEC 모델에서, 세포를 소 뇌의 회색질로부터 단리시킨 후, 전형적으로는 사전에 래트 꼬리 콜라겐으로 코팅된 표면 상에서 성장시킨다. 모델을 개선시키기 위해, BBEC를 (전형적으로 신생 래트로부터의) 1차 성상세포 또는 C6 래트 신경교종 세포와 함께 공배양시킬 수 있다. 도 22는 성상세포 및 소 뇌 모세혈관 내피 세포의 공배양물을 도시한 것이다. 상기 공배양물 검정은 생체내 BBB와 매우 유사하다. 첵첼리(Cecchelli) 등 (참고 문헌 6)은 소 뇌 모세혈관 내피 세포 및 래트 1차 성상세포의 공배양물을 포함하는 바람직한 BBEC 검정을 기술하였다. 상기 검정은 강력한 생체내 및 시험관내 상관관계를 가진, BBB의 적당한 시험관내 모델을 제공하는 것으로 나타났다. 도 22에 도시되어 있는 바와 같은 (특히 참고 문헌 6의 168-172페이지에 기술되어 있는 바와 같은) 상기 모델에서, 소 뇌 내피 세포는 막 상에서 배양하고, 래트 1차 성상세포는 배양용 접시의 바닥 상에서 배양한다.
도 22에 제시되어 있는 바와 같이, 상기 두 세포 집단은 배양 배지를 공유하며, 이를 통해 세포는 직접 접촉하지 않고 체액 교환이 이루어질 수 있다. 도 22에는 콜라겐으로 코팅된 삽입물 (밀리셀 CM(Millicell CM), 공극 크기 0.4 mm, 밀리포어(Millipore)) 상에서 배양된 전면배양 소 뇌 내피 세포의 구조가 도시되어 있다. 소 뇌 모세혈관 내피 세포는 소형의, 빽빽하게 패킹된, 비-중첩 및 접촉 억제된 세포로 이루어진 단층을 형성한다. 상기 배양 조건에서, 소 뇌 모세혈관 내피 세포는 내피 (인자 VIII-관련 항원, 안지오텐신 전환 효소) 및 BBB 특징, 둘 모두를 유지한다. 상기 BBB 수송 검정을 수행하기 위한 키트 ("CT 보비알@BBB 팩(CT Bovial@BBB Pack)")는 셀리알(Cellial) (프랑스 랑스; www.cellial.com)로부터 상업적으로 이용가능하다.
투과성 및 일반 수송 메카니즘은 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 설명될 수 있다. 참고 문헌 6에서, 예를 들어, 링거(Ringer)-HEPES (150 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 2.2 mM CaCl, 0.2 mM MgCl, 6 mM NaHCO, 2.8 mM 글루코스, 5 mM HEPES)를 6웰 플레이트의 하부 구획에 첨가한다 (웰당 2.5 ml). 이어서, 하나의 필터를 링거를 함유하는 6웰 플레이트의 제1 웰로 옮기고, 표지된 또는 비표지된 약물을 함유하는 링거는 상부 구획에 배치한다. 약물 첨가 후 다른 시점에, 필터를 6웰 플레이트의 또 다른 웰로 옮겨 놓음으로써 하부 구획에서 상부 구획으로부터의 가능한 통과를 최소화시킨다. 37℃ 로킹 플랫폼 상에서 인큐베이션을 수행한다. 진탕은 세포 단층 표면 상의 수성 경계층의 두께를 최소화하고, 친유성 용질의 투과성에 영향을 준다. 각 하부 구획 및 원액으로부터 분취액을 채취하고, 비표지된 약물에 대해 HPLC에 의해, 또는 표지된 약물에 대해 액체 섬광 계수기로 각 샘플 중 약물의 양을 측정한다. 투과도 계산은 문헌 [Siflinger-Birnboim et al., J Cell. Physiol. 132; 111-117] (참고 문헌 45)에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
상기 기술된 검정, 또는 관련 기술분야에 공지된 또 다른 적합한 검정은 본 발명의 폴리펩티드 및 접합체가 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있는지를 확인하는 데 사용될 수 있다.
LDLR에의 결합 검정
본 발명의 폴리펩티드 및 접합체는 LDLR에 그의 LA 도메인을 통해 결합하도록 디자인되었다. 폴리펩티드가 LDLR LA 도메인에 결합하는지 여부는 통상의 기술자에게 널리 공지된 표준 기법, 예를 들어, 시험 폴리펩티드를 사용 및 사용하지 않고 면역검정, 예컨대, ELISA 검정, 방사성 리간드 결합 검정, 표면 플라즈몬 공명 검정, 예컨대, 비아코어(Biacore)™ 방법, 또는 구조 분석법 (예컨대, X선)을 사용하여 시험될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 마이크로 몰 이상의 해리 상수 (Kd), 예컨대, 10-6 M 이상, 바람직하게, 나노몰의 Kd, 예컨대, 10-9 M 이상으로 LDLR의 LA 도메인에 결합한다.
항-LDLR 항체는 폴리펩티드 또는 접합체가 LDLR에 결합함으로써 BBB를 통과하는지 여부를 시험하기 위해 경쟁 검정에서 사용될 수 있다. 항-LDLR 항체는 LDLR에 결합하는 폴리펩티드 및 접합체와 LDLR 결합에 대하여 경쟁하고, 따라서, LDLR에 결합하여 BBB를 통과하는 폴리펩티드 또는 접합체의 양을 감소시킨다. 따라서, LDLR을 매개로 한 BBB 통과는 (수용체에의 결합을 차단하는) 항-LDLR 항체의 존재 또는 부재하에서 상기 기술된 바와 같은 BBB 수송 검정을 수행하고, BBB의 투과도를 펩티드 및 접합체와 비교함으로써 측정될 수 있다. 항-LDLR 항체의 존재하에서 BBB의 통과가 감소되었다면, 이는 폴리펩티드 또는 접합체가 LDLR을 매개로 하여 BBB를 통과한다는 것을 나타내는 것이다.
신경교종 세포는 그의 표면 상에 LRP1 (LDLR) 수용체를 과다발현하는 것으로 기술되어 있고, 이는 신경교종 세포 (U87MG)를 알렉사(Alexa) 488로 표지된 아브캄(abcam) LRP1 항체 (1:500 희석액)와 접촉시킴으로써 확인되었다. DAPI를 이용하여 병치를 수행하고, 사진 촬영을 하였다. 이는 공초점 현미경 및 소 내피 세포 (BBB 키트)를 사용하여 반복할 수 있다. 따라서, 신경교종 세포는 LRP1을 발현하고, 신경교종 세포를 포함하는 시험관내 BBB 모델, 예컨대, 신경교종 세포와 함께 공배양된 BBEC는 폴리펩티드 또는 접합체가 LDLR에 결합함으로써 BBB를 통과하는지 여부를 확인하기 위해 (상기 기술된 바와 같이) 경쟁 검정에서 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드
폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. "폴리펩티드"라는 용어는 "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 폴리펩티드는 다양한 형태, 예컨대, 천연, 융합, 글리코실화된, 비-글리코실화된, 지질화된, 비-지질화된, 인산화된, 비-인산화된, 미리스토일화된, 비-미리스토일화된, 단량체, 다량체, 미립자, 또는 변성된 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 발현, 세포 배양물로부터의 정제 및 화학적 합성을 비롯한, 다양한 수단에 의해 제조될 수 있다. 재조합적으로 발현된 폴리펩티드가 바람직하고, 특히, 하이브리드 및 융합 폴리펩티드가 바람직하다.
본 발명의 폴리펩티드는 정제된 또는 실질적으로 정제된 형태로, 즉, 다른 폴리펩티드는 실질적으로 없는, 예컨대, 천연적으로 발생된 폴리펩티드, 특히, 다른 숙주 세포 폴리펩티드는 없는 형태로 제공될 수 있고, 일반적으로 약 50% (중량 기준) 이상 순수하고, 일반적으로 약 90% 이상 순수하며, 즉, 조성물 중 약 50% 미만, 및 더욱 바람직하게 약 10% 미만 (예컨대, 5%)이 다른 발현 폴리펩티드로 이루어진다. 따라서, 조성물 중 폴리펩티드는 분자 발현이 이루어진 전체 유기체로부터 분리된 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 전형적으로 단리 또는 정제된 것이다.
"폴리펩티드"라는 용어는 임의 길이의 아미노산 중합체를 의미한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 개입되어 있을 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대, 표지된 성분과의 접합에 의해 변형될 수 있는 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산) 뿐만 아니라, 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드 또한 포함한다. 폴리펩티드는 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 존재할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 변이체는 바람직하게 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환하는, 폴리펩티드 서열에의 개별 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능상 유사한 아미노산을 기술하는 표는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
접합체
한 측면에서, 본 발명은 작용제에 연결된 본 발명의 폴리펩티드 {즉, "레귤론 폴리펩티드," "RAP 폴리펩티드," "가요성 폴리펩티드" 또는 "강성 폴리펩티드"; 예컨대, 서열 2 내지 16 중 임의의 것을 포함하는 것}를 제공한다. 작용제에 연결된 본 폴리펩티드는 관련 기술분야에서 일반 용어인 접합체로서 지칭된다. 본 발명의 접합체는 BBB를 통과할 수 있다. 전형적으로, 작용제는 BBB를 가로질러 수송하고자 하는 작용제, 예컨대, 진단 또는 요법에 사용하기 위한 작용제이다.
작용제는 전형적으로 치료제 또는 진단제이다.
작용제는 약물, 폴리펩티드, 효소, 항생제, 항암제, 방사성 작용제, 항체, 세포 독소, 검출가능한 표지 또는 항-혈관신생 화합물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 작용제는 이종 폴리펩티드이고, 예컨대, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 상이한 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질을 제공한다. 통상의 기술자는 본 발명의 폴리펩티드가 더욱 긴 장쇄의 폴리펩티드의 단편일 때, "이종 단백질"은 상기 더욱 긴 장쇄의 폴리펩티드의 상호 서열이 아님을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 작용제는 치료제 및/또는 진단제에 대한 비히클로서의 작용을 하는 나노입자의 일부를 포함하거나, 그의 일부이다. 본 발명의 폴리펩티드는 전형적으로 나노입자의 표면에 연결된다. 바람직하게, 나노입자는 생분해성이다. 치료제 또는 진단제는 전형적으로 나노입자 매트릭스 안에 용해되거나, 포획되거나, 캡슐화되거나, 또는 나노입자 매트릭스에 부착된다. 생분해성 나노입자, 특히, 친수성 중합체, 예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)로 코팅된 것이 약물 전달 장치로서 유용한데, 그 이유는 장기간 동안 순환되고, 전달을 위한 특정 부위를 표적화할 수 있기 때문이다 [Mohanraj & Chen Trop. J. Pharm . Res. 5, 561-573 (2006)]. 유리 비히클로서 나노입자를 사용하는 것에는 많은 장점이 있다. 전신 통과 후 치료제 또는 진단제의 수동적 및 능동적 표적화, 이 둘 모두의 표적화 달성을 위해 나노입자는 입자 크기 및 크기 특징을 쉽게 조작될 수 있다. 특히, 수송 동안 국재화 부위에서 치료제의 방출을 조절하고 지속시킴으로써 치료 효능을 증가시키고, 다른 기관과의 상호작용을 최소화시켜 부작용을 감소시키기 위해 치료제의 기관 분포 및 이어지는 치료제의 제거를 변경시킨다. 방출 조절 및 입자 분해 특징은 매트릭스 성분의 선택에 의해 쉽게 조절될 수 있다. 치료제 또는 진단제의 적재량은 상대적으로 높고, 치료제 또는 진단제는 어떤 화학 반응 없이 시스템 내로 혼입될 수 있으며; 이는 치료제 또는 진단제의 활성을 보존하는 데 있어 중요한 인자가 된다.
한 실시양태에서, 나노입자는 동시 계류 출원 PCT/IB2012/052320에 기술되어 있는 나노입자로서, 여기서, 나노입자는 블록 공중합체, 및 임의적으로 하나 이상의 치료제 또는 진단제(들)를 포함하고, 여기서,
(i) 블록 공중합체는 블록 A 및 D를 포함하고;
(ii) 블록 A는 단량체 단위 B 및 C를 포함하는 제1 중합체로 이루어지고, 여기서, B는 총 탄소 원자수가 ≤ 30이고, C는 디히드록시 또는 디아미노 단량체이고;
(iii) 블록 D는 히드록실 수가 ≥ 10인 에스테르 또는 에테르 결합을 함유하는 탄화수소 쇄를 포함하는 제2 중합체로 이루어지는 것인, 나노입자이다.
치료제 또는 진단제(들)는 나노입자 내에, 또는 나노입자의 표면 상에 존재할 수 있다. 치료제 또는 진단제(들)와 나노입자 사이의 상호작용은 전형적으로 비-공유 결합, 예를 들어, 수소 결합, 정전기 상호작용 또는 물리적 캡슐화이다. 그러나, 대안적 실시양태에서, 치료제 또는 진단제(들) 및 나노입자는 공유 결합 또는 링커에 의해 연결된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 작용제에 접합된 본 발명의 폴리펩티드로 이루어진 다량체를 제공한다.
접합체는 전형적으로 치료상 또는 진단상 유용한 유효 수준 또는 생리학상 유의한 수준으로 BBB를 통과할 수 있다. 필요한 치료제 또는 진단제 수준은 작용제, 진단 또는 치료받는 대상체 및 병증에 따라 달라질 것이며, 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 접합체는 BBB를 통과할 수 있는 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 유지하며, 즉, 접합체는 작용제와 접합되기 이전의 본 발명의 폴리펩티드와 비교하여 BBB를 통과할 수 있는 능력을 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130% 이상 가진다. BBB를 통과할 수 있는 능력은 상기 언급된 검정을 비롯한, 임의의 적합한 BBB 수송 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
작용제가 치료제인 접합체
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드가 연결된 작용제는 치료제이다. 치료제는 전형적으로 약물이다.
특정 실시양태에서, 치료제는, 전형적으로 분자량이 1,000 달톤 미만인 소형 분자 약물일 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료제는 "생물학적"인 것, 예컨대, 항체 또는 항체 단편, 인터루킨, 인터페론, 또는 다른 단백질일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 이종 (치료학적) 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질을 제공한다.
전형적인 치료제로는 (i) 마이크로튜불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라제 억제제, 또는 DNA 삽입제로서 작용할 수 있는 화학치료제; (ii) 효소적으로 작용할 수 있는 단백질 독소; (iii) 방사성 동위 원소; (iv) 항생제; (v) 진통제; (vi) 항정신병제; 및 (vii) 항우울제를 포함한다. CNS 내에서, 더욱 바람직하게, 뇌에서 활성을 띠는 치료제가 바람직하다. 이는 (i) 항우울제, 항정신병제, 자극제, 항불안제 및 진정제를 비롯한, 향정신성 약물, 및 (ii) 뇌 신생물, 예컨대, 뇌 종양을 치료하기 위한 항신생물성 약물을 포함한다.
작용제가 진단제인 접합체
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드가 연결된 작용제는 진단제이다. 진단제는 질환, 장애, 병증 또는 병리의 존재 또는 정도를 측정하는 데 사용될 수 있는 작용제이고; 바람직하게, 신경계 질환을 진단하는 것이다. 전형적인 진단제는 x선 조영 제제, 방사성 동위 원소, 표지 및 염료이다.
진단제는 전형적으로 염료, 화학발광 염료, 방사성 영상화제, 금속 킬레이트 착물, 표지, 예컨대, 형광 표지, 효소-기질 표지, 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하거나, 그로 이루어진다.
본원에서 사용되는 바, "표지"라는 용어는 (i) 검출가능한 신호를 제공하거나; (ii) 제2 표지와 상호작용하여 제1 또는 제2 표지에 의해 제공되는 검출가능한 신호, 예컨대, FRET (형광 공명 에너지 전이)를 변형시키거나; (iii) 항원 또는 리간드와의 상호작용을 안정화시키거나, 또는 그와의 결합 친화도를 증가시키거나; (iv) 전하, 소수성, 형상, 또는 다른 물리적 파라미터에 의해 이동성, 예컨대, 전기영동 이동성, 또는 세포 투과성에 영향을 주거나; 또는 (v) 포획 모이어티를 제공하여 리간드 친화도, 항체/항원 결합, 또는 이온 착물화를 조절하는 작용을 하는, 본 발명의 폴리펩티드에 부착될 수 있는 작용제를 의미한다.
일부 실시양태에서, 진단제는 이종 폴리펩티드이고, 예컨대, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 이종 (진단학적) 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질을 제공한다. 이종 폴리펩티드는 표지될 수 있다. 이종 폴리펩티드는 항체, 항체 단편, 수용체 또는 표적에 선택적으로 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드, 예컨대, 질환 병리를 특징으로 하는 변경된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 아밀로이드 플라크에 선택적으로 결합하는 표지된 항체 또는 단편은 알츠하이머병을 진단하는 데 사용될 수 있는 반면, 종양 마커에 선택적으로 결합하는 표지된 항체 또는 단편은 종양의 존재를 진단하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 작용제에의 연결
본 발명의 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 작용제에 연결, 즉, 접합될 수 있다. 전형적으로, 연결은 화학적 접합에 의해 또는 (작용제가 폴리펩티드일 때) 본 발명의 폴리펩티드 및 작용제를 포함하는 융합 단백질을 발현함으로써 수행될 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 "링커"를 통해 작용제에 접합된다. 링커는 2개 이상의 반응성 부위를 가진다. 링커의 한 반응성 부위는 폴리펩티드의 잔기에 결합되고, 나머지 다른 한 반응성 부위는 작용제에 결합된다. 링커는 하나 이상의 작용제를 본 발명의 폴리펩티드에 연결하여 접합체를 형성하는 데 사용될 수 있는 이작용성 또는 다작용성 모이어티이다. 접합체는 작용제 및 본 발명의 폴리펩티드에의 결합을 위한 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 접합체가 본 발명의 폴리펩티드 및 이종 단백질 (즉, 작용제)을 포함하는 경우, 링커는 본 발명의 폴리펩티드의 C 말단에 및 작용제의 N 말단에 위치하는, 또는 그 반대로 위치하는 또 다른 폴리펩티드 서열일 수 있다. 상기 경우에서, 접합체는 본 발명의 폴리펩티드, 이종 단백질 (즉, 작용제) 및 폴리펩티드 링커를 하이브리드 또는 융합 단백질로서 발현시킴으로써 편리하게 제조될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 작용제에 직접 접합된다 (즉, 본 발명의 폴리펩티드는 링커를 통해 작용제에 접합되지 않는다).
일부 실시양태에서, 작용제는 이종 폴리펩티드이다. 상기 경우에서, 본 발명의 폴리펩티드는 전형적으로 펩티드 결합을 통해 작용제에 접합된다. 펩티드 결합은 예를 들어, 폴리펩티드 화학 분야에 널리 공지되어 있는 액상 합성 방법 ([E. Schroder and K. Luibke, "The polypeptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드와 이종 폴리펩티드 (및 임의적으로, 폴리펩티드 링커) 사이의 펩티드 결합은 접합체를 하이브리드 또는 융합 단백질로서 발현시킴으로써 형성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 이종 폴리펩티드인 작용제를 포함하는 접합체는 식 NH2-F-A-{-X-L-} n -B-G-COOH (여기서, X는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열이고; L은 임의적인 링커 아미노산 서열이고; A는 임의적인 아미노산 서열이고; B는 임의적인 아미노산 서열이고; F는 작용제를 코딩하는 임의적인 아미노산 서열이고; G는 작용제를 코딩하는 임의적인 아미노산 서열이고; n은 1 이상 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6 등)인 정수이다)로 표시될 수 있다. 일반적으로, n은 1, 2 또는 3이다. 이종 폴리펩티드인 작용제를 포함하는 본 발명의 접합체는 F 및/또는 G를 포함한다. F 및 G는 동일한 작용제 또는 상이한 작용제일 수 있다.
{-X-L-}의 각 n의 경우에서, 링커 아미노산 서열 -L-은 존재하거나, 존재하지 않을 수 있다. 예를 들어, n=2일 때, 하이브리드는 ....X1-L1-X2-L2..., ...X1-L1-X2..., ...X1-X2-L2... 등일 수 있다. 링커 아미노산 서열(들) -L-은 전형적으로 짧은 단쇄가 될 것이다 (예컨대, 20개 이하의 아미노산, 즉, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개). 그 예로 클로닝을 촉진시키는 짧은 단쇄의 폴리펩티드 서열, 폴리-글리신 링커 (즉, Gly n (여기서, n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과)을 포함하는 것), 및 히스티딘 태그 (즉, His n (여기서, n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과))를 포함한다. 다른 적합한 링커 아미노산 서열은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 유용한 링커는 GSGGGG (서열 17) 또는 GSGSGGGG (서열 18)이며, 여기서, Gly-Ser 디펩티드는 BamHI 제한 부위로부터 형성되며, 이로써 클로닝 및 조작을 지원하고, (Gly)4 테트라펩티드가 전형적인 폴리-글리신 링커이다. 다른 적합한 링커, 특히 최종 Ln으로서 사용하기 위한 것으로서 적합한 것은 Leu-Glu 디펩티드 또는 서열 19이다. 일부 실시양태에서, 예컨대, X가 오직 펩티드 결합에 의해서만 또 다른 X 및/또는 B에 직접 부착될 때, L은 존재하지 않는다.
-A-는 임의적인 N 말단 아미노산 서열이다. 이는 전형적으로 짧은 단쇄가 될 것이다 (예컨대, 40개 이하의 아미노산, 즉, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개). 예로는 단백질 수송을 지시하는 리더 서열, 또는 클로닝 또는 정제를 촉진하는 짧은 단쇄의 폴리펩티드 서열 (예컨대, 히스티딘 태그, 즉, His n (여기서, n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과))을 포함한다. 다른 적합한 N 말단 아미노산 서열은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. X1에 그 자신의 N 말단 메티오닌이 존재하지 않을 경우, -A-는 바람직하게 N 말단 메티오닌을 제공하는 올리고 펩티드 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산), 예컨대, Met-Ala-Ser, 또는 단일 Met 잔기이다.
-B-는 임의적인 C 말단 아미노산 서열이다. 이는 전형적으로 짧은 단쇄가 될 것이다 (예컨대, 40개 이하의 아미노산, 즉, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개). 예로는 단백질 수송을 지시하는 리더 서열, 또는 클로닝 또는 정제를 촉진하는 짧은 단쇄의 폴리펩티드 서열 (예컨대, 히스티딘 태그, 즉, His n (여기서, n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과)을 포함하는 것), 또는 단백질 안정성을 증진시키는 서열을 포함한다. 다른 적합한 C 말단 아미노산 서열도 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
일부 실시양태에서, 작용제는 BBB 통과 후, 본 발명의 폴리펩티드로부터 방출된다. 이는 뇌에서 효소 활성을 통해, 또는 뇌에서 생리화학적 차이에 대한 반응으로 달성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 제조
한 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 발현을 유도하는 조건하에서 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드 및 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 발현을 위해 이종 숙주를 사용할 수 있다. 이종 숙주는 원핵성 (예컨대, 박테리아) 또는 진핵성일 수 있다. 이. 콜라이(E. coli)일 수 있지만, 다른 적합한 숙주로 브레비바실러스 코시넨시스(Brevibacillus chosinensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 나이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 미코박테리아(Mycobacteria) (예컨대, 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)), 효모 등을 포함한다. 이는 대개 상기 숙주에서 코딩되는 아미노산에는 영향을 널리 공지 않으면서, 발현 효율을 최적화시키기 위해 코돈을 변이시키는 데 도움이 된다.
"재조합 숙주 세포" (또는 간단하게 "숙주 세포")라는 용어는 재조합 발현 벡터가 그 안으로 도입되어 있는 세포를 의미한다. 상기 용어는 특정의 대상 세포 뿐만 아니라, 상기 세포의 자손도 의미하고자 하는 것을 이해하여야 한다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예컨대, DNA) 절편 사이의 기능상 관계를 의미한다. 전형적으로, 상기 용어는 전사되는 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능상 관계를 의미한다. 예를 들어, 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 프로모터 또는 인핸서 서열이 코딩 서열의 전사를 자극시키거나, 조절한다면, 프로모터 또는 인핸서 서열은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접해 있고, 즉, 이는 시스-작용하는 것이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대, 인핸서는 그에 의해 전사가 증진되는 코딩 서열에 물리적으로 인접해 있을 필요가 없거나, 또는 그에 매우 근접하게 위치해 있을 필요는 없다.
본 발명은 또한 폴리펩티드 또는 접합체를 화학적으로 합성하는 단계를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 접합체는 (1) 변형된 폴리펩티드의 시스테인 기와 링커와의 반응으로 공유 결합을 통해 폴리펩티드-링커 중간체를 형성한 후, 활성화된 작용제와 반응시키는 것; 및 (2) 작용제의 친핵성 기와 링커와의 반응으로 공유 결합을 통해 작용제-링커 중간체를 형성한 후, 변형된 폴리펩티드의 시스테인 기와 반응시키는 것를 비롯한, 통상의 기술자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건, 및 시약을 사용하여 수개의 경로에 의해 제조될 수 있다. 접합 방법 (1) 및 (2)는 본 발명의 접합체를 제조하는 데 각종의 변형된 폴리펩티드, 작용제, 및 링커와 함께 사용될 수 있다.
폴리펩티드 및 접합체 를 함유하는 제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제제화된, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드 및/또는 접합체를 함유하는 조성물, 예컨대, 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물은 임의적으로 병용 요법으로, 즉, 다른 작용제와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 1종 이상의 다른 약물과 함께 조합된 본 발명의 접합체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"는 생리학적으로 화합성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 담체는 (예컨대, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합한 것이다.
제약 조성물은 바람직하게 제조 및 보관 조건하에서 멸균성이고 안정성이다.
조성물은 액제, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 고농도의 약물에 적합한 조직화된 구조로 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 지질 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅제, 예컨대, 레시틴을 사용함으로써, 분산제인 경우, 원하는 입자 크기로 유지시킴으로써, 및 계면 활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 많은 경우에서, 조성물 중 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 주사가능한 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
투여 경로에 의존하여, 폴리펩티드 또는 접합체는 그의 활성화, 특히 투여 이후의 활성화로부터의 보호를 위해 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"이란 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하면서, 어떤 원치않는 독성 효과도 부여하지 않는 염을 의미한다 (예컨대, [Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm . Sci . 66:1-19] 참조). 상기 염의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
독성 조절을 위해서는 생리학적 염, 예컨대, 나트륨 염을 포함할 수 있다. 염화나트륨 (NaCl)이 바람직하고, 이는 예컨대, 약 10±2 mg/ml NaCl과 같이, 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염으로는 염화칼륨, 인산 이수소 칼륨, 인산나트륨 탈수화물, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.
조성물의 오스몰 농도는 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게, 240-360 mOsm/kg이 될 것이며, 더욱 바람직하게 290-310 mOsm/kg 범위내 포함될 것이다.
조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 전형적인 완충제로는 포스페이트 완충제; 트리스(Tris) 완충제; 보레이트 완충제; 숙시네이트 완충제; 히스티딘 완충제 (특히 수산화알루미늄 아주반트를 포함하는 것); 또는 시트레이트 완충제를 포함한다. 완충제는 전형적으로 5-20 mM 범위로 포함될 것이다.
조성물의 pH는 일반적으로 5 내지 8.1, 및 더욱 전형적으로 6 내지 8, 예컨대, 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8이 될 것이다.
조성물은 전형적으로 글루텐 무함유이다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술파이트, 소듐 술파이트 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화된 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
조성물은 온도 보호제를 포함할 수 있다. 액체 온도 보호제를 조성물에 첨가하여 그의 빙점을 강하, 예컨대, 빙점을 0℃ 아래로 하락시킬 수 있다. 따라서, 열적 분해를 막기 위해 조성물을 0℃ 아래, 그러나, 그의 빙점보다 높은 온도에서 보관할 수 있다. 또한, 온도 보호제를 통해 냉동 및 해동 후의 엉김 또는 침전으로부터 무기 염 아주반트를 보호하면서, 조성물을 냉동시킬 수 있고, 또한, 승온, 예컨대, 40℃보다 높은 온도에서 조성물을 보호할 수 있다. 적합한 온도 보호제는 인간 투여에 안전하여야 하고, 쉽게 수혼화성/수용성이어야 하고, 조성물 중의 다른 성분들을 손상시키지 않아야 한다. 그 예로는 글리세린, 프로필렌 글리콜, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 적합한 PEG의 평균 분자량 범위는 200-20,000 Da일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜의 평균 분자량은 약 300 Da ('PEG-300')일 수 있다.
멸균화 방법, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함하는 것, 이 둘 모두에 의해 미생물이 존재하지 못하도록 확실히 막을 수 있다. 또한 등장화제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함하는 것도 바람직할 수 있다.
폴리펩티드 및 접합체는 상이한 부류의 부형제의 조합을 사용하여 제제 중에서 안정화될 수 있으며, 예컨대, (1) 이당류 (예컨대, 사카로스, 트레할로스) 또는 폴리올 (예컨대, 소르비톨, 만니톨)은 차별적인 배제에 의해 안정제로서 작용하고, 이는 또한 동결건조 동안 동결보호제로서도 작용할 수 있고, (2) 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20)는 액체/얼음, 액체/물질 표면 및/또는 액체/대기 인터페이스와 같은 인터페이스 상의 단백질의 상호작용을 최소화시킴으로써 작용하고, (3) 완충제 (예컨대, 포스페이트-, 시트레이트-, 히스티딘)는 제제 pH를 조절하고 유지시키는 데 도움을 준다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드 및 접합체를 추가로 안정화시키고, 예컨대, 그의 응집을 막기 위해 상기 이당류 폴리올, 계면활성제 및 완충제가 본 발명의 방법에 추가로 사용될 수 있다.
멸균 주사액은 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매 중에 본원에 열거된 성분들 중 하나 또는 그의 조합과 함께 혼입시킨 후, 필요에 따라, 멸균 정밀여과를 수행함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산제는 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액 제조를 위한 멸균 분제의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이며, 이를 통해 사전에 멸균 여과된 그의 액제로부터 임의의 추가의 원하는 성분과 함께 활성 성분으로 이루어진 분제를 수득할 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하는 데 본 발명의 폴리펩티드에 접합될 수 있는 작용제의 양은 치료받는 대상체, 및 특정 투여 모드에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 상기 양은 치료학적 효과를 발휘하는 양이 될 것이다. 일반적으로, 100% 중에서 상기 양의 범위는 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게, 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게 약 1% 내지 약 30%의, 제약상 허용되는 담체와 조합된 폴리펩티드 또는 접합체가 될 것이다.
의학적 용도 및 치료 방법
본 발명의 폴리펩티드 및 접합체는 요법에서 유용하다. 특히, 이는 치료제를 뇌로 전달하는 데 유용하다. 치료하고자 하는 질환은 본 발명의 폴리펩티드에 의해 수송되는 치료제에 의존하겠지만, 뇌 질환이 바람직하다. 따라서, 치료될 수 있는 질환으로는 신경계 질환, 임의적으로 뇌 종양, 뇌 전이, 정신분열증, 간질, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 졸중, 및/또는 BBB의 기능 장애와 관련된 질환을 포함한다.
투여량 및 투여
최적의 원하는 반응 (예컨대, 치료학적 반응)을 제공하기 위해 투여량 요법은 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수개의 분할된 용량이 시간이 경과함에 따라 투여될 수 있거나, 또는 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 나타는 바에 따라 그에 비례하여 감량 또는 증량될 수 있다. 투여의 용이 및 균일한 투여량 위해 비경구용 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 이롭다. 본원에서 사용되는 바, 투여 단위 형태란 치료하고자 하는 대상체에 맞게 단위 제형으로 적합화된 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각 단위는 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료학적 효과를 발휘할 수 있는 미리 결정된 양의 폴리펩티드 또는 접합체를 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 명세 사항은 (a) 폴리펩티드 또는 접합체의 독특한 특징, 달성하고자 하는 특정 치료학적 효과, 및 (b) 상기 폴리펩티드 또는 접합체를 조제하는 분야에서 고유한, 개체에서 감수성 치료에 대한 제한 사항에 의해 지배되고, 그에 직접적으로 의존한다.
별법으로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 지효성 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우, 투여는 더 적은 빈도로 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에게 투여되는 폴리펩티드 또는 접합체의 반감기에 따라 달라진다. 투여량 및 투여 빈도는 처치가 예방학적인지 또는 치료학적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방학적 적용인 경우, 장기간 동안에 걸쳐 상대적으로 저빈도 간격으로 상대적으로 낮은 투여량이 투여된다. 일부 환자는 그의 남은 여생 동안 처치를 계속해서 받게 된다. 치료학적 적용인 경우, 질환 진행이 감소되거나, 종결될 때까지, 및 바람직하게, 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 보일 때까지, 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 이후, 환자는 예방학적 요법을 투여받을 수 있다.
환자에게 독성을 띠지 않으면서, 특정 환자, 조성물, 및 투여 모드에 대해 바람직한 치료학적 반응을 달성하는 데 효과적인 양으로 활성 성분을 수득하기 위해 본 발명의 제약 조성물 중 폴리펩티드 또는 접합체의 실제 투여량 수준을 달리할 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 폴리펩티드 또는 접합체 (또는 작용제)의 배출 속도, 치료 지속 기간, 사용되는 폴리펩티드 또는 접합체와 함께 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 병증, 일반 건강 상태 및 이전 병력, 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 인자를 비롯한, 다양한 약동학적 인자에 의존할 것이다.
"치료상 유효 투여량"의 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 바람직하게 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 기간을 증가시키거나, 또는 질환 고통에 기인하는 손상 또는 장애를 예방한다.
본 발명의 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법들 중 하나 이상의 것을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 모드는 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 바람직한 투여 경로로는 두개내, 비내, 안구내, 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "비경구 투여"라는 어구는 일반적으로 주사에 의해 이루어지는, 장관 및 국소 투여 이외의 다른 투여 모드를 의미하며, 이는 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
별법으로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체는 비-비경구 경로, 예컨대, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비내로, 경구적으로, 질내로, 직장으로, 설하로, 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 접합체는 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드 및 접합체는 전형적으로 BBB 통과를 필요로 하는 경로를 통해, 즉, 말초 투여를 통해 투여될 수 있다. 보편적으로 사용되는, BBB 통과를 필요로 하는 투여 경로는 정맥내, 근육내, 동맥내 및 복강내 경로이다.
폴리펩티드 또는 접합체는 임플란트, 경피용 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 비롯한, 방출 조절형 제제와 같이, 신속한 방출로부터 보호하는 운반체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안히드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 다수의 상기 제제 제조 방법은 특허를 받은 것이거나, 또는 일반적으로 통상의 기술자에게 공지되어 있는 것이다. 예컨대, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 접합체 또는 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 의료용 장치를 이용하여 투여될 수 있다.
진단학적 용도 및 진단 방법
본 발명의 폴리펩티드 및 접합체는 진단에 유용하다. 이는 특히, 진단제를 뇌로 전달하는 데 유용하다. 진단 또는 모니터링하고자 하는 질환은 본 발명의 폴리펩티드에 의해 수송되는 치료제에 의존하겠지만, 뇌 질환이 바람직하다. 그러므로, 진단 또는 모니터링될 수 있는 질환으로는 신경계 질환, 임의적으로 뇌 종양, 뇌 전이, 정신분열증, 간질, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 졸중, 및/또는 BBB의 기능 장애와 관련된 질환을 포함한다.
핵산
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예컨대, 핵산 조합물, 벡터, 또는 벡터 조합물)을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 접합체, 특히, 작용제가 폴리펩티드인 접합체를 코딩하는 핵산 (예컨대, 핵산 조합물, 벡터, 또는 벡터 조합물)을 포함하는 조성물을 제공한다.
핵산은 발현 개선을 위해 최적화될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드에 따라 디자인될 수 있다. 따라서, 본 발명과 관련하여, 상기 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 폴리펩티드 서열 중 하나 이상을 코딩할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 핵산과 혼성화할 수 있는 핵산을 제공한다. 혼성화 반응은 상이한 "엄격도" 조건하에서 수행될 수 있다. 혼성화 반응의 엄격도를 증가시키는 조건은 널리 공지되어 있고, 관련 기술분야에 공개되어 있다 (예컨대, [13]의 7.52페이지). 관련 조건의 예로는 (엄격도 증가순으로) 인큐베이션 온도 25℃, 37℃, 50℃, 55℃ 및 68℃; 완충제 농도 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC (여기서, SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충제이다) 및 다른 완충제 시스템을 사용하는 그의 등가물; 포름아미드 농도 0%, 25%, 50%, 및 75%; 인큐베이션 시간 5분 내지 24시간; 1, 2회 또는 그 초과의 세척 단계; 세척 인큐베이션 시간 1, 2, 또는 15분; 및 세척액 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC, 또는 탈이온수인 것을 포함한다. 혼성화 기법 및 그의 최적화는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 [7, 8, 9 등].
핵산은 낮은 엄격도 조건하에서 표적에 혼성화할 수 있고; 다른 실시양태에서, 핵산은 중간 정도의 엄격도 조건하에서 혼성화하고; 바람직한 실시양태에서, 핵산은 높은 엄격도 조건하에서 혼성화한다. 예시적인 낮은 엄격도 혼성화 조건 세트는 50℃ 및 10 x SSC이다. 예시적인 중간 정도의 엄격도 혼성화 조건 세트는 55℃ 및 1 x SSC이다. 예시적인 높은 엄격도 혼성화 조건 세트는 68℃ 및 0.1 x SSC이다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 코딩하는 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함하는 (예컨대, 안티센스 또는 프로빙을 위한, 또는 프라이머로서 사용하기 위한) 핵산을 포함한다.
본 발명에 따른 핵산은 다양한 형태 (예컨대, 단일 가닥, 이중 가닥, 벡터, 프라이머, 프로브, 표지된 것 등)를 취할 수 있다. 본 발명의 핵산은 환형 또는 분지형일 수 있지만, 일반적으로는 선형일 것이다. 달리 언급 또는 요구되지 않는 한, 핵산을 사용하는 본 발명의 임의의 실시양태는 이중 가닥 형태, 및 이중 가닥 형태를 구성하는 각각의 두 상보적인 단일 가닥 형태, 둘 모두를 사용할 수 있다. 프라이머 및 프로브는 안티센스 핵산과 같이, 일반적으로 단일 가닥이다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 코딩하는 핵산은 바람직하게 정제된 또는 실질적으로 정제된 형태로, 즉, 다른 핵산은 실질적으로 없는, (예컨대, 천연적으로 발생된 핵산은 없는), 특히, 숙주 세포 핵산은 없는 형태로, 일반적으로 약 50% (중량 기준) 이상 순수, 일반적으로 약 90% 이상 순수한 형태로 제공된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 코딩하는 핵산은 게놈 또는 cDNA 라이브러리 등으로부터 다수의 방식으로, 예컨대, 전체적으로 또는 부분적으로 화학적 합성 (DNA의 포스포라미다이트 합성)에 의해, 뉴클레아제 (예컨대 제한 효소)를 사용하여 보다 긴 장쇄의 핵산을 분해함으로써, (리가제 또는 폴리머라제를 사용하여) 보다 짧은 단쇄의 핵산 또는 뉴클레오티드를 연결시킴으로써 제조될 수 있다.
"핵산"이라는 용어는 일반 의미로 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및/또는 그의 유사체를 함유하는, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 포함한다. 이는 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드를 포함한다. 이는 또한 DNA 또는 RNA 유사체, 예컨대, 변형된 백본 (예컨대, 폴리펩티드 핵산 (PNA) 또는 포스포로티오에이트) 또는 변형된 염기를 함유하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, DNA, cDNA, 재조합 핵산, 분지형 핵산, 플라스미드, 벡터, 프로브, 프라이머 등을 포함한다. 본 발명의 핵산이 RNA 형태를 취하는 경우, 이는 5' 캡을 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있다.
본원에 기술된 폴리펩티드 또는 접합체를 코딩하는 핵산은 벡터의 일부가 될 수 있다.
핵산과 관련하여 사용될 때, "상보체" 또는 "상보성"이라는 용어는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 의미한다. 따라서, C의 상보체는 G이고, G의 상보체는 C이고, A의 상보체는 T (또는 U)이고, T (또는 U)의 상보체는 A이다. 또한, 염기, 예컨대, I (퓨린 이노신), 예컨대, 상보체 피리미딘 (C 또는 T)을 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 코딩하는 핵산은 예를 들어, 폴리펩티드를 제조하는 데; 생물학적 샘플 중 핵산의 검출을 위한 혼성화 프로브로서; 추가 카피의 핵산을 생성하는 데; 리보자임 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생성하는 데; 단일 가닥 DNA 프라이머 또는 프로브로서; 또는 삼중 가닥 형성 올리고뉴클레오티드로서 사용될 수 있다.
본 발명은 부분적으로 또는 전체적으로 화학 수단을 사용하여 핵산을 합성하는 것인, 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 코딩하는 핵산을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 (예컨대, 클로닝 또는 발현 벡터), 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "최적화된"이라는 용어는 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로, 진핵 세포, 예를 들어, 피키아(Pichia) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 뉴클레오티드 서열이 변경되었다는 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 "모" 서열로도 알려져 있는 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산을 완전히 또는 가능한 많이 유지하도록 조작된다. 다른 진핵 세포에서 다른 서열의 최적화된 발현 또한 본원에 포함된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열 또한 최적화된 것으로 지칭된다.
서열 동일성
서열 비교를 위해, 전형적으로 한 서열은 참조 서열로서 작용하며, 그와 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 서브서열 좌표를 지정하고, 필요할 경우, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대해 상대적인 시험 서열의 서열 동일성(%)을 계산한다. 동일성에 대해 두 서열을 비교할 때, 서열이 인접해 있을 필요는 없지만, 임의의 갭을 보유할 것이며, 그에 따른 패널티는 전체 동일성(%)을 감소시키게 될 것이다. blastn의 경우, 디폴트 파라미터는 갭 개방 패널티=5 및 갭 연장 패널=2이다. blastp의 경우, 디폴트 파라미터는 갭 개방 패널티=11 및 갭 연장 패널=1이다.
본원에서 지칭되는 서열 동일성(%)은 각각 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977] 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 기술되어 있는 BLAST 알고리즘에 따라 측정된다. BLAST 분석을 실행하는 소프트웨어는 미국 국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용가능하다. (뉴클레오티드 서열인 경우) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 워드길이 (W)=11, 기대치 (E)=10, M=5, N=-4 및 두 가닥 모두 비교를 사용한다. 아미노산 서열인 경우, BLASTP 프로그램은 워드길이=3, 및 기대치 (E)=10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989] 참조) 정렬 (B)=50, 기대치 (E)=10, M=5, N=-4, 및 두 가닥 모두 비교를 사용한다.
일반
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아미노산 서열"이라는 용어가 본원에 개시된 각각의 서열 뿐만 아니라, 그의 단편, 상동체, 유도체 및 유도체에 대한 언급을 포함한다는 것을 이해하여야 한다.
"~을 포함하는(comprising)"이라는 용어는 "~을 포함하는(including)"이라는 것 뿐만 아니라, "~으로 이루어진"이라는 것도 포함하며, 예컨대, X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수 있거나, 또는 예컨대, X + Y와 같이, 추가의 것을 포함할 수 있다.
"~으로 이루어진"이라는 용어는 "~을 포함하나, 이에 한정되지 않는"이라는 것을 의미한다.
"본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 용어는 조성물, 방법 또는 구조가 추가의 성분, 단계, 및/또는 부분을 포함할 수 있지만, 오직 추가의 성분, 단계, 및/또는 부분이 청구되는 조성물, 방법 또는 구조의 기본적이고 신규한 특징을 실질적으로 변경시키지 않는 경우에만 그러하다는 것을 의미한다.
수치값 χ와 관련하여 "약"이라는 용어는 χ±10%를 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 관련 기술분야 범위 내의 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 종래 방법을 사용할 것이다. 상기 기법은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. [10-17]을 참조할 수 있다.
본 발명은 하기의 비-제한적인 실시예를 참조로 하여 추가로 기술된다.
실시예
LA-상호작용 폴리펩티드 데이터베이스의 컴파일링
LA-상호작용 폴리펩티드 데이터베이스를 컴파일링하기 위해, 본 발명자들은 LDLR 패밀리 구성원의 LA 도메인과 상호작용할 수 있는 것으로 공지되어 있는 모든 폴리펩티드에 대한 구조적 정보를 수집하였다.
이러한 구조 데이터를 통해 본 발명자들은, 화학적 실체가 LA 도메인과 상호작용하여야 한다는 중요한 특징을 도출해 낼 수 있었다. 하기 LDLR 패밀리 구성원이 고려되었다 (도 1 참조):
1. LDLR (저밀도 지단백질 수용체)은 모든 패밀리 구성원의 원형이다;
2. VLDLR (초저밀도 지단백질 수용체);
3. 아포ER2 (아포지단백질 E-수용체 2, LRP8로도 공지됨);
4. MEGF7 (표피 성장 인자 유사 단백질 7, LRP4로도 공지됨);
5. LRP1 (LDL 수용체 관련 단백질 1, LRP로도 공지됨);
6. LRP1B (LDL 수용체 관련 단백질 1B)
7. LRP2 (LDL 수용체 관련 단백질 2, 메갈린(Megalin)으로도 공지됨).
Figure pct00017
본 발명자들은 문헌에서 살펴볼 수 있는 각 LDLR 패밀리 구성원의 결합 파트너 (리간드) 모두를 표 1에 기록하였다. LDLR 구성원의 LA 모듈과 상호작용하는 리간드 군을 본원에서는 "LA-상호작용 폴리펩티드 데이터베이스"로 명명한다.
중요한 상호작용 패턴에 관한 이론적 설명
LDLR 패밀리 LA 도메인의 상호작용 파트너에 대해 발견된 정보는 2개의 부분으로 나뉠 수 있다: 한 부분은 활성 데이터에 관한 것이고, 나머지 다른 한 부분은 구조 정보에 관한 것이다. 문헌에서는 유사한 실험 조건을 사용하였을 때, 활성 데이터 세트는 거의 수득하지 못했고, 이에 예측 모델 구축을 위해 상기 데이터를 사용하는 것은 일반적으로 권고되지 않고 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 상기 구조 데이터로부터 특정의 중요한 정보를 추출하고, 이용할 수 있었다.
본 발명자들은 상기 구조 데이터가 매우 이질적이라는 것을 발견하였다:
· 일부 리간드는 단지 단일 LA 도메인에만 결합하는 반면, 일부 다른 리간드는 (결합능 효과를 이용하여) 2개의 모듈과 상호작용을 확립한다.
· 일부 리간드 (예컨대, 소형 안지오펩 폴리펩티드)는 1차 구조상 서로 가깝게 위치하는 잔기와 상호작용하는 반면, 다른 리간드는 서로 매우 멀리 떨어져 있고, 아미노산 서열의 다른 부분을 구성하는 잔기와 상호작용한다.
· 일부 리간드는 가요성 구조 영역 (예컨대, 루프)과 상호작용하는 반면, 다른 리간드는 강성 영역 (예컨대, α-나선)과 상호작용한다.
LA-상호작용 폴리펩티드 데이터베이스에서 리간드는 매우 이질적인 것으로 밝혀졌지만, 본 발명자들은 놀랍게도 모든 LDLR 패밀리 구성원의 모든 LA 모듈의 폴딩이 고도로 보존된다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 피셔(Fisher)와 동료들에 의해 기술된 바와 같이 [21], LDLR의 2개의 LA 도메인과 수용체 관련 단백질 (RAP) 사이의 복합체의 LA4 모듈이 공결정화되었다는 것을 발견하게 되었다 (도 3 참조). 각 LA 모듈은 N 말단 단부 부근에 짧은 β-헤어핀, 3개의 디술피드 결합, 및 고도로 보존되는 칼슘 결합부를 가진다. 칼슘 이온은 고도로 보존되는 4개의 산성 잔기 (D147, D151, D157, E158)의 측쇄, 및 2개의 백본 카르보닐 기 (W144 및 D149)에 의해 8면체 기하학적 구조로 배위된다 [32]. 방향족 잔기 (LA4 상의 W144 및 LA3 상의 F105)와 함께 상기의 산성 기는 모두 높은 친화도로 RAP와 결합하는 모든 LRP1 LA 모듈 쌍에 보편적으로 존재한다 [33]. 연구된 복합체의 모든 구조에서, 결합의 필수 요소는, 양으로 하전된 리신 (리간드)과 보존되는 산성 기 사이에 다중 H-결합이 형성되고, 이를 통해 칼슘 이온 (수용체) 주변에 음으로 하전된 크라운을 형성하는 강력한 정전기 상호작용에 있다. 또한, 블랙로우(Blacklow) 리뷰 [34]에서 수개의 상호작용 단백질 파트너에 대해 제시된 바와 같이, 수용체 중 보존되는 방향족 잔기는 리신 쇄의 비-극성 영역에서의 소수성 상호작용으로 안정화된다 (도 4 참조).
LA 도메인과 H-결합 또는 소수성 상호작용을 형성하는 모든 리간드 잔기에 대한 완전한 목록은 하기 표 2에 제시되어 있다. 표에서 2개의 엔트리를 갖는 구조는 2개의 상호작용 도메인을 갖는 것이다 (예컨대: 2FCW는 RAP 및 LDLR의 LA4 도메인 사이의 상호작용을 나타내는 반면, 2FCW2는 RAP 및 같은 수용체의 LA3 도메인 사이의 상호작용을 나타낸다).
Figure pct00018
본 발명자들은 관찰된, 대부분 보존되는 약리작용단 특징을 하기 표 3에 도식으로 나타내었다.
Figure pct00019
2.3 BBB를 통과할 수 있는 공지 폴리펩티드의 모델링
상호작용 폴리펩티드 데이터베이스로부터 수집된 정보 이외에도, 본 발명자들은 또한 이미 BBB를 통과할 수 있는 것으로 알려져 있는 폴리펩티드를 분석하였다. 특히, 본 발명자들은 안지오펩 및 레귤론을 연구하는 것으로 선택하였다. 상기 폴리펩티드에 대해 이용가능한 구조 정보는 없었는 바, 이에 본 발명자들은 모델을 수집하여 상기 폴리펩티드로 연구하였다.
2007년 드뮐과 동료들에 의해 도입된 [1,2] 안지오펩은 현재까지 LDLR을 포함하는 메카니즘을 이용하여 BBB를 통과할 수 있는 것으로 알려져 있는 유일의 폴리펩티드이다. 레귤론 폴리펩티드는 BBB를 통과하는 것으로 알려져 있다.
안지오펩
아프로티닌은 6,500 Da인, 쿠니츠형 도메인을 함유하는 LRP 및 LRP2의 프로테아제 억제제 리간드이다. 안지오펩은 아프로티닌보다 더 높은 트랜스사이토시스 능력을 보이는 쿠니츠 도메인으로부터 유도된 폴리펩티드 패밀리이다. 하기 표 4에서 본 발명자들은 상이한 안지오펩에 대한 트랜스사이토시스 및 분포 부피 값을 보고하였다. 본 발명자들은 안지오펩-2 (AP2)가 우수한 트랜스사이토시스 수준 및 높은 실질/전체 뇌 분포 부피 비, 둘 모두를 갖는 바, 이에 그를 가장 유망한 폴리펩티드인 것으로 확인하게 되었다.
상기 폴리펩티드 각각을 구성하는 AA에 대한, 카이(Cai) 및 동료들에 의해 보고된 [35] 113개의 물리화학적 특성을 고려하여 그 폴리펩티드에 대한 1차 분석을 수행하였다. 이어서, 하기 방식으로 집적적인 계층적 클러스터링 방법을 사용하여 폴리펩티드를 클러스터링하였다:
· 각 AA 사이의 비유사성은 113 차원 공간에서의 정규화된 유클리드 거리로서 계산하였다.
· 각 폴리펩티드 사이의 거리는 같은 위치에 있는 AA 사이의 거리의 합으로서 계산하였다.
클러스터링 결과는 도 5에 제시되어 있다. 본 발명자들은 상기 폴리펩티드가 하기 3개의 주요 군으로 분류될 수 있다는 것을 발견하게 되었다: (A) 안지오펩 5 및 8; (B) 안지오펩 76, 78, 79, AP2, AP1, AP5, AP7; 및 (C) 안지오펩 90 및 91. 오직 AA 물리화학적 특성만을 사용하여 수득한 상기 클러스터링은 트랜스사이토시스에서의 유의한 변화를 반영한다: (A)군은 트랜스사이토시스 비율이 낮고; (B)군은 그 값이 중간 정도이고 (AP1 제외. AP5 및 AP7에 대한 데이터는 누락); (C)군의 트랜스사이토시스 값이 가장 높다.
Figure pct00020
전통적으로는 상이한 아미노산이 트랜스사이토시스에 미치는 효과를 구조 분석으로부터 추가로 통찰하게 되지만, 안지오펩에 대해 이용가능한 구조 정보는 현재 없다. 그러므로, 본 발명자들은 주형으로서 아프로티닌의 결정화된 쿠니츠 도메인 (PDB 코드 2ZJX)을 사용하여 상동성 모델 전략법에 따라 안지오펩에 대한 가상 구조를 구축하였다. 안지오펩 AP2와의 정렬은 하기 제시되어 있으며, 여기에서는 상동성 모델링 프로그램의 기능에 기인하여 오직 마지막 아미노산 (Y)만이 누락되어 있다:
Figure pct00021
본 발명자들은 하기 이유로 아프로티닌을 주형으로서 선택하였다:
· 72%의 서열 동일성을 수득하였는데, 이는 상동성 모델링에서 일반 역치인 35%보다 훨씬 높은 값이다.
· (잠재적으로 LDLR과 상호작용하는 데 필수적인) 두 리신 모두 존재한다.
· LDLR에 결합하는 데 필수적인 잔기는 잠재적으로 잘 배향되어 있고, 노출되어 있다.
상동성 모델링에 의해 수득된 AP2의 일반 폴드는 도 6에 제시되어 있다.
폴드 예측에 대한 순이론적 방법 [36,37,38]을 사용하여 AP2의 상동성 모델을 확인하였다. 본 발명자들은 순이론적 모델이 상동성 모델로서 유사한 폴드를 제공한다는 것을 발견하게 되었다 (도 7 참조).
AP2 이외에, 다른 안지오펩 또한 상동성 모델링 사용시 쿠니츠 유사 폴드를 보였다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 안지오펩이 쿠니츠 유사 폴드를 가진다는 것을 제안하였다.
AP2- LDLR 상호작용 모델링
이어서, 본 발명자들은 AP2와 LDLR 사이의 상호작용을 모델링하였다. 하기 2가지 주요 가설을 고려하였다: (A) LDLR의 단일 도메인 결합제로서의 AP2 (즉, 복합체: 2FCW, 1N7D, 2FYL에 대해 관찰된 바와 같이, 단일 LA 도메인에 결합하는 것); 및 (B) 이중 도메인 결합제로서의 AP2 (즉, 2KNY, 1V9U, 2KRY, 3A7Q에 대해 관찰된 바와 같이, 2개의 LA 도메인에 결합하는 것). 주형으로서 LDLR-RAP 복합체 구조 (PDB 2FCW)를 사용하여 모든 정렬을 수행하였다. 본 발명자들은 하기의 여러 이유에서 이것이 최상의 구조인 것으로 간주하였다: (i) 이는 결정학적 구조이고; (ii) 해상도가 우수하고 (1.26 Å); (iii) 리간드와 수용체 사이의 상호작용 개수가 다른 실험 구조에서보다 많다.
단일 도메인 결합제로서의 AP2
AP2의 상동성 구조를 여러 방식으로 RAP-LDLR 결정학적 복합체의 RAP의 중요한 잔기 (표 3 참조)와 함께 견고하게 (오직 번역 및 회전 운동) 정렬하였다. 중첩되는 등가 잔기의 개수를 최대화한 모델_1 (하기 표 5)을 가장 적절한 것으로 간주하였다:
Figure pct00022
모델_1은 RAP-LDLR 상호작용의 3개의 중요한 잔기: 필수 상호작용 리신인 K256, LDLR의 보존되는 산성 잔기의 H-결합 공여자로서 작용하는 K253 및 R296의 중첩을 최적화시킨다 (* 이 구축물은 RAP K256보다는 AP2 K15를 사용하여, 및 (또 다른 LA 모듈에서 K256과 등가인) RAP K270보다는 AP2 K10을 사용하여 이중 도메인 결합제로서 AP2를 도킹함으로써 구축되었다).
역장 MMFF94를 사용하여 모델_1의 최소화를 수행하였다 [39]. 최종의 최소화된 구조는 도 8에 제시되어 있다.
이중 도메인 결합제로서의 AP2
수개의 실험 관찰 결과, 일부 폴리펩티드는 단일 모듈보다는 LA 모듈 쌍에 결합하는 것으로 나타났다 [22,33]. 이에 대한 합리적인 설명은, 리간드가 LDLR 패밀리 단백질에 결합하는 데 있어서 결합능 효과가 중요한 역할을 한다는 것이다 [21]. 피셔와 동료들에 의해 풀린 결정 구조에서, 각 개별 LA 모듈과 RAP 사이의 접촉 인터페이스는 작은 바 (< 400 A2), 이에 그들은 단일 모듈이 높은 친화성 결합을 제공하기에는 충분하지 않다는 것을 제안하였다.
이러한 이유에서, 본 발명자들은 또한 AP2가 이중 도메인 결합제인지 여부를 고려하였다. AP2를 K15 (AP2)를 K256 (RAP)과, 및 K10 (AP2)을 K270 (RAP)과 중첩시킴으로써 (표 5의 모델_6) RAP와 함께 정렬하였다. MMFF94 [39] 역장을 사용하여 모델을 최소화하였고, 이를 통해 도 9에 제시된 바와 같은 최종 구조를 수득하였다.
AP2 상호작용 특징
두 모델 모두 (단일 및 이중 도메인 결합제로서의 AP2)에서, 3개의 중요한 잔기 (R8, K10 및 R11)가 하나의 LA 모듈과 강하게 상호작용하여 모든 LDLR 패밀리 구성원에서 보존되는 산성 수용체 잔기와 H-결합을 형성하였다. 추가로 모델_6 (이중 도메인 결합제로서의 AP2)에서, K15는 다른 LA 모듈의 크라운 산성 잔기와 H-결합을 형성하였다. 이러한 잔기는 모두 (리신 및 아르기닌) LA 도메인의 여러 공지된 리간드 중에 존재한다 (표 2).
본 발명자들은 분자내 H-결합이 폴리펩티드의 N 말단 잔기와 E17의 측쇄 사이에서 확립될 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 이러한 상호작용은 폴리펩티드의 가요성을 제한할 수 있고, AP2-LA 상호작용을 촉진시킬 수 있다. 이는 안지오펩-79의 P/B 분포 부피 비가 AP2에 비하여 훨씬 더 낮은 것을 설명할 수 있다. 상기 두 폴리펩티드는 실제로 매우 유사하지만, 안지오펩-79에는 C 말단으로부터 2개의 아미노산만큼 떨어져 있는 위치에 글루탐산이 결실되어 있다 (도 5 참조). 유사하게, 본 발명자들은 P/B 분포 부피 비가 0.50보다 큰 폴리펩티드는 모두 C 말단 단부에 산성 잔기를 가진다는 것을 발견하게 되었다. 예외적으로 유일하게 안지오펩-91만이 P/B 비 = 0.49였다. 예측 안지오펩-2 구조와 BBB 투과 변화를 일으키는 아미노산상의 변이 사이의 다른 관계는 검출할 수 없었다.
결론적으로, 본 발명자들은 안지오펩에 대한 새로운 구조 모델을 제공하였다. LA 모듈과의 상호작용에 중요한 5개의 잔기와, 안지오펩의 폴드의 안정화를 위한 추가 잔기가 확인되었다.
이러한 새로운 데이터를 이용하여 본 발명자들은 LDLR에 결합하고, BBB를 통과하는 새로운 폴리펩티드를 개발하게 되었다. 이러한 폴리펩티드는 하기 2개의 주요 군으로 나뉜다: (1) 일부는 레귤론 서열에 기초하고, 베타-헤어핀 폴드를 갖는 것으로 예상되고; (2) 다른 것은 LDLR과 상호작용하는 RAP에 기초한다.
레귤론
목적
BBB (혈액 뇌 장벽)의 시험관내 모델을 통해 레귤론 펩티드 (서열 1)를 포함하는 및 포함하지 않는 본 발명자들의 나노입자의 통과에 대해 분석하고자 하였다.
물질 및 방법
BBB 모델
뇌 모세혈관 기능 연구를 위한 시험관내 시스템을 제공하기 위해, 본 발명자들은 삽입물의 한쪽에서는 뇌 모세혈관 내피 세포를, 및 나머지 다른 한쪽에서는 신경아교 세포 (성상세포)를 배양함으로써 생체내 BBB와 매우 유사한 공배양 방법을 개발하였다. 내피 세포를 필터 상의 상부 구획에서 배양하고, 성상세포를 6웰 플레이트의 플라스틱 상의 하부 구획에서 배양하였다.
이러한 조건하에서, 내피 세포는 내피 마커 (인자 VIII-관련 항원, 비-혈전 형성성 표면, 프로스타시클린 제조, 안지오텐신 전환 효소 활성) 및 BBB 특징 (밀착 연접부 존재, 음세포 작용 소포체 결핍 등)을 유지하였다.
· 성상세포 배양물
신선한 성상세포의 1차 배양물을 인노프로트(Innoprot) (참조 P10202)로부터 제공받았다. 이를 개시 플라스크에서 48 h 동안 유지시켰다. 세포를 플레이트 P100 중 AM-a 배양 배지 (인노프로트, 참조 1831)에 시딩하였다. 전면성장률이 80-90%가 되었을 때, 성상세포를 6웰 플레이트 (125,000개의 세포/웰 (2 ml))에 시딩하였다. 48-72 h 후 공배양물이 확립되었다.
· 소 뇌 미세혈관 내피 세포 (BBMVEC 세포)
셀 어플리케이션즈 인크.(Cell Applications Inc.)로부터 입수한 내피 세포를 질소에서 냉동시켰다. 세포를 해동시키고, "코팅" (부착 인자 용액 (셀 어플리케이션즈로부터 입수) 30 min, 37℃ + 1 ㎍/ml 피브로넥틴 (시그마(Sigma)로부터 입수) 10 min, 37℃) 공정 후, 플레이트 P100 중 BBMVEC용 배지 (셀 어플리케이션즈)에 시딩하였다. 세포 전면성장률이 60-70%가 되었을 때, 코팅 공정 후 (삽입물에 대해 150,000-200,000개의 세포), 세포를 삽입물 (6웰 플레이트에 대한 공극 1.0 ㎛, 밀리포어, PIRP30R48)에 시딩하였다. 48-72 h 후 공배양물이 확립되었다.
· BBB 모델 확립
성상세포 배지를 흡인하고, BBMVEC 배지를 성상세포와 함께 웰에 첨가하였다. 삽입물을 성상세포와 함께 웰로 옮겨 놓았다. 이어서, 본 발명자들은 상부 구획 (관강 구획)에 내피 세포를, 및 하부 구획 (관강에서 떨어진(abluminal) 구획)에 성상세포를 가졌다.
· TEER ( 경상피 전기 저항) 측정
공배양물 확립으로부터 72 h 경과 후, 관강 구획과 관강에서 떨어진 구획 사이의 저항을 측정하였다 (매 측정당 3회 실시).
TEER 값이 150 Ω x ㎠ 초과인 것을 (밀착 연접부가 형성되어 있는) 우수한 BBB 모델로 간주하였다.
트랜스사이토시스 실험
레귤론 펩티드 (서열 1)로 가식된 나노입자 및 레귤론 펩티드로 가식되지 않은 나노입자, 및 (가식되지 않은 NP에 대한) 세포를 포함하지 않는 하나의 삽입물 블랭크를 시험하는 트랜스사이토시스 실험을 TEER 값이 230 Ω x ㎠인 2개의 BBB 모델에서 수행하였다.
샘플을 제조하였다: 링커액 중 250 ㎍ NP/ml. 모든 샘플을 10 min 동안 초음파처리하였다. 1.5 ml의 샘플을 삽입물에 첨가하고, 2.5 ml의 링거액을 웰 (6웰 플레이트)에 첨가하였다.
결과
37℃에서 60 min 동안 교반한 후, 상부 및 하부 구획에서 샘플을 수집하고, NTA 분석법을 이용하여 분석하였다.
Figure pct00023
상기 데이터는 도 23에 그래프로 제시되어 있다.
결론
우수한 BBB 모델 (TEER 230 Ω x ㎠)에서, 가식되지 않은 나노입자는 장벽을 거의 통과하지 못한 반면, 가식되지 않은 입자는 모두 블랭크 (BBB를 포함하지 않는 삽입물)를 통해 장벽을 통과하였다.
펩티드로 가식된 나노입자인 경우, 거의 모든 나노입자 (95%)가 BBB를 통과하였다. 따라서, 레귤론 펩티드는 BBB를 통한 통과 메카니즘에 있어 중요한 역할을 한다.
레귤론 _구축물
레귤론은 BBB를 통과할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 시험관내 BBB 모델로서 소 뇌 내피 모세혈관 세포 및 1차 성상세포의 공배양물을 사용하였을 때, 본 발명자들은 레귤론으로 가식된 나노입자는 BBB를 통과할 수 있는 반면, 코팅되지 않은 나노입자는 BBB를 통과하지 못한다는 것을 발견하였다. 음성 대조군은 BBB를 통과하지 못하였고, 이를 통해 BBB는 가식된 나노입자가 그를 통과하는 동안 온전한 상태 그대로 유지되었다는 것을 확인할 수 있었다. 본 실험 데이터는 도 23에 제시되어 있다. 따라서, 도 23은 레귤론 (서열 1)이 BBB를 가로질러 나노입자를 수송할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
레귤론은 59개의 AA (서열 1)로 이루어지고, 따라서, (19개의 AA를 함유하는) 안지오펩보다 더 크다. (BLAST 비교 방법에 따르면) 안지오펩과 레귤론 사이에는 접하게 되는 어떤 서열 유사성도 없다. 추가로, 레귤론에 대한 어떤 구조 정보도 공지되어 있지 않다. LDLR에 의한 레귤론의 가능한 트랜스사이토시스를 조사하기 위해 본 발명자들은 구조 연구를 수행하였고, 이를 통해 레귤론의 상동성 모델을 생성할 수 있었다.
본 발명자들은 레귤론의 상동성 모델링에 대해 최상의 주형은 하기 제시된 바와 같이 68%의 높은 서열 동일성을 갖는 P62 외피 당단백질 (PDB 코드 3N40_P)이라는 것을 발견하게 되었다:
Figure pct00024
레귤론 상동성 모델의 일반 폴드는 도 10에 제시되어 있다. 본 발명자들에 의해 수득된 상동성 모델 구조는 하기 2개의 부분: (1) 강성 β-헤어핀 구조 (도 10에서 동그라미로 표시); 및 (2) 구조화되지 않은 가요성 장쇄로 나누어질 수 있다.
본 발명자들은 LDLR과의 잠재적인 상호작용에 필수적인 2개의 잔기 (K48 및 R49)가 정확히 β-헤어핀의 U턴 부위에 존재한다는 것을 알게 되었다.
레귤론 - LDLR 상호작용 모델링
AP2에 대한 것과 같이, 본 발명자들은 레귤론과 LDLR 사이의 상호작용을 모델링하였다. 이 경우, 본 발명자들은 레귤론과 LDLR LA-모듈 사이의 상호작용에 관해 이용가능한 증거는 여전히 없다는 것을 알게 되었다. 또한, 하기 2가지 주요 가설을 고려하였다: (1) LDLR의 단일 도메인 결합제로서의 레귤론; 및 (2) 이중 도메인 결합제로서의 레귤론. 주형으로서 레귤론 및 LDLR-RAP 복합체 구조 (PDB 2FCW)의 상동성 모델을 사용하여 모든 정렬을 수행하였다.
단일 도메인 결합제로서의 레귤론
레귤론과 LA 모듈과의 결합에 대한 1차 가설은 폴리펩티드가 그의 구조화된 부분 (도 10에서 동그라미로 표시)과 상호작용한다는 것이다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 영역은 β-헤어핀 (β-가닥, U턴, β-가닥)에 상응하고, 이는 U턴에 다른 분자가 LA 모듈에 결합하는 데 필수적인 2개의 AA (리신 및 아르기닌)를 가진다. 상기 두 잔기의 측쇄는 노출되어 있고, 가능한 상호작용을 위해 잘 배향되어 있다. 이러한 이유에서, 본 발명자들은 (1) 레귤론 U턴 리신 (K48)이 RAP (K256)의 필수적인 상호작용 리신과 중첩되는 모델, 및 (2) U턴 아르기닌 (R49)이 RAP의 상이한 두 잔기와 중첩되는 모델: R296 (모델_1); 및 K253 (모델_2)을 생성하였다.
K48 및 R49, 둘 모두 LA 모듈의 보존되는 산성 잔기와 H-결합을 형성하기 때문에, 상기 두 모델 모두 긍정적인 평가를 받았다 (하기 표 6 참조).
Figure pct00025
비록 레귤론 K48 및 R49와 LA 모듈의 중요한 주된 잔기와의 상호작용이 매우 강력하고, 구조적으로 잘 맞지만, 본 발명자들은 상기 두 잔기 스스로 이루어지는 상호작용은 전체 레귤론 (59개의 잔기)의 결합을 위해서는 충분하지 않다고 믿었다. 이러한 가설은 전체 레귤론 표면에 비하여 훨씬 작은 상호작용 표면적에 기초하였다 (도 11). 본 발명자들은 레귤론의 가요성 루프가 결합에 결합하는 바, 이에 레귤론이 이중 도메인 결합제로서 간주된다고 믿었다.
이중 도메인 결합제로서의 레귤론
레귤론을 강성 구조로서 처리하게 되면, 레귤론은 AP2와 같은 방식으로 2개의 LA 모듈과 동시에 상호작용하지 못한다. 주형은 필수적인 두 리신이 이중 결합제 모델을 확립할 수 있도록 적절한 거리에 위치하게 하지 못한다. 가능한 대안적 레귤론-LA 모듈 상호작용 패턴을 모델링하기 위해, 본 발명자들은 레귤론을 상이한 조건으로 "절단"하여 그를 포함하는 서브세트 모델을 구축하였다.
(상기 언급된 바와 같은) K48 & R49를 포함하는 서열과는 별도로, 본 발명자들은 LA 모듈과 (항상 리신/아르기닌 패턴에 기초하여) 상호작용할 수 있는 하기 2개의 다른 주요 영역을 확인하였다: 하나는 K2-K3 모티프를 포함하고, 나머지 다른 하나는 잔기 R13, R19 및 K20, K22를 포함한다. 이중 가장 바람직한 것은 후자의 것인데, 그 이유는 후자의 것이 전자의 것보다 상호작용 표면이 더 크기 때문이다. 또한, 이는 AP2의 가요성 쿠니츠 도메인과 유사한 잔기 조성 및 배열을 가진다. 상기와 같이, LDLR-RAP 복합체와 중첩시킨 후, 이어서, 시스템을 최소화시킴으로써 중첩을 수행하였다. 최소화된 구조에서 하기 레귤론 잔기는 LA 모듈: R13, D15, K20과 H-결합을 확립하였다 (도 12 참조). 분자 동력학적 시뮬레이션을 적용하였을 때, R19 및 K22가 LA 모듈과 H-결합을 형성하기 시작하였다.
레귤론의 가요성에 기초하여, 본 발명자들은 레귤론이 헤어핀 영역 뿐만 아니라, 잔기 R13에서부터 K20까지에 이르는 부분을 사용함으로써 두 LA 모듈 결합제로서 작용한다는 것을 제안하였다.
레귤론 _구조 설명
상기 기술된 상동성 모델링 접근법으로부터, 본 발명자들은 레귤론의 구조가 긴 가요성 루프이며, 여기서, 오직 구조화된 부분만이 C 말단 영역에 근접하게 위치하는 베타-헤어핀이라는 것을 제안하였다 (도 10). 헤어핀은 하기 잔기에 의해 형성된다:
· TVIHGKREVTLH (서열 20)
베타-헤어핀은 2개의 베타-가닥 및 U턴으로부터 형성된다. 2개의 베타-가닥은 하기 영역에 위치한다:
· TVIHG (서열 21)
· EVTLH (서열 22).
U턴은 2개의 필수 AA로부터 형성된다:
· KR.
더 짧은 단쇄의 레귤론 서열
따라서, 본 발명자들은 레귤론이 그의 헤어핀 영역을 사용하여 LDLR과 상호작용한다는 것을 제안하였다. 본 발명자들은 레귤론의 BBB를 통과하는 데 사용하기 위한 것으로서, C 말단 부분을 포함하는 2개의 새로운 폴리펩티드를 디자인하였다. 2개의 구축물이 디자인되었다:
레귤론 _ 구축물1
서열: PTVIHGKREVTLHL (서열 2)
길이: 14개의 AA.
"레귤론_구축물1" 폴리펩티드는 레귤론의 최소 구조화된 영역을 포함한다. 그의 구조는 오직 베타-헤어핀 영역만을 포함한다 (도 13). 이러한 더 짧은 단쇄의 폴리펩티드 중 베타-헤어핀의 보존을 입증하기 위해, 본 발명자들은 순이론적 방법을 사용하여 레귤론_구축물1의 구조를 예측하였다. 베타-헤어핀 구조가 관찰되었다 (도 14 참조).
레귤론 _ 구축물4
서열: PMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH (서열 3)
길이: 23개의 AA.
"레귤론_구축물4" 폴리펩티드는 레귤론_구축물1의 전체 서열 및 베타-헤어핀 양단에 추가 서열을 포함한다. 레귤론의 C 말단의 모든 아미노산을 포함한다. 본 발명자들은 추가 서열이 이론상 베타-시트를 형성할 수 있는 평행 루프를 나타내기 때문에 레귤론_구축물4가 특히 적합한 폴리펩티드라는 것을 제안하였다 (도 15 참조). 본 발명자들은 순이론적 방법을 사용하여 레귤론_구축물4의 구조를 예측하고, 전체 폴리펩티드에 대한 신장된 베타-헤어핀 구조를 수득하였다 (도 16 참조).
RAP 알파-나선
상기 언급된 바와 같이, RAP의 D3 도메인은 LDLR에 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 상호작용은 2개의 LDL 수용체 A형 (LA) 모듈과 RAP의 2개의 알파-나선을 통해 일어난다. 단일 알파-나선은 LYS256을 비롯한, 상호작용에 필수적인 잔기를 포함하는 반면, 다른 것은 복합체를 안정화시키는 것으로 보인다. 본 발명자들은 RAP-D3 서열에 기초하여 3개의 새로운 폴리펩티드를 디자인하였다.
RH_ 구축물1
서열:
Figure pct00026
길이: 20개의 AA.
본 발명자들에 의해 RH_구축물1 폴리펩티드는 LDLR과의 RAP-D3 상호작용의 최소 단위인 것으로 확인되었다 (도 18 참조). 본 발명자들은 순이론적 방법을 사용하여 RH_구축물1의 구조를 예측하고, 단부에서 단부까지의 완전한 알파-나선 구조를 관찰하였다 (도 19 참조).
RH_ 구축물2
서열:
Figure pct00027
길이: 41개의 AA.
본 발명자들에 의해 확인된 RH_구축물2 폴리펩티드는 LDLR과의 상호작용에 필수적인 잔기를 포함하는 RAP의 전장 알파-나선에 상응하는 것이다. 여기서, 본 발명자들은 α-나선 형성을 돕고, 추가의 영역을 포함함으로써 BBB의 전위를 지원하는, RH_구축물1에 비하여 더욱 긴 장쇄의 절편를 취하였다. 순이론적 예측 방법은 길이가 9 내지 30개의 잔기 길이인 것인 폴리펩티드에 대하여 최적화된 것이고, RH_구축물2는 41개의 잔기를 가지기 때문에, 상기 방법은 본 폴리펩티드에 대해서는 사용되지 못했다. α-나선의 안정성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 100 ps의 짧은 단쇄의 분자 동력학적 시뮬레이션을 수행하였다. 본 시뮬레이션에 따르면, α-나선은 상대적으로 안정한 것이었다 (도 20 참조).
RH_ 구축물3
서열:
Figure pct00028
길이: 84개의 AA.
RAP D3 도메인 대부분을 포함하는 RH_구축물3 폴리펩티드는 2개의 α-나선에 의해 형성된다. LDLR과의 상호작용에 필수적인 잔기를 포함하는, RH_구축물2 폴리펩티드의 α-나선 이외에도, 상기 구축물은 LDLR과 상호작용하여 복합체를 안정화시키는, Arg296을 함유하는 제2 α-나선으로 이루어진다.
또한, RH_구축물3이 30개 초과의 잔기를 포함하지 때문에, 순이론적 예측 방법은 RH_구축물3에 적용되지 못했다. α-나선의 안정성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 100 ps의 짧은 단쇄의 분자 동력학적 시뮬레이션을 수행하였다. 본 시뮬레이션에 따르면, α-나선은 안정한 것으로 보였다 (도 21 참조).
추가의 새 폴리펩티드 디자인
본 발명자들은 AP2 및 RAP 주형과 다른 추가의 새로운 폴리펩티드를 디자인하였다.
컴파일링된 상호작용 폴리펩티드 데이터베이스 (표 2)로부터, 본 발명자들은 2가지 유형의, LDLR 구성원과의 상호작용을 구별지었다:
1. 일부 폴리펩티드는 상이한 가요성 영역에 위치하는 잔기 (예컨대: 1V9U, 2KRI, 3A7Q, 1N7D)를 사용하여 LDLR과 상호작용하다.
2. 다른 폴리펩티드는 α-나선에 위치하는 잔기 (예컨대: 2FCW, 2FCW2, 2KNY, 2FYL, 2FYL2)를 사용하여 LDLR과 상호작용하다.
본 발명자들은 본원에서 "가요성" 폴리펩티드 및 "강성" 폴리펩티드로 지칭되는, 상기 두 상호작용 유형 둘 모두에 대한 폴리펩티드를 디자인하였다.
가요성 폴리펩티드
LDLR의 LA 모듈에 결합할 수 있는 가요성 폴리펩티드의 디자인은 주로 AP2 이중 결합제 모델에서 확인된 중요한 상호작용 특징에 기초하였다. 하기 AP2 잔기는 LA 도메인과의 상호작용을 촉진시키는 작용을 하는 것으로 간주되기 때문에, 이는 본 발명자들의 모델에서 고정된 상태로 유지되었다: R8, G9, K10, R11, K15, E17.
"가요성" 폴리펩티드는 모두 하기 디자인 기준을 가졌다:
· 필수 AP2 잔기는 LA 모듈과의 상호작용을 유지하도록 그대로 유지된다 (R8, G9, K10, R11, K15, E17).
· AP2 비-필수 잔기는
o 분자간 상호작용을 최대화시키기 위해,
o 분자내 상호작용을 최대화시키기 위해,
o 가요성-루프 2차 구조를 채용하는 성향이 높은 폴리펩티드를 형성하기 위해,
o 수용성이 될 개연성이 높은 폴리펩티드를 형성하기 위해 변형된다.
AA 2차 구조 성향은 일반 대중에 널리 보급된 초우-파스만(Chou-Fasman) 방법 [41,42]의 개선된 버전인, 코스탄티니(Costantini) 및 동료들에 의해 결정된 기준에 따라 확립되었다 [40].
본 발명자들에 의해 디자인된 가요성 폴리펩티드의 목록은 하기 표 7에 제시되어 있다.
Figure pct00029
일례로, 본 발명자들은 모든 flex_1 잔기의 디자인을 상세하게 설명하였다:
· T1은 이중 쿠니츠형 폴딩 촉진을 위해 Y14와의 소수성 분자내 상호작용을 촉진시킬 수 있도록 선택되었다.
· G2는 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 잔기인 것으로 선택되었다.
· E3은 LA 모듈의 R103과의 H-결합 분자간 상호작용을 촉진시킬 수 있도록 선택되었다.
· S4는 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 극성 잔기인 것으로 선택되었다.
· N5는 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 극성 잔기인 것으로 선택되었다.
· T6은 LA 모듈의 V106과의 소수성 분자간 상호작용을 촉진시킬 수 있도록 선택되었다.
· V7은 LA 모듈의 T126과의 소수성 분자간 상호작용을 촉진시킬 수 있도록 선택되었다.
· R8은 LA 모듈과의 상호작용에 필수적인 것으로 간주되는 AP2 잔기였다.
· G9는 LA 모듈과의 상호작용에 필수적인 것으로 간주되는 AP2 잔기였다.
· K10은 LA 모듈과의 상호작용에 필수적인 것으로 간주되는 AP2 잔기였다.
· R11은 LA 모듈과의 상호작용에 필수적인 것으로 간주되는 AP2 잔기였다.
· G12는 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 극성 잔기인 것으로 선택되었다.
· S13은 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 극성 잔기인 것으로 선택되었다.
· Y14는 이중 쿠니츠형 폴딩 촉진을 위해 T1과의 소수성 분자내 상호작용을 촉진시킬 수 있도록 선택되었다.
· K15는 LA 모듈과의 상호작용에 필수적인 것으로 간주되는 AP2 잔기였다.
· D16은 LA 모듈의 Q104와의 H-결합 분자간 상호작용을 촉진시킬 수 있도록 선택되었다.
· E17은 N 단부와 분자내에서 상호작용하고, 이중 쿠니츠형 폴딩 촉진을 위해 필수적인 것으로 간주되는 AP2 잔기였다.
· N18은 가요성-루프를 형성하는 성향이 높은 극성 잔기인 것으로 선택되었다.
· R19는 LA 모듈의 D110과 H-결합 분자간 상호작용을 형성하는 극선 잔기인 것으로 선택되었다.
강성 폴리펩티드
본 발명자들은 그의 "강성" 폴리펩티드 디자인 전략법을 AP2 대신 공결정화된 RAP LA 복합체에 기초하여 수행하였다. RAP는 3개의 연결된 강성 α-나선을 형성하는, 106개의 AA로 이루어진 큰 폴리펩티드이다. RAP는 그의 가장 큰 2개의 α-나선을 사용하여 2개의 LA 모듈과 상호작용한다.
본 발명자들은 단일 또는 이중 도메인 결합제로서 작용할 수 있는, 단일 α-나선을 형성하는 보다 작은 소형의 폴리펩티드를 디자인하였다. RAP의 주요 상호작용 모티프는 "K**K***Y"인 것으로 확인되었고, 여기서, 두번째 리신이 필수적인 것이다. 다른 두 잔기는 수용체의 중요한 카르복실레이트 및 카르보닐 모이어티에 대한 H-결합 공여자 기 역할을 한다. 따라서, 본 발명자들은 첫번째 리신 및 티로신 잔기는, 이 역시 H-결합 공여자이고, 양으로 하전된 것인 리신 또는 아르기닌 잔기로 교환될 수 있으며, 이로써 그가 최적의 방식으로 산성 수용체 잔기와 상호작용할 수 있게 할 수 있다는 것을 제안하였다. RAP 모사체의 다른 잔기는 α-나선을 형성하는 성향이 높은 AA이어야 한다.
알리아스(Alias) 및 동료들은 "Ac-YGDAAAE-X-EAAAAG-NH2" 패턴을 사용하여 α-나선 폴리펩티드를 수득하는 데 성공을 거두었다 [43]. 다중 알라닌 모니프는 확실히 α-나선이 형성될 수 있도록 하고, 아스파르테이트 잔기는 폴리펩티드의 가용성을 증가시키고, 티로신 잔기는 폴리펩티드 농도의 분광 분석적 정량화를 용이하게 하는 것으로 제안되었다 [44].
본 발명자들에 의해 디자인된 이중 도메인 결합제는 알리아스 및 동료들의 폴리펩티드보다 더 크고, 비록 다중 알라닌 잔기가 확실히 α-나선이 형성될 수 있도록 하더라도, 알라닌은 가용성에 관한 문제를 일으키는 비극성 잔기이다. 상기와 같은 가용성에 관한 문제를 피하기 위해, 본 발명자들은 α 나선의 결합 표면의 반대측 상에서 알라닌 잔기를 글루타메이트 잔기로 돌연변이화시키는 것을 선택하였다. 글루타메이트는 그의 음전하에 기인하여 선택되었으며, 이로써 폴리펩티드의 가용성은 증가하게 되고, 잠재적으로 폴리펩티드의 양으로 하전된 쪽 (리간드의 결합 부위)은 수용체의 음으로 하전된 표면 쪽으로 지향된다. 또한, 글루타메이트 잔기는 α-나선을 형성하는 성향이 높다. 마지막으로, RAP α-나선에 존재하는 잔기 또한 고려된다 (rigid_5).
본 발명자들에 의해 디자인된 모든 강성 폴리펩티드는 하기 표 8에 제시되어 있다.
Figure pct00030
본 발명자들에 의해 디자인된 모든 강성 폴리펩티드의 구조는 상기 기술된 순이론적 방법을 사용하여 예측하였다 [36]. 순이론적 모델을 통해 제안된 폴리펩티드 모두에 대한 α-나선 구조를 예측하였다. (폴리펩티드의 길이가 같다는 것을 감안할 때) 2가지 추세가 관찰되었다:
· 알라닌의 개수가 적을수록, 폴리펩티드가 α-나선 구조를 가질 수 있는 기회는 더 낮다
· 알라닌 잔기가 많을수록, 폴리펩티드가 불용성이 될 가능성은 더 높다.
형광 표지된 펩티드 시험관내 BBB 모델 통과 시험
물질 & 장치
물질
- 링거-Hepes 완충제 (RH 완충제):
NaCl 150 mM; KCL 5.2 mM; CaCl2 2.2 mM; MgCl2 0.2 mM; NaHCO3 6 mM; Hepes 5 mM; 글루코스 2.8 mM. pH 7.2-7.4로 조정 및 0.22 ㎛의 필터 공극 크기를 통과하는 필터.
- DMEM/F12
- 루시퍼 옐로우-CH(Lucifer Yellow-CH), 시그마, 참조 L0259
장치
- 세포 배양용 인큐베이터 (37℃, 습윤 대기, 95% 대기 및 5% CO2).
- 멸균 세포 배양용 캐비닛.
- 뚜껑이 있는 밀리셀 24웰 리시버 트레이, 밀리포어, 참조 PSMW010R5.
- 코닝 96웰 솔리드 블랙 평평 바닥 폴리스티렌 TC 처리된 마이크로플레이트.
- 수조, 37℃.
- 흡인 시스템.
- 자동 마이크로피펫터.
- 형광계.
시험관내 BBB 모델 확립
도 22에 도시된 바와 같이 공배양 방법을 수행하였다. 마우스의 혼합된 신경아교 세포의 1차 배양물은 24웰 플레이트 상에 시딩하고, 소 뇌 내피 세포는 또 다른 플레이트 중의 콜라겐 코팅된 삽입물 상에서 배양하였다. 3일 후, 삽입물을 성상세포 함유 플레이트로 이동시키고, 추가로 3일 동안 배양하였다. 시험관내 BBB의 무결성을 평가하기 위해, 실험 당일 경내피 전기 저항 (TEER)을 측정하였다. TEER 값이 200 Ω/㎠보다 높은 것을 허용가능한 것으로 간주하였다.
필터 시험
하기 방법에 따라 막이 펩티드가 상부 구획으로부터 하부 구획으로 통과하여 이동하는 것을 막을 수 있는지 여부를 시험하였다. 펩티드를 20 ㎍/ml의 형광단으로 삽입물 관강 측에 적용시키고, 링거-Hepes 완충제 (링거-Hepes 완충제의 조성은 상기 기술되어 있다)로 충전된 웰에 배치하였다. 1 h 동안 인큐베이션시킨 후, 상부 및 하부 구획으로부터 샘플을 수집하고, 형광계를 사용하여 측정하였다. 두 구획 모두에서의 펩티드 농도가 동일하다면, 이는 펩티드 확산이 막에 의해 제약을 받지 않았다는 것을 나타낸다.
통과 시험 방법
(각 조건마다 3회에 걸쳐 연구한다는 것을 고려하여) 각각의 시험된 펩티드 용액을 최종 형광단 농도 20 ㎍/ml로 DMEM/F12 배지 중에서 제조하였다. 형광 표지된 스크램블된 펩티드 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다. 20 μM 루시퍼 옐로우 (LY)를 각 샘플에 첨가하였다. LY는 뇌 투과도가 낮은 소형 친수성 분자인 바, 이에 그의 내피 투과율이 내피 세포 단층의 무결성을 나타낸다. FRET 유사 이벤트를 막기 위해 시험 펩티드에 의해 운반되는 형광 표지의 Em/Ex의 스펙트럼과 화합성인 분자 트레이서를 선택하는 것이 중요하다.
삽입물을 각 웰마다 0.8 ml의 배지가 있는 새 24웰 플레이트로 이동시키고, 37℃에서 가온시키고, 400 ㎕의 미리 가온시킨 샘플 용액을 각 삽입물에 첨가하였다. 분취량의 각 용액을 수집하고 (t=0 상부), 4℃에서 보관하고, 광노출 뿐만 아니라, 배지로부터 보호하였다 (t=0 하부). 37℃ 및 5% CO2에서 60 min 동안 인큐베이션시킨 후, 상부 및 하부 용액을 수집하였다 (t=60 상부 및 t=60 하부).
각 조건으로부터 얻은 모든 샘플 (t=0 상부, t=0 하부, t=60 상부 및 t=60 하부) (시험 펩티드 및 음성 대조군)을 검은색 96웰 마이크로플레이트 뿐만 아니라, 상응하는 표준 곡선에 플레이팅하였다. 다중 웰 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정하였다.
이어서, 펩티드의 물질 균형을 수행하여 가능한 흡수 또는 축적 현상에 대해 확인하였다. 물질 균형 값은 실험 종료시 회수된 화합물의 비율(%)을 제공하며, 이는 하기 제시된 바와 같이 계산된다:
Figure pct00031
.
투과도 계산
LY 및 시험된 펩티드에 대한 내피 투과율 값 또한 계산하였다. 제거 원리를 사용하여 농도 비의존성 수송 파라미터를 수득하였다. 하기 제시된 바와 같이, 수송된 화합물의 양을 공여자 챔버 농도로 나누고, 제거된 총 부피를 계산함으로써 인큐베이션 시간 사이에 제거된 부피의 증분량을 계산하였다:
Figure pct00032
.
[C]l은 초기 관강 트레이서/펩티드 농도를 나타내고, [C]α는 관강에서 떨어진 트레이서/펩티드 농도를 나타내고, Vα는 관강에서 떨어진 챔버의 부피를 나타낸다. 실험하는 동안, 제거 부피는 시간 경과에 따라 선형으로 증가하였다. 평균 제거 부피를 시간에 대해 플롯팅하고, 기울기는 선형 회귀 분석에 의해 추정하여 추정 평균 및 표준 오차를 제공하였다. 공배양물에 대한 제거 곡선의 기울기는 PSt로 나타낸다 (여기서, PS는 투과도 x 생성물 표면적 (㎕/분)을 나타낸다). 오직 콜라겐으로만 커버된 필터에 대한 제거 곡선의 기울기는 PSf로 나타낸다. 내피 단층에 대한 PS 값 (PSe)은 하기 제시된 바와 같이 계산된다:
Figure pct00033
.
PSe 값을 필터 표면적 (밀리셀 24 (세포 배양물 삽입물)의 경우, 0.7 ㎠)으로 나누어 내피 투과율 (Pe, cm/분)을 얻었다.
LY Pe 및 시험 펩티드/스크램블 펩티드 Pe 계수를 각 샘플마다 계산하였다. LY Pe 계수 값이 0.2 - 0.8 x 10-3 cm·min-1일 경우, 이때 장벽은 실험 후 온전한 것으로 간주하였고, 시험 펩티드 및 대조군의 투과도 값은 주로 세포횡단 유량에 기인하였다.
결과
본 방법을 사용하였을 때, 형광 펩티드는 하기 비율로 모델 BBB를 통과하였다:
레귤론
Figure pct00034
BBB 통과율: 3.73%.
레귤론 폴리펩티드
서열:
Figure pct00035
BBB 통과율: 11.43%.
RAP 폴리펩티드
서열:
Figure pct00036
BBB 통과율: 8.27%.
가요성 폴리펩티드
서열:
Figure pct00037
BBB 통과율: 8.17%.
강성 폴리펩티드
서열:
Figure pct00038
BBB 통과율: 7.51%.
상기 데이터는 도 24에 그래프로 제시되어 있다.
결론
본 발명자들은 수용체를 매개로 BBB의 트랜스사이토시스가 이루어지는 폴리펩티드를 개발하였다. 본 발명의 폴리펩티드를 작용제에 접합시킴으로써, 그렇지 않았다면 BBB에 의해 배제되었을 작용제를 BBB를 가로질러 뇌 내로 수송할 수 있게 되었다. 본 발명의 폴리펩티드를 치료제 및/또는 진단제에 접합시킴으로써 치료제 및/또는 진단제를 뇌로 수송할 수 있게 되었고, 이로써 새로운 개선된 치료학적 및 진단학적 가능성을 제공하였다.
Figure pct00039
참고 문헌
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
SEQUENCE LISTING <110> Sagetis Biotech, SL <120> POLYPEPTIDES FOR BLOOD BRAIN BARRIER TRANSPORT <130> P062878WO <140> not yet assigned <141> 2013-11-14 <150> GB 1220474.9 <151> 2012-11-14 <160> 48 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Regulon <400> 1 His Lys Lys Trp Gln Phe Asn Ser Pro Phe Val Pro Arg Ala Asp Glu 1 5 10 15 Pro Ala Arg Lys Gly Lys Val His Ile Pro Phe Pro Leu Asp Asn Ile 20 25 30 Thr Cys Arg Val Pro Met Ala Arg Glu Pro Thr Val Ile His Gly Lys 35 40 45 Arg Glu Val Thr Leu His Leu His Pro Asp His 50 55 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Regulon_construct1 <400> 2 Pro Thr Val Ile His Gly Lys Arg Glu Val Thr Leu His Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Regulon_construct4 <400> 3 Pro Met Ala Arg Glu Pro Thr Val Ile His Gly Lys Arg Glu Val Thr 1 5 10 15 Leu His Leu His Pro Asp His 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RH_construct1 <400> 4 Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln 1 5 10 15 Lys Gln Leu Glu 20 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RH_construct2 <400> 5 Asp Lys Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala 1 5 10 15 Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His 20 25 30 Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val 35 40 <210> 6 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RH_construct3 <400> 6 Asp Lys Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala 1 5 10 15 Lys Ile Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His 20 25 30 Glu Lys Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser 35 40 45 Arg Ser Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu 50 55 60 Gly Tyr Thr Val Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser 65 70 75 80 Arg Ala Arg His <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flex_1 <400> 7 Thr Gly Glu Ser Asn Thr Val Arg Gly Lys Arg Gly Ser Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Glu Asn Arg <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flex_2 <400> 8 Phe Arg Glu Ser Asn Thr Ile Arg Gly Lys Arg Glu Thr Thr Lys Asp 1 5 10 15 Glu Asn Arg <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flex_3 <400> 9 Thr Lys Glu Thr Ser Ala Thr Arg Gly Lys Arg Glu Thr Thr Lys Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flex_4 <400> 10 Ala Arg Glu Thr Ser Ile Val Arg Gly Lys Arg Asp Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Glu Gly Lys <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flex_5 <400> 11 Ser Ser Glu Ser Asn Ile Thr Arg Gly Lys Arg Glu Tyr Thr Lys Asp 1 5 10 15 Glu Gly Arg <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rigid_1 <400> 12 Gly Asp Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala 1 5 10 15 Ala Asp Gly Tyr 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rigid_2 <400> 13 Gly Asp Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Lys Ala Ala Ala Arg Ala Ala 1 5 10 15 Ala Asp Gly Tyr 20 <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rigid_3 <400> 14 Gly Asp Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Asp 20 25 30 Gly Tyr <210> 15 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rigid_4 <400> 15 Gly Asp Ala Ala Glu Ala Lys Ala Glu Lys Ala Glu Ala Lys Ala Glu 1 5 10 15 Ala Ala Glu Ala Lys Ala Glu Lys Ala Glu Ala Lys Ala Ala Ala Glu 20 25 30 Gly Tyr <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rigid_5 <400> 16 Gly Asp Ala Ala Glu Ala Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Ala Asn 1 5 10 15 Ala Ala Lys Ala Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Ala Ala Ala Asn 20 25 30 Gly Tyr <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 17 Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Linker <400> 18 Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 19 Ala Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Regulon hairpin <400> 20 Thr Val Ile His Gly Lys Arg Glu Val Thr Leu His 1 5 10 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta strand <400> 21 Thr Val Ile His Gly 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta strand <400> 22 Glu Val Thr Leu His 1 5 <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is A, F, S or T <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is G, K, R or S <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 18 <223> Xaa is G or N <220> <221> misc_feature <222> 19 <223> Xaa is K or R <400> 23 Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp 1 5 10 15 Glu Xaa Xaa <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is F, T or Y <400> 24 Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is G, K, R or S <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 17 <223> Xaa is G or N <220> <221> misc_feature <222> 18 <223> Xaa is K or R <400> 25 Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 10 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 16 <223> Xaa is G or N <220> <221> misc_feature <222> 17 <223> Xaa is K or R <400> 26 Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 10 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Xaa is G or N <220> <221> misc_feature <222> 16 <223> Xaa is K or R <400> 27 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 8 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 10 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> Xaa is G or N <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> Xaa is K or R <400> 28 Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 8 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> Xaa is G or N <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> Xaa is K or R <400> 29 Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu Xaa Xaa 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 8 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is G or N <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> Xaa is K or R <400> 30 Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu Xaa Xaa 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is G or N <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is K or R <400> 31 Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu Xaa Xaa 1 5 10 <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is A, F, S or T <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is G, K, R or S <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 18 <223> Xaa is G or N <400> 32 Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp 1 5 10 15 Glu Xaa <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is G, K, R or S <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 17 <223> Xaa is G or N <400> 33 Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 15 Xaa <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 10 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 16 <223> Xaa is G or N <400> 34 Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu Xaa 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> 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is F, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is G or N <400> 39 Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu Xaa 1 5 10 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is A, F, S or T <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is G, K, R or S <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> Xaa is F, T or Y <400> 40 Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp 1 5 10 15 Glu <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is G, K, R or S <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 13 <223> Xaa is F, T or Y <400> 41 Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 10 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> Xaa is F, T or Y <400> 42 Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 15 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 10 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> Xaa is F, T or Y <400> 43 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 <210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is N or S <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 8 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 10 <223> Xaa is F, T or Y <400> 44 Xaa Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is A, I or T <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 8 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 9 <223> Xaa is F, T or Y <400> 45 Xaa Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> Xaa is I, T or V <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 8 <223> Xaa is F, T or Y <400> 46 Xaa Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> 5 <223> Xaa is D, E or G <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> Xaa is S, T or Y <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> Xaa is F, T or Y <400> 47 Arg Gly Lys Arg Xaa Xaa Xaa Lys Asp Glu 1 5 10 <210> 48 <211> 357 <212> PRT <213> Receptor associted protein <400> 1 Met Ala Pro Arg Arg Val Arg Ser Phe Leu Arg Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Gly Pro Trp Pro Ala Ala Ser His Gly 20 25 30 Gly Lys Tyr Ser Arg Glu Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Pro Lys Arg 35 40 45 Glu Ser Gly Glu Glu Phe Arg Met Glu Lys Leu Asn Gln Leu Trp Glu 50 55 60 Lys Ala Gln Arg Leu His Leu Pro Pro Val Arg Leu Ala Glu Leu His 65 70 75 80 Ala Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Asp Glu Leu Ala Trp Lys Lys Leu 85 90 95 Lys Leu Asp Gly Leu Asp Glu Asp Gly Glu Lys Glu Ala Arg Leu Ile 100 105 110 Arg Asn Leu Asn Val Ile Leu Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Lys Lys 115 120 125 Asp Ala Arg Gln Val Thr Ser Asn Ser Leu Ser Gly Thr Gln Glu Asp 130 135 140 Gly Leu Asp Asp Pro Arg Leu Glu Lys Leu Trp His Lys Ala Lys Thr 145 150 155 160 Ser Gly Lys Phe Ser Gly Glu Glu Leu Asp Lys Leu Trp Arg Glu Phe 165 170 175 Leu His His Lys Glu Lys Val His Glu Tyr Asn Val Leu Leu Glu Thr 180 185 190 Leu Ser Arg Thr Glu Glu Ile His Glu Asn Val Ile Ser Pro Ser Asp 195 200 205 Leu Ser Asp Ile Lys Gly Ser Val Leu His Ser Arg His Thr Glu Leu 210 215 220 Lys Glu Lys Leu Arg Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asp Arg Leu Arg Arg 225 230 235 240 Val Ser His Gln Gly Tyr Ser Thr Glu Ala Glu Phe Glu Glu Pro Arg 245 250 255 Val Ile Asp Leu Trp Asp Leu Ala Gln Ser Ala Asn Leu Thr Asp Lys 260 265 270 Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Glu Leu Lys His Phe Glu Ala Lys Ile 275 280 285 Glu Lys His Asn His Tyr Gln Lys Gln Leu Glu Ile Ala His Glu Lys 290 295 300 Leu Arg His Ala Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Arg Val Ser Arg Ser 305 310 315 320 Arg Glu Lys His Ala Leu Leu Glu Gly Arg Thr Lys Glu Leu Gly Tyr 325 330 335 Thr Val Lys Lys His Leu Gln Asp Leu Ser Gly Arg Ile Ser Arg Ala 340 345 350 Arg His Asn Glu Leu 355

Claims (20)

  1. (a) 길이가 59개 미만의 아미노산 길이이고, 서열 2의 7개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하고, (서열 1에 대해 넘버링된) K48 및 R49를 포함하는 레귤론 폴리펩티드;
    (b) 길이가 100개 미만의 아미노산 길이이고, 서열 4로부터의 20개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 RAP 폴리펩티드;
    (c) 길이가 100개 미만의 아미노산 길이이고, 가요성 루프를 포함하며, 하기 서열:
    X1 X2 E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 X11
    또는
    R G K R X7 X8 X9 K D E
    (여기서, X1 = A, F, S 또는 T; X2 = G, K, R 또는 S; X3 = S 또는 T; X4 = N 또는 S; X5 = A, I 또는 T; X6 = I, T 또는 V; X7 = D, E 또는 G; X8 = S, T 또는 Y; X9 = F, T 또는 Y; X10 = G 또는 N; X11 = K 또는 R)를 포함하는 가요성 폴리펩티드; 또는
    (d) 길이가 100개 미만의 아미노산 길이이고, 알파 나선을 포함하며, 하기 컨센서스 서열:
    (K/R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R), 임의적으로
    G D (A/E)α (K/R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R) A Xβ G Y
    (여기서, 바람직하게 α는 1-10이고, β는 1-25임)를 포함하는 강성 폴리펩티드
    인, 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과하기 위한 폴리펩티드.
  2. 제1항 (a)에 있어서,
    (a) (서열 1에 대해 넘버링된) (i) T43, V44, I45, H46, G47, 및/또는 (ii) E50, V51, T52, L53 및 H54; 및 임의적으로
    (b) (서열 1에 대해 넘버링된) P43 및 L55; 및 임의적으로
    (c) (서열 1에 대해 넘버링된) (i) P37, M38, A39, R40, E41, 및/또는 (ii) H56, P57, D58, 및 H59를 포함하는 레귤론 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가:
    (a) 서열 2 또는 서열 3을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 레귤론 폴리펩티드;
    (b) 서열 4, 서열 5 또는 서열 6을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 RAP 폴리펩티드;
    (c) 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 또는 서열 11을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 가요성 폴리펩티드;
    (d) 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 강성 폴리펩티드
    인 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합적으로 제조된 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 합성에 의해 제조된 폴리펩티드.
  6. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드; 및
    (b) 작용제
    를 포함하며, 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과할 수 있는,
    BBB를 가로질러 작용제를 수송하기 위한 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 작용제가 약물, 폴리펩티드, 효소, 항생제, 항암제, 방사성 작용제, 항체, 세포 독소, 검출가능한 표지 또는 항-혈관신생 화합물인 접합체.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 작용제가 치료제인 접합체.
  9. 제8항에 있어서, 작용제가 소형 분자 약물인 접합체.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서, 작용제가 진단제이고, 임의적으로 여기서 진단제는 염료, 화학발광 염료, 방사성 영상화제, 금속 킬레이트 착물, 형광 표지, 효소-기질 표지, 항체 또는 그의 항체 단편인 접합체.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 링커를 통해 작용제에 접합된 것인 접합체.
  12. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 작용제에 직접적으로 접합된 것인 접합체.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자를 포함하는 접합체.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 BBB를 가로질러 수송된 후, 폴리펩티드로부터 방출가능한 것인 접합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 폴리펩티드, 접합체, 또는 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 신경계 질환, 임의적으로, 뇌 종양, 뇌 전이, 정신분열증, 간질, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 졸중, 및/또는 BBB의 기능 장애와 관련된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩티드, 접합체, 또는 제약 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 진단 방법에서 사용하기 위한 폴리펩티드, 접합체, 또는 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 신경계 질환 진단에서 사용하기 위한 폴리펩티드, 접합체, 또는 제약 조성물.
  20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
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