JP5034005B2 - 細胞死誘導ペプチド、map化細胞死誘導ペプチド、細胞死誘導剤及び抗癌剤 - Google Patents
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上記課題を解決するための本願第1発明の構成は、配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号39〜281の領域から選ばれる連続した4〜12個のアミノ酸からなるペプチドであって、以下の(a)及び(b)に該当する、細胞死誘導ペプチドである。
(a)SNLHLの内の連続した3個以上のアミノ酸を含まない。
(b)当該ペプチドを固定化したチップ上での48時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の80%以下である。
上記課題を解決するための本願第2発明の構成は、前記第1発明に係るペプチドの生細胞数測定平均値がコントロールの生細胞数測定平均値の70%以下である、細胞死誘導ペプチドである。
上記課題を解決するための本願第3発明の構成は、以下の(1)〜(14)のいずれかのアミノ酸配列を有する、細胞死誘導ペプチドである。
(1)YSKSGIAC
(2)KSGIACFL
(3)GIACFLKE
(4)ACFLKEDD
(5)KEDDSYWD
(6)SPCWQVKW
(7)CWQVKWQL
(8)QVKWQLRQ
(9)KWQLRQLV
(10)LRNGELVI
(11)NGELVIHE
(12)KENTKNDK
(13)NTKNDKQM
(14)KNDKQMVQ
第3発明に規定する上記(1)〜(14)のいずれかの細胞死誘導ペプチドのアミノ酸配列は、いずれも配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号39〜281の領域から見出されたものである。後述の実施例において述べるように、これらの細胞死誘導ペプチドは、いずれも第1発明の(b)に該当する細胞死誘導活性が具体的に確認されている。
上記課題を解決するための本願第4発明の構成は、前記第3発明に係る(1)〜(14)のいずれかのアミノ酸配列において任意の1個又は2個のアミノ酸が置換・欠失・又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、当該ペプチドを固定化したチップ上での48時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の80%以下である、細胞死誘導ペプチドである。
上記課題を解決するための本願第5発明の構成は、1個以上のCを含む4〜12個のアミノ酸からなり、かつ、前記Cのカルボキシル末端側には芳香族アミノ酸が結合している、細胞死誘導ペプチドである。
上記課題を解決するための本願第6発明の構成は、前記第5発明に係る細胞死誘導ペプチドにおいて、前記芳香族アミノ酸のカルボキシル末端側には、任意の種類の1個又は2個のアミノ酸を介してKが結合している、細胞死誘導ペプチドである。
上記課題を解決するための本願第7発明の構成は、前記第1発明〜第6発明のいずれかに係る細胞死誘導ペプチドが可溶化状態のものであり、あるいは、そのアミノ基又はカルボキシル基において固定化された状態のものである、細胞死誘導ペプチドである。
上記課題を解決するための本願第8発明の構成は、第1発明〜第6発明のいずれかに係る細胞死誘導ペプチドの1種又は2種以上をMAP化したものである、MAP化細胞死誘導ペプチドである。
上記課題を解決するための本願第9発明の構成は、第1発明〜第7発明のいずれかに係る細胞死誘導ペプチド、及び/又は、第8発明に係るMAP化細胞死誘導ペプチドを有効成分とする、細胞死誘導剤である。
上記課題を解決するための本願第10発明の構成は、第1発明〜第7発明のいずれかに係る細胞死誘導ペプチド、及び/又は、第8発明に係るMAP化細胞死誘導ペプチドを有効成分とする、抗癌剤である。
本願発明者は、細胞死誘導活性を有するペプチドを同定するための手法として、ハイスループットコンビナトリアルケミストリーにおいてペプチドチップを使用した。この方法は、新規な生理活性を持つペプチドのスクリーニングに有用であり、チップ上での細胞培養を可能にする。
(a)SNLHLの内の連続した3個以上のアミノ酸を含まない。
(b)当該ペプチドを固定化したチップ上での48時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の80%以下である。
ペプチドチップは、非常に高密度で網羅的なチップの作製が可能であり、現在、8000spot/ membraneが可能である。ハイスループットコンビナトリアルケミストリーとして新規生理活性を持つペプチドのスクリーニングに有用であることが期待される。
TRAILの細胞外ドメインの全領域を網羅し、かつアミノ酸を前記のように2残基ずつ順次ズラして、それぞれ8残基のアミノ酸からなるペプチドを、合計119種類、前記の Fmoc 法で固相合成した。これらのペプチドには、配列表の配列番号1におけるアミノ酸番号の若い方から順に Peptide number (ペプチド試料としての通し番号)を付与した。即ち、Peptide No. 1はアミノ酸番号39〜46に相当するアミノ酸配列を持つペプチド、Peptide No. 2はアミノ酸番号41〜48に相当するアミノ酸配列を持つペプチド、・・・である。セルロースメンブレンに、固相合成したペプチドのスポットを直径6mmに切り出して、96穴プレートの底面に入れた。
図3に、ペプチドチップによる増殖阻害活性、即ち細胞死誘導活性の解析結果を示す。図3の横軸は Peptide No.を示す。図3の縦軸は、コントロール(チップ上にペプチドを固定化せずに行った測定例)における蛍光強度の測定値を1とした場合の、各 Peptide No.の比蛍光強度である。実際には各 Peptide No.についてそれぞれ9回の測定を行っており、図3にはそれらの平均値を表記した。又、図3中の上下に挿入した破線は、効果判定の一つの指標として記載したものである。
実施例1は固定化状態にある細胞死誘導ペプチドについての活性測定であるため、次に、実施例1で効果が確認された幾つかの細胞死誘導ペプチドについて、その可溶化状態における細胞死誘導活性を検定した。
図7に示す4種類のペプチドを用い、Jurkat細胞1.0×105 cell/mLを含む RPMI 培地(血清有り)に可溶性ペプチドを2mMの濃度で添加し、37°C、5%CO2 の条件下で24時間培養した後に、前記 Cytotoxone を添加し、10分間インベートした。次に反応停止液を加えて10秒間攪拌してから560nmの励起で590nmの蛍光を測定し、死細胞の放出するLDHを測定した。なお「No peptide」とは、上記において Jurkat の培地にペプチドを添加しなかった例である。
図8(b)に示すMAP化細胞死誘導ペプチド(Lys 残基の側鎖によって枝別れをしたMAP)を合成した。MAPに用いられた4単位の細胞死誘導ペプチドのアミノ酸配列も、図8(b)に示されている。一方、これと同じ細胞死誘導ペプチドを直鎖状に多量体化したものも合成した。
上記の各実施例の結果から、本発明の細胞死誘導ペプチド及びMAP化細胞死誘導ペプチドは、癌細胞に対する有効な細胞死誘導活性を有することが明らかとなった。従って、癌細胞を殺滅するペプチド医療への応用の可能性があり、又、本研究によって確立したスクリーニング法を用いた更なる有用な細胞死誘導ペプチドの発見が期待される。
〔配列表〕
SEQUENCE LISTING
<110> National University Corporation Nagoya University
<120> 細胞死誘導ペプチド、MAP化細胞死誘導ペプチド、細胞死誘導剤及び抗癌剤
<130> POK-05-028
<160> 17
<210> 1
<211> 281
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 1
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 16
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 32
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 48
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 64
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 96
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 112
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 128
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 144
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 176
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 192
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 208
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 224
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 256
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala 272
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 281
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 2
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys 8
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 3
Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu 8
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 4
Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu 8
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 5
Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp 8
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 6
Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp Asp 8
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 7
Ser Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp 8
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 8
Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu 8
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 9
Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln 8
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 10
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val 8
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 11
Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 8
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 12
Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu 8
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 13
Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys 8
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 14
Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met 8
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 15
Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 8
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 16
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser 8
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 17
Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp 8
Claims (5)
- 以下の(3)、(4)、(6)及び(7)のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞死誘導ペプチドを有効成分とすることを特徴とする細胞死誘導剤。
(3)GIACFLKE
(4)ACFLKEDD
(6)SPCWQVKW
(7)CWQVKWQL - 前記細胞死誘導ペプチドが可溶化状態のものであり、あるいはそのアミノ基又はカルボキシル基において固定化された状態のものであることを特徴とする請求項1に記載の細胞死誘導剤。
- 請求項1又は請求項2に記載の細胞死誘導ペプチドの1種又は2種以上をMAP(Multiple Antigenic Peptide)化したものであるMAP化細胞死誘導ペプチドを有効成分とすることを特徴とする細胞死誘導剤。
- 請求項1又は請求項2に記載の細胞死誘導ペプチド、及び、請求項3に記載のMAP化細胞死誘導ペプチドを有効成分とすることを特徴とする細胞死誘導剤。
- 請求項1又は請求項2に記載の細胞死誘導ペプチド、及び/又は、請求項3に記載のMAP化細胞死誘導ペプチドを有効成分とすることを特徴とする抗癌剤。
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