JP3972108B2

JP3972108B2 - 細胞死誘導のためのペプチド

Info

Publication number: JP3972108B2
Application number: JP2004124338A
Authority: JP
Inventors: 裕之本多; 猛小林; 己歳国松; 竜司加藤; 郁佳子奥野
Original assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2004-04-20
Filing date: 2004-04-20
Publication date: 2007-09-05
Anticipated expiration: 2024-04-20
Also published as: JP2005306762A

Description

本発明は、腫瘍細胞に対しての細胞死誘導ペプチドに関する。より詳細には、TRAIL（TRAIL）の細胞外ドメイン配列に由来するペプチドに関する。

TRAIL(TNF related apotosis inducing ligand)は、この受容体（デスリガンド）を介して癌細胞にアポトーシス（能動的細胞死）を誘導するが、正常細胞には影響を及ぼしない。このためTRAILは、副作用のない癌治療に利用できることが考えられている。しかし、その受容体との結合様式はまだ詳細に解明されてはおらず、その安定した大量生産プロセスもまだ未開発である。また、タンパク質そのものに比べて、ペプチドのような小さい分子の方が生体吸収性が高く、標的化分子や他の薬剤分子による科学的修飾が簡便であることが知られている。

ペプチドは、TRAILなどのタンパク質と比較して低分子でありながら、生体内において様々な生理活性を有する。多くの生体ホルモンやサイトカインの他、抗菌性ペプチドや、細胞接着性ペプチドなど、多くの機能を持つペプチドがこれまで報告されている。また、ペプチドの有機合成化学は、非常に発展しており、薬剤としての安定供給が可能である。

これまでに、抗菌活性、細胞接着の促進、アポトーシスやその他のタンパク質活性阻害剤など細胞機能性ペプチドなどたくさんの既往の研究例がある。しかし、短いペプチドであり、かつ細胞障害性を有するペプチドの報告は非常に少ない（非特許文献1、2）。さらに、このような活性を有するペプチドであっても、ペプチドの末端が固定化された状態でも活性を保持するものは報告がなかった。
Buckley CD, et al.、RGD peptides induce apoptosis by direct caspase-3 activation.、"Nature"、（UK）、1999年、397(6719)巻、p.534-9 Terui Y, et al.、NH2-terminal pentapeptide of endothelial interleukin 8 is responsible for the induction of apoptosis in leukemic cells and has an antitumor effect in vivo.、"Cancer Res. "、1999年、59(22)巻、p.5651-5

本発明は、細胞死誘導に有効なペプチドを提供することを目的とする。より詳細には、本発明は、細胞死誘導活性を有するペプチドを応用した細胞死誘導剤、抗癌剤、および癌を治療するための医薬を提供することを目的とする。

本発明者らは、細胞死誘導活性を有するペプチドを同定するための手法として、ハイスループットコンビナトリアルケミストリーにおいてペプチドチップを使用した。この方法は、新規生理活性を持つペプチドのスクリーニングに有用であり、チップ上での細胞培養を可能にする。スクリーニングの対象として、アポトーシス誘導因子であるTRAIL（TNF-related apoptosis-induced ligand）のアミノ酸配列を対象として、細胞死を誘導する部位の探索を行った。その結果、TRAILの細胞外ドメイン配列SNLHLの５残基がガン細胞に対し高い殺細胞効果があることを見いだした。さらに、本発明者らは、上記SNLHLペプチドをスクリーニングする際に、SNLHLには及ばないものの、従来到底得られなかった細胞増殖阻害能を有する複数のポリペプチドを同定するに至った。

また、上記ペプチドを固定化すると、より高い細胞死誘導活性を示した。固定化された状態では、同時に作用するペプチドの密度が高いことに意味があり、高い細胞死誘導活性を示したと考えられる。

上記知見に基づき、上記ペプチドを有効成分とする細胞死誘導剤を完成するに至った。

すなわち、本発明は、SNLHLのアミノ酸配列を有するペプチドおよび該ペプチドの1つまたは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチドを提供する。

また、上記ペプチドを含有する、細胞死誘導剤を提供する。

さらに、上記ペプチドを含有する、抗癌剤を提供する。

また、上記ペプチドを含有する、癌を治療するための医薬を提供する。

さらに、細胞死誘導剤または抗癌剤を製造するための、上記ペプチドの使用を提供する。

本発明のSNLHLペプチドおよび以下の実施例で示す幾つかの特定のポリペプチド（これらをまとめて本発明の細胞死誘導ペプチドという）は、固定化された状態でより効果があることが利点であり、さまざまな機能性材料に応用可能である点に関して非常に有用である。

本発明の細胞死誘導ペプチドは、癌治療剤として医薬品への応用が可能である。特に、血球系癌細胞の細胞死誘導剤として利用することができる。

本発明のペプチドは、SNLHLの配列を有するペプチドの1つまたは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチドを含む。特に好ましくは、SNLHLの配列を有するペプチドである。

ここで、ペプチドとは、2つ以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものである。本発明のペプチドは、特に5アミノ酸が結合したペプチドである。本発明のペプチドは、細胞死誘導活性を有する限り、種々の修飾や担体への固定化がなされていてもよい。細胞死誘導活性とは、ペプチド、担体、または細胞死誘導剤を投与することにより、細胞死を誘導することができる活性である。

保存的置換されたペプチドとは、同種の生化学的特性を有するアミノ酸残基によるアミノ酸置換（たとえば1、2、または3個の残基）を含むペプチドをいう。典型的には、保存的な置換は、置換されたポリペプチドの活性に対してほとんど影響を有さず、総電荷、疎水性／親水性、および／または置換したアミノ酸の立体的な大きさをほぼ保存するものである。したがって、SNLHLの配列を有するペプチドに1つまたは数個の保存的な置換を含むペプチドは、細胞死誘導活性を保持する。

保存的な置換と考えられるアミノ酸置換の例は、SNLHLのアミノ酸のうち：SerをAlaで；LysをArgで；SerをCysで；AsnをGlnで；LeuをIleで；LeuをMetで；LeuをPheで；SerをThrで；およびLeuをValで置換したペプチドを含む。

保存的な置換についてのさらなる情報は、Ben-Bassatら、（J. Bacteriol. 169： 751-7, 1987）、O'Reganら、（Gene 77： 237-51, 1989）、Sahin-Tothら、（Protein Sci. 3： 240-7, 1994）、Hochuliら、（Bio/Technology 6： 1321-5, 1988）、国際公開公報第00/67796号（Curdら）において、並びに遺伝学および分子生物学の標準的な教科書において、その他の位置においても見出すことができる。また、我々が以前に行ったFasリガンドについての研究においても、アミノ酸の保存的置換を有するこのような短いペプチドが細胞死誘導活性を保持していることが示されている（特願2003-287727を参照されたい）。したがって、このような保存的置換を有するSNLHLペプチドが細胞死誘導活性を有することは、当業者には明らかであろう。

本発明のペプチドは、以下の方法によって製造することができる。たとえば、ペプチド合成法によって製造することもできる。また、本発明のペプチドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。

ペプチド合成法によって製造する場合、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。ペプチド合成法は、たとえば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。

たとえば、当該ペプチドを構成し得るペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。このようなペプチドの合成には、自動合成基を使用してもよい（図1）。

具体的には、たとえばFmoc法を使用して、樹脂に固定したアミノ酸誘導体に1個ずつアミノ酸をカルボキシル末から結合させていく固相合成で合成することができる（図2は、メンブレンに固定化されたペプチドチップの作製の概略図を示す）。このような樹脂は、市販のペプチド合成用樹脂を使用すればよい。

Fmoc法では、α-アミノ基が塩基（たとえば、ピペリジン）で除去できるFmoc基で保護されているペプチド誘導体を使用する。この保護基を除いた後、N,N‐ジメチルホルムアミド（DMF）等で洗浄して乾燥させる。次いで、次の縮合剤（たとえば、HOBt）でカルボキシル基を活性化させたアミノ酸誘導体（たとえば、HOBtとのエステル）を縮合させる。次いで、DMF等で洗浄後、次のサイクルのための脱保護を行う。

上記サイクルを繰り返して所望の配列の合成ペプチドを得ることができる。このようにして得られたペプチドは、リンカーによって末の位置で樹脂に結合している。また、ペプチドの側鎖には保護基が付いている。

次に、この樹脂との結合を切断することによって遊離のペプチドが得ることができる。たとえば、還元条件下でトリフルオロ酢酸処理をし、側鎖保護基の脱保護および樹脂からの切断を行えばよい。

脱保護および切断処理後のペプチドは、ジエチルエーテル等で数回洗浄することによって遊離した保護基を除去することができる。また、メンブレンに固定化されたペプチドを得るためには、以下の実施例に記載したようにペプチドを合成し、切断処理を行わずに使用すればよい。

一方、本発明のペプチドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。たとえば、本発明のペプチドをコードするDNAを適切な発現ベクター内のプロモーターの制御下に組み込み、該ベクターを細胞にトランスフェクトすることにより、本発明のペプチドを発現させることができる。このようにして発現されたペプチドを精製して単離して使用すればよい。

得られたペプチドは、必要に応じて精製することもできる。ペプチドを精製するには、公知の分離、精製法を適切に組み合わせて行うことができる。分離、精製法としては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などがあげられる。

このようにして得られたペプチドは、細胞死誘導活性が損なわれない限り、透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とすることもできる。

また、本発明のペプチドは、C末端が固定化されていても細胞死誘導活性を有し、従って官能基を有する様々な化合物に結合（修飾）することができる。特に、本発明のペプチドは、以下の実施例に示したように、固定化された場合に細胞死誘導活性が向上される。したがって、本発明のペプチドは、担体に固定化されていてもよい。担体としては、たとえば、脂質を利用したリポソーム、糖質デンドリマーを利用した多価ペプチドポリエチレングリコールへの固定化があげられる。

本発明のペプチドを脂質（たとえば、パルミチン酸など）と結合させ、これをリポソームに取り込ませ（FEBS Lett. 2003; 540(1-3): 133-40. Liposome entrapment and immunogeni studies of a synthetic lipophilic multiple antigenic peptide bearing VP1 and VP3 domains of the hepatitis A virus: a robust method for vacccine design. Haro I, et al.を参照されたい）、以下に記載するように、特により細胞親和性の高い抗癌剤に応用することができる。

また、本発明のペプチドは、C末端が固定化されていても細胞死誘導活性を有するので、ポリエチレングリコール（PEG）と結合させることによってPEGハイブリット体とすることもできる（Gene Ther. 2000; 7(11): 1183-92 Protective copolymers for nonviral gene vectors: synthesis, vector characterization and application in gene delivery. Finsinger D et al.を参照されたい）。

その他、本発明のペプチドは、C末端が固定化されていても細胞死誘導活性を有するので、様々な分子デザインが可能である。たとえば、多価ペプチドとすることもできる。放射状に分岐したリジンのデンドリマーからなる小型コア分子を基本構造にして、その上に一連のペプチドを結合させることにより、三次元配座を有する巨大な高分子を作製することができる。本発明のペプチドをこのような高分子にデザインすることにより、細胞認識機能が向上する。したがって、以下に記載するように、細胞に（特に、抗癌剤として癌細胞に）投与したときの殺細胞効果を増強することができる。

細胞死誘導剤、抗癌剤、および癌を治療するための医薬
本発明の細胞死誘導剤、抗癌剤、および癌を治療するための医薬は、上記ペプチド単独であってもよく、あるいは薬理学的に許容される担体に固定化または混合されていてもよい。また、これらの薬剤は、当業者であれば、当該技術分野において既知の方法を使用して、容易に製剤とすることができるであろう。また、このような細胞死誘導剤および抗癌剤は、経口的又は非経口的（たとえば、局所、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。

特に、本発明の細胞死誘導剤、抗癌剤、および癌を治療するための医薬は、以下の実施例に示したように、合成高分子を利用したメンブレン、天然高分子を利用したハイドロゲル、ヒドロキシアパタイトのような無機担体に固定化されたペプチド単独であってもよく、上記のように担体に固定化されたペプチドを含む製剤としてもよい。また、近年ペプチドはそれ自身が自己組織化することでゲルを形成することが知られるため、ペプチドそのものをマテリアルとして利用してもよい。これらの態様の場合、細胞死を誘導したい細胞、組織等に直接適用してもよい。

本発明の細胞死誘導剤、抗癌剤、および癌を治療するための医薬の製造に用いられてもよい薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機高分子あるいは無機担体物質があげられ、たとえば、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、および懸濁化剤、あるいは固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤等があげられる。さらに必要に応じ、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を含むこともできる。

賦形剤としては、例えば、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。溶剤としては、例えばプロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン等が挙げられる。懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。

本発明の細胞死誘導剤および抗癌剤において、本発明のペプチドは、通常、製剤全体に対して約０．１〜１００重量％、好ましくは約１０〜９９．９重量％、さらに好ましくは約２０〜９０重量％程度である。本発明の細胞死誘導剤および抗癌剤において、本発明のペプチドまたは担体以外の成分の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約１０〜９９．９重量％、好ましくは約２０〜９０重量％程度である。

ペプチドチップは、非常に高密度で網羅的なチップの作製が可能であり（現在8000spot/ membrane が可能）、ハイスループットコンビナトリアルケミストリーとして新規生理活性を持つペプチドのスクリーニングに有用であることが期待される。本実施例では、細胞死誘導活性（特に、抗腫瘍性の機能）を有する新規ペプチドの探索手法としてペプチドチップを使用し、腫瘍細胞に対する細胞死誘導活性のスクリーニングを行った。スクリーニング対象として、アポトーシス誘導因子として知られるTRAILの細胞外ドメインのアミノ酸配列を用いた。

〔実験方法〕
セルロースメンブレンにFmoc法で固相合成したペプチドのスポットを直径6mmに切り出して、96穴プレートの底面に入れた。無血清培地DMEM-F-12（Gibco）を使用して、Jurkat細胞(ヒトTリンパ球培養細胞)をその上で培養した。細胞濃度1×10⁵cell/mlに調整し、プレート1wellに対し100μl入れた。この細胞を各チップ上で48時間で培養した（37℃、5% CO₂）。蛍光試薬により細胞を染色し、蛍光プレートリーダーFluoroskan Ascent（Labsystems）を用いて培養後の生細胞および細胞死の様子を測定した。蛍光試薬には、生細胞数についてはcalceinAM（molecular probes）（測定：励起485nm、蛍光538nm）、細胞死についてはCytotox one(Promega) （測定：励起560nm、蛍光590nm）を使用した。

ペプチドチップは、ペプチド自動合成機ASP 222 (Intavis 社製)を使用して、β-アラニンでコートしたセルロースメンブレン上に以下のように作成した。メンブレン上のβ-アラニンのアミノ基にFmocアミノ酸溶液（濃度0.25mol/l）を1.5μlスポッティングし、最初のアミノ基のカルボキシル基をメンブレンに結合させる。洗浄操作のあと、次のアミノ酸をFmocアミノ酸として反応して固定化させる。以下順次アミノ酸を結合させて、目的の配列を持つペプチドを合成した（図2）。合成したペプチドのC末端部分は、メンブレンと結合した状態で固定されている。

〔実験結果〕
上記ペプチドチップにおいて、TRAILのアミノ酸配列を網羅的にスポッティングしたメンブランを使用して、探索した。

図3は、ペプチドチップによる増殖阻害活性、すなわち細胞死誘導活性の解析結果を示す。アミノ酸５残基SNLHLは、特異的に高い殺細胞効果があることを見いだした。このペプチドの殺細胞効果は、先に報告したFasリガンド中の配列、CNNLPペプチドと同様の効果があることがわかった（特願2003-287727を参照されたい）。

上記結果より、本発明のペプチドは、細胞死抑制活性を有し、従って細胞増殖阻害効果を有することが明らかとなった。

このようなペプチドは、がん細胞を殺傷するペプチド医療への応用の可能性があり、本研究によって確立したスクリーニング法を用いたさらなる有用なペプチドの発見が期待される。

ペプチドチップ自動合成基を示す図。ペプチドチップ作製スキームを示す図。ペプチドチップによる解析結果を示す図。ペプチドチップによる解析結果を示すグラフ。

Claims

アミノ酸配列がSNLHLからなるペプチドを含有する、細胞死誘導剤。
請求項１に記載のペプチドを含有する、抗癌剤。
請求項１に記載のペプチドを含有する、癌を治療するための医薬。
細胞死誘導剤、抗癌剤、または癌を治療するための医薬を製造するための、請求項１に記載のペプチドの使用。