JPH04500905A - Ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子並びにｐｉ連結リンパ球機能関連抗原―３の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ９、ＰＩ連結アタッチメント機構を欠損することを特徴とする請求項４記載の組 換えＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主。

１０、請求項５記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主。

１１、請求項８または１０記載の宿主であって、前記宿主が、イー・コリ、シウ ドモナス、バシルス、ストレプトミセス、酵母、カビ、動物細胞、植物細胞並び に組織培養によるヒト細胞の種よりなる群から選択される宿主。

１２．動物細胞が、ＣＨＯおよびＲ１，１よりなる群から選択される請求項１１ 記載の単細胞宿主。

１３、宿主がＬ−Ｍ　（ｔｋ−）である請求項９記載の単細胞宿主。

１４、請求項８記載の単細胞宿主を培養する工程からなるポリペプチドの製造方 法。

１５、形質転換宿主が、 ＣＨＯ（ｐＪＯＤ−ｓ−ＬＦＡ３Ｐ２４）およびＲ１，１（ＢＧ２４＞よりなる 群から選択される請求項１４記載の方法。

１６、請求項９記載の単細胞宿主を培養する工程からなる可溶性ポリペプチドの 製造方法。

１７、請求項１０記載の単細胞宿主を培養する工程からなる可溶性ポリペプチド の製造方法。

１８、形質転換宿主を、Ｌ−Ｍ　（ｔｋ−＞（ＢＧ２４＞およびＬ−Ｍ（ｔｋ− ）（ｐＪＯＤ−ｓ−ＬＦＡ３Ｐ２４）よりなる群から選択する請求項１６記載の 方法。

１９、請求項１または２記載のＤＮＡ配列よりなる群から選択されるＤＮＡ配列 によって発現に際してコードされるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが ヒト起源の他の蛋白質を実質的に含有しないポリペプチド。

２０、免疫抑制的または増強的な有効量の請求項１９記載のポリペプチドと薬学 的に許容し得るキャリヤとからなる薬学的組成物。

２１、患者を処置するに際し、請求項２０記載の組成物を用いて薬学的に許容し 得る様式によりこれらを処置する工程からなる患者処置方法。

２２、診断的に有効量の請求項１つ記載のポリペプチドまたはこれに対する抗体 からなる、Ｔ細胞サブセット、ＣＤ２＋細胞を検出するための、または過剰もし くは枯渇したＴ細胞を特徴とする疾患の原因をモニタするための診１！７ｒ！ｆ ｌ成物。

２３、診断として請求項２２記載の組成物を用いる工程からなる、Ｔ［胞サブセ ット、ＣＤ２＋細胞を検出するための、または過剰もしくは枯渇したＴＭ胞を特 徴とする疾患の原因をモニタするための方法。

２４、請求項２３記載の組成物からなる、ＴＡＥＩＩ胞サブセット、ＣＤ２＋細 胞を検出するための、または過剰もしくは枯渇したＴ細胞を特徴とする疾患の原 因をモニタするための手段。

２５、ＬＦＡ−３阻害剤を単離する方法であって、前記方法が、（ａ）ｐ２４に よりセルラインを感染しくｂ）ジューカット（Ｊｕｒｋａｔｔ　）細胞および前 記感染セルラインを用いて結合アッセイを行い、更に（Ｃ）工程（ａ）の細胞に 対するジューカット細胞の結合を阻害する分子を選択する ことからなるＬＦＡ−３インヒビターの単離方法。

明細書 ＤＮＡ配列、組換えＤＮＡ分子並びに ＰＩ″宜ンバ−能　゛　原−３の製造　２この発明は、ＤＮＡ配列、組換えＤＮ Ａ分子並びにリンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態）を製造す る方法に関する。更に詳しくは、この発明は、適切な単細胞宿主中でＣＤ２、Ｔ リンパ球の表面上のレセプタに結合するＬＦＡ−３の可溶性ＰＩ連結形態または その誘導体を適切な単細胞宿主中で発現に際してコードすることを特徴とするＤ ＮＡ配列に関する。この発明によれば４．これらのＤＮＡ配列およびこれらを含 有する組換えＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主は、ヒト起源の他の蛋 白質を実質的に含有しないＬＦＡ−３の製造にも用いられる。そしてこの新規な 抗体は、この発明の治療および診断組成物並びに方法に用いることができる。

ｌ肌立！遣 Ｔリンパ球は、標的および抗原産生細胞と相互作用することにより、免疫応答に おいて主要な役割を果たす６例えば、Ｔリンパ球に媒介された標的細胞の殺傷は 、標的細胞に対する細胞毒性Ｔリンパ球の吸着を含む多段階プロセスである。

そして、ヘルパーＴリンパ球は、抗原産生細胞への吸着により免疫応答を開始す る。

標的および抗原産生細胞とのＴリンパ球のこれらの相互作用は高度に特異的であ り、Ｔリンパ球の表面上の多くの特異的な抗原レセプタの１つによる標的または 抗原産生細胞上の抗原の認識に依存する。

Ｔリンパ球および他の細胞のレセプター抗原相互作用は、種々のＴリンパ球表面 蛋白質、例えば抗原レセプタ複合体ＣＤ３　（Ｔ３）およびアクセサリ−分子Ｃ Ｄ４、ＬＦＡ−１、ＣＤ８、並びにＣＤ２によっても促進される。また、これは 、標的または抗原産生細胞の表面で発現されるＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１並びに ＭＭＣのようなアクセサリ−分子にも依存する。実際、Ｔリンパ球上の、および 標的または抗原産生細胞上のアクセサリ−分子は、互いに相互作用して細胞間吸 着を媒介するという仮説がある。よって、これらのアクセサリ−分子は、リンパ 球抗原産生細胞およびリンパ球標的細胞相互作用の効率を増強し、白血球エンド セリアル（Ｉｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　）細胞相互作用およ びリンノ（球再循環に重要であると考えられている。

例えば、最近の研究により、ＣＤ２　（Ｔリンパ球アクセサリ−分子）とＬＦＡ −３（＠的細胞アクセサリー分子）との間の、標的細胞に対するＴリンパ球吸着 を媒介する特定の相互作用があることが示唆された。この吸着は、Ｔリンパ球機 能応答の開始に必須である（エム・エル・ダストンら、「精製されたリンパ球機 能関連抗原−３はＣＤ２に結合しＴリンパ球吸着を媒介するＪ　、Ｊ、　Ｅｘｐ 、　Ｈｅｄ、、　１６５．　Ｄｏ、　６７７−９２（１９８７）、スプリンガー ら、「リンパ球機能関連ＬＦＡ−１、ＣＤ２．並びにＬＦＡ−３分子：免疫系の 細胞吸着レセプタ」、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｎ＋ｔｕｎｏ１．、５．　ｐｐ、 　２２３−５２　（１９８７））　、　ｔた、ＬＦＡ−３またはＣＤ２に対する モノクローナル抗体は、細胞毒性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球依存応答 のスペクトルを阻害することが示された（エフ・サンチェス−マドリッドら、「 ヒトＴリンパ球媒介細胞溶解に関連した特定の３つの抗原：ＬＦＡ−１、ＬＦＡ −２、並びにＬＦＡ−３ＪＰｒｏｃ、　Ｗａｔｔ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ、　７９．　ｐｐ、　７４８９−９３　（１９８２））　。

ＬＦＡ−３は抗原産生細胞上に、および標的細胞、特に単球、顆粒球、ＣＴＣ− ｓ、Ｂ−リンパ芽球細胞、平滑筋細胞、血管エンドセリアル細胞、並びに１ａ￥ ｌ芽細胞上に認められる（スプリンガーら、前記文献）、ＬＦＡ−３は、２つの 独特の細胞表面形態として存在する（ダストンら、「膜表面におけるＬ　Ｆ　Ａ −３細胞吸着糖蛋白質についてのアンカー機構」、Ｎａｔｕｒｅ、　３２９．　 ＤＤ、　８４６−８４８（１９８７））　、これらの形態は、主として生体膜の 脂質二重層に対するその付着ｍ楕によって異なる。この種のアンカー機構の１つ は、伸びた疎水性アミノ酸を介するものであり、膜横断ドメインとも呼ばれ、脂 質二重層を貫通するものである。この形態のＬＦＡ−３をコードするｃＤＮＡは 、組込み膜形成とも呼ばれるが、既にクローン化され配列決定されでいる（ビー ・ウォルナーら、Ｊ　ＥＸＤ。

Ｈｅｄ、、　１６６、　ｐｐ、　９２３−３２　（１９８７））。

その他、Ｌ　Ｆ　Ａ、　−３は、蛋白質のＣ末端に共有結合により付着したホス ファチジルイノシトール（’ＰＩＪ）含有糖脂質を介して、Ｂリンパ芽球細胞の 膜に挿入することが報告されている（ダストンら、前記文献）、この種の膜挿入 は、細胞表面にホスホイノシトール特異的ホスホリパーゼＣを添加した後に蛋白 質の存在を観察することにより推論される。この酵素は、蛋白質のＰＩ連結形態 のみを遊離する。これは組込み膜形成には影響を与えない、よって、この酵素の 存在下におけるＬＦＡ−３の遊離は、ＬＦＡ−３がＰ■連結形態を有することを 示唆する。

ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態は、遺伝子転写の他のＲＮＡスプライシングから誘導 されると考えられる。これは、ＬＦＡ−３の膜横断形態より、異なる細胞の種類 で、また異なる発育段階に際して、選択的に発現されると考えられる。

天然供給源、例えばリンパ芽球細胞からの精製により利用可能なものよりも、Ｌ ＦＡ−３の組換えＰＩ連結形態を大量に得るのが望ましい、更に望ましいのは、 ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態から大量の可溶性ＬＦＡ−３を得ることである。

九肌二歴羞 この発明は、これらの問題点を解決するものである。この発明の１つの観点は、 ＬＦＡ−３の組換えＰＩ連結形態の製造である。この発明の他の観点は、ＬＦＡ −３のＰＩ連結形態からの可溶性ＬＦＡ−３のｇＲ造である。ｆ＆者の態様は、 ＰＩ連結アタッチメントｍｉを欠損するセルライン中でＬＦＡ−３のＰＩ連結形 態をコードするＤＮＡ配列を発現させることにより達成される。この発明のなお 更なる観点は、ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態から誘導される可溶性ＬＦＡ−３の製 造方法である。この態様は、ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態の疎水性Ｊ［！凹領域を コードするＤＮＡ配列のこれらの蛋白質を除去することによって達成される。

この発明は、ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態ま、たはその誘導体を適切な単細胞宿主 中で発現に際してコードするＤＮＡ配列を提供することによってこれらそれぞれ の目標を達成するものである。

また、この発明は、これらのＤＮＡ配列を含有する刊換えＤＮＡ分子およびこれ らにより形質転換された単細胞宿主を提供する。これらの宿主により、広範な治 療および診断組成物および方法に使用する、この発明のＬＦＡ−３のＰＩ連結形 態、およびその誘導体の大量生産が可能となる。

この発明のＤＮＡ配列は、 （ａ）ファージλＰ２４に担持されたＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列、および （ｂ）前記ＤＮＡ配列によって発現に際してコードされるポリペプチドを発現に 際してコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択される。

また、この発明のＤＮＡ配列は、Ｌ、　Ｆ　Ａ　−３のＰＩ連結形態の疎水性膜 横断領域をコードするＤＮＡ配列のこれらの部分を除去することによって製造さ れるファージλＰ２４中に担持されたＤＮＡ挿入物の誘導体から選択される。

ｌ匡二應見ｌ盈墨 第１図は、免疫アフィニティクロマトグラフィを使用してヒト赤血球から精製し たヒトＬＦＡ−３のＮ末端および種々のペプチド断片のアミノ酸配列を示す。

第２図は、ヒト赤血球から精製したヒトＬＦＡ−３のアミノ酸配列から誘導され た化学合成オリゴヌクレオチドＤＮＡグローブの２つのプールを示す。

第３図は、ファージλＰ２４に担持されたＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列およびこれ から推論されたアミノ酸配列を示す。

第４図は、グラスミドｐＮＮＯ１の配列決定に関連する部分を示す。

第５図は、プローブＬＰ−１０、ＬＦ−１１、ＮＮ−Ａ、ＮＮ−Ｂ、ＮＮ−Ｃ１ 並びにＮＮ−Ｄのヌクレオチド配列を示す。

第６図は、ＬＦＡ−３の組込み膜形成をコードする、ファージλＰ２４に担持さ れたＤＮＡ挿入物（および推論されたアミノ酸配列）およびファージλＨＴ１６ に担持されたＤＮＡ挿入物（および推論されたアミノ酸配列）の比較を示す。

ｌ引ゴＱじ１ｊ 末梢血液リンパ球から誘導されたλｇｔｌｏｃＤＮＡライブラリーから、この発 明のＤＮＡ配列を単離した。しかしながら、ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態を発現す る他の細胞から調製したライブラリーを用いることもできる。これらには、例え は、単球、顆粒球、ＣＴＬ”ｓ、Ｂ−リンパ芽球、平滑筋細胞、エンドセリアル 細胞並びに繊維芽細胞が包含される。

また、ヒトゲノムのバンクを使用することもできる。

このライブラリーをスクリーニングするため、一連の化学合成アンチセンスオリ ゴヌクレオチドＤＮＡグローブを使用した。ヒト赤血球から精製したＬＦＡ−３ を使用して決定したＬＦＡ−３の種々の断片のアミノ酸配列を考慮してこれらの １０−ブを選択しな、これらの断片を第１図に示す、最少の縮退のオリゴヌクレ オチド１０−ブの構成を許容した種々の領域からアミノ酸を選択した。

２つのプローブのプールを調製した：ＬＦ１およびＬＰ２−５である。これらの プールを第２図に示す、ＬＦＩは３２倍縮退した２０マーであり、ＬＰ２−５は ３８４倍縮退した２０マーである。この後者の１−ルの高度の縮退のため、この プールを４つのサブプールに更に分割した。ＬＰ２、ＬＦ３、ＬＦ４並びにＬＦ ５であり、それぞれ９６倍縮退である。

スクリーニングのため、ファージハイプリダイゼーションスクリーリングアッセ イを利用し、このオリゴヌクレオチド１０−ブをｃＤＮＡライブラリーにハイブ リクイズさせた。

このグローブの１つにハイブリクイズするクローン、Ｐ２４を選択した。更に、 単離を行い、プラスミドに選択したクローン、Ｐ２４のｃＤＮＡ挿入物をサブク ローン化した後、そのヌクレオチド配列を決定し、これらのヌクレオチド配列か らアミノ酸配列を推論した。

第３図に、ファージλＰ２４のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列およびこれか ら推論されたアミノ酸配列を示す、第３図に示すように、このｃＤＮＡ挿入物は 、７２０ｂｐ（２４０アミノ酸）のオーブンリーディングフレーム、１７ｂｐの ５−非翻訳領域並びに９３ｂｐの３゛非翻訳領域を有する。また、膜横断ドメイ ン、すなわちＮａｇ□−Ｎ　７２％が存在する。Ｐ２４の３−非翻訳領域は、ポ リ（Ａ）アデニル化部位を含有する。Ｐ２４ｃＤＮＡは２４０アミノ酸の蛋白質 をコードし、２８アミノ酸のシグナル配列を含む６第６図に、ＬＦＡ−３（ＨＴ Ｉ　６）のＭ＃Ｉｌ込み形態のＤＮＡ配列および推論されたアミノ酸配列と、こ の発明のＬＦＡ−３のＰＩ連結形態との比較を示す、この比較から、ＬＦＡ−３ の膜層込み形態のＣ末端におけるサイトプラズムドメインを含む最後の１４アミ ノ酸（Ａ　Ａ　２゜ｅ　ＡＡ２□２）が、ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態の４つの異 なるアミノ酸によって置換されていることは明らかである。

この発明のＤＮＡ配列： （ａ）ファージλＰ２４に担持されたＤＮＡ挿入物Ｐ２４のＤＮＡ配列、および （ｂ）前記ＤＮＡ配列により発現に際してコードされるポリペプチドを発現に際 してコードするＤＮＡ配列、すなわち、第３図に示され寄託されたクローンλＰ ２４に含有されるｃＤＮＡ配列は、この発明に従って種々の方法により以下に記 載するように使用することができる。

このＤＮＡ配列、その一部、またはその合成もしくは半合成コピーは、種々の変 異を調製する開始材料として使用することができる。この種の変異は、サイレン ト、すなわち変異したコドンによってコードされるアミノ酸配列が変化しない変 異、またはノンサイレント、すなわち変異したコドンによってコードされるアミ ノ酸配列が変化する変異とし得る。この発明のＬＦＡ−３−ｓを製造または使用 するに際して、両方の種類の変異が有用たり得る６例えば、これらの変異は、よ り高いレベルの製造、より容易な精製、またはＬＦＡ−３のＰＩ連結形態の分泌 されて短くなるかまたは可溶性の形態の製造を許容し得る。

また、この発明のＤＮＡ配列は、ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態、またはその誘導体 を製造するのに有用であり、これらのＤＮＡ配列により形質転換されたＰＩ連結 により蛋白質に付着し得る単細胞宿主、例えばＣＨＯＡＩ胞中でこれらによって 発現に際してコードされる。好ましくは、この発明の第２の態様によれば、これ らのＤＮＡ配列は、ＰＩ連結アタッチメント機構を欠損するセルライン、例えば マウスＬ−細胞、例えばＬ−Ｍ（ｔｋ−）細胞中で発現し得る。この場合、ＬＦ Ａ−３は、可溶性の形態で培地中に分泌され得る。このＬＦＡ−３の分泌形態は 、Ｌ−Ｍ　（ｔｋ−）細胞の細胞内に保持されるかＣＨＯ＃胞から抽出される他 の形態より約３ｋｄ小さい、理論に拘泥されることを望むものではないが、本発 明のＤＮＡ配列により、より小さい可溶性の形態のＬＦＡ−３が製造され分泌さ れると考えられる。１１！横断領域の一部は、ＰＩ連結アタッチメントｉ構を欠 損する細胞による分泌の前後で切断され、したがって細胞表面に対するＬＦＡ− ３のＰＩ連結形態の十分な付着が妨害されるためである。

この発明の他の態様によれば、ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態をコードするＤＮＡ配 列は、第３図のものと比較して改変しくアミノ酸−２８〜２１２＞、これから例 えば約ヌクレオチド６６２〜７３１のような疎水性膜横断領域をコードする蛋白 質を除去し、これらの改変された配列により形質転換された全ゆる細胞中で可溶 性ＬＦＡ−３蛋白質の製造を図ることができる。

当業界で周知のように、この発明のＤＮＡ配列は、適切な発現ベクタ中でこれら を発現制御配列に機能的に連結することにより発現し、適切な単細胞宿主を形質 転換するその発現ベクタに用いられる。

発現制御配列へのこの発明のＤＮＡ配列の機能的連結には、勿論、ＤＮＡ配列の 上流の正確なリーディングフレーム中における翻訳開始シグナルの設定が包含さ れる０発現されるこの発明の特定のＤＮＡ配列がメチオニンで開始しない場合（ 例えば、成熟ＰＩ連結形態のＬＦＡ−３はフェニルアラニンで開始する）、開始 シグナルは結果的に付加的なアミノ酸、生成物のＮ末端に位置するメチオニンを 与える。この種のメチオニル含有生成物は、この発明の組成物および方法に直接 用いることができ、使用する前にメチオニンを除去するのが通常はより望ましい 、これらにより発現されたポリペプチドからこの種のＮ末端メチオニンを除去す る方法は、当業界で利用可能である０例えば、ある種の宿主および発酵条件によ り、生体内でＮ末端メチオニンの実質的に全ての除去が可能である。他の宿主は 、Ｎ末端メチオニンの試験管内における除去が必要である。しかしながら、この 種の生体内および試験管内における方法は、当業界で周知である。更に、この発 明のＬＦＡ−３−は、Ｎ末端におけるＮ末端メチオニンに加えてアミノ酸を含み 得る。このＬＦＡ−３は、これらのアミノ酸と共に使用することができ、または これらは使用する前にＮ末端メチオニンにより切断され得る。

広範な種類の宿主／発現ベクタの組合せを、この発明のＤＮＡ配列の発現に際し て用いることができる。有用な発現ベクタは、例えば、クロモシーム、非クロモ シーム並びに合成りＮＡ配列の断片、例えば種々の公知のＳＶ４０の誘導体およ び公知の＆Ｉｉ菌プラプラスミドえばｃｏｌＥｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐ ＭＢ９並びにこれらの誘導体を含むイー・コリ由来のプラスミド、より広範な宿 主範囲のプラスミド、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えばファージλの多数 の誘導体、例えばＮＭ９８９、並びに他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３および フィラメント状一本１ＤＮＡフアージ、酵母プラスミド、例えば２μプラスミド またはその誘導体、真核細胞中で有用なベクタ、例えは動物細胞で有用なベクタ およびプラスミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導されるベクタ、例えばフ ァージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるよう改変されたプラスミドよりな るものとし得る。この発明の好適な態様では、ＢＧ８、ｐ　ＢＨ３１２関連ベク タ［ア・−ル・ゲートら、Ｃｅ１ｌ、　４５．　ｐｐ、　６８５−９８　（１９ ８６）　］を用いる。

更に、広範な種類の発現制御配列のいずれが、機能的に連結された場合にＤＮＡ 配列の発現を制御する配列をこれらのベクタ中で使用してこの発明のＤＮＡ配列 を発現させる。この種の有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０またはアデ ノウィルスの初期および後期プロモータ、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣもしくは ＴＲＣ系、ファージλの主要オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白 質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼもしくは他の解糖系酵素のプロ モータ、酸性ホスファターゼのプロモータ、例えばＰｂｏ２、酵母α接合因子の プロモータ、並びに反核または真核細胞またはこれらのウィルスの遺伝子の発現 を制御するのが公知の他の配列、並びにこれらの種々の組合せが包含される。動 物細胞発現（例えば、Ｌ−Ｍ　（ｔｋ−）細胞）については、アデノウィルス２ の主要後期プロモータから誘導された発現制御配列を使用するのが好適である。

また、広範な種類の単細胞宿主細胞が、この発明のＤＮＡ配列の発現に有用であ る。これらの宿主には、周知の真核および原核宿主、例えばイー・コリ、シウド モナス、バシルス、ストレプトミセス、カビ、例えば酵母、並びに動物細胞、例 え１ｆＣＨＯおよ７ＪＲ１，１、Ｂ−Ｗオ、！：ヒＬ−Ｍｌｔ！Ａ胞、７７リカ ミドリザル細胞、例えはＣｏ５ｔ、ＣＯ３７、Ｂ５Ｃ４０、並びにＢＭＴＩＯｌ 並びに組織培養におけるヒト細胞および植物細胞が包含され得る。ＬＦＡ−３の 可溶性形態の発現のため、適切な宿主細胞は蛋白質のＰＩアタッチメントを欠損 する。Ｌ−Ｍ　（ｔｋ−）Ｎｉｌ胞が好適である。

必すしも全てのベクタ、発現制御配列並びに宿主が十分に同等に機能してこの発 明のＤＮＡ配列を発現するわけではないことを勿論理解すべきである。また、全 ての宿主は、同一の発現系について十分量等に機能し得ない、しかしながら、当 業者であれば、特別な実験なしにまたこの発明の範囲を離れることなく、これら のベクタ、発現ｖＩ＃配列、並びに宿主の内から選択を行うことができよう０例 えば、ベクタを選択するに際し、ベクタはその中で複製する必要があるため、宿 主を考慮すべきである。ベクタのコピー数、そのコピー数を制御する能力、並び にベクタによってコードされる全ゆる他の蛋白質の発現、例えば抗生物質マーカ も同様に考慮すべきである。

発現制御配列を選択するに際し、種々の因子をも考慮すべきである。これらには 、例えば、この発明の、特に可能な二次構造に関し、系の相対的な長さ、その制 御性、並びにその特定のＤＮＡ配列との和合性が包含される。単細胞宿主は、選 択したベクタとのこれらの和合性、これらに対するこの発明のＤＮＡ配列によっ て発現に際してコードされる生成物の毒性、これらの分泌特性、これらの蛋白質 を正確に折り畳む能力、これらの発酵要求性、並びにこの発明のＤＮＡ配列によ って発現に際してコードされる生成物の精製の容易性を考慮して選択すべきであ る。

これらのパラメータの内、当業者であれば、発酵に際して、または例えばマウス 細胞またはＣＨＯ［胞のラージスゲールによる動物培養に際して、この発明のＤ ＮＡ配列を発現し得る種々のベクタ／発現制御系／宿主の組合せを選択し得る。

この発明のＤＮＡ配列の発現に際して生産されるポリペプチドは、発酵または動 物細胞培養から単離し、当業界で公知の種々の方法で精製することができる。こ の種の単離および精製技術は、種々の因子、例えば生成物を如何にして製造する か、それが可溶性であるか不溶性であるか、またそれは細胞から分泌されるかそ れとも細胞を破壊することによって単離する必要があるのかに依存する。しかし ながら、当業者であれば、この発明の範囲から離れることなく最も適切な単離お よびｖｔ！ｉ！技術を選択し得る。

この発明のポリペプチドは、免疫応答を遮断または促進する組成物および方法に 有用である０例えば、これらは、標的細胞とのＴ細胞相互作用を妨害することに より、細胞毒性Ｔリンパ球活性を阻害する活性を有する。これらは、免疫応答に 対して類似する遮断または促進効果を有する。これらはヘルパーＴＡＩＩＩ胞と 標的細胞との相互作用を妨害するためである。

更に、この発明の化合物は、溶解および免疫応答につき特異的なＴ細胞を標的と するのに、または特異的に標的としたＴ細胞に対してリンホカインのような薬物 を配送するのに使用し得る。更に詳しくは、この発明のポリペプチドの可溶性誘 導体は、Ｔリンパ球のＣＤ２部位の飽和、したがってＴ細胞活性化の阻害に用い ることができる。これは、組織移植対宿主疾患、自己免疫疾患、例えぼりウマチ 性関節炎、並びに同種組織移植切片拒否の回避に大いに有用であるのは明らかで ある。更に、この発明のポリペプチドは、ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態またはＣＤ ２に対してモノクローナル抗体を越えて好適である。この発明のポリペプチドが 、ヒト以外の種において産生じた抗体より、ヒトにおいて免疫応答を誘発する傾 向がより少ないためである。この発明の治療組成物は、典型的には免疫抑制また は増強に有効な量のこの種のポリペプチドと薬学的に許容し得るキャリヤとから なる。この発明の治療方法は、これらの組成物を用いて薬学的に許容し得る様式 で患者を処置する工程からなる。

これらの治療に使用するこの発明の組成物は、種々の形態とすることができる。

これらには、例えば、固体、半固体並びに液体の投与形態、例えば錠剤、ビル、 粉末、液体溶液または懸濁液、リボ′ソーム、座薬、注入および注射溶液が包含 される。好適な形態は、投薬および治療適用の意図する様式に依存する。また、 この組成物は、好ましくは、当業者に公知の従来の薬学的に許容し得るキャリヤ およびアジュバントを含む、好ましくは、この発明の組成物は単位投与の形態で あり、通常は１日に１回以上患者に投与し得る。

一般に、本発明の薬学的組成物は、他の薬学的に重要なポリペプチド（例えばア ルファーインターフェロン）に使用されるものと同様の方法および組成物を使用 して処方および投薬し得る。よって、このポリペプチドは、凍結乾燥形態で保存 し、投与の直前に滅菌水で再構成し、非経口的、皮下、静脈内または病巣内のよ うな投与の通常の経路によって投薬することができる。

また、この発明のポリペプチドまたはこれらに対する抗体は、Ｔ細胞サブセット またはＣＤ２十細胞の検出、または過剰もしくは枯渇したＴ細胞を特徴とする疾 患、例えば自己免疫疾患、移植ウィルス宿主疾患並びに同種組織移植切片拒否の モニタを行う診断組成物および方法に有用である。更に、この発明のポリペプチ ドは、Ｔリンパ球の活性化またはＴリンパ球媒介による標的細胞の殺傷を阻害す るのに有用なＬＦＡ−３媒介付着の阻害剤のスクリーニングに使用することがで きる。この種のスクリーニング技術は当業界で周知である。

ｉ＆後に、この発明のポリペプチドまたはこれらに対する抗体は、ＢおよびＴ細 胞を分離するのに有用である０例えば、固体支持体に結合した場合、この発明の ポリペプチドまたはこれらに対する抗体は、ＢおよびＴ細胞を分離し得る。

この発明がより理解されるべく、以下の実施例を記載する。

これらの実施例は説明の目的のためのみであり、如何なる様式においてもこの発 明の範囲を限定するものとして構成されたものではない。

オリゴヌクレオチドグローブの合 エム・ダストンら、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｈｅｄ、、前記文献に記載されたように 先に精製され、ビー・ウォルナーら、前記文献に記載されたように配列決定され たＬＦＡ−３のサンプル（ダナ・ファーバー・キャンサー・インスチチュート、 ボストン、マサチューセッツ）を得た０次に、アプライド・バイオシステムス３ ０Ａ　ＤＮＡ合成装置により、最少の核酸縮退（第１図の下線参照）を特徴とす るＬＦＡ−３のサンプルのアミノ末端配列からの領域をコードするアンチセンス オリゴヌクレオチドＤＮＡ１０−プの２つのプールを化学的に合成した。

それぞれの選択されたアミノ酸配列について、全ての可能なコドンに相補的なプ ローブのプールを合成した。ＤＮＡのみならずｍＲＮＡにおいても対応する配列 に対してそのハイブリダイゼーションを可能とするアンチセンスのプローブを合 成した。［γ−”Ｐ’１ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを使用し、この オリゴヌクレオチド１０−ブをラベルした（マキサムとギルバート、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７４゜ｐ、　５６０　（１９７７）　 ）　。

第２図に示すように、オリゴヌクレオチドグローブプールＬＦＩは、３２倍縮退 を有する２０マーであった。１０−ブプールＬＦ２−５は、３８４倍縮退を有す る２０マーであった。しかしながら、その縮退を低減すべく、Ｇｌｙに対する縮 退コドンをそれぞれのサブプールについて４つの可能なヌクレオチドの１つにス プリットすることにより、このプールをそれぞれ９６倍縮退の４つのサブプール に合成した。その後、先に記載したように（ウォルナーら、Ｎａｔｔｌｒｅ、　 ３２０．００゜７７−８１　（１９８６））　、ヒト扁桃ｍＲＮＡを含有するノ ーザン・プロットに対する個々のサブプールのハイブリダイゼーションにより、 正しくない配列を含有する３つのプールから正しい配列を含有するサブプールを 選択した。オリゴヌクレオチドプローブのサブプールＬＦ２は、ヒト扁桃ＲＮＡ において１３００ヌクレオチド転写物とハイブリダイズしたが、これは、これが 正しい配列を含有することを示唆した。したがって、これを使用し、種々のライ ブラリーをスクリーニングするＬＦＩをプールしな。

λ　ｔｌｏ　′血゛　リンパｃＤＮＡライブラリーの末梢血液リンパ球（ＰＢＬ ）ＤＮＡライブラリーを調製するため、１回の吸着を介して白血球泳動（１ｅｕ ｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　）＃９からＰＢＬを加工し、単球を除去した。その後、 ＩＦＮｒ１０００Ｕ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍ１ＰＨＡを用いて２４時間非吸着 細胞を刺激した。フェノール抽出（マニアティスら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ０ｎｉｎ１７．０．１８７　（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ− ）（１９８２））を使用してこれらの細胞からＲＮＡを単離し、１回のオリゴｄ Ｔセルロース・クロマトグラフィーによりポリＡ”　ｍＲＮＡを調製した。

このＲＮＡをエタノール沈澱させ、高速真空にてこれを乾燥し、このＲＮＡを１ ０μ１Ｈ２０（０，５μｇ／μｌ）に再懸濁した。このＲＮＡをＣＨｓ　Ｈｇ　 ＯＨ（５ｍ　Ｍ最終濃度）およびβ−メルカプトエタノール（０，２６Ｍ）中で 室温にて１０分開廷理した。その後、４３℃で０．１Ｍ）リス−ＭＣＩ　（ｐＨ ８，３）にメチル水銀処理ＲＮＡを添加し、０、ＯＩＭＭｇ、Ｏ，ＯＩＭＤＴＴ 、２ｍＭバナジル複合体、５μｇオリゴｄＴ＋ｔ−＋ａ　、２０ｍＭＫＣｌ、１ ｍＭｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、０．５ｍＭｄＡＴＰ、２μｃｉ　［（Ｚ　 −’２Ｐ］ｄＡＴＰ、並びに３０Ｕ１．５μｌ　ＡＭＶ逆転写酵素（セイカガク ・アメリカ）、全ｊ１５０μｌとした。この混合物を室温で３分、４４℃で３時 間インキュベートし、その時間接、２．５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを添加するこ とにより反応を停止した。

等容量のフェノール：クロロホルム（１：１）を用いて反応混合物を抽出し、０ ．２容の１０ＭＮＨ，ＯＡｃおよび２．５容のＥｔＯＨを用いて水相を２回沈澱 させ、これを真空下で乾燥させた。ｃＤＮＡの収率は１，５μｇであった。

合成の際にＤＮＡポリメラーゼ■の大フラグメントを使用する以外は、オカヤマ とベルブ（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　２．　Ｄ。

１６１　（１９１３２））およびグブラーとホ７７７　（Ｇｅｎｅ、　２５．　 ｐ、　２６３（１９８３）　）の方法に従って第２ストランドを合成した。

このＤＮＡを８０μＩＴＡ緩衝液（０，３３Ｍトリス酢酸（ｐＨ７，８）、０． ０６６ＭＫ酢酸、０．０１ＭＭｇ酢酸、０、ＯＯＩＭＤＴＴ、５０．ｃｚｇ／ｍ １ＢｓＡ）、５μｇＲＮアーゼＡ、４単位ＲＮアーゼＨ１５０μＭβＮＡＤ、８ 単位イー・コリリガーゼ、０．３１２５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ並び にｄＴＴＰ、１２単位Ｔ、ポリメラーゼに再懸濁することにより二本ｆＮ　ｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａを平滑末端とし、この混合物を３７℃で９０分間インキュベートし、 １／２０容の０．５ＭＥＤＴＡを添加し、フェノール：クロロホルムにより抽出 した。０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、０．１ＭＮａＣ１、Ｏ，Ｏ ＯＩＭＥＤＴＡ中にて０１５０セフアデツクスカラムにより水相のクロマトグラ フィを行い、二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含有するリードビークを補集し、これをエ タノール沈澱させた。収Ｊｉ：６０５μｇｃＤＮＡ。

標準的な手順を使用し、この二本鎖ｃＤＮＡをリンカ３５Ｓ’ＡＡＴＴＣにＡＣ ；ＣＴＣＣＡＧＣＣ；ＣＧＧＣＣ（、Ｃ３’３’　ＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧ ＣＣＧＧＣＣ，Ｓ’に連結した。その後、５５００セフアクリルカラム上で８０ ０ｂｐおよびより長い断片のｃＤＮＡの大きさ選択を行い、Ｅｃ　ｏＲＩ消化λ ｇｔｌｏにこれを連結した。製造者のグロトコールに従って連結反応の分画をギ ガバック（ストラテジーン）にパッケージした。パッケージしたファージを使用 し、イー・コリＢＮＮ１０２細胞に感染させ、増幅するために細胞をブレーティ ングした。得られたライブラリーは、１．１２５Ｘ１０’の独立した組換え体を 含有していた。

ライブラリーのスクリーニング ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブＬＦＩを用い、ベントンとデービス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ、　１９６．　ｏ、　１８０　（１９７７）　）のプラークハイブ リダイゼーションスクリーニング技術を使用して、前記調製したＰＢＬｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングした。

Ｌブロスおよび０．２％マルトース中のＢＮＮ　１０２細胞の一夜培養物をベレ ット化し、これを等容量のＳＭＭ衝液（５０ｍＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，５） 、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇ５Ｏ，、並びに０．０１％ゼラチン）に再 懸濁した。その後、予め室温にて１５分間１．５×１０６フアージ粒子により９ ｍ夏の細胞を吸着させ、これらを３０のＬＢＭｇプレートにブレーティングした 。

３７℃における８時間のインキュベーションの後、このプレートに由来するフィ ルタにファージを吸着させ、０．５ＮＮａＯＨ／１．５ＭＮａＣＩのプール上に ５分間これらを置くことによってフィルタを溶解させ、その後同じ緩衝液に５分 間これらを浸漬した。０．５Ｍトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７，４）、１．５ＭＮａＣ １にそれぞれ５分間２回これらを浸漬することによりフィルタを中和し、ＩＭＮ Ｈ，ＯＡｃ中で２分間これらをリンスし、空気によりフィルタを乾燥させ、８０ ℃で２時間これらを焼成した。

０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール（ＭＷ４００，０００）、 ０．２％ウシ血清アルブミン、０．０５Ｍ）リス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）、１ Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ビロリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ、並びに１０％ 硫酸デキストラン（ＭＷ５００．０００＞中で予備ハイブリダイズし、）冨ルタ をオリゴヌクレオチドプローブＬＦＩにハイブリダイズさせた。オートラジオグ ラフィによリハイブリダイズするλ−ｃＤＮＡを検出した。

最初にＰＢＬライブラリーから２６の陽性のファージを選択し、これらのクロー ンを再スクリーニングし、同じプローブを使用して低密度にてこれらのプラーク 精製を行った。

Ｐ２４ｃＤＮＡクローンの　“ ＤＮＡ配列解析により、前記スクリーニングしたクローン、Ｐ２４からｃＤＮＡ の特徴を調べた。クローンλＰ２４からＮｏｔ工消化したＤＮＡをベクタｐＮＮ Ｏ１にサブクローン化してＰ２４を得、配列解析°を進めた。λＰ２４の全挿入 物は単一のＮｏｔ工断片を含有していた。サブクローン化のため、一般に使用さ れる技術を用い、ベクタのＥｃ　ｏＲＩ部位またはＳｍａＩ部位を使用した。

°制限消化および新たな合成断片による置換によりｐＵＣ８の合成ポリリンカを 除去することにより、配列決定プラスミドｐＮＮＯ１を作成した。ｐＵＣプラス ミドに共通する２、５ｋｂの骨格は、複製開始点を与えると共にアンピシリン耐 性を与えるものであり、変化していない。

ｐＮＮＯｌの新たに合成した部分を第４図に示す。

主としてマキサムとギルバートの方法（Ｈｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌｏａｙ。

６５、　ｐｆ）、　４９９−５６０．　（１９８０）　）によりサブクローンの ＤＮＡ配列を決定した。しかしながら、幾つかの断片については、チャーチとギ ルバートの関連する手１１ｊ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．０．１９９ｔ　（１９８４））を使用した。ｐＮＮ Ｏｌの構造は、チャーチーギルバートのアプローチにより、ＮＯｔ工消化および ４つの２０ヌクレオチド長さのプローブ：ＮＮ−Ａ、ＮＮ−Ｂ、ＮＮ−Ｃ並びに ＮＮ−Ｄを使用し、挿入した断片の末端の配列決定を可能とする。第５図を参照 するとよい。

第３図は、ファージλＰ２４のｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列を示す、またこれは 、これから推論されたアミノ酸配列を示す。

Ｐ２４ｃＤＮＡからのＬＦＡ−３の連結Ｆ態の決Ｒ２４ｃＤＮＡによってコード されたＬＦＡ−３の連結形態の特徴を決定した。Ｒ１，１セルラインを選択した 。

ＰＩ連結により膜に付着する表面抗原を発現することが知られているためである 。

Ｒ２４／Ｒ１，１、ＨＴ１６／Ｒ１，１のクローンの５Ｘ１０’細胞（ＬＦＡ− ３の膜層込み形態をコードするｃＤＮＡにより感染されたＲ１．１セルライン（ ビー・ウオルナーら、前記大獄））およびＲ１，１！胞を１．５μｌのホスホイ ノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）を用いて３７℃で１時間イン キュベートした。インキュベートに際してＰＩＰＬＣは、細胞表面からＰＩ連結 蛋白質を放出するが、他の機楕、例えば膜層込み蛋白質によって細胞表面に付着 された蛋白質に対しては全く影響を与えないことが知られている（エム−ｏつ、 Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ、、　２４４．　ｐ、　１（１９８７））　。

ＦＡＣ３により検定した表面蛍光の減少により、Ｒ２４／Ｒ１，１またはＨＴ１ ６／Ｒ１，１の細胞表面から放出されたＬＦＡ−３の量を測定した。Ｒ２４／Ｒ １，１細胞とＰＩＰＬＣとのインキュベーションにより、結果的に９５％の表面 ＬＦＡ−３が放出されるのに対し、ＰＩＰＬＣはＲ１，１細胞またはＨＴ１６／ Ｒ１，１細胞の螢光に対して全く影響を与えないことが分った。これは、Ｒ２４ ｃＤＮＡがＬＦＡ−３のＰＩ連結形態をコードすることを示す。

Ｒ２４’／Ｒ１，１由来のＬＦＡ−３のＰＩ連結形態の他の細鳳会！と１１ 次に、Ｒ１，１細胞中で発現されたものとしてＲ２４ｃＤＮＡに由来するＬＦＡ −３のＰＩ連結形態がＲ２４／Ｒ１，１の他の細胞に対する吸着を媒介するか否 かを試験しｆ、ｚ、ＣＤ２ｃＤＮＡ　（Ｌｌ　１４）を発現するＬ４１Ｂ胞を用 いるロゼツト化（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）解析を行うことによりこれを試験した。

６穴の組織培養グレートの９．６ｃｍ２の穴で、六当り３Ｘ１０’細胞の細胞密 度としてコントロールし細胞およびＬｌ　１４　（ＣＤ２感染）細胞を生育させ た。ロスウェル・パーク・メモリアル・インキュベート（ＲＰＭＩ　１０６０） 培地を用いて穴を２回洗浄してＩｆＡ１２２残渣および死滅した細胞を除去した 後、コントロールとして１．５ｘｌＯ’　Ｒ２４／Ｒ１，１またはＲ１，１細胞 を穴当り添加した。ツルバール・セントリフエージ中にて４℃で２分間４００ｒ ｐｍでプレートを回転させた。４℃で２時間細胞をインキュベートした後、ＲＰ Ｍ１１０６０培地を用いて穴を洗浄して過剰のＲ２４／Ｒ１，１またはＲ１，１ ４１８胞を除去した。顕微鏡下で測定したものとしてＲ２４／Ｒ１，１細胞をＬ Ｌ１４Ｍ胞によりロゼツト化しな、Ｌ１１４細胞によるＲ２４／Ｒ１，１のロゼ ツト化を観察したが、非感染コントロール細胞にはよらなかった。このロゼツト 化は、ＬＦＡ−３（ＴＳ２／９）に対してＭＡｂ、またはＣＤ２　（ＴＳ２／１ ８）に対してＭＡｂにより阻害され得た。これは、ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態が 、マウスＬ細胞で発現された組換えＣＤ２との相互作用を許容する構造で、Ｒ１ ，１細胞の細胞表面で発現されることを示す、Ｒ２４／Ｒ１，ＩＭＡＩｌ＠また は非感染Ｒ１，１細胞は非感染マウスＬ細胞によりロゼツト化せず、これはこれ らの細胞間相互作用の特異性を示す。

ＣＨＯＩ　ｔ：８ｇ＋るＲ２４ｃＤＮＡ由来のＬＦＡ−３のＰ１１藍星呈久１１ Ｒ２４のＬＦＡ−３ｃＤＮＡ断片のフレニュー平滑末端化ＮｏｔＩＰＩ連結形態 をグラスミドｐＪＯＤ−ｓの平滑末端化５ａｌＩ部位に挿入してｐＪＯＤ−ｓ− ＬＦＡ３Ｐ２４を得た。

ベクタｐＪＯＤ−５は、イン・ビトロ・インターナショナル・インク・カルチャ ー・コレクション、６１１Ｐ、ハモンド・フェリー・アールディ、リンチカム、 メリーランド、２１０９０に、１９８８年７月２２日に寄託され、受託番号１０ １７９を受けた。

次に、ＣＨＯ＋ｉ［［Ｉ胞の感染のため、Ｐｖｕ■を用いてｐＪＯＤ−ｓ−ＬＦ Ａ３Ｐ２４を線状化した。室温で２０分間、ＴＥおよび１ｘＨＥＢＳ　（１３７ ｍＭＮａｅ　１．５ｍＭＫＣｌ、０１００３０ＭＮａ２ＨＰＯ，、，７Ｈ２０， ６ｍＭデキストロース、２０ｍＭヘベス（ｐＨ７，１））中の０．１２５ＭＣａ Ｃ１２を用いて１０μｇのＰｖｕＩ線状化Ｄ？’りＡをインキュベートした。ア ルファ“−ＭＥＭ培地中にてＤＮＡを細胞に添加し、３７℃で４時間インキュベ ートした。培地を除去した後、アルファ”　−ＭＥＭ中１０％クリセロール中で 室温にて４分間細胞をインキュベートした。培地を用いて細胞をリンスし、アル ファ“−ＭＥＭ中で２日間生育させ、その後選択培地（アルファー−ＭＥＭ）に 移した。

ＦＡＣ３分析によりＬＦＡ−３のＰＩ連結形態の発現を測定した。ＦＡＣ３によ る分析のため、それぞれのＲ２４−ＣＨＯメントレキセートクローンおよびコン トロールＣＨＯ細胞当りｌＸ１０６細胞を、ハンクスＢ５５ＩＩ街液、。５ＭＥ ＤＴＡを用いて４℃で１５分間インキュベートすることにより、組織培養プッシ ュから除去した。その後分離した細胞をペレット化し、５０μＩのＰＢＮＩＩ街 液（ＩＸＰＢＳｌ、５％Ｂ５Ａ１．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、氷上で ４５分間１００μｌのＭＡｂＴＳ２／９　（１，２ｍｇ／ｍ１）（チム・スプリ ンガーの寄贈）を用いてインキュベートした６次に、１ｍｌのＰＢＮ綬街液を用 いて細胞を２回洗浄し、遠心によりペレット化した。ｌｔｌ［１胞ベレツトをＰ ＢＮＭ衝液中のＦＣＴの１：５０希釈（螢光共役アフイニテイ精製Ｆ（ａｂ）２ １！ｌｒ片ヤギ抗ウサギＩ　ｇ　Ｇ　（キャペル、バイオメディカル、ペンシル バニア））の１００μｍに再懸濁した。

遠心により細胞をペレット化し、１ｍｌのＰＢＮ緩衝液に細胞ペレットを２回再 懸濁することにより過剰のＰＣＩを除去した。その後、８００μｍの１ｘＰＢｓ に細胞を再懸濁し、ＦＡＣ３上で螢光強度を測定した。コントロールＣＨ０４１ １Ｉ胞より５〜５０倍高い螢光を示す５つのクローンを認めた。

Ｒ１，１細　におけるＲ２４ｃＤＮＡ由来ＬＦＡ−３のＰＩ温ｌｕ１匹！とｌ勇 発現ベクタＢＧ３１２から誘導された発現ベクタＢＧ２４を使用した。ＮｏｔＩ によりプラスミドｐ　２４　ＤＮＡを消化することによりＢＧ２４を構成し、フ レニューにより平滑末端とした０次に、ｐ２４の８６０ｂｐＮｏｔＩ断片を単離 し、続いてＥｃ　ｏＲＩで線状化した平滑末端発現ベクタＢＧ３６８を用いて連 結を行った。ＢＧ３６８は次のようにして作成した。動物発現ベクタｐＢＧ３１ ２（アール・ゲートら、Ｃｅ１ｌ、　４５．　ｐｐ、　６８５−９８　（１９８ ６）　）をＥｃ　ｏＲ４およびＢｇｌＩ［を用いて消化し、２つのＥｃｏＲＩお よび２つのＢｇｌｎ制限部位の１つを欠失させた（位置０のＥｃｏＲＩ部位およ びほぼ位置９００に位置するＢｇｌＩ［部位）。

ＮｒｕＩを用いてＢＧ２４の９０μｇＤＮＡを線状化し、０．２９ＵＶでバイオ ラド（リッチモンド、カリポルニア）シーンパルスを使用し、９６０μＦＤに設 定した容量を用いて、ＤＮＡエレクトロボーレーションにより、１０μｇのＮｒ ｕＩ線状化ｐＴＣＦＤＮＡ　（エフ・グロスベルトら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄ　Ｒｅｓ、　１０．　ｏ、　６７１５　（１９８２））および３００μｇの超 音波処理サケ精子ＤＮＡを用いて作成した。ＲＰＭ１１０６０培地＋１ｍｇ／ｍ １Ｇ４１８中にて、感染のため、Ｒ１，１細胞を選択した０選択培地による９６ 穴デイツシユの穴当り１０’細胞まで希釈を限定した後に単一クローンを選択し た。Ｇ４１８に耐性の８つのクローンを、前記したようにＦＡＣ３分析によりＬ ＦＡ−３発現のＰＩ連結形態について検定した。８つの全てのＰ２４／Ｒ１，１ クローンは、Ｒ１，１コントロール細胞より１０〜１０００倍高いレベルでＬＦ Ａ−３のＰＩ連結形態を発現した。

Ｌ細　におＣるＬＦＡ−３Ｐ２４ｃＤＮＡのｐｒ連結ノ、の１戊 マウスＬｍ胞でＰ　２４．　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを発現させるため、前記したように ９０μｇのプラスミドＢＧ２４ＤＮＡを共感染させたが、これは、Ｎｒｕ　Ｉに より、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）（グロスベルドら、前記文献）を担持す る１０μｇプラスミドｐＯＰＦＤＮＡを用い、５ｃａＩにより線状化し、１ｘｌ Ｏ’　Ｌ−Ｍ　（ｔｋ−）細胞（シー・ビー・チルホースト、Ｊ、　ｌ１１１ｕ ｎ、　１３１．　ｐ、　２０３２　（１９８３）　）とし、前記したエレクトロ ボーレーションによった。１００ｍｍプレート当りＩ×１０５細胞の細胞密度で ＤＭＥＭ＋ＨＡＴ中でこれらを生育させることによるｔｋ発現により感染細胞を 選択した。クローンを拾い、１００ｍｍディツシュ当り５Ｘ１０’細胞に拡大し 、前記したようにＦＡＣ３分析によりＬＦＡ−３のＰＩ連結形態の発現を検定し た。コントロール細胞のレベルを越える幾つかの発現を認めたが、ＬＦＡ−３の ＰＩ連結形態の７０％は後記するように培地に分泌された。

Ｐ２４／Ｌｍ　からのＬＦＡ−３の　秘史に、Ｐ　２４／Ｌ細胞がＬＦＡ−３を 分泌するか否か試験することを意図した。このマウス上セルライン、Ｌ−Ｍ　（ ｔｋ−）は、ＰＩ連結アタッチメント機構を欠損することか知られているためで ある。Ｐ２４細胞を３５８−ｍｅｔを用いて代謝的にラベルし、この′ｓＳラベ ルしたＬＡＦ−３のＰＩ連結形態を、ＭＡｂＴＳ２／９　（チム・スプリンガー の寄贈）を用いて培地から次のようにして沈澱させた。３ｘｌＯ’　Ｐ２４／Ｌ 、ＨＴ１６／Ｌ　（ビー・ウオルナーら、前記文献）またはＬ（ｔｋ−）細胞を 、それぞれ６穴細胞培養プレートの１穴にブレーティングし、ＤＭＥＭ−ＨＡＴ 完全培地（ＤＭＥＭ＋ＨＡＴ＋１０％ＦＣ３＋グルタミン）中で一夜生育させた 。その後、メチオニン（ＭＥＭ＞を含有しないＩＸ最少必須培地イーグル（改変 ）を用いて穴をリンスした＊”Ｓｍｅｔラベルのため、１．５ｍｌのＭＥＭ培地 （メチオニンを含有しない）、プラスグルタミン、２．５％完全ＤＭＥＭ並びに ２２５μｃｉ３ｓＳｍｅｔ　にュー・イングランド・ヌクレア、ダルウェア、１ １３５ｍＣｉ／μｍ）をそれぞれの穴に添加し、３７℃で１８時間インキュベー トした。０．７ｍｌの培地に対し、アガロースに共役した１０μｍのＭＡｂＴＳ ２／９を添加し、混合物を４℃で一夜振盪した。それぞれの穴に対し、３００μ ｍのＤＯＣｉ衝液（両液ｍＭ）リス（ｐＨ７，３）、５０ｍＭ塩化ナトリウム１ ．５％ジオキシコレート５．５％トリトンＸ１００）を添加し、プレートから細 胞をかき取り、エッペンドルフチューブに移し、ポルテックスにかけ、室温で１ ５分間遠心した。この上澄１００μｍに対し、アガロースに共役した１０μｌの ＭＡｂＴＳ２／９を添加し、ｉ＝しながら４℃で一夜インキユベートした。ＴＳ ２／９−アガｏ−ス３ｓＳ−ＬＦＡ＝３複合体を遠心によりベレット化し、１ｍ ｌのＤＯＣＷ街液を用いて３回洗浄し、５０μｌのＳＤＳ装填Ｍ、両液に再懸濁 した。”５−ＬＦＡ−３（Ｐ　Ｔ連結形態）は、複合体を６５℃で１０分間加熱 することによりＴＳ２／９−アガロースから解離した。ＴＳ２／９アガロースを 遠心により沈澱させ、２５μｌの上澄を還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で 電気泳動した。Ｐ２４／Ｌ細胞の培地からのＭＡｂＴＳ２／９を伴う５５ｋｄ３ ｓＳラベル蛋白質の沈澱のみが認められ、Ｌ　（ｔｋ−）コントロール細胞の培 地からは認められなかった。

５ＤＳ−ＰＥＧＥにより、Ｐ２４／Ｌ細胞から分泌された３５３ラベルＬＦＡ− ３は、Ｐ　２４／Ｌ＋Ｉ［［Ｉ胞またはＨＴ１６／ＬＭＥ胞の細胞内に保持され たｓｓＳラベルＬＦＡ−３よりおよそ３ｋｄ小さいと測定された。これは、疎水 性ポテンシャル膜横断領域の全部または一部が分泌の前に除去され、これにより ＬＦＡ−３のＰＩ連結形態の細胞表面膜への有効な組込みが妨害されたことを示 す。

この発明のＬＦＡ−３ｃＤＮＡ配列のＰＩ連結形態を担持する次のプラスミドを 、１９８８年７月２２日にリンチカム、メリーランドのイン・ビトロ・インター ナショナル・インコ・カルチャー・コレクションに寄託した：このプラスミドは 受託番号ＩＶＩ−１０１８０を与えられた。

この発明の多数の態様を前記したが、その基本的な構成を改変して、この発明の 方法および組成物を利用する他の態様を提供し得ることは明らかである。したが って、この発明の範囲は、ここに添付する請求の範囲によって規定され、例とし て示した特定の！Ｂ橡によらないことを理解すべきである。

ＦＩＧ、Ｉ ＮＨ２末４　：　ｒｓ凹乃宜αｙｃｘｖＴｒＨｖｐｓ＋ｐＬＦＡ−３ＬＫＥＶＬ ｈ五ＫＱＫ巨五ＶＡＥＬＴ７２−７３　：　ＤＫＶＡＥＬＥＮＳＥＦＴ９．　： 　ＶＹＬＤＴＶＳＧＳＬＴＩＹＮＬＴＳＴ、ｏ５：　ＦＦＬＹＶＬＥＳＬＰＳＰ ＴＬＴＣＡＬ”６８　：　Ｇｒ、語ＹＳ ＦＩＧ、　５ ｔｒｐ　ｌｙ＋　ｌｙｓ　ｇｉｎ　ｌｙｓ　ａｓｐ　１ｙｓ５’　ＴＧＧ　八人 Ａ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　Ｇ入Ｃ入λへＣＣＴＣ入 ＦＩＧ、　３ ？２４アミノｖＬｈよび’ｃＤＮＡＷｆＪＦＩＧ、　４ −ｉ−−−−−−　ＰＵＣ−−−−−−−１１−−−−−−クローンイしＳ 七　〇 ＦＩＧ、６Ａ Ｈ丁１６お・よびｐ２１１　ｃ　ＤＮＡ枇東ＦＩＧ、　６Ｂ 国際調査報告 １＋＋−・神−＾…丑１・Ｐ倚や　ＰＣ？／υＳ　８９１０３６５２国際調査報 告 ＵＳ　８９０３６５２ ０発　明　者　へツション、キャサリン　アメス、 リカ合衆国、マサチューセッツ　０２１９０．サウス　ウェイマフアランティン 　レーン　９６

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）ファージ入Ｐ２４に担持されたＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列および （ｂ）前記ＤＮＡ配列によって発現に際してコードされるポリペプチドを発現に 際してコードするＤＮＡ配列よりなる群から選択されるＤＮＡ配列。
2. ２．第３図の式Ｎ１−８３０のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１８−８３０のＤＮＡ 配列、第３図の式Ｎ１０２−８３０のＤＮＡ配列並びに前記ＤＮＡ配列のいずれ かによって発現に際してコードされるポリペプチドを発現に際してコードするＤ ＮＡ配列よりなる群から選択されるＤＮＡ配列。
3. ３．第３図の式Ｎ１−６５３−Ｎ７３８−８３０のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１ ０２−６５３−Ｎ７３８−８３０のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１−６６２−Ｎ７ ３８−８３０のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１０２−６６２−Ｎ７３８−８３０の ＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１−６３８−Ｎ７３８−８３０のＤＮＡ配列、第３図 の式Ｎ１０２−６３８−Ｎ７３８−８３０のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１−７０ １−Ｎ７３８−８３０のＤＮＡ配列、第３図の式Ｎ１０２−７０１−Ｎ７３８− ８３０のＤＮＡ配列、並びに前記ＤＮＡ配列のいずれかによって発現に際してコ ードされるポリペプチドを発現に際してコードするＤＮＡ配列よりなる群がら選 択されるＤＮＡ配列。
4. ４．請求項１または２記載のＤＮＡ配列からなる組換えＤＮＡ分子であって、前 記ＤＮＡ配列が、前記組換えＤＮＡ分子中で発現制御配列に機能的に連結された 組換えＤＮＡ分子。
5. ５．請求項３記載のＤＮＡ配列からなる組換えＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ 配列が、前記組換えＤＮＡ分子中で発現制御配列に機能的に連結された組換えＤ ＮＡ分子。
6. ６．請求項４または５記載の組換えＤＮＡ分子であって、前記発現制御配列が、 ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期または後期プロモータ、ｌａｃ系、ｔｒｐ 系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主要オペレータおよびプロモータ領域、 ｆｄコート蛋白質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖 系酵素のプロモータ、酸性ホスファターゼのプロモータ並びに酵母α−接合因子 のプロモータよりなる群から選択される組換えＤＮＡ分子。
7. ７．分子が、ｐＪＯＤ−ｓ−しＦＡ３Ｐ２４およびＢＧ２４よりなる群から選択 される請求項４記載の組換えＤＮＡ分子。
8. ８．請求項４記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主。
9. ９．ＰＩ連結アタッチメント機構を欠損することを特徴とする請求項４記載の組 換えＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主。
10. １０．請求項５記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主。
11. １１．請求項８または１０記載の宿主であって、前記宿主が、イー・コリ、シウ ドモナス、バシルス、ストレプトミセス、酵母、カビ、動物細胞、植物細胞並び に組織培養によるヒト細胞の種よりなる群から選択される宿主。
12. １２．動物細胞が、ＣＨＯおよびＲ１．１よりなる群から選択される請求項１１ 記載の単細胞宿主。
13. １３．宿主がＬ−Ｍ（ｔｋ−）である請求項９記載の単細胞宿主。
14. １４．請求項８記載の単細胞宿主を培養する工程からなるポリペプチドの製造方 法。
15. １５．形質転換宿主が、 ＣＨＯ（ｐＪＯＤ−ｓ−ＬＦＡ３Ｐ２４）およびＲ１．１（ＢＧ２４）よりなる 群から選択される請求項１４記載の方法。
16. １６．請求項９記載の単細胞宿主を培養する工程からなる可溶性ポリペプチドの 製造方法。
17. １７．請求項１０記載の単細胞宿主を培養する工程からなる可溶性ポリペプチド の製造方法。
18. １８．形質転換宿主を、し−Ｍ（ｔｋ−）（ＢＧ２４）およびＬ−Ｍ（ｔｋ−） （ｐＪＯＤ−ｓ−ＬＦＡ３Ｐ２４）よりなる群から選択する請求項１６記載の方 法。
19. １９．請求項１または２記載のＤＮＡ配列よりなる群から選択されるＤＮＡ配列 によって発現に際してコードされるポリペプチドであって、前記ポリペプチドが ヒト起源の他の蛋白質を実質的に含有しないポリペプチド。
20. ２０．免疫抑制的または増強的な有効量の請求項１９記載のポリペプチドと薬学 的に許容し得るキャリヤとからなる薬学的組成物。
21. ２１．患者を処置するに際し、請求項２０記載の組成物を用いて薬学的に許容し 得る様式によりこれらを処置する工程からなる患者処置方法。
22. ２２．診断的に有効量の請求項１９記載のポリペプチドまたはこれに対する抗体 からなる、Ｔ細胞サブセット、ＣＤ２＋細胞を検出するための、または過剰もし くは枯渇したＴ細胞を特徴とする疾患の原因をモニタするための診断組成物。
23. ２３．診断として請求項２２記載の組成物を用いる工程からなる、Ｔ細胞サブセ ット、ＣＤ２＋細胞を検出するための、または過剰もしくは枯渇したＴ細胞を特 徴とする疾患の原因をモニタするための方法。
24. ２４．請求項２３記載の組成物からなる、Ｔ細胞サブセット、ＣＤ２＋細胞を検 出するための、または過剰もしくは枯渇した丁細胞を特徴とする疾患の原因をモ ニタするための手段。
25. ２５．ＬＦＡ−３阻害剤を単離する方法であって、前記方法が、（ａ）ｐ２４に よりセルラインを感染し（ｂ）ジューカット（ｊｕｒｋａｔｔ）細胞および前記 感染セルラインを用いて結合アッセイを行い、更に（ｃ）工程（ａ）の細胞に対 するジューカット細胞の結合を阻害する分子を選択する ことからなるＬＦＡ−３インヒビターの単離方法。