JP5422204B2

JP5422204B2 - ＤＧＫα阻害剤を含有する抗癌剤

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Publication number: JP5422204B2
Application number: JP2008508605A
Authority: JP
Inventors: 郁夫坂根; 健二柳澤; 英雄加納; 孝一神保
Original assignee: 国立大学法人千葉大学
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2027-03-29
Also published as: JPWO2007114239A1; WO2007114239A1

Description

本発明は，抗癌剤，特にメラノーマの治療剤に関する。より詳細には，本発明は，メラノーマ等の癌細胞のアポトーシスを誘導する方法ならびにアポトーシス誘導剤に関する。

メラノーマ（黒色腫）は，あらゆる癌のなかでも最も悪性度が高く，致死率が高いことが知られている。メラノーマの生化学的特徴の一つは，乳癌，大腸癌，膵臓癌や卵巣癌と並び，NF(nuclear factor )-κBが常時活性化されていることである（Amiri KI, and Richmond A. Cancer Metastasis Rev. 2005; 24: 301-313；Ivanov VN, et al, Oncogene. 2003; 22: 3152-3161：Soengas MS, and Lowe SW. Oncogene. 2003; 22: 3138-3151）。NF-κBはアポトーシス抑制因子の一つなので，この活性の上昇は化学療法の有効性を減じる結果となる。したがって，現在のところメラノーマに対するきわめて有効な化学療法は存在しておらず，原則的に治療は外科的切除に頼ったものになっている。

腫瘍壊死因子-α（TNF-α）とその受容体活性化は，主要なアポトーシス経路であり，最終的にカスペース-8を活性化して細胞死を引き起こすが（Morgan M, et al., J Cell Biol. 2002; 157: 975-984），一方，TNF-α受容体活性化後，NF-κBの活性化が起こり，アポトーシス阻止効果を示すことも知られている（Chen G, et al., Science. 2002; 296: 1634-1635）。したがって，TNF-α受容体活性化以降のシグナル伝達系において生ずるアポトーシスと抗アポトーシスシグナルのバランスによりTNF-α依存性の細胞死が制御されている。

NF-κBは当初，免疫グロブリンのκエンハンサー内に存在するDNA配列，GGGGACTTTCC（配列番号１）に結合するB細胞に特異的な転写因子として同定された。しかし，その後の解析によりこの転写因子はB細胞だけではなく，他の細胞にも広く分布しており，150種を超える数多くの遺伝子発現を制御していることが明らかになった（Ivanov VN, et al, Oncogene. 2003; 22: 3152-3161；Baeuerle PA, and Henkel T. F. Annu Rev Immunol. 1994; 12: 141-179；Verma IM, et al., Genes Dev. 1995; 9: 2723-2735）。NF-κBは，Relファミリーに属するp65（RelA）やp50（NF-κB1）などの分子から形成されるホモまたはヘテロ二量体であり，未刺激の細胞においては，そのインヒビターであるIκB分子と細胞質中で複合体を形成し,その核移行が阻止されることにより不活性化されている（Baldwin AS. J Clin Invest. 2001; 107: 241-246）。TNF-αをはじめとする様々な刺激によってIκBがリン酸化され，その結果IκBはプロテアソームにより分解され，NF-κBは核に移行し，種々の遺伝子発現を制御すると考えられている。NF-κBは細胞のアポトーシスや癌化との関連が示されるとともに，免疫機能や炎症およびウィルス感染・発症時における役割など，医学的側面からも注目されている（Ivanov VN, et al, Oncogene. 2003; 22: 3152-3161；Baeuerle PA, and Henkel T. F. Annu Rev Immunol. 1994; 12: 141-179；Verma IM, et al., Genes Dev. 1995; 9: 2723-2735）。

ジアシルグリセロールキナーゼ (DGK)はジアシルグリセロールをリン酸化してホスファチジン酸を生成する酵素である。基質のジアシルグリセロールはコンベンショナルプロテインキナーゼCおよびノーベルプロテインキナーゼCの活性化因子として既に確立しており，更に，プロテインキナーゼC以外にも，カイメリン（chimaerin），Unc-13，Ras グアニルヌクレオチド放出タンパク質のC1（亜鉛フィンガー）ドメインに結合して活性化することが知られている（Hurley JH, et al., Protein Sci. 1997; 6: 477-480；Kazanietz MG. Mol Pharmacol. 2002; 61: 759-767）。一方，反応産物のホスファチジン酸もホスファチジルイノシトール 5キナーゼやRaf-1をはじめとする種々のシグナル伝達酵素の活性を制御することが報告されている（English D. Cell Signal. 1996; 8: 341-347；Exton JH. Biochim Biophys Acta. 1994; 1212: 26-42）。

哺乳類のDGKには10種のアイソザイムが存在し，その構造上の特徴からI型（α, β, γ），II型（δ, η, κ），III型（ε），IV型（ζ, ι），V型（θ）に分類される（Imai S, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 39870-39881；Kanoh H, et al., J Biochem. 2002; 131: 629-633；Sakane F, and Kanoh H. Int J Biochem Cell Biol. 1997; 29: 1139-1143；Topham MK, and Prescott SM. J Biol Chem. 1999; 274: 11447-11450；van Blitterswijk WJ, and Houssa B. Chem Phys Lipids. 1999; 98: 95-108）。更に，β-，γ-，δ-，η-，ζ-，ι-アイソザイムには選択的スプライス産物が存在し，それぞれ発現パターンや細胞内局在性などの性質が異なる（Kanoh H, et al., J Biochem. 2002; 131: 629-633.18；Ito T, et al., J Biol Chem. 2004; 279: 23317-23326）。したがって，哺乳類のDGKには少なくとも16種のアイソフォームが存在することになる。一方，興味深いことに，単細胞生物の酵母にはDGKは存在せず，また，線虫やショウジョウバエなどの比較的単純な多細胞生物には数種類の限定されたアイソフォームしか見つかっていない。したがって，DGKアイソフォームの多くは，細胞の癌化，発生・分化，免疫系，神経系構築など高等な多細胞生物独自の機能に関与すると考えられている。

I型DGKは，全てのアイソザイムに共通して存在する触媒領域と2個の亜鉛フィンガードメイン以外に，分子内に2個のEFハンドモチーフ（Ca²⁺結合能をもつ）をもっている（Sakane F, et al., J Biol Chem. 1991; 266: 7096-7100；Sakane F, et al., Nature. 1990; 344: 345-348；Yamada K, et al., Biochem J. 1997; 321: 59-64）。I型アイソザイムの中では，DGKαの研究が最も進んでおり，最近，その生理機能が幾つか明らかになってきている（Kanoh H, et al., J Biochem. 2002; 131: 629-633；Sakane F, and Kanoh H. Int J Biochem Cell Biol. 1997; 29: 1139-1143；Topham MK, and Prescott SM. J Biol Chem. 1999; 274: 11447-11450；van Blitterswijk WJ, and Houssa B. Chem Phys Lipids. 1999; 98: 95-108）。例えば，本アイソザイムは，ムスカリン受容体を発現させたTリンパ球において，非特異的DGK阻害剤（R59949）や過剰発現系を用いた実験により，カルバコールによって誘導されるアポトーシスをFasリガンドの遊離抑制を介して阻害することが示唆されている（Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450）。

また，血管内皮細胞が肝細胞増殖因子刺激によって移動する際に，本アイソザイムがc-Srcによりリン酸化され，活性化されることも報告されている（Cutrupi S, et al, EMBO J. 2000; 19: 4614-4622）。しかし，これまでに，DGKαを含めDGKアイソザイムのメラノーマ細胞における発現の有無や，その役割は全く明らかにされていない。

本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
Amiri KI, and Richmond A. Cancer Metastasis Rev. 2005; 24: 301-313 Ivanov VN, et al, Oncogene. 2003; 22: 3152-3161 Soengas MS, and Lowe SW. Oncogene. 2003; 22: 3138-3151 Morgan M, et al., J Cell Biol. 2002; 157: 975-984 Chen G, et al., Science. 2002; 296: 1634-1635 Baeuerle PA, and Henkel T. F. Annu Rev Immunol. 1994; 12: 141-179 Verma IM, et al., Genes Dev. 1995; 9: 2723-2735 Baldwin AS. J Clin Invest. 2001; 107: 241-246 Hurley JH, et al., Protein Sci. 1997; 6: 477-480 Kazanietz MG. Mol Pharmacol. 2002; 61: 759-767 English D. Cell Signal. 1996; 8: 341-347 Exton JH. Biochim Biophys Acta. 1994; 1212: 26-42 Imai S, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 39870-39881 Kanoh H, et al., J Biochem. 2002; 131: 629-633 Sakane F, and Kanoh H. Int J Biochem Cell Biol. 1997; 29: 1139-1143 Topham MK, and Prescott SM. J Biol Chem. 1999; 274: 11447-11450 van Blitterswijk WJ, and Houssa B. Chem Phys Lipids. 1999; 98: 95-108 Ito T, et al., J Biol Chem. 2004; 279: 23317-23326 Sakane F, et al., J Biol Chem. 1991; 266: 7096-7100 Sakane F, et al., Nature. 1990; 344: 345-348 Yamada K, et al., Biochem J. 1997; 321: 59-64 Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450 Cutrupi S, et al, EMBO J. 2000; 19: 4614-4622 Outram SV, et al., Immunology. 2002; 105: 391-398

本発明は，メラノーマをはじめとする癌の治療剤および治療方法，特に癌細胞のアポトーシス誘導剤を提供すること，ならびにそのような治療剤の候補物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。

本発明者は，DGKのα-アイソザイムが，調べたメラノーマ細胞全てに発現しているのに対して，癌化していないメラノサイトには検出されないことを見出した。そして，DGKαがTNF-αによって誘導されるメラノーマ細胞のアポトーシスを抑制していること，ならびに，その制御はNF-κB経路を介して行われていることを明らかにした。

すなわち，本発明は，DGKα阻害剤を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。別の観点においては，本発明は，DGKα阻害剤を有効成分として含有する，癌細胞のアポトーシス誘導剤を提供する。また別の観点においては，本発明は，DGKα阻害剤を有効成分として含有する，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤を提供する。また別の観点においては，本発明は，DGKα阻害剤を有効成分として含有する，NF-κBの発現の抑制剤を提供する。本発明において好ましくは，DGKα阻害剤は，抗DGKα抗体，DGKα遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド，リボザイムおよびｓｉＲＮＡ，および，3-[2-[4-[ビス-(4-フルオロフェニル)メチレン]-1-ピペリジニル]エチル]-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-4(1H)キナゾリノン（R59949）および6-[2-[4-[(4-フルオロフェニル)フェニルメチレン]-1-ピペリジニル]エチル]-7-メチル-5H-チアゾロ(3,2-a)ピリミジン-5-オン（R59022）からなる群より選択される。

さらに別の観点においては，本発明は，抗癌剤，癌細胞のアポトーシス誘導剤，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤またはNF-κBの発現の抑制剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質をDGKαを発現する細胞と接触させ，前記試験物質がDGKαの発現および／または機能を阻害するか否かを判定することを含む方法を提供する。

さらに別の観点においては，本発明は，DGKαを阻害することにより、癌を治療する方法および癌細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。また別の観点においては，本発明は，DGKαを阻害することにより，メラノーマ細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。また別の観点においては，本発明は，DGKαを阻害することにより，NF-κBの発現を抑制する方法を提供する。

図１は，AKIメラノーマ細胞とメラノサイトにおけるDGKαの発現を示す。図２は，I型DGKの過剰発現のアポトーシスへの影響を示す。図３は， DGKαのノックダウンによるアポトーシスへの影響を示す。図４は，DGKαの過剰発現，またはノックダウンによるNF-κBの核内局在への影響を示す。図５は，DGKαの過剰発現，またはノックダウンのNF-κB活性への影響を示す。図６は，NF-κB阻害剤（MG-132）のNF-κB活性とアポトーシスへの影響を示す。

本発明においては，下記の実施例に示されるように，メラノーマ細胞においてDGKαがアポトーシスを強く抑制する役割を担っていることが明らかになった。DGKαは，正常細胞ではＴリンパ球とオリゴデンドロサイト以外ではあまり発現していないことが知られており，本発明により初めてメラノーマにおいて発現が亢進されていることが見いだされた。非特異的DGK阻害剤（R59949，I型DGK全てを阻害）や過剰発現系を用いた実験により，Tリンパ球において高度に発現しているDGKαが，Tリンパ球特異的な現象であるAICD（activation-induced cell death）に関与することが示唆されている（Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450；Outram SV, et al., Immunology. 2002; 105: 391-398）。しかし，他の細胞種においてDGKαがアポトーシスの制御に関与しているという報告はなされていない。本発明は，メラノーマを含め癌細胞のアポトーシスへのDGKの関与について初めて明らかにするものであり，siRNAによるDGKαの特異的ノックダウン（発現量低下）法を用いることにより，DGKαのアポトーシスへの関与を直接的に示すことができた。ムスカリン受容体を安定発現させたTリンパ球では，Fasリガンドの遊離抑制を介してDGKαがカルバコールによって誘導されるアポトーシスを阻害することが示唆されている（Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450）。しかし，高濃度のFasリガンドの添加によってもAKI細胞のアポトーシス亢進は観察されない（データ示さず）ことから，T細胞とは異なり，メラノーマ細胞のアポトーシスではFasリガンドの遊離は主な経路として機能していないことが強く示唆された。

さらに，本発明においては，メラノーマ細胞において，DGKαによるアポトーシス抑制にはNF-κB経路が必要であることが見出された。なお，これまでにFasリガンドの遊離抑制とNF-κBの活性化との関連についての報告はないので，DGKαは異なった細胞ではそれぞれ別の情報伝達経路を介してアポトーシスを制御しているものと考えられる。

下記の実施例で示されるように，AKI細胞の内在性DGKαは主に核に局在していた。また，AKI細胞で過剰発現したDGKαも顕著な核内への局在が観察されたが，DGKβとDGKγの核への局在は限られていた（データ示さず）。したがって，DGKαが核へ局在することがアポトーシスを制御する上で重要であることが示唆される。Tリンパ球では，カルバコール刺激によるアポトーシス誘導時（未刺激時でも）に，DGKαは細胞質に存在する（Alonso R, et al., J Biol Chem. 2005; 280: 28439-28450）。一方，メラノーマ細胞では， TNF-α刺激時（未刺激時も）に，DGKαが核内に局在している点で大きく異なる。Tリンパ球（細胞質）とメラノーマ細胞（核内）での局在性の違いが，DGKαがアポトーシスを抑制するために使用するシグナル経路が異なる大きな原因なのかもしれない。

現在のところメラノーマに対するきわめて有効な化学療法は存在しておらず，原則的に治療は外科的切除に頼ったものになっている。本発明においては，DGKαのsiRNAがメラノーマ細胞のNF-κB活性を低下させ，アポトーシスを促進することが明らかになった。NF-κB活性亢進はメラノーマ細胞の化学療法に対する抵抗性の主な原因であることが示されているので，DGKαのsiRNAは化学療法に対しても感受性を高めると考えられる。さらに，本発明にしたがって，DGKαの活性の阻害を指標として，メラノーマをはじめとする癌の治療薬の有力な候補物質をスクリーニングすることも可能である。

DGKα阻害剤
本発明にしたがう抗癌剤は，DGKα阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする。ここで，「DGKα阻害剤」とは，DGKαの発現量または酵素活性を有意に減少させる物質を意味する。DGKα阻害剤としては，DGKαに特異的な阻害剤でもよく，他のDGKアイソザイムをも阻害しうる阻害剤でもよい。DGKを阻害しうる阻害剤としては，例えば，3-[2-[4-[ビス-(4-フルオロフェニル)メチレン]-1-ピペリジニル]エチル]-2,3-ジヒドロ-2-チオキソ-4(1H)キナゾリノン（R59949とも称される）および6-[2-[4-[(4-フルオロフェニル)フェニルメチレン]-1-ピペリジニル]エチル]-7-メチル-5H-チアゾロ(3,2-a)ピリミジン-5-オン（R59022とも称される）が知られている。これらのいずれも本発明において用いることができる。本発明の抗癌剤は，DGKαの発現が亢進されている癌において，癌細胞のアポトーシスを誘導することができ，特に，乳癌，大腸癌，膵臓癌，卵巣癌などの，NF-κBが活性化されている癌の治療に有用であると考えられる。

抗DGKα抗体
本発明のDGKα阻害剤として好ましいものの１つは抗DGKα抗体である。本明細書において，「抗DGKα抗体」とは，DGKαと抗原抗体反応により結合しうる抗体を意味する。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。

DGKαに結合するポリクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，DGKαを感作抗原として用いて動物を免疫し，その血清から得ることができる。DGKαに結合するモノクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，DGKαを感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし，このハイブリドーマを培養することにより得ることができる。

本発明のモノクローナル抗体には，ハイブリドーマにより産生される抗体に加えて，抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体，キメラ抗体，ＣＤＲ移植抗体，およびこれらの抗体の断片等が含まれる。

遺伝子組み換え抗体は，抗DGKα抗体を生産するハイブリドーマから抗体をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これを発現ベクター中に挿入して，動物細胞，植物細胞などを形質転換し，この形質転換体を培養することにより製造することができる。キメラ抗体とは，ある動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。DGKαに結合しうる抗体断片としては，Fab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等が挙げられる。

DGKαに結合する抗体を産生する細胞は，当該技術分野においてよく知られる方法により取得することができる。DGKαを感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。より詳細には，まず，抗原となるDGKαを製造する。ヒトのDGKαは，GenBank受託番号X62535に記載される遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列にしたがって，通常の方法により組換え的に生成することができる。ヒトのDGKαの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８および９に示す。

次に，このようにして製造したDGKαを抗原として，動物の皮下，静脈内または腹腔内に投与する。免疫動物としては，マウス，ラット，ハムスター，ウサギ，ヤギ等の哺乳動物を用いることができる。好ましくは，抗原をキャリアタンパク質に結合させるか，フロインド完全アジュバント等の適当なアジュバントとともに抗原を投与する。あるいは，抗原としてDGKαの部分ペプチドを用いてもよい。DGKαと他のDGKアイソザイムとのアミノ酸配列を比較することにより，DGKαに対して特異性の高い抗体を作製するための抗原ペプチドを選択する方法は，当該技術分野においてよく知られている。

抗原の投与は，１−３週間毎に数回行う。血清中の免疫グロブリンの量をＥＬＩＳＡ法などにより測定することにより，抗体価をモニターする。十分に抗体価が上昇した後，この動物から免疫細胞を取り出す。免疫細胞としては好ましくは脾臓細胞を用いる。抗体産生免疫細胞と，同種の哺乳動物に由来する骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマを作製するのに適した各種の骨髄腫細胞株が市販されている。融合は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，例えばＰＥＧの存在下で行い，ＨＡＴ培地で融合細胞を選択する。培養上清をＥＬＩＳＡ法などによりアッセイして，抗原と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。次に，限界希釈法により目的とする抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることができる。

モノクローナル抗体は，モノクローナル抗体産生細胞を培養して得られる培養液の上清から，またはあらかじめ２，４，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで前処理したマウスにモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内投与し，接種後７日から１０日目にマウスの腹水を採取し，遠心分離し，上清を分取することにより製造することができる。モノクローナル抗体の精製は，通常のタンパク質精製方法，例えば，塩析，限外濾過，ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ＨＰＬＣ等の方法を用いて行うことができる。好ましくは，プロテインＡカラムによるアフィニティークロマトグラフィーを行う。精製したモノクローナル抗体のサブクラスは，市販のマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いてタイピングすることにより決定することができる。

本発明のモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子の塩基配列は，得られたモノクローナル抗体産生細胞の遺伝子を解析することにより得ることができる。モノクローナル抗体産生細胞から全ＲＮＡを抽出し，これを鋳型としてリバーストランスクリプターゼを用いてｃＤＮＡ断片を調整する。次に，適切に設計されたプライマーを用いてＰＣＲにより抗体遺伝子のＶ領域を増幅し，この領域のｃＤＮＡの塩基配列を決定する。

本発明のモノクローナル抗体の結合の特異性は，ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，免疫薄層クロマトグラフィー，BIAcore，蛍光抗体法等の当該技術分野において知られる方法を用いて確認することができる。例えば，DGKαを固定化したマイクロプレートに，２倍希釈系列の本発明のモノクローナル抗体を加えてインキュベートした後，酵素標識二次抗体を加え，基質を加えて発色させ，マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。

本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して，遺伝子組換え技術を用いて組換え型の抗体を製造することができる。組換え型の抗DGKαモノクローナル抗体を製造するためには，本発明の抗体をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み，宿主細胞に導入する。宿主細胞としては，大腸菌，酵母，哺乳動物細胞，昆虫細胞，植物細胞などを用いることができ，特に哺乳類細胞，例えば，CHO，COS，BHKを用いることが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は，例えば塩化カルシウム法，リン酸カルシウム法，DEAEデキストラン法，カチオン性リポソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法，エレクトロポーレーション法，リポフェクションなどの方法により行うことができる。得られた形質転換宿主細胞を培養し，抗体を発現させることにより，組換え型の抗体を製造することができる。

キメラ抗体とは，ある動物（例えばマウス）に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物（例えばヒト）に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。キメラ抗体は，DGKαに結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから，抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，一方，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これらを組み合わせて適当な発現ベクター中に挿入して，宿主細胞中で発現させることにより，組換え的に製造することができる。

ＣＤＲ移植抗体は，ある動物（例えばマウス）の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の動物（例えばヒト）の抗体の相補性決定領域に移植した抗体である。ＣＤＲ移植抗体をコードする遺伝子は，DGKαに結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマからクローニングされた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列に基づいて，それぞれＣＤＲ１，２，３をコードする遺伝子配列を設計し，他の動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベクター中の対応するＣＤＲ１，２，３の配列と置き換えることにより得ることができる。例えば，マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計した数個のプライマーを用いて，ＰＣＲ法により合成することができる。あるいは，合成ＤＮＡを用いて全配列を構築してもよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞中で発現させることにより，ＣＤＲ移植抗体を組換え的に製造することができる。

DGKαに結合しうるFab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等の抗体断片は，上述の本発明の抗DGKαモノクローナル抗体をパパイン，トリプシン等の酵素で処理するか，またはこれらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより，製造することができる。

DGKα遺伝子の発現抑制剤
DGKα阻害剤の他の例としては，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす分子（例えば，ｄｓＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）等の，DGKα遺伝子の発現（転写および／または翻訳）の抑制剤を挙げることができる。このような核酸は，DGKα遺伝子またはDGKαをコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害することができる。アンチセンス，リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。

アンチセンスオリゴヌクレオチドとは，DGKαをコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ｍＲＮＡと特異的に結合し，転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害する。結合はワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよい。

リボザイムとは，触媒的特性を有する１またはそれ以上のＲＮＡのＲＮＡ構造を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々の二次構造のリボザイム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは，二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。

医薬製剤および投与
DGKα阻害剤は，そのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で用いられる担体を用いて製剤される。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用されるいずれのものをも用いることができ，例えば，滅菌水，生理食塩水，賦形剤，安定剤，酸化防止剤，緩衝剤，界面活性剤，結合剤等が好ましく用いられる。さらに，DGKα阻害剤をマイクロカプセルや高分子ゲル中に封入して，徐放性製剤としてもよい。

本発明の抗癌剤の投与経路は，経口投与，静脈内投与，皮内投与，皮下投与，筋肉内投与，体腔内投与等が挙げられる。好ましくは，疾患部位に直接または経皮的に投与するか，あるいは，カテーテル等を用いて直接注入してもよい。本発明の抗癌剤をメラノーマ治療に用いる場合には，直接あるいは，皮下注射により投与することができる。

投与量は，DGKα阻害剤の種類や投与経路，疾患の程度等に応じて適宜選択されるが，疾患部位に直接投与する場合，通常，10μg〜10mg，好ましくは，500μg〜500mgである。非経口投与，例えば静脈注射等では，通常，1μg〜1mg/Kg，好ましくは，20μg〜20mg/Kgである。

スクリーニング方法
別の観点においては，本発明は，多様な試験物質から，抗癌剤，癌細胞のアポトーシス誘導剤，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤，またはNF-κBの発現の抑制剤の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニングは，試験物質をDGKαと接触させ，この試験物質がDGKαの発現または酵素活性を阻害するか否かを判定することにより行うことができる。試験物質がDGKαの発現を阻害する能力は，既知の方法によりDGKαのmRNA量またはタンパク質量を測定することにより評価することができる。試験物質がDGKαの酵素活性を阻害する能力は，既知の方法によりジアシルグリセロールキナーゼ活性を測定することにより評価することができる。これらのアッセイにより，DGKαの発現または酵素活性を阻害するものとして同定された物質は，抗癌剤，癌細胞のアポトーシス誘導剤，メラノーマ細胞のアポトーシス誘導剤，またはNF-κBの発現の抑制剤の候補物質であると考えられる。

試験物質は，種々の合成又は天然の化合物ライブラリー，コンビナトリアルライブラリー，オリゴヌクレオチドライブラリー，ペプチドライブラリー等のライブラリーから得ることができる。また，細菌，真菌類，藻類，植物，動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００６−０９５２５８号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

実験方法
1．細胞
ヒトメラノーマ由来細胞株AKIとMMAcは北海道大学遺伝子病制御研究所，守内哲也，濱田淳一両博士より，70W，G361，SK-mel-23，SK-mel-118はSloan Kettering Cancer Center，Houghton博士より供与された。正常ヒト表皮メラノサイト（NHEM）はクラボウより購入した。メラノーマ由来細胞は，10％ウシ胎仔血清（Roche Diagnostics, Germany），ペニシリンGナトリウム（100 U/ml）および硫酸ストレプトマイシン（100 μg/ml）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Sigma-Aldrich, U.S.A.）中で，CO₂インキュベーター（5％ CO₂，37℃）を用いて培養した。NHEMの培養は，ウシ脳下垂体抽出液（0.2％V/V），ウシ胎仔血清（0.5％V/V），ヒト組換え型塩基性繊維芽細胞増殖因子（3 ng/ml），ハイドロコーチゾン（5×10-⁷ M），インスリン（5 μg/ml），トランスフェリン（5 μg/ml），ホルボールミリステートアセテート（10 ng/ml），ヘパリン（3 μg/ml）を添加したMedium 254（Cascade Biologics, U.S.A.）中で，CO₂インキュベーター（5％ CO₂，37 ℃）を用いて行った。

2．発現ベクター
野生型（WT）ブタDGKα（Sakane F, et al., Nature. 1990; 344: 345-348），キナーゼ不活性（kinase-dead）型(KD)-ブタDGKα（G435D）（Yamada K, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2003; 305: 101-107），野生型ラットDGKβ（Goto K, and Kondo H. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 7598-7602），および野生型ヒトDGKγ（Kai M, et al., J Biol Chem. 1994; 269: 18492-18498）を，pEGFP-C3 Vector（タカラバイオ-クロンテック）に組み込み，グリーン蛍光タンパク質（GFP）との融合タンパク質として発現させた。発現ベクターの導入は，Effectene transfection reagent（Qiagen, Germany）を用い。添付のプロトコールに従い行った。

3．短干渉RNA（siRNA）
GFP（コントロール），DGKα，DGKγをノックダウンするsiRNAは，以下の配列を有するように設計した：
GFP センス；5'-ACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAU-AG-3'（配列番号２），
GFP アンチセンス；3'-UA-UGCCGUAGUUCCACUUGAAGUUCUA-5'（配列番号３），
DGKα アンチセンス；5'-CAAAGAUCCUCAAGGAUUUAGAGAU-AG-3'（配列番号４），
DGKα アンチセンス；3'-UA-GUUUCUAGGAGUUCCUAAAUCUCUA-5'（配列番号５），
DGKγ センス；5'-CCAAAGAACUGAAAUUCUGCGUUCA-AG-3'（配列番号６），
DGKγ アンチセンス；3'-GGUUUCUUGACUUUAAGACGCAGU-5'（配列番号７）。
siRNAの導入は，HiPerFect transfection reagent（Qiagen）を用い，添付のプロトコールに従い行った。

4．ウエスタンブロット法
各種発現ベクターまたはsiRNAを導入した細胞をリシスバッファ（150 mM NaCl，20 mM Tris-HCl (pH 7.2)，1 mM EDTA，1 mM フッ化フェニルメチルスルホニル，プロテアーゼインヒビターカクテル（1 錠/50ml，Roche Diagnostics））にて融解し，超音波処理（4 ℃）により破砕後，4 ℃，5分，3000 rpmで遠心分離し，上清（溶解物）を回収した。この溶解物の一部を用い，蛋白量をBCA プロテインアッセイ（Pierce Biotechnology, U.S.A.）により定量した。残りに5分の1容量のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-サンプルバッファ（125 mM Tris-HCl (pH 6.8)，10％ SDS，50％グリセロール，10％ 2-メルカプトエタノール，0.005％ブロモフェノールブルー）を加え，100 ℃，5分煮沸し，これをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）用試料とした。SDS-PAGEを行った後，ポリビニリデンジフルオリド膜（Bio-Rad Laboratories, U.S.A.）へ転写（400 mA，1時間）し，転写膜をブロックエース（大日本製薬）でブロッキングした。抗DGKα抗体（Kanoh H, et al., J Biol Chem. 1986; 261: 5597-5602），抗アクチン抗体（Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.）または抗GFP抗体（Santa Cruz Biotechnology）をブロックエースで希釈し，1時間反応させた。洗浄後，それぞれの一次抗体に応じたペルオキシダーゼ標識二次抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories, U.S.A.）と反応させた。洗浄後，ECLウエスタンブロッティング検出システム（Amersham Biosciences, U.K.）を用いて発光させ，Hyperfilm（Amersham Biosciences）に露光させてバンドを検出した。バンドの濃さはImage Jソフトウェア(National Institute of Health, U.S.A.)を用いて定量した。

5．リバーストランスクリプターゼ(RT)-ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
各細胞からISOGEN（ニッポンジーン）を用いて総 RNAを抽出した。5 μgの総 RNAよりSuperScript First-Strand Synthesis System（Invitrogen, U.S.A.）を用いてcDNAを合成した。この第１鎖cDNA（500 ng 総RNA相当）にEx Taq ポリメラーゼ（タカラバイオ）とヒトDGKα特異的プライマー（Yamada K, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2003; 305: 101-107）を加え，94℃，4分の初期変性に続いて， 94℃，30秒（変性），60℃，30秒（アニーリング），72℃，2分（伸長）のサイクルを30回繰り返す遺伝子増幅を行った。コントロールとして，グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼcDNAを25サイクルのPCRで増幅した。PCR産物はアガロースゲル電気泳動を行い分離し，臭化エチジウム染色により検出した。

6．アポトーシスの検出
ポリ-L-リジンでコートしたカバーグラスに細胞を播種し，各種発現ベクターまたはsiRNAを導入し，導入24時間後に50 ng/ml TNF-α（Strathmann Biotec AG, Germany）を加えアポトーシスを誘導した。更に24時間インキュベーション後，3.7％ホルムアルデヒドを用いて固定した。0.1％ Triton X-100を用いて透過性を高めた後，In Situ Cell Death Detection Kit（Roche Diagnostics）を用いて，TdT 媒介dUTP ニック末端ラベル（TUNEL）法に基づく染色を行った。Vectashield（Vector Laboratories, U.S.A.）を用いて封入し，共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss LSM 510）にて1,000個以上の細胞を観察し，陽性細胞をカウントした。

7．免疫蛍光染色
ポリ-L-リジンにてコートしたカバーグラスに細胞を播種し，各種発現ベクターまたはsiRNAを導入し，24時間後に50 ng/ml TNF-αを加えアポトーシスを誘導した。更に24時間インキュベーション後，3.7％ホルムアルデヒドを用いて固定した。0.1％ Triton X-100を用いて透過性を高めた後，2％ウシ血清アルブミン/PBSで希釈した抗DGKα抗体または抗NF-κB抗体（Santa Cruz Biotechnology）と1時間反応させた。洗浄後，それぞれの一次抗体に応じたAlexa Fluor 488またはAlexa Fluor 594を結合した二次抗体（Eugene, U.S.A.）と反応させた。Vectashieldを用いて封入し，共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss LSM 510）にて細胞内局在を観察した。

8．NF-κB活性の測定
NF-κBのプロモーター配列と，その下流にルシフェラーゼcDNAがレポーターとして組み込まれているpNF-κB-Luc Vector（タカラバイオ-クロンテック）を各種発現ベクターまたはsiRNAと共にAKIメラノーマ細胞に導入し，導入後24時間後に50 ng/ml TNF-αを加えアポトーシスを誘導した。更に12時間後，細胞をGlo Lysis Buffer（Promega, U.S.A.）にて融解し，ルシフェラーゼの基質（Steady-Glo，Promega）を加えて反応させた。ルシフェラーゼによる発光はWallac 1420 ARVOsxマルチラベルプレートリーダー（PerkinElmer, U.S.A.）を用いて測定した。なお，ルシフェラーゼ活性は，pSV-β-Galactosidase Control Vector（Promega）をコトランスフェクションしてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定し，発現効率を求めて補正した。

実験結果
1．I型DGKのメラノーマ細胞と正常メラノサイトにおける発現
これまでに，DGKアイソザイムのメラノーマ細胞における発現の有無は全く明らかになっていない。そこで，まずI型DGK（α-, β-, γ-アイソザイム）のmRNAとタンパク質の発現を，RT-PCR法とウェスタンブロット法により調べた。その結果，6種のメラノーマ細胞の全てで，DGKα mRNAが検出された（表1）。

各種メラノーマ細胞の溶解物（15 μgタンパク質）を用い，SDS-PAGEで分離後， I型 DGK（α，β，γ）のタンパク質の発現を各アイソザイムに特異的な抗体を用いたウエスタンブロット法（WB）により解析した。また，I型 DGK のmRNAの発現は，500 ngの総RNAを用い，各アイソザイム特異的プライマーを用いたRT-PCR後のアガロース電機泳動/臭化エチジウム染色により解析した。＋：検出される；N.D.: 検出されない。

DGKαタンパク質は，調べた全てのメラノーマ細胞で検出された。しかし，他のI型アイソザイムであるDGKβとDGKγのmRNAとタンパク質は，DGKαのそれらを検出したものと同様の条件下では検出できなかった。したがって，調べた限りのメラノーマ細胞ではα-アイソザイムのみが発現していることが明らかになった。DGKα発現細胞の代表例として，AKI細胞を用いて得られたウエスタンブロット法およびRT-PCR法の結果を，それぞれ図1Aおよび図1Bに示す。ウェスタンブロット法では，クローン化されたDGKαcDNAの計算分子量と一致する80K以外に分子量60Kの位置にもバンドが認められる（図1A）が，これはタンパク質分解酵素による分解産物，もしくは未同定の選択的スプライス産物であると考えられる。

次に，共焦点レーザー顕微鏡を用い，抗DGKα抗体を用いた間接免疫蛍光法により，AKI細胞の内在性DGKαの細胞内局在を確認したところ，主に核内に局在することが明らかになった（図1C）。コントロールとしては，抗DGKα抗体の代りに正常家兎 IgGを用いた。バー：10 μm。

一方，正常メラノサイトでのDGKαの発現を検討したところ，興味あることに，メラノサイトには本アイソザイムのmRNA，タンパク質共に検出されなかった（図1AおよびB）。この結果は，DGKα が色素細胞系ではメラノーマ細胞特異的に発現しており，その発現は主に転写レベルで調節されていることを示している。

2．AKIメラノーマ細胞のアポトーシスに対するDGKαの過剰発現またはノックダウンの影響
DGKαがメラノーマ細胞に特化した機能をもっていることが示唆されたので，その機能を明らかにすることを試みた。メラノーマ細胞は種々の刺激や薬剤によって誘導されるアポトーシスに高い抵抗性を示すことが知られている。そこで，次に，AKI細胞を用いて DGKα を過剰発現，または逆に内在性のDGKα の発現量を低下させることによって，メラノーマ細胞のアポトーシスにおける本アイソザイムの寄与・役割を検討した。

まず，DGKα の過剰発現のアポトーシスに及ぼす影響を調べた。結果を図２に示す。AKIメラノーマ細胞にコントロールベクター（pEGFP alone），pEGFP-DGKα-WT，pEGFP-DGKα-KD，pEGFP-DGKβ-WTまたはpEGFP-DGKγ-WTを遺伝子導入し，導入24時間後にTNF-α（50 ng/ml）を加え，更に24時間インキュベーションした。24 hインキュベーション終了後，細胞溶解物（10 μg）をSDS-PAGEにより分離し，抗GFP抗体を用いてウエスタンブロットを行い，各タンパク質の発現を確認した（図2A）。分子量（M.W.）マーカーの位置を左側に示した。次に，インキュベーション終了後，TUNEL染色を行い，共焦点レーザー顕微鏡にて観察した（図2B）。GFP融合タンパク質が発現し且つTUNEL染色陽性の細胞をカウントし，GFP陽性細胞数全体に占める割合（％）を求めた。結果は独立した3回の実験から得られた平均±標準偏差で示した。

その結果， DGKα-WTの過剰発現（図2A）によって，AKI細胞のTNF-αによって誘導されるアポトーシスが顕著に阻害されることを見出した（図2B）。しかし，キナーゼ不活性型である DGKα-KDでは，ほぼ同レベルの発現が認められるにもかかわらず（図2A），この様な効果は観察されなかった（図2B）。この結果は，DGKαによるアポトーシス抑制にはDGKαの触媒活性が必須であることを示している。他のI型アイソザイムであるDGKβ-WTとDGKγ-WTの過剰発現ではアポトーシスの阻害は観察されず，かえって上昇させる傾向が認められた。したがって，このAKIメラノーマ細胞におけるアポトーシス抑制にはDGKαアイソザイムのみが関与することが強く示唆された。

次に，過剰発現系とは逆に，siRNAによるDGKαタンパク質のノックダウン（発現量低下）実験を行った。AKIメラノーマ細胞にコントロール（GFP），DGKα，またはDGKγのsiRNAを導入し，導入24時間後にTNF-α（50 ng/ml）を加え，更に24時間インキュベーションした。インキュベーション終了後，細胞溶解物（10 μg）をSDS-PAGEにより分離し，DGKα抗体にてウエスタンブロットを行い，DGKαタンパク質の発現量低下を確認した（図3A）。DGKα（80Kと60K）の各バンドの濃さを定量し，コントロールと比較した相対値を下段に示した。次に，インキュベーション終了後，TUNEL染色を行い，共焦点レーザー顕微鏡にてアポトーシス細胞をカウントし，全体の細胞数に占める割合（％）を求めた。結果は独立した3回の実験から得られた平均±標準偏差で示した（図3B）。

図3Aに示すように，特異的siRNAの導入によりDGKαタンパク質（80Kと60Kバンドの両者）の発現量が著しく低下（約70％阻害）することが確認された。そして，コントロールに比べ，DGKαのノックダウンにより，TNF-αによって誘導されるアポトーシスが顕著に亢進することが明らかになった（図3B）。しかし，DGKγのsiRNAではこのような効果は認められなかった。この結果は，α-アイソザイムが特異的にアポトーシス抑制に関与することを更に支持するものである。

3．AKIメラノーマ細胞のNF-κB活性に対するDGKαの過剰発現またはノックダウンの影響
メラノーマ細胞がTNF-αによって刺激されると，最終的にはアポトーシスが誘導されるが，他方，抗アポトーシス効果として，p65を含むNF-κBが核内へ移行し，アポトーシス抑制因子をはじめとする様々なタンパク質の転写が促進される。したがって，DGKαの過剰発現，またはノックダウンによるNF-κBの核内局在への影響を調べた。結果を図４に示す。

AKIメラノーマ細胞にコントロールベクター（pEGFP alone），pEGFP-DGKα-WT，またはpEGFP-DGKα-KDを導入し，導入24時間後にTNF-α（50 ng/ml）を加え，更に12時間インキュベーションした。インキュベーション終了後，抗NF-κB（p65）抗体を用いて染色（赤色）し，共焦点レーザー顕微鏡にて，GFP融合タンパク質が発現した細胞におけるNF-κB（p65）の細胞内局在性を観察した（図4A）。バー：10 μm。次に，Image J ソフトを使用し，各条件下での核／細胞質に存在するNF-κB（p65）の蛍光強度比を解析した（図4B）。結果は独立した3回の実験（それぞれ20個以上の細胞を解析）から得られた平均±標準偏差で示した。

さらに，AKIメラノーマ細胞にコントロール（GFP）， DGKα，またはDGKγのsiRNAを導入し，導入24時間後にTNF-α（50 ng/ml）を加え，更に12時間インキュベーションした。インキュベーション終了後，抗NF-κB（p65）抗体を用いて染色し，共焦点レーザー顕微鏡にてNF-κB（p65）の細胞内局在性を検討した（図4C）。バー：10 μm。次に，Image Jソフトを使用し，各条件下での核／細胞質に存在するNF-κB（p65）の蛍光強度比を解析した（図4D）。結果は独立した3回の実験（それぞれ20個以上の細胞を解析）から得られた平均±標準偏差で示した。

TNF-α刺激時のAKI細胞の細胞質中と核内に存在するp65の割合を測定したところ，DGKα-WTの過剰発現により，その核内局在の割合が顕著に上昇した（図4AおよびB）。なお，この際，p65の発現量には殆ど変化がないことを確認している（データ示さず）。しかし，DGKα-KDではこの様な効果は観察されなかった。この結果は，DGKαによるアポトーシス抑制現象は核内局在NF-κBの比率上昇と関連しており，両者共に酵素の触媒活性が必須であることを示している。一方，DGKαのsiRNAによるノックダウンによっては，逆に核内に存在するp65の割合がコントロールに比べ下降した（図4CおよびD）。更に，DGKγのsiRNAではこのような効果は認められないことを確認した。

次に，実際にNF-κBの転写活性が上昇しているか否かをルシフェラーゼレポーターアッセイによって検討した。AKIメラノーマ細胞にコントロールベクター（pEGFP alone），pEGFP-DGKα-WT，またはpEGFP-DGKα-KDを遺伝子導入し，導入24時間後にTNF-α（50 ng/ml）を加えた。更に12時間インキュベーションし，細胞を回収し，ルシフェラーゼ活性を測定した（図5A）。活性はコントロール細胞を100％とした相対値で表した。結果は独立した3回の実験から得られた平均±標準偏差で示した。

DGKα-WTの過剰発現により，TNF-α存在，非存在下いずれにおいても，NF-κBの転写活性が明らかに上昇した。しかし，不活性型DGKαではこの様な効果は観察されなかった。したがって，DGKαによるNF-κB活性上昇には，やはりDGKαの触媒活性が必須であることが明らかになった。この事実はNF-κBの核内移行促進のためにはDGKαの活性が必須であること（図４）と良く一致している。

次にAKIメラノーマ細胞にGFP（コントロール），またはDGKαのsiRNAを導入し，導入24時間後にTNF-α（50 ng/ml）を加えた。更に12時間インキュベーションし，細胞を回収し，ルシフェラーゼ活性を測定した（図5B）。活性はコントロール細胞を100％とした相対値で表した。結果は独立した3回の実験から得られた平均±標準偏差で示した。DGKαのsiRNAによるノックダウンでは，逆にNF-κB活性が下降した以上の結果を総合すると，DGKαはその触媒活性を介してNF-κBの転写活性を正に制御していることが明らかになった。また，DGKαによるアポトーシスの抑制とNF-κBの活性亢進が密接な関係があることを示唆している。

さらに，DGKα依存性のアポトーシス抑制とNF-κBの活性亢進との関係を確かめるために，DGKα-WTの過剰発現によって引き起こされたアポトーシス抑制に及ぼすNF-κB阻害剤の影響を検討した。まず，AKIメラノーマ細胞にコントロールベクター（pEGFP alone），またはpEGFP-DGKα-WTを遺伝子導入し，導入23時間後にMG-132（5 μM）を加え1時間インキュベーションした。更にTNF-α（50 ng/ml）を加えてインキュベーションした。12時間のインキュベーション後，細胞を回収し，ルシフェラーゼ活性を測定した（図6A）。活性はコントロール細胞を100％とした相対値で表した。結果は独立した3回の実験から得られた平均±標準偏差で示した。その結果，NF-κB阻害剤（MG-132）の添加により，DGKα-WTの過剰発現によって上昇したTNF-α依存性のNF-κB活性がほぼコントロールレベルまで阻害されることが確認された。

次に，24時間のインキュベーション後，TUNEL染色を行った。共焦点レーザー顕微鏡にて，GFP融合タンパク質が発現し且つTUNEL染色陽性の細胞をカウントし，GFP陽性細胞数全体に占める割合（％）を求めた（図6B）。誘導されたアポトーシスの程度は，コントロール細胞を100％とした相対値で表した。独立に２回繰り返した実験でほぼ同様の結果が得られ，そのうちの代表的なものを示した。その結果，図2Bで認められたようにDGKα-WTの過剰発現によってTNF-α-誘導アポトーシスが顕著に抑制されたが，MG-132はこのDGKαの抗アポトーシス効果を完全に無効化することが明らかになった。以上の結果は，DGKαによるアポトーシスの抑制は確かにNF-κBの活性亢進を介していることを示している。

５．動物実験
本発明のDGKα阻害剤が癌を抑制する効果は、公知の文献（例えば、Y.Takei, et al., Cancer Res., 64, 3365 (2004)；Y.Minakuchi, et al., Nucleic Acids Res., 32, e109 (2004)；F.Takeshita, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 102, 12177 (2005)）に記載の方法にしたがって、動物で実験することができる。

皮膚癌細胞としては、Mouse B16F1 メラノーマ細胞を用いる。動物としては、雌C57BL/6J マウス (４週齢, 10 gm)を用いる。癌を形成させるためには、0.1 ml リン酸緩衝化食塩水に懸濁した約1x10⁵個のB16F1 メラノーマ細胞をC57BL/6J マウスの左脇腹に皮下注射する。7〜10日後に形成した癌の体積を測定する。

DGKα特異的siRNAの効果は、以下のようにして測定する。B16F1 メラノーマ細胞の皮下注射48時間後に，アテロコラーゲン（AteloGene（商標）；株式会社高研）と混合したDGKα特異的siRNAを局所（皮下）または全身（静注）投与する。DGKα特異的siRNAとAteloGeneの混合比および濃度、ならびにDGKα特異的siRNAの投与時期について、種々の条件を設定することができる。5〜8日後に形成した癌の体積を測定し，DGKα特異的siRNAの効果を検定する。

本発明の抗癌剤は，癌，特にメラノーマの治療に有用である。また，本発明は，抗癌剤の候補物質のスクリーニングにも有用である。

Claims

配列番号４または配列番号５に記載のＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡを含有する、ジア
シルグリセロールキナーゼのアイソザイムα（ＤＧＫα）の活性を阻害し、かつＮＦ（ｎ
ｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ）−κＢの発現を抑制することを特徴とする抗癌剤。
配列番号４または配列番号５に記載のＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡを含有する、ジア
シルグリセロールキナーゼのアイソザイムα（ＤＧＫα）の活性を阻害し，かつＮＦ（ｎ
ｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ）−κＢの発現を抑制することを特徴とするメラノーマ治療
剤。
ジアシルグリセロールキナーゼのアイソザイムα（ＤＧＫα）の活性を阻害し，かつＮ
Ｆ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ）−κＢの発現を抑制することを特徴とする抗癌剤お
よび／またはメラノーマ治療剤の候補物質を同定する方法であって、試験物質をＤＧＫα
を発現する細胞と接触させ、前記試験物質がＤＧＫαの発現および／または機能を阻害す
るか否かを判定するステップと、ＮＦ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ）−κＢ活性を測
定するステップと、を含む方法。