WO2012043747A1 - グリオーマの治療方法、グリオーマの検査方法、所望の物質をグリオーマに送達させる方法、及びそれらの方法に用いられる薬剤 - Google Patents

グリオーマの治療方法、グリオーマの検査方法、所望の物質をグリオーマに送達させる方法、及びそれらの方法に用いられる薬剤 Download PDF

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ceacam1
antibody
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Definitions

  • the present invention relates to a method for treating glioma, a method for examining glioma, a method for delivering a desired substance to glioma, and a drug used in these methods, and more particularly, treatment of glioma targeting Eva1 and / or Ceacam1
  • the present invention relates to a method, a test method, and a method for delivering a desired substance to a glioma.
  • this invention relates to the chemical
  • Glioma is a general term for tumors that arise from neural stem cells, neural progenitor cells, and glial cells (glia cells), and is a representative example of a malignant tumor of the brain that accounts for about 25% of Japanese primary brain tumors.
  • gliomas are classified into astrocytic tumors, oligodendrocyte tumors, oligodendrocyte tumors, ependymoid tumors, etc. according to the cells derived from them, and graded according to the clinical malignancy defined by WHO. Rated from 1 to 4.
  • Grade 4 is the tumor with the highest malignancy and poor prognosis. Particularly, grade 3 and 4 tumors are called malignant gliomas.
  • Eva1 also referred to as Epithelial V-like antigen, MPZL2
  • MPZL2 Epithelial V-like antigen
  • Ceacam1 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1, CARCINOEMBRYONIC, ANTIGEN-RELATED CELL, ADHESION MOLECULE 1
  • CARCINOEMBRYONIC Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1
  • ANTIGEN-RELATED CELL ADHESION MOLECULE 1
  • Ceacam1 is thought to be involved in cell proliferation, inhibition of immune cell cytotoxicity, VEGF-induced angiogenesis, apoptosis, metastasis, and regulation of innate and adaptive immune responses ( Non-patent documents 5 to 6).
  • Ceacam1-L which is one of the splicing variants of Ceacam1, encodes an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif in its cytoplasmic tail and exerts tumor suppressor activity via this motif.
  • Non-Patent Documents 5 to 7 there is a report that the expression of Ceacam1-L is increased in lung, large intestine and thyroid cancer.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to find a molecule that is specifically expressed in glioma and to provide a therapeutic method, a testing method, and a desired substance for glioma targeting the molecule.
  • the object is to provide a method for delivery to a glioma, and a drug used in those methods.
  • the present inventor has shown that the Eva1 gene is specifically expressed in glioma and suppresses the function of the Eva1 gene (anti-Eva1 protein antibody, Eva1 protein). It was found that the proliferation ability, tumor formation ability and tissue invasion ability of glioma cells, and the tumor mass formation ability of glioma stem cells can be suppressed by a peptide having a dominant negative character, RNA that binds to the transcript of Eva1 gene. The present inventor has also found that an anti-Eva1 protein antibody can be used to deliver a desired substance to glioma stem cells. Furthermore, the present inventor has also found from a survey using a brain tumor database that there is a strong correlation between the survival rate of glioma patients and the expression of the Eva1 gene in gliomas derived from the patients.
  • the present inventors have found that the expression pattern of many genes varies by suppressing the expression of Eva1 in glioma stem cells. Furthermore, intensive research was conducted focusing on the Ceacam1 gene, in which a significant decrease in expression was observed by suppressing the expression of Eva1. As a result, although Ceacam1 is not expressed in normal brain tissue, it is highly expressed in glioma stem cells and glioma (mainly GBM). Further, from the investigation using the brain tumor database, the survival rate of glioma patients and its It was also found that there was a strong correlation between the expression of the Ceacam1 gene in patient-derived glioma. In addition, the present inventor has also revealed that enhancing the expression of Ceacam1-L increases the malignancy of glioma stem cells, while suppressing the expression of Ceacam1 decreases the malignancy of glioma.
  • the present inventor has found that it is possible to treat and test glioma targeting Eva1 and Ceacam1 and to deliver a desired substance to glioma, thereby completing the present invention. It was.
  • the present invention provides the following inventions.
  • (1) A method of treating glioma that suppresses the function of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene in a subject.
  • (2) A therapeutic agent for glioma comprising, as an active ingredient, a molecule that suppresses the function of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene.
  • (3) The treatment according to (2), wherein the molecule that suppresses the function of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene is a molecule described in any of (a) to (f) below: medicine.
  • A Anti-Eva1 protein antibody
  • b Peptide having a dominant negative trait for Eva1 protein
  • c RNA that binds to transcript of Eva1 gene
  • D Anti-Ceacam1 protein antibody
  • e Peptide having dominant negative trait for Ceacam1 protein
  • f RNA that binds to transcription product of Ceacam1 gene
  • a test agent for glioma comprising, as an active ingredient, a molecule that binds to an expression product of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene.
  • an active ingredient is at least one of an anti-Eva1 protein antibody and an anti-Ceacam1 protein antibody.
  • An anti-Eva1 protein antibody to which a desired substance is bound and an anti-Ceacam1 protein antibody to which the desired substance is bound are administered to the subject, and the desired substance is delivered to the glioma in the subject How to make.
  • FIG. 2 is an electrophoresis photograph showing the results of analyzing the expression of Eva1 in mouse glioma stem cells and human glioma stem cells by RT-PCR. The expression of the gapdh gene was used as an internal standard. It is a microscope picture which shows the result of having analyzed the expression of Eva1 protein in NSCL61 and hGIC by immunostaining.
  • the green light-emitting portion indicates the site stained with the anti-Eva1 antibody
  • the blue light-emitting portion in the drawing indicates the intracellular nucleus counterstained with Hoechst 33342.
  • the scale bar in the figure indicates 50 ⁇ m. It is a microscope picture which shows the result of having analyzed the expression of Eva1 protein in the tumor derived from NSCL61 by immuno-staining.
  • the red light-emitting part indicates the site stained with the anti-Eva1 antibody (see the middle two panels), and the green light-emitting part in the figure indicates the expression of GFP (left two panels).
  • the blue light-emitting part shows the intracellular nucleus counterstained with Hoechst 33342.
  • the scale bar in the figure indicates 200 ⁇ m.
  • GFP is integrated in the vector introduced in order to establish NSCL61, it has shown that the expression is a cell derived from NSCL61 or NSCL61.
  • the green light-emitting portion indicates the site stained with the anti-Eva1 antibody
  • the blue light-emitting portion in the drawing indicates the intracellular nucleus counterstained with Hoechst 33342.
  • the scale bar in the figure indicates 50 ⁇ m.
  • FIG. 1 It is a microscope picture which shows the result of having analyzed the expression of Eva1 protein in glioma tissue primary GBM (primary GBM, primary glioblastoma multiform, primary glioblastoma multiforme glioblastoma) by immunostaining.
  • the green light-emitting portion indicates the site stained with the anti-Eva1 antibody
  • the blue light-emitting portion in the drawing indicates the intracellular nucleus counterstained with Hoechst 33342.
  • the scale bar in the figure indicates 50 ⁇ m.
  • 2 is an electrophoretogram showing the results of RT-PCR analysis of Eva1 expression in human primary glioma tissue and human glioma stem cells.
  • the expression of the gapdh gene was used as an internal standard.
  • 2 is an electrophoretogram showing the results of RT-PCR analysis of Eva1 expression in a glioma cell line.
  • the expression of the gapdh gene was used as an internal standard. It is a figure which shows the result of having immunostained Eva1 of hGIC and a glioma cell line, and analyzing by flow cytometry.
  • the left side of the figure shows the result of reacting only the secondary antibody (anti-rabbit IgG antibody derived from goat labeled with Alexa568) with each cell, and the middle in the figure reacts only with the control antibody (rabbit IgG) with each cell.
  • the right side of the figure shows the result of reacting anti-Eva1 antibody and secondary antibody with each cell.
  • the scale bar indicates 200 ⁇ m.
  • hGIC1- ⁇ Eva1 Ab shows the result of adding anti-Eva1 antibody and Rab-ZAP to hGIC1
  • hGIC2- ⁇ Eva1 Ab shows the result of adding anti-Eva1 antibody and Rab-ZAP to hGIC2.
  • HGIC1-cont Ab shows the result of adding control antibody (rabbit IgG) and Rab-ZAP to hGIC1
  • hGIC2-cont Ab shows control antibody (rabbit IgG) and Rab-ZAP together with hGIC2. The results of addition to are shown.
  • the green light-emitting part indicates the site stained with the anti-Eva1 antibody (see the top three panels), and the red light-emitting part in the figure indicates the expression of CD31 (middle)
  • the blue light-emitting portion indicates the intracellular nucleus stained with Hoechst 33342.
  • the scale bar in the figure indicates 100 ⁇ m
  • the bottom three panels are photographs in which a staining diagram with an anti-Eva1 antibody, a staining diagram with an anti-CD31 antibody, and a staining diagram with Hoechst 33342 are superimposed.
  • FIG. 3 is an electrophoresis photograph showing the results of analyzing the expression of the Ceacam1 gene and the like in NSCL61, eva1sh ⁇ expressed NSCL61, hGSC2 and eva1sh ⁇ expressed hGSC2 by RT-PCR. The expression of the gapdh gene was used as an internal standard.
  • FIG. 3 is an electrophoresis photograph showing the results of analysis of expression of ceacam1 , fgf5 and ceacam6 in human primary glimama and hGSC by RT-PCR. The expression of the gapdh gene was used as an internal standard.
  • the green light-emitting portion indicates a site stained with the anti-Ceacam1 antibody
  • the blue light-emitting portion in the drawing indicates an intracellular nucleus counterstained using Hoechst 33342.
  • the scale bar in the figure indicates 100 ⁇ m. It is a microscope picture which shows the result of having analyzed the expression of Ceacam1 in a primary GBM sample (GBM1 and GBM2) by immunostaining. In addition, the brown part in a figure shows the site
  • the scale bar in the figure indicates 100 ⁇ m
  • the bottom four panels are photographs in which a staining diagram with an anti-Ceacam1 antibody, a staining diagram with an anti-GFP antibody, and a staining diagram with Hoechst 33342 are superimposed.
  • “Invasion” and “Tumor mass” in the figure indicate the “invasion” portion and “tumor mass” of the xenograft tumor, respectively.
  • HGSC is a photograph of electrophoresis showing the results of analysis by RT-PCR the expression of CEACAM1-l in NSCL61 and OPCL61 (L) and ceacam1-s (S).
  • FIG. 3 is an electrophoresis photograph showing the results of analysis of expression of ceacam1 , fgf5 and ceacam6 in human primary glimama and hGSC by RT-PCR. The expression of the gapdh gene was used as an internal standard. It is a photograph which shows the result of having analyzed Cos7 cell which forcedly expressed FLAG tag binding
  • Western blotting was carried out by introducing a control vector (control vector), a FLAG tag-bound Ceacam1-L expression vector (ceacam1-2 ⁇ FLAG), and a ceacam1sh expression vector (ceacam1shRNA) on Cos7 cells, and on the second day after the introduction (transfection).
  • the cell extract collected was used.
  • the result of analysis using anti-GAPDH antibody was used as an internal standard (loading control). “Mouse” indicates the result for mouse Ceacam1, and “Human” indicates the result for human Ceacam1.
  • the present invention provides a method for treating glioma that suppresses the function of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene in a subject.
  • glioma is a general term for tumors generated from neural stem cells, neural progenitor cells, and glial cells.
  • glioblastoma multiforme GBM
  • astrocytoma astrocytoma
  • Blastoma superior ventricular tumor
  • oligodendrogliomas choroid plexus papillomas
  • especially anaplastic astrocytoma, anaplastic oligodendrastrocytoma, anaplastic oligodendrogliomas but are not limited to these diseases .
  • the treatment of glioma according to the present invention includes, for example, suppression of the proliferation ability of glioma cells, suppression of tumor formation ability of glioma cells, suppression of tissue invasion ability of glioma cells, suppression of tumor mass formation ability of glioma stem cells, Examples thereof include those performed through suppression of angiogenesis in glioma.
  • the “subject” in the treatment method of the present invention is a glioma patient.
  • examples of the subject include mice, rats, dogs, cats, cows, horses, pigs, birds and the like.
  • “Suppression of gene function” in the treatment method of the present invention includes both suppression of gene expression (suppression of transcription and suppression of translation) and suppression of the functions of transcription product (mRNA) and translation product (protein). I mean.
  • the “Eva1 gene” that is the target of function suppression is typically a gene consisting of the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1 if it is derived from human, and typically if it is derived from mouse. Specifically, it is a gene consisting of the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the DNA sequence of a gene can be mutated in nature (ie, non-artificially) due to such mutations. Therefore, in the present invention, such a natural mutant can also be a target of function suppression.
  • the “Ceacam1 gene” that is the target of function suppression is also referred to as BGP (bile glycoprotein, BILIARY GLYCOPROTEIN), BGP1 (BILIARY GLYCOPROTEIN1,) or CD66 (CD66 antigen) gene, and in humans it is 19q13.
  • BGP bile glycoprotein, BILIARY GLYCOPROTEIN
  • BGP1 BILIARY GLYCOPROTEIN1
  • CD66 CD66 antigen
  • the DNA sequence of a gene can be mutated in nature (ie, non-artificially) due to such mutations. Therefore, in the present invention, such a natural mutant can also be a target of function suppression.
  • the treatment method of the present invention uses the Eva1 gene and the Ceacam1 gene. In combination with at least one of the genes, the function of the Ceacam6 gene may be suppressed.
  • NCA non-specific cross-reactive antigen
  • NONSPECIFIC CROSSREACTING ANTIGEN normal cross-reactive antigen
  • CEAL CEA-like protein
  • CEA-LIKE PRO CEA-like protein
  • the anti-Ceacam6 protein antibody and the Ceacam6 protein are inhibited.
  • a peptide having a dominant negative trait, RNA that binds to the transcription product of the Ceacam6 gene, and these molecules should be prepared according to the method described in the section ⁇ Therapeutic Agent for Glioma> below. Can do.
  • “Suppression of the function of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene” refers to “a molecule that suppresses the function of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene (hereinafter referred to as“ Eva1 ”). Molecules that suppress the function of genes and the like ”)", for example, anti-Eva1 protein antibody, peptide having dominant negative trait for Eva1 protein, RNA that binds to transcript of Eva1 gene, anti-Ceacam1 protein antibody, Ceacam1 It can be carried out using a peptide having a dominant negative trait for protein, RNA that binds to the transcription product of Ceacam1 gene.
  • a method for administering the molecule to a subject for example, direct administration into the brain or intravenous injection can be performed.
  • Examples of a method for directly administering a molecule that suppresses the function such as the Eva1 gene into the brain include a method in which a cannula or the like is inserted by a stereotaxic method and administered to the glioma through the cannula.
  • a method in which a brain barrier permeation substance is bound to the molecule can be used, but the method is not limited thereto.
  • the brain barrier (BBB) in the normal brain is not formed in the blood vessel in the brain tumor in which angiogenesis has occurred, so the brain barrier permeation substance is not bound.
  • a molecule that suppresses a function such as the Eva1 gene can be delivered to the GBM by intravenous injection or the like.
  • Examples of the brain barrier permeating substance include, but are not limited to, a glycoprotein consisting of 29 amino acids derived from rabies virus (see Kumar et al., Nature, July 5, 2007, 448, pages 39-43). .
  • the present invention provides a therapeutic agent for glioma comprising as an active ingredient a molecule that suppresses the function of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene.
  • Examples of the “molecule that suppresses the function of the Eva1 gene” include, for example, an anti-Eva1 protein antibody, a peptide having a dominant-negative trait for the Eva1 protein, RNA that binds to a transcript of the Eva1 gene, an anti-Ceacam1 protein antibody, Ceacam1 Examples include peptides having a dominant negative trait for proteins and RNA that binds to the transcription product of the Ceacam1 gene.
  • the anti-Eva1 protein antibody or the anti-Ceacam1 protein antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and may be a functional fragment of an antibody. Also good. “Antibody” also includes all classes and subclasses of immunoglobulins.
  • the “functional fragment” of an antibody means a part (partial fragment) of an antibody that specifically recognizes Eva1 protein or Ceacam1 protein. Specifically, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, variable region fragment (Fv), disulfide bond Fv, single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2, diabody, multispecific antibody, And polymers thereof.
  • anti-Eva1 protein antibodies and the like include chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and functional fragments of these antibodies.
  • a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody is desirable from the viewpoint of reducing side effects.
  • a “chimeric antibody” is an antibody in which a variable region of a certain antibody is linked to a constant region of a heterogeneous antibody.
  • a chimeric antibody for example, immunizes a mouse with an antigen, cuts out an antibody variable region (variable region) that binds to the antigen from the mouse monoclonal antibody gene, and binds to a human bone marrow-derived antibody constant region (constant region) gene. This can be obtained by incorporating it into an expression vector and introducing it into a host for production (for example, JP-A-8-280387, US Pat. No. 4,816,397, US Pat. No. 4,816,567, US Pat. 5807715).
  • the “humanized antibody” is an antibody obtained by grafting (CDR grafting) the gene sequence of the antigen binding site (CDR) of a non-human-derived antibody to a human antibody gene, and its production method is publicly known. (See, for example, EP239400, EP125503, WO90 / 07861, WO96 / 02576).
  • a “human antibody” is an antibody derived from all regions. In the production of human antibodies, it is possible to use a transgenic animal (for example, a mouse) that can produce a repertoire of human antibodies by immunization. Methods for producing human antibodies are known (for example, Nature, 1993, 362, 255-258, Intern. Rev.
  • amino acid sequence of an anti-Eva1 protein antibody or the like is modified without decreasing desirable activities (such as binding activity to Eva1 protein or Ceacam1 protein, antiglioma activity, and / or other biological properties).
  • Amino acid sequence variants can be made by introducing mutations into DNA encoding the antibody chain or by peptide synthesis.
  • the site where the amino acid sequence of the antibody is modified may be the constant region of the heavy chain or light chain of the antibody as long as it has an activity equivalent to that of the antibody before modification, and further, the variable region (framework region and CDR).
  • Modification of amino acids other than CDR is considered to have a relatively small effect on the binding affinity with the antigen, but at present, the amino acid of the CDR is modified to screen for an antibody having an increased affinity for the antigen.
  • Methods are known (PNAS, 102: 8466-8471 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 485-493 (2008), International Publication No. 2002/051870, J. Biol. Chem., 280: 24880-24887 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 345-351 (2008)).
  • the number of amino acids to be modified is preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids, and most preferably within 3 amino acids (for example, within 2 amino acids, 1 amino acid).
  • the amino acid modification is preferably a conservative substitution.
  • conservative substitution means substitution with another amino acid residue having a chemically similar side chain. Groups of amino acid residues having chemically similar amino acid side chains are well known in the technical field to which the present invention belongs.
  • acidic amino acids (aspartic acid and glutamic acid), basic amino acids (lysine, arginine, histidine), neutral amino acids, amino acids having a hydrocarbon chain (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), hydroxy group Amino acids with amino acids (serine / threonine), amino acids with sulfur (cysteine / methionine), amino acids with amide groups (asparagine / glutamine), amino acids with imino groups (proline), amino acids with aromatic groups (phenylalanine / tyrosine / (Tryptophan).
  • the amino acid sequence variant preferably has the same binding activity to the antigen as the target antibody (for example, the antibody described in this Example).
  • the binding activity to the antigen can be evaluated by analysis using, for example, a flow cytometer, ELISA, Western blotting, immunoprecipitation method or the like.
  • deamidation is suppressed by substituting an amino acid adjacent to the amino acid deamidated or deamidated with another amino acid for the purpose of increasing the stability of the antibody. May be.
  • glutamic acid can be substituted with other amino acids to increase antibody stability.
  • the present invention also provides the antibody thus stabilized.
  • the modification of the antibody may be a modification of the post-translational process of the antibody, such as changing the number or position of glycosylation sites.
  • the ADCC activity of the antibody can be improved.
  • Antibody glycosylation is typically N-linked or O-linked.
  • Antibody glycosylation is highly dependent on the host cell used to express the antibody.
  • the glycosylation pattern can be modified by a known method such as introduction or deletion of a specific enzyme involved in sugar production (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-113663, US Pat. No. 5,047,335, US Pat. No. 5,510,261, US Pat. No. 5278299, International Publication No. 99/54342).
  • the anti-Eva1 protein antibody or the like used in the therapeutic agent of the present invention can be used for the treatment of gliomas such as cytotoxic agents as described in the section ⁇ Delivery method to glioma, Drug for delivery to glioma> below. A substance may be bound. By using such an antibody, so-called missile therapy can be performed.
  • Examples of the peptide having a dominant negative trait for the Eva1 protein contained as an active ingredient of the glioma therapeutic agent include substitution, deletion, addition and / or insertion of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4. And applied polypeptides.
  • it is a peptide consisting of the extracellular region of Eva1 protein shown in the Examples described later.
  • a peptide having a dominant negative trait for the Ceacam1 protein contained as an active ingredient of a therapeutic agent for glioma for example, substitution, deletion of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14, 16, 18 or 20, Polypeptides to which additions and / or insertions have been performed can be mentioned.
  • RNA that binds to the transcript of the Eva1 gene or RNA that binds to the transcript of the Ceacam1 gene contained as an active ingredient of the therapeutic agent for glioma , DsRNA (double stranded RNA) complementary to the transcript of the gene encoding Eva1 protein or Ceacam1 protein, or DNA encoding the dsRNA.
  • DNA encoding dsRNA includes antisense DNA encoding antisense RNA for any region of the transcript (mRNA) of the target gene, and sense DNA encoding sense RNA for any region of the mRNA, Antisense RNA and sense RNA can be expressed from the antisense DNA and the sense DNA, respectively. Moreover, dsRNA can be produced from these antisense RNA and sense RNA.
  • antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector
  • antisense RNA and sense RNA are expressed from different vectors, respectively.
  • an antisense RNA expression cassette in which a promoter capable of expressing a short RNA such as a polIII system is linked upstream of the antisense DNA and the sense DNA.
  • sense RNA expression cassettes are constructed, and these cassettes are inserted into the vector in the same direction or in the opposite direction.
  • an expression system in which antisense DNA and sense DNA are arranged in opposite directions so as to face each other on different strands.
  • one double-stranded DNA in which an antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired is provided, and antisense RNA and sense RNA from each strand are provided on both sides thereof.
  • a promoter is provided oppositely so that it can be expressed.
  • a terminator is added to the 3 ′ end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand). It is preferable to provide.
  • this terminator a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used.
  • the two promoter types are preferably different.
  • antisense RNA expression in which a promoter capable of expressing a short RNA such as a polIII system is linked upstream of the antisense DNA and the sense DNA.
  • a cassette and a sense RNA expression cassette are constructed, and these cassettes are held in different vectors.
  • those skilled in the art can prepare the dsRNA by chemically synthesizing each strand.
  • the dsRNA used in the present invention is preferably siRNA or shRNA (short haipin RNA).
  • siRNA means double-stranded RNA consisting of short strands in a range that does not show toxicity in cells.
  • shRNA is a single-stranded RNA in which a sense RNA and an antisense RNA are arranged with a spacer sequence, and hydrogen bonding occurs between the sense RNA and the antisense RNA in a cell or the like, resulting in a spacer. It means that the sequence becomes a hairpin structure and can be an siRNA by cleaving the hairpin structure in a cell.
  • the chain length is not particularly limited as long as the expression of the target gene can be suppressed and it does not show toxicity.
  • the chain length of dsRNA is, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21 to 30 base pairs.
  • the DNA encoding dsRNA need not be completely identical to the base sequence of the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% or more). Sequence identity can be determined by the BLAST program.
  • RNA that binds to the transcription product of Eva1 gene include DNA (antisense DNA) encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of Eva1 gene or the transcription product of Ceacam1 gene, Also, DNA encoding an RNA having a ribozyme activity (ribozyme) that specifically cleaves a transcript of the Eva1 gene or a transcript of the Ceacam1 gene.
  • DNA antisense DNA
  • ribozyme activity ribozyme
  • the above-mentioned brain barrier permeation substance may be bound to a molecule that suppresses the function of the Eva1 gene or the like of the present invention.
  • the therapeutic agent of the present invention can contain other components in addition to molecules that suppress functions such as the Eva1 gene.
  • other components include carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, and physiological saline.
  • excipient lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used.
  • disintegrant starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc.
  • the buffer can be used as the buffer.
  • the emulsifier gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used.
  • the suspending agent glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • the stabilizer propylene glycol, diethylin sulfite, ascorbic acid or the like can be used.
  • preservatives phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used.
  • sodium azide, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the present invention provides a method for examining glioma, which detects the expression of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene in a subject.
  • the prognosis test of glioma patients can be performed as well as the test of whether or not the patient has glioma.
  • inspection there is no restriction
  • the prognosis of a glioma patient can be determined using the graph shown in FIG. 20 or 27 as a parameter
  • the “target” in the inspection method of the present invention includes a living body and a sample separated from the living body (for example, a cell, a tissue, an organ, a body fluid, etc.).
  • the “living body” is not limited to a glioma patient but may be a healthy person (including a person who may have glioma).
  • examples of the “living body” include animals such as mice, rats, dogs, cats, cows, horses, pigs and birds.
  • the “Eva1 gene” for detecting expression is typically a gene consisting of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 if it is derived from human, and typically if it is derived from mouse.
  • the DNA sequence of a gene can be mutated in nature (ie, non-artificially) due to such mutations. Therefore, in the present invention, such a natural mutant can also be a detection target.
  • the “Ceacam1 gene” for detecting expression is typically a gene derived from the DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 13 (human Ceacam1-L gene) and SEQ ID NO: 15.
  • a gene comprising the DNA sequence described in 15 human Ceacam1-S gene.
  • it is derived from a mouse, typically, it comprises a gene consisting of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 17 (mouse Ceacam1-L gene) and a gene consisting of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 19 (mouse Ceacam1-S).
  • the DNA sequence of a gene can be mutated in nature (ie, non-artificially) due to such mutations. Therefore, in the present invention, such a natural mutant can also be a detection target.
  • detecting gene expression means both detection of the presence or absence of gene expression and detection of the degree of expression.
  • the expression level of a gene can be grasped as an absolute amount or a relative amount. In the case of grasping the relative amount, for example, it can be determined by comparing with the gene expression level of the prepared standard sample.
  • the “standard sample” is a sample in which whether or not the target gene is expressed is specified in advance. For example, a pathological tissue in which a site where glioma already exists can be used as the standard sample of the present invention. In addition, a tissue (normal tissue) not affected by glioma can also be used as the standard sample of the present invention.
  • gene expression means both transcription and translation of a gene. Therefore, “detection of gene expression” in the present invention includes both detection at the transcription level (mRNA level) and translation level (protein level).
  • a known technique can be used.
  • the detection method at the transcription level include RT-PCR, DNA microarray analysis, Northern blotting, in situ hybridization, dot blot, and RNase protection assay.
  • detection methods at the translation level include antibodies such as immunohistochemical staining, imaging cytometry, flow cytometry, ELISA, radioimmunoassay, immunoprecipitation, immunoblotting, antibody array, in vivo imaging, and the like.
  • the method of detecting using (immunological technique) is mentioned.
  • a detection method at the translation level is preferable, and a detection method using an antibody (immunological technique) is particularly preferable.
  • an antibody to which a labeling substance is bound can be used.
  • the amount of antibody bound to the Eva1 protein or the amount of antibody bound to the Ceacam1 protein can be directly measured.
  • An indirect detection method such as a method using a secondary antibody bound with a labeling substance or a method using a polymer bound with a secondary antibody and a labeling substance can also be used.
  • the “secondary antibody” is an antibody exhibiting specific binding to the antibody of the present invention.
  • an anti-rabbit IgG antibody can be used as the secondary antibody.
  • Labeled secondary antibodies that can be used are commercially available for antibodies derived from various biological species such as rabbits, goats, and mice, and appropriate secondary antibodies are available depending on the biological species from which the antibody of the present invention is derived. Can be selected and used in the present invention. Instead of the secondary antibody, protein G or protein A to which a labeling substance is bound can be used.
  • Information obtained by carrying out the method of the present invention for glioma patients can be used for evaluation or grasping of the patient's pathology, evaluation of therapeutic effects, and the like.
  • the method of the present invention is performed in parallel with the treatment of glioma, the therapeutic effect can be evaluated based on the resulting information.
  • the change in the expression of Eva1 gene and / or Ceacam1 gene in the pathological tissue is examined, and the therapeutic effect from the change in the amount of Eva1 gene and / or Ceacam1 gene. Can be determined.
  • the examination of glioma is usually performed by a doctor (including those who have received instructions from the doctor; the same applies hereinafter), but the expression level of Eva1 gene and the expression level of Ceacam1 gene in the pathological tissue obtained by the method of the present invention.
  • the data on is useful for diagnosis by doctors. Therefore, the method of the present invention can also be expressed as a method of collecting and presenting data useful for diagnosis by a doctor.
  • the present invention provides a test agent for glioma comprising, as an active ingredient, a molecule that binds to an expression product of at least one of Eva1 gene and Ceacam1 gene in a subject.
  • the expression product of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene refers to a transcription product (mRNA) or a translation product (protein) of the Eva1 gene and / or the Ceacam1 gene.
  • molecules that can bind to the Eva1 gene or the Ceacam1 gene transcription product include primers used in RT-PCR, probes used in DNA microarray analysis, Northern blotting, and the like.
  • the molecule is a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of the transcript of the Eva1 gene or Ceacam1 gene.
  • it is a polynucleotide comprising a base sequence of 15 bases or more that is complementary to the base sequence of the transcript of the Eva1 gene or Ceacam1 gene.
  • Examples of molecules that can bind to the translation product of Eva1 gene or Ceacam1 gene include anti-Eva1 protein antibody and anti-Ceacam1 protein antibody.
  • the “antibody” may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a functional fragment of an antibody. “Antibody” also includes all classes and subclasses of immunoglobulins.
  • the “functional fragment” of an antibody means a part (partial fragment) of an antibody that specifically recognizes Eva1 protein. Specifically, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, variable region fragment (Fv), disulfide bond Fv, single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2, diabody, multispecific antibody, And polymers thereof.
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • an immunized animal is immunized with an antigen (Eva1 protein or Ceacam1 protein, a partial peptide thereof, or a cell that expresses these), and conventional means (for example, , Salting out, centrifugation, dialysis, column chromatography, etc.).
  • Monoclonal antibodies can be prepared by a hybridoma method or a recombinant DNA method. Examples of the hybridoma method include the method of Kohler and Milstein (Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975)). Examples of the recombinant DNA method include a DNA encoding the antibody or peptide of the present invention.
  • a hybridoma or B cell Cloned from a hybridoma or B cell, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host cell (eg, mammalian cell line, E. coli, yeast cell, insect cell, plant cell, etc.), and the antibody of the present invention is a recombinant antibody (For example, P. J. Delves, Antibody Production: Essential Technologies, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean Monoclonal Antibodies.) s, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Vandamme A.M.et al, Eur.J.Biochem.192:. 767-775 (1990)).
  • a host cell eg, mammalian cell line, E. coli, yeast cell, insect cell, plant cell, etc.
  • the antibody of the present invention is a recombinant antibody (For example, P. J. Delves, Antibody Production: Essential Technologies, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean Monoclonal Antibodies.)
  • the “molecule that binds to the expression product of at least one of the Eva1 gene and the Ceacam1 gene” of the present invention those obtained by binding a labeling substance to these molecules can be used. By detecting the label, the amount of these molecules bound to the expression product of the Eva1 gene or the expression product of the Ceacam1 gene can be directly measured.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can bind to these molecules and can be detected by a chemical or optical method.
  • peroxidase peroxidase
  • ⁇ -D-galactosidase microperoxidase
  • horseradish examples include peroxidase (HRP), fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, and radioactive substances.
  • HRP peroxidase
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • RITC rhodamine isothiocyanate
  • alkaline phosphatase biotin, and radioactive substances.
  • the administration of a molecule that binds to the expression product of the Eva1 gene or the expression product of the Ceacam1 gene should be performed by selecting the method described in the section ⁇ Method of treating glioma>. Can do.
  • test agent of the present invention may contain other components described in the section ⁇ Glioma therapeutic agent> in addition to the molecule that binds to the expression product of the Eva1 gene or the expression product of the Ceacam1 gene.
  • the present invention is directed to administering a desired substance to a glioma in a subject, wherein at least one of an anti-Eva1 protein antibody to which a desired substance is bound and an anti-Ceacam1 protein antibody to which the desired substance is bound is administered to the subject.
  • a method for delivery, and an agent for delivering a desired substance to a glioma in a subject comprising as an active ingredient at least one of an anti-Eva1 protein antibody and an anti-Ceacam1 protein antibody.
  • the “desired substance” in the present invention is not particularly limited.
  • examples of the substance include cytotoxic agents, particularly ribosome inactivating protein (RIP), that is, saporin, ricin, Shiga toxin and the like.
  • examples of the substance include the labeling substances described above.
  • a test substance for evaluating the action on glioma can be mentioned.
  • anti-Eva1 protein antibody and “anti-Ceacam1 protein antibody” to which a desired substance is bound are the same as the antibodies described in the above section ⁇ Glioma test drug> or ⁇ Glioma therapeutic drug>.
  • a method of administering an anti-Eva1 protein antibody to which a desired substance is bound and / or an anti-Ceacam1 protein antibody to which a desired substance is bound to a subject the method described in the above ⁇ Method for treating glioma> is used. You can choose.
  • the drug to be delivered to the glioma may contain other components described in the section ⁇ Glioma therapeutic agent> in addition to the anti-Eva1 protein antibody and / or the anti-Ceacam1 protein antibody to which a desired substance is bound.
  • mice were obtained from the Animal Resource Development Office of the RIKEN Center for Developmental Biology and Regeneration Science (CDB) and Charles River Japan Co., Ltd. All experimental protocols related to mice were approved by the RIKEN CDB Animal Experiment Committee. Reagents and growth factors were purchased from Sigma-Aldrich Japan and Peprotech, respectively, unless otherwise specified.
  • NSC Mouse neural stem cells
  • hGIC human glioma stem cells
  • NSC medium reagent, bFGF (10 ng / ml), EGF (10 ng / ml) was prepared.
  • DMEM / F12 Gibco, manufactured by BRL
  • OPCL61 was established as follows. That is, first, differentiation induction into oligodendrocyte progenitor cells (OPC), mouse-derived p53-deficient neural stem cells (p53-defective NSC) in OPC medium (reagent, PDGFAA (10 ng / ml), bFGF (2 ng / ml), And 0.25% fetal calf serum (FCS), followed by immunopanning (see Immunopanning, Kondo T, et al., Genes Dev, 2004, Vol. 18, pages 2963-2972). It was purified by.
  • OPC oligodendrocyte progenitor cells
  • p53-defective NSC mouse-derived p53-deficient neural stem cells
  • FCS 0.25% fetal calf serum
  • Glioma glioblastoma cell lines (C6, T98G, Tp483, SF126, U87, and U251) are 10% fetal bovine serum (FCS), 100 units / ml penicillin G, and 100 ug / ml streptomycin (GIBCO) ) In DMEM with added.
  • FCS fetal bovine serum
  • GEBCO 100 ug / ml streptomycin
  • the hGIC and glioma cell lines are a rabbit-derived anti-Eva1 polyclonal antibody (10 ⁇ g / ml) and a goat-derived anti-rabbit IgG antibody labeled with Alexa568 (Molecular Probe, diluted to 1/400). Immunolabeled with.
  • the immunolabeled cells were analyzed using a dual wavelength excitation light (488 nm solid state laser and 638 nm semiconductor laser) through a JSAN cell sorter (manufactured by Bay Biosciences). Propidium iodide (PI) positive cells (for example, dead cells) were excluded from this analysis.
  • ⁇ Immunostaining> Dissected mouse brains were fixed overnight in 4% paraformaldehyde at 4 ° C. After fixation, the brain was cryoprotected with PBS containing 12-18% sucrose and embedded in OCT compound. Then, coronal sections (thickness 10 ⁇ m) were prepared from the cerebral cortex. In addition, Eva1 was activated using HistoVT One (manufactured by Nacalai Tesque) according to the instruction manual. Next, the sections were pretreated with PBS containing 0.3% Triton X-100 to allow the antibody to penetrate, and then treated in blocking solution (2% skim milk, 0.3% Triton X-100, PBS) for 1 hour. did.
  • Rabbit-derived anti-Eva1 polyclonal antibody (5 ⁇ g / ml) Anti-rat Nestin monoclonal antibody derived from mouse (manufactured by BD Bioscience, diluted to 1/400) Rat-derived anti-GFP monoclonal antibody (Nacalai Tesque, diluted 1/500) Anti-CD31 monoclonal antibody derived from mouse (Abcam, diluted to 1/200) Mouse-derived anti-Ceacam1 monoclonal antibody (R & D, diluted 1/50) These antibodies are anti-rabbit IgG derived from Alexa568-labeled goat (Molecular Probe, diluted 1/400), Alexa488-labeled goat-derived anti-rabbit IgG or anti-rat IgG (Molecular Probe, 1/400) Or using a Cy3-labeled goat-derived anti-mouse IgG antibody (Jackson Immunoresearch, diluted to 1/400). In order to visualize the nuclei, the cells were counterstained with Hoechst
  • hGIC human-derived glioma stem cells
  • human primary GBM primary glioblastoma multiform, primary glioblastoma multiforme
  • human primary glioma tissue were provided by the Department of Neurosurgery, Kumamoto University School of Medicine.
  • hGIC, hGIC1, and hGIC2 are also referred to as hGSC, hGSC1, and hGSC2, respectively.
  • poly (A) + RNA was prepared from these samples using QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare), and cDNA was synthesized using Transcribation First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche).
  • paraffin-embedded human brain tumors were prepared into 6 ⁇ m thick sections.
  • the antigen was activated using HistoVT One (manufactured by Nacalai Tesque) according to the instructions for use.
  • the sections were pretreated in TPBS containing 5% skim milk at room temperature for 30 minutes, incubated with an anti-Eva1 polyclonal antibody derived from rabbit (used diluted at 1/50) for 2 hours at room temperature, Subsequently, immunostaining was performed using Alexa488-labeled goat-derived anti-rabbit IgG (manufactured by Molecular Probe, diluted to 1/400). In order to visualize all nuclei, cells were counterstained with Hoechst 33342 (1 ⁇ g / ml).
  • NSCL61 and hGIC were suspended in 5 ⁇ l medium and injected into the brain of 5-8 week old female nude mice previously anesthetized with 10% pentobarbital.
  • the stereotaxic coordinates of the injection site were 2 mm forward from lambda, 2 mm behind sagittal suture, and 5 mm deep.
  • RT-PCR was performed as described in the following literature (see Kondo T, et al., EMBO J, 2000, Vol. 19, pages 1998-2007).
  • the cycle parameters were 35 cycles of 94 ° C. for 20 seconds, 57 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 35 seconds.
  • 22 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 53 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 90 seconds were used.
  • oligonucleotide DNA primers shown in Table 1 were synthesized and used.
  • mouse eva1 was amplified from mouse NSC cDNA using RT-PCR and KODplus polymerase (TOYOBO) according to the instructions and cloned into pMOSBlue vector (Roche). The nucleotide sequence was confirmed using BigDye Terminator Kit version 3.1 (AppliedBiosystems) and ABI sequencer model 3130xl (AppliedBiosystems). Then, mouse eva1 cDNA was inserted into pcDNA3-2xFLAG-c vector (manufactured by Invitrogen) to obtain pcDNA3-eva1-2xFLAG-c.
  • oligonucleotide DNA primers were synthesized.
  • 5 ′ primer 5′-AGAATTCGCCACCATGTATGGCAAGAGCCCCGC-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • 3 ′ primer 5′-ACTCGAGGTCTGTATCTTCCCAAAAAACA-3 ′ (SEQ ID NO: 8).
  • each of the human and mouse CEACAM1-L cDNA fragment is inserted into pcDNA3-2xFLAG vector to obtain pcDNA3.1- hceacam1-L -2xFLAG-c and pcDNA3.1- mceacam1 -L-2xFLAG-c.
  • the target sequence of mouse eva1 is 5′-GCAGTCAACGGGACAGATGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 9), and the target sequence of human eva1 is 5′-GTGCACCACTGTACGCTCTCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 10).
  • the shRNA against the Eva1 gene expressed from these vectors is referred to as “Eva1shRNA”, “Eva1sh” or “eva1sh”.
  • the target sequence of mouse ceacam1 is 5′-GGGAAAACACTACGGCTATAGA-3 ′ (SEQ ID NO: 75), and the target sequence of human ceacam1 is 5′-GGATGGCAACCGTCAAATTGT-3 ′ (SEQ ID NO: 76).
  • shRNA against the Ceacam1 gene expressed from these vectors is referred to as “ceacam1 shRNA” or “ceacam1 sh”.
  • the target sequence of the control shRNA (shRNA against the EGFP gene) is 5'-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCA-3 '(SEQ ID NO: 11).
  • transfection is performed by Hide, T. et al. Et al., Cancer Res. 2009, 69, 7953-7959, Hide, T .; As described in Stem Cells, 2011, Vol. 29, No. 4, pp. 590 to 599, using Nucleofector (manufactured by Lonza) according to the manufacturer's instructions.
  • cytotoxicity assay was performed using an anti-Eva1 polyclonal antibody derived from rabbit and an anti-rabbit IgG antibody (product name: Rab-ZAP, manufactured by Advanced Targeting Systems) to which ribosome-inactivating protein saporin was bound. Went according to. That is, control IgG derived from rabbit (Jackson Immunoresearch) or anti-Eva1 antibody was incubated with Rab-ZAP (100 ng) in a 96-well plate for 30 minutes each at room temperature. 5000 hGIC1 were seeded in each well and cultured at 37 ° C. for 2 days in a CO 2 incubator. Cell viability was measured by MTT assay as described in the following literature (see Hide T et al., Cancer Res., 2009, 69, 7953-7959).
  • DNA microarray analysis was performed using 3D-Gene Mouse Oligo chip 24k (number of detected genes: 23,522, manufactured by Toray Industries, Inc.).
  • the total RNA used for the analysis was labeled with Cy5 using an aminoallyl message AMP II aRNA amplification kit (Amino All Message AMP II aRNA Amplification Kit, manufactured by Applied Biosystems). Then, the obtained Cy5-labeled aRNA pool was hybridized to a microarray according to the manufacturer's protocol (www.3d-gene.com).
  • the hybridization signal was scanned using a scan array express scanner (ScanArray Express Scanner, manufactured by Perkin Elmer), and the obtained data was processed using GenePixPro version 5.0 (manufactured by Molecular Devices).
  • the raw data for each spot was normalized by replacing it with the mean intensity of the background signal determined by the signal intensity of all blank spots in the 95% confidence interval.
  • a value larger than 2 standard deviations (SD) of the background signal intensity was evaluated as effective.
  • SD standard deviations
  • the signal detected in each gene was normalized by a global normalization method (the median value of detected signal intensity was adjusted to 25).
  • Example 1 Preparation of peptide antibody>
  • an antibody according to the present invention (anti-Eva1 antibody) was prepared. Specifically, 86-102 amino acids (PMSGRFKDRVSWDGNPE, see SEQ ID NO: 12, see FIG. 1) were selected as antigens from the human-derived Eva1 protein (hEva1, the extracellular region of SEQ ID NO: 2 (1-150 amino acids)). A synthetic peptide consisting of the selected amino acid sequence was prepared and used to immunize rabbits, and serum was collected from the rabbits and purified using a peptide affinity column to obtain anti-Eva1 derived from rabbits. Polyclonal antibodies were prepared.
  • the specificity of the obtained anti-Eva1 antibody was evaluated by Western blotting.
  • the obtained results are shown in FIG.
  • the antibody according to the present invention is similar to the anti-FLAG tag antibody. It was confirmed that Eva1 protein (hEva1-2xFLAG) to which 2xFLAG tag was bound could be detected.
  • Eva1 protein (hEva1-2xFLAG) to which 2xFLAG tag was bound could be detected.
  • pcDNA3 a cell-derived protein that expressed only the control vector
  • the antibody according to the present invention is a small amount of Eva1 protein expressed in the cell, like the anti-FLAG tag antibody. It was confirmed that can be specifically detected.
  • Example 2 ⁇ Expression of Eva1 in glioma stem cells>
  • glioma stem cells NSCL61, OPCL61, hGIC1, hGIC2
  • normal cells NSC, OPC, NB (neuroblast, neural stem cells)
  • eva1 is expressed in mouse-derived glioma stem cells (NSCL61, OPCL61) and human-derived glioma stem cells (hGIC1, hGIC2), it is expressed in OPC and NB. Negligible expression was also observed in NSC.
  • mouse-derived glioma stem cells (NSCL61) and human-derived glioma stem cells (hGIC1, hGIC2) express Eva1, but in normal cells (NSC). Very little expression was observed.
  • Example 3 ⁇ Expression of Eva1 in glioma tissue and glioma cell line>
  • RT-PCR was performed to examine the expression of Eva1 at the mRNA level in the glioma tissue removed by surgery.
  • the examined glioma tissues are as follows: GBM: glioblastoma multiform, glioblastoma multiforme (WHO diagnostic criteria grade 4) AO: Anaplastic oligodendroglio, anaplastic oligodendroglioma (WHO diagnostic criteria grade 3) AOA: Anaplastic oligo-astrocytoma, anaplastic oligodendrocyte astrocytoma (grade 3 of WHO diagnostic criteria) OLI: Oligodendroglioma oligodenoma (WHO diagnostic criteria grade 2) In addition to the glioma tissue, RT-PCR was also performed on normal brain tissue (NB: Normal brain or CB: Control human brain) and hGIC used in Example 2. The obtained results are shown in FIG.
  • RT-PCR was performed to examine the expression of Eva1 at the mRNA level in human GBM-derived glioma cell lines and rat glioma cell lines.
  • the examined glioma cell lines are as follows: T98G: human glioma cells (see Stein et al., J. Cell. Physiol., 1979, Vol. 99, pages 43-54)
  • Tp483 human glioma cells (see Law et al., Cancer Genet Cytogene. 2005, 160, 1-14)
  • SF126 human glioma cells (see Rosenblum et al., Pharmacol., 1981, Vol. 6, pp.
  • eva1 was expressed in most GBM tissues examined, and the expression of eva1 was confirmed in several GBM-derived glioma cell lines.
  • Example 4 ⁇ Expression of Eva1 in glioma stem cells and glioma cell lines>
  • Eva1 was strongly expressed in human glioma stem cells (hGIC1 and hGIC2). However, in the glioma cell line, expression of Eva1 could not be detected by FACS.
  • glioma stem cells can easily have the same pathological findings as actual brain tumors. It is known to be found.
  • Eva1 that is not expressed in normal tissues of the adult brain but highly expressed in glioma stem cells and glioma tissues (particularly GBM) is not only used as a marker for glioma. It can be used as a therapeutic target.
  • Eva1 can be used for prognosis of glioma patients (predicting postoperative survival rate and survival time of glioma patients) because it is highly expressed in such a specific expression, particularly in GBM. Can be considered. The following examples will verify these possibilities.
  • Example 5 ⁇ Inhibition of tumor cell mass formation of glioma stem cells by anti-Eva1 antibody>
  • As a characteristic of glioma stem cells it is known to form a non-adherent tumor cell mass (sphere) when cultured in a serum-free medium (Vescovi et al., Nature Reviews CANCER, June 2006, Vol. 6, No. 6, pages 425-436). Therefore, the effect of anti-Eva1 antibody on tumor cell mass formation of glioma stem cells was examined.
  • hGIC1 or hGIC2 was cultured for 5 days in NSC medium (serum-free) supplemented with 10 ⁇ g / ml anti-Eva1 antibody (or rabbit IgG as a control antibody).
  • NSC medium serum-free
  • the obtained cell mass was lightly pipetted and subjected to observation with an inverted phase contrast microscope. The obtained result is shown in FIG.
  • the antibody according to the present invention inhibited tumor cell mass formation of glioma stem cells.
  • Example 6 ⁇ Cytotoxicity assay using anti-Eva1 antibody>
  • a cytotoxicity assay using Rab-ZAP was performed. The obtained result is shown in FIG.
  • Rab-ZAP is an anti-rabbit IgG antibody to which ribosome-inactivating protein saporin is bound. Therefore, when rabbit IgG that is bound to a cell and Rab-ZAP bind, saporin is introduced into the cell, resulting in cell death.
  • the antibody according to the present invention can be used in a method for delivering a desired substance (for example, Rab-ZAP) to glioma.
  • a desired substance for example, Rab-ZAP
  • Example 7 RNA (Eva1shRNA) that binds to the transcript of the Eva1 gene according to the present invention can suppress cell proliferation of glioma stem cells by knocking down the expression of Eva1 protein.
  • Eva1 shRNA can suppress tumor formation of glioma stem cells. That is, human glioma stem cells in which Eva1 shRNA was constitutively expressed were transplanted into the brain of nude mice (intracranial cell transplantation), and the tumor formed in the brain 20 days after the transplantation was observed, and the size of the tumor was determined. Measured. As a control, human glioma stem cells in which shRNA against the EGFP gene was constantly expressed were transplanted into the skull. The obtained results are shown in FIGS.
  • RNA that binds to the transcript of the Eva1 gene according to the present invention can also suppress cell proliferation and tumor formation of glioma stem cells by knocking down the expression of Eva1 protein and suppressing its function. Became.
  • Example 8 ⁇ Verification of the inhibitory effect of a molecule that suppresses the function of the Eva1 gene on tissue infiltration of glioma> Whether a molecule that suppresses the function of the Eva1 gene according to the present invention can suppress tissue infiltration of glioma was verified using a peptide having a dominant-negative trait with respect to the Eva1 protein.
  • a gene encoding the extracellular region of Eva1 protein (1 to 150 amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2) is inserted into the pEF-Fc plasmid vector, and the extracellular region of Eva1 protein and human IgG A plasmid capable of expressing a fusion protein with Fc (Eva1-IgG-Fc) in cells was prepared (for the pEF-Fc plasmid vector, see “Suda et al., J Exp Med., 1994, 179, Pp. 873-879)).
  • this plasmid was introduced into mouse-derived glioma stem cells (NSCL61) to establish an NSCL61 cell line (NSCL61 + Eva1-IgG-Fc) that constantly expresses Eva1-IgG-Fc. Then, the established cells, NSCL61 cells (NSCL61 + Eva1shRNA) constitutively expressing Eva1shRNA, or NSCL61 cells (NSCL61 + controlshRNA) constitutively expressing control shRNA are transplanted into the skull and transplanted. Tumors formed in the brain around 3 weeks from the beginning were observed. The obtained result is shown in FIG.
  • glioma stem cells (NSCL61 + control shRNA) were confirmed to form invasive GBM in the ventricle of all transplanted mice.
  • glioma stem cells in which a molecule that suppresses the function of the Eva1 gene (Eva1-IgG-Fc or Eva1shRNA) was constantly expressed formed tumors frequently outside the ventricles.
  • a molecule that suppresses the function of the Eva1 gene can suppress not only cell proliferation of glioma stem cells and tumor formation but also tissue infiltration of GBM.
  • Example 9 ⁇ Correlation between Eva1 expression and survival rate of glioma patients> Whether the prognosis of glioma patients can be diagnosed was examined using the expression of Eva1 as an index. That is, using the National Cancer Institute's brain tumor database REMBRANT (REposition for Molecular BRA Neoplasma DaTa), we investigated whether there is a correlation between the expression of Eva1 mRNA in patient-derived glioma and the survival rate of the patient. It was. The obtained result is shown in FIG.
  • glioma stem cells can be transformed into tumorigenic endothelial cells (“Ricci-Vitiani, L. et al., Nature, 2010, 468, 824-828”, “Wang, R. et al., Nature, 2010, 468, 829-833 ”), and expression of Eva1 and the endothelial cell marker: CD31 in human glioma stem cells (hGSC1 and hGSC2) and human primary cultured GBM cells. Analysis was performed by immunostaining. The obtained results are shown in FIG. In addition, expression of Eva1 and CD31 in glioma derived from glioma stem cells (hGSC2 or NSCL61) was analyzed by immunostaining. The obtained result is shown in FIG.
  • CD31 protein which is an endothelial marker, was expressed in Eva1-positive cells both in vitro (FIG. 21) and in vivo (FIG. 22).
  • GBM glioblastoma multiforme
  • AA anaplastic astrocytoma, anaplastic astrocytoma
  • AOA anaplastic astrocytoma
  • AO anaplastic oligodendroglioma
  • CB The expression of ceacam1 and the like in normal brain tissue
  • hGSC was analyzed by RT-PCR. The obtained results are shown in FIG.
  • Ceacam1 was not expressed in normal brain tissue, but was found to be expressed in glioma stem cells and mainly GBM.
  • Example 12 Similarly to Eva1, whether or not prognosis of glioma patients can be diagnosed using the expression of Ceacam1 as an index was verified. That is, using the brain cancer database REMBRANT of the National Cancer Institute of the United States, the presence or absence of a correlation between the expression of Ceacam1 in the patient-derived glioma at the mRNA level and the survival rate of the patient was examined. The obtained result is shown in FIG.
  • Example 13 The intracellular localization of Ceacam1 was analyzed by immunostaining. The obtained result is shown in FIG. In addition, the localization of Ceacam1 in the tissue was analyzed by immunostaining. The obtained results are shown in FIGS.
  • Ceacam1 was expressed on the cell surfaces of NSCL61 and hGSC.
  • Ceacam1 positive cells are present in human primary GBM tissues (GBM1 and GBM2).
  • GBM1 and GBM2 human primary GBM tissues
  • Ceacam1 is a tumor mass (Tumor mass). It was also revealed that it is mainly present on the invasion hGSC rather than on the hGSC.
  • Ceacam1 splicing variants include Ceacam-S composed of an N-terminal variable Ig-like region, a conserved transmembrane region and a short cytoplasmic domain, and an N-terminal variable Ig-like region, a conserved transmembrane region and a long cytoplasm. It is known that Ceacam-L composed of domains exists.
  • Ceacam1-S and Ceacam6 that are both expressed in malignant tumors can block the inhibitory signal of Ceacam1-L by inhibiting Ceacam1-L homodimer formation and increasing its angiogenic activity.
  • Mculler, MM et al., J. Cell Biol., 2009, 187, 569-581, Singer, BB et al., PLoS One, 2010, 5, e8747 have also been reported. .
  • Ceacam-S mainly Ceacam1-L was expressed in human glioma stem cells.
  • both variants were expressed in mouse glioma stem cells.
  • Ceacam6 was expressed in hGSC and all human malignant gliomas.
  • Example 15 In order to examine the relationship between the expression of Ceacam1-S, Ceacam1-L, and Ceacam6 in glioma and the malignancy or antitumor activity of the tumor shown in Example 14, ceacam1sh was overexpressed in glioma stem cells. The obtained results are shown in FIG. In addition, Ceacam1-L was forcibly expressed in glioma stem cells. The obtained results are shown in FIGS.
  • glioma can be examined and treated with Eva1 and / or Ceacam1 as a target, and a desired substance can be delivered to glioma. Therefore, the present invention can greatly contribute particularly to the medical field for glioma.

Abstract

　グリオーマに特異的に発現する分子を標的としたグリオーマの治療方法、検査方法及び所望の物質をグリオーマに送達させる方法、並びにそれらの方法に用いられる薬剤等を提供することを目的とし、Ｅｖａ１やＣｅａｃａｍ１を標的としてグリオーマの治療及び検査を行うことや、所望の物質をグリオーマに送達させることが可能であることを見出した。

Description

グリオーマの治療方法、グリオーマの検査方法、所望の物質をグリオーマに送達させる方法、及びそれらの方法に用いられる薬剤
　本発明は、グリオーマの治療方法、グリオーマの検査方法、所望の物質をグリオーマに送達させる方法、及びそれらの方法に用いられる薬剤に関し、より詳しくは、Ｅｖａ１及び／又はＣｅａｃａｍ１を標的としたグリオーマの治療方法、検査方法及び所望の物質をグリオーマに送達させる方法に関する。また、本発明は、それらの方法に用いられる薬剤に関する。
　グリオーマは、神経幹細胞、神経系前駆細胞及び神経膠細胞（グリア細胞）から発生する腫瘍の総称であり、日本の原発性脳腫瘍の約２５％を占める脳の悪性腫瘍の代表格である。また、グリオーマは各々由来する細胞に応じて、星細胞系腫瘍、乏突起膠細胞系腫瘍、乏突起星細胞系腫瘍、上衣系腫瘍などに分類され、さらに、ＷＨＯが定める臨床的悪性度によってグレード１～４に評価される。なお、グレード４が最も悪性度が高く予後の悪い腫瘍であり、特にグレード３及び４の腫瘍は悪性グリオーマと称されている。
　この悪性グリオーマにおいては、この数十年間、手術を基本として放射線治療及び化学療法を補助療法とする治療がほとんど変わっておらず、特に中枢神経系組織における悪性グリオーマのうち最も悪性度の高い多形神経膠芽腫（ＧＢＭ、ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）に対しては有効な治療法は未だ見出されていない。
　このため、グリオーマに対する治療や診断の標的となりうる新規な分子の探索が進められており、これまでに、例えば、ＤＢＣＣＲ１Ｌ遺伝子がオリゴデンドロサイト由来のグリオーマに特異的に発現していることが報告されている（特許文献１）。
　一方、一回膜貫通型の細胞膜タンパク質であるＥｖａ１（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｖ－ｌｉｋｅ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＭＰＺＬ２とも称される）は、細胞骨格系に関わる分子であり、胸腺等で発現していることが知られている。また、このタンパク質は、肺小細胞癌（ＳＣＣ）、転移性肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）、膵がん、乳頭状甲状腺癌等において発現していることが報告されている（非特許文献１～４）。
　しかしながら、Ｅｖａ１とグリオーマとの関係については、これまで何ら報告されていない。
　また、Ｃｅａｃａｍ１（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１、ＣＡＲＣＩＮＯＥＭＢＲＹＯＮＩＣ　ＡＮＴＩＧＥＮ－ＲＥＬＡＴＥＤ　ＣＥＬＬ　ＡＤＨＥＳＩＯＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＥ　１）は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ファミリーのメンバーであり、他のＣＥＡタンパク質との同種結合及び異種結合を介して細胞接着を調節することが知られている。さらに、Ｃｅａｃａｍ１は、細胞増殖、免疫細胞の細胞毒性に対する阻害、ＶＥＧＦによって誘導される血管形成、アポトーシス、転移、並びに先天免疫応答及び適応免疫応答の調節にも関与していると考えられている（非特許文献５～６）。
　また、Ｃｅａｃａｍ１のスプライシングバリアントの一つであるＣｅａｃａｍ１－Ｌは、その細胞質尾部に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｍｏｔｉｆ）をコードしており、このモチーフを介して腫瘍抑制活性を発揮することが示されている（非特許文献５～７）。その一方で、Ｃｅａｃａｍ１－Ｌの発現が肺、大腸及び甲状腺の癌において亢進しているという報告もある（非特許文献８～１１）。
　このように、肺癌等においてＣｅａｃａｍ１はどのような機能を発揮しているかはっきりしておらず、ことグリオーマとの関連性については十分に分析されていないのが現状である。
特開２００９－２３２７０５号公報
Ｄｉｆｉｌｉｐｐａｎｔｏｎｉｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、３９巻、１９３６～１９４７ページ Ｐｉｙｕｓｈら、Ｃｅｌｌ、２００９年、１３８巻、６４５～６５９ページ Ａｒｕｍｕｇａｍら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、２００９年、６９巻、１４号、５８２０～５８２８ページ Ｊａｒｚａｂら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、２００５年、６５巻、４号、１５８７～１５９７ページ Ｋｕｅｓｐｅｒｔ，Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２００６年、１８巻、５６５～５７１ページ Ｇｒａｙ－Ｏｗｅｎ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年、６巻、４３３～４４６ページ Ｈｕｂｅｒ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、２７４巻、３３５～３４４ページ Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１９８９年、１０８巻、２６７～２７６ページ Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、２０００年、６巻、２９８８～２９９３ページ Ｌｉｕ，Ｗ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００７年、２６巻、２７４７～２７５８ページ Ｇａｕｒ，Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ、２００８年、７巻、４６
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、グリオーマに特異的に発現する分子を見出し、当該分子を標的としたグリオーマの治療方法、検査方法及び所望の物質をグリオーマに送達させる方法、並びにそれらの方法に用いられる薬剤等を提供することにある。
　本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｅｖａ１遺伝子がグリオーマに特異的に発現しており、Ｅｖａ１遺伝子の機能を抑制する分子（抗Ｅｖａ１タンパク質抗体、Ｅｖａ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ）によって、グリオーマ細胞の増殖能、腫瘍形成能及び組織浸潤能、並びにグリオーマ幹細胞の腫瘍塊形成能が抑制できることを見出した。また、本発明者は、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体を用いて、グリオーマ幹細胞に所望の物質を送達しうることも見出した。さらに、本発明者は、脳腫瘍データベースを用いた調査から、グリオーマ患者の生存率とその患者由来のグリオーマにおけるＥｖａ１遺伝子の発現との間には強い相関があることも見出した。
　また、本発明者は、グリオーマ幹細胞においてＥｖａ１の発現を抑制することにより、多数の遺伝子の発現パターンが変動することを見出した。さらに、Ｅｖａ１の発現を抑制することにより顕著な発現低下が認められたＣｅａｃａｍ１遺伝子に着目し、鋭意研究を重ねた。その結果、Ｃｅａｃａｍ１は正常な脳の組織では発現していないものの、グリオーマ幹細胞やグリオーマ（主にＧＢＭ）において高発現しており、さらに、脳腫瘍データベースを用いた調査から、グリオーマ患者の生存率とその患者由来のグリオーマにおけるＣｅａｃａｍ１遺伝子の発現との間には強い相関があることも見出した。また、Ｃｅａｃａｍ１－Ｌの発現を増強することにより、グリオーマ幹細胞の悪性度は亢進する一方で、Ｃｅａｃａｍ１の発現を抑制すると、グリオーマの悪性度が低下することも本発明者は明らかにした。
　これら知見に基づき、本発明者は、Ｅｖａ１やＣｅａｃａｍ１を標的としてグリオーマの治療及び検査を行うことや、所望の物質をグリオーマに送達させることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）対象における、Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能を抑制する、グリオーマの治療方法。
（２）Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分とする、グリオーマの治療薬。
（３）Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能を抑制する分子が、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載の分子である、（２）に記載の治療薬。
（ａ）抗Ｅｖａ１タンパク質抗体
（ｂ）Ｅｖａ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド
（ｃ）Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ
（ｄ）抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体
（ｅ）Ｃｅａｃａｍ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド
（ｆ）Ｃｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ
（４）対象における、Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の発現を検出する、グリオーマの検査方法。
（５）Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の発現産物に結合する分子を有効成分とする、グリオーマの検査薬。
（６）抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体のうちの少なくともいずれか１つの抗体を有効成分とする、（５）に記載の検査薬。
（７）所望の物質が結合された抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び所望の物質が結合された抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体のうちの少なくともいずれか１つの抗体を対象に投与する、所望の物質を対象におけるグリオーマに送達させる方法。
（８）抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体のうちの少なくともいずれか１つの抗体を有効成分とする、所望の物質を対象におけるグリオーマに送達させるための薬剤。
　本発明によれば、Ｅｖａ１やＣｅａｃａｍ１を標的としてグリオーマの治療及び検査を行うことや、所望の物質をグリオーマに送達させることが可能となった。
ヒトＥｖａ１（ｈＥｖａ１）アミノ酸配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列）及びマウスＥｖａ１（ｍＥｖａ１）アミノ酸配列（配列番号４に記載のアミノ酸配列）のアライメントを示す図である。図中、下線が引かれているアミノ酸配列は、抗Ｅｖａ１抗体の抗原として用いた合成ペプチドの配列（８６～１０２アミノ酸）であることを示す。また、太字はシグナル配列（１～２０アミノ酸）であることを示し、四角で囲んだ箇所は膜貫通ドメイン（１５２～１７５アミノ酸）であることを示し、矢印はシステイン残基を指し示す。 ＦＬＡＧタグを融合させたｈＥｖａ１タンパク質を用いたウェスタンブロッティングにより、抗Ｅｖａ１抗体を評価した結果を示す写真である。なお、抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いた分析の結果は抗Ｅｖａ１抗体を用いた分析の結果の陽性対照であり、抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた分析の結果を内部標準（ローディングコントロール）とした。 マウスグリオーマ幹細胞及びヒトグリオーマ幹細胞におけるＥｖａ１の発現を、ＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお、ｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。 ＮＳＣＬ６１及びｈＧＩＣにおけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中緑色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは５０μｍを示す。 ＮＳＣＬ６１由来の腫瘍におけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中赤色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し（真ん中の２パネル　参照）、図中緑色に発光している部分はＧＦＰの発現を示し（左側の２パネル　参照）、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは２００μｍを示す。なお、ＧＦＰはＮＳＣＬ６１を樹立するために導入したベクター内に組み込まれているものであるため、その発現はＮＳＣＬ６１又はＮＳＣＬ６１由来の細胞であることを示している。 ｈＧＩＣ由来の異種移植腫瘍におけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中緑色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは５０μｍを示す。 グリオーマ組織原発性ＧＢＭ（ｐｒｉｍａｒｙ　ＧＢＭ、ｐｒｉｍａｒｙ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、原発性多形性神経膠芽腫）におけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中緑色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは５０μｍを示す。 マウス脳の矢状断面（胎生１８日（Ｅ１８）、生後１日（Ｐ１）、生後１００日（Ｐ１００））におけるＥｖａ１タンパク質の発現を、免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中緑色に発光している部分はＥｖａ１の発現を示し（上から２段目の３パネル　参照）、図中赤色に発光している部分はＮｅｓｔｉｎの発現を示し（一番上の３パネル　参照）、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また、図中「Ｖ」は脳室を示し、スケールバーは５０μｍを示す。 ヒト原発性グリオーマ組織及びヒトグリオーマ幹細胞におけるＥｖａ１の発現を、ＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお、ｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。 グリオーマ細胞株におけるＥｖａ１の発現を、ＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお、ｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。 ｈＧＩＣ及びグリオーマ細胞株のＥｖａ１を免疫染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。図中左側は二次抗体（Ａｌｅｘａ５６８で標識されたヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ抗体）のみを各細胞と反応させたものの結果を示し、図中真ん中はコントロール抗体（ウサギＩｇＧ）のみを各細胞と反応させたものの結果を示し、図中右側は、抗Ｅｖａ１抗体と二次抗体とを各細胞に反応させたものの結果を示す。 抗Ｅｖａ１抗体による腫瘍細胞塊（ｓｐｈｅｒｅ）形成の抑制を示す顕微鏡写真である。図中スケールバーは２００μｍを示す。 抗Ｅｖａ１抗体とＲａｂ－ＺＡＰとの組み合わせによる、細胞障害アッセイの結果を示すグラフである。図中「ｈＧＩＣ１－αＥｖａ１　Ａｂ」は抗Ｅｖａ１抗体とＲａｂ－ＺＡＰとをｈＧＩＣ１に添加した結果を示し、「ｈＧＩＣ２－αＥｖａ１　Ａｂ」は抗Ｅｖａ１抗体とＲａｂ－ＺＡＰとをｈＧＩＣ２に添加した結果を示す。また、「ｈＧＩＣ１－ｃｏｎｔ　Ａｂ」はコントロール抗体（ウサギＩｇＧ）とＲａｂ－ＺＡＰとをｈＧＩＣ１に添加した結果を示し、また「ｈＧＩＣ２－ｃｏｎｔ　Ａｂ」はコントロール抗体（ウサギＩｇＧ）とＲａｂ－ＺＡＰとをｈＧＩＣ２に添加した結果を示す。 Ｅｖａ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡ（Ｅｖａ１ｓｈ）を発現させることにより、ヒト及びマウスグリオーマ幹細胞の増殖は低下したことを示すグラフである。図中、縦軸は５－ｂｒｏｍｏ－２’－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）を取り込んだ細胞（ＢｒｄＵ＋ｃｅｌｌｓ）の割合（％）を示し、コントロールｓｈＲＮＡが発現しているグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ１、ｈＧＩＣ２、又はＮＳＣＬ６１）と比較して、アスタリスクが一つ付されているのはｐ＜０．０５であることを示し、アスタリスクが二つ付されているのはｐ＜０．００１であることを示す。 生体内において、Ｅｖａ１ｓｈを発現させることにより、ｈＧＩＣの腫瘍形成が減少したことを示すマウスの写真である。 Ｅｖａ１ｓｈ又はコントロールｓｈＲＮＡを発現させたｈＧＩＣ１由来の異種移植腫瘍の写真である。 Ｅｖａ１ｓｈ又はコントロールｓｈＲＮＡを発現させたｈＧＩＣ２由来の異種移植腫瘍の写真である。 Ｅｖａ１ｓｈ又はコントロールｓｈＲＮＡを発現させたｈＧＩＣ由来の異種移植腫瘍のサイズ（長径）の測定の結果を示すグラフである。図中「ｃｏｎｔ」はコントロールｓｈＲＮＡを発現させたｈＧＩＣ由来の異種移植腫瘍の結果を示し、「Ｅｖａ１ｓｈ」はＥｖａ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡを発現させたｈＧＩＣ由来の異種移植腫瘍の結果を示す。 コントロールｓｈＲＮＡ、Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡ（Ｅｖａ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡ）、又はＥｖａ１－ＩｇＧ－Ｆｃを発現させたＮＳＣＬ６１由来の腫瘍の写真である。 米国国立がん研究所の脳腫瘍データベース　ＲＥＭＢＲＡＮＴ（ＲＥｐｏｓｉｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢＲＡｉｎ　Ｎｅｏｐｌａｓｉａ　ＤａＴａ）を用いて、患者由来のグリオーマにおけるＥｖａ１のｍＲＮＡレベルでの発現と、その患者の生存率との関連性を調べた結果を示すグラフである。縦軸は「術後のグリオーマ患者の生存率」を、横軸は「グリオーマ患者の術後の調査期間」を示す。 ｈＧＳＣ及びヒト初代培養ＧＢＭ細胞におけるＥｖａ１及びＣＤ３１等の発現を免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中緑色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し（最上段の３枚のパネル　参照）、図中赤色に発光している部分はＣＤ３１の発現を示し（真ん中の段の３枚のパネル　参照）、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは１００μｍを示し、最下段の３枚のパネルは、抗Ｅｖａ１抗体による染色図と、抗ＣＤ３１抗体による染色図と、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２による染色図とを重ね合わせた写真である。 ＮＳＣＬ６１由来のグリオーマ標本及びｈＧＳＣ２由来のグリオーマ標本におけるＥｖａ１及びＣＤ３１等の発現を免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中緑色に発光している部分は抗Ｅｖａ１抗体によって染色された部位を示し、図中赤色に発光している部分はＣＤ３１の発現を示し、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは１００μｍを示す。 東レ３Ｄ－ジーンマウスオリゴチップ２４Ｋ（ＴＯＲＡＹ　３Ｄ－ｇｅｎｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｏｌｉｇｏ　Ｃｈｉｐ　２４ｋ．）を用いて、ＮＳＣＬ６１とｅｖａ１ｓｈ－発現ＮＳＣＬ６１（ＮＳＣＬ６１＋ｅｖａ１ｓｈ）との階層的クラスター分析を行った結果を示す写真である。 ＲＴ－ＰＣＲにより、ＮＳＣＬ６１、ｅｖａ１ｓｈ－発現ＮＳＣＬ６１、ｈＧＳＣ２及びｅｖａ１ｓｈ－発現ｈＧＳＣ２におけるＣｅａｃａｍ１遺伝子等の発現を分析した結果を示す電気泳動の写真である。なおｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。また、「－」はｅｖａ１ｓｈが発現していない細胞であることを示し、「＋」はｅｖａ１ｓｈが発現している細胞であることを示す。 ＮＳＣ、ＮＳＣＬ６１及びｈＧＳＣにおけるｃｅａｃａｍ１、ｆｇｆ５及びｋｒｔ６の発現をＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なおｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。 ヒトｐｒｉｍａｒｙ　ｇｌｉｏｍａ及びｈＧＳＣにおけるｃｅａｃａｍ１、ｆｇｆ５及びｃｅａｃａｍ６の発現をＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なおｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。 米国国立がん研究所の脳腫瘍データベース　ＲＥＭＢＲＡＮＴを用いて、患者由来のグリオーマにおけるＣｅａｃａｍ１のｍＲＮＡレベルでの発現と、その患者の生存率との関連性を調べた結果を示すグラフである。縦軸は「術後のグリオーマ患者の生存率」を、横軸は「グリオーマ患者の術後の調査期間」を示す。 ＮＳＣＬ６１及びｈＧＳＣにおけるＣｅａｃａｍ１の発現を免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中緑色に発光している部分は抗Ｃｅａｃａｍ１抗体によって染色された部位を示し、図中青色に発光している部分はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは１００μｍを示す。 ｐｒｉｍａｒｙ　ＧＢＭ標本（ＧＢＭ１及びＧＢＭ２）におけるＣｅａｃａｍ１の発現を免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中茶色の部分は抗Ｃｅａｃａｍ１抗体によって染色された部位を示す。また図中のスケールバーは１００μｍを示す。 ｈＧＳＣから作製した異種移植腫瘍におけるＣｅａｃａｍ１の発現を免疫染色により分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中赤色に発光している部分は抗Ｃｅａｃａｍ１抗体によって染色された部位を示す（真ん中の段の４枚のパネル　参照）。図中緑色に発光している部分はＧＦＰ発現部位を示し（最上段の４枚のパネル　参照）、図中青色に発光している部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色された細胞内の核を示す。また図中のスケールバーは１００μｍを示し、最下段の４枚のパネルは、抗Ｃｅａｃａｍ１抗体による染色図と、抗ＧＦＰ抗体による染色図と、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２による染色図とを重ね合わせた写真である。さらに図中「Ｉｎｖａｓｉｏｎ」及び「Ｔｕｍｏｒ　ｍａｓｓ」は、異種移植腫瘍の「浸潤」部及び「腫瘍塊」を各々示す。 ｈＧＳＣ、ＮＳＣＬ６１及びＯＰＣＬ６１におけるｃｅａｃａｍ１－ｌ（Ｌ）及びｃｅａｃａｍ１－ｓ（Ｓ）の発現をＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお、図中「Ｍ」はＨｙｐｅｒＬａｄｄｅｒ　１（Ｂｉｏｌｉｎｅ社製）を展開したレーンであることを示す。 ヒトｐｒｉｍａｒｙ　ｇｌｉｏｍａ及びｈＧＳＣにおけるｃｅａｃａｍ１、ｆｇｆ５及びｃｅａｃａｍ６の発現をＲＴ－ＰＣＲにより分析した結果を示す電気泳動の写真である。なおｇａｐｄｈ遺伝子の発現を内部標準とした。 ＦＬＡＧタグ結合Ｃｅａｃａｍ１－Ｌ及び／又はＣｅａｃａｍ１ｓｈＲＮＡを強制発現させたＣｏｓ７細胞を抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。ウェスタンブロッティングは、コントロールベクター（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｖｅｃｔｏｒ）、ＦＬＡＧタグ結合Ｃｅａｃａｍ１－Ｌ発現ベクター（ｃｅａｃａｍ１－２×ＦＬＡＧ）、ｃｅａｃａｍ１ｓｈ発現ベクター（ｃｅａｃａｍ１ｓｈＲＮＡ）をＣｏｓ７細胞に導入し、その導入（トランスフェクション）後２日目に回収した細胞抽出物を用いて行った。なお、抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた分析の結果を内部標準（ローディングコントロール）とした。また「Ｍｏｕｓｅ」はマウスＣｅａｃａｍ１に関しての結果を示し、「Ｈｕｍａｎ」はヒトＣｅａｃａｍ１に関しての結果を示す。 クリスタルバイオレット染色により、ｃｏｎｔｒｏｌｓｈ発現ＮＳＣＬ６１、ｃｅａｃａｍ１ｓｈ発現ＮＳＣＬ６１、、ｃｏｎｔｒｏｌｓｈ発現ｈＧＳＣ６１、ｃｅａｃａｍ１ｓｈ発現ｈＧＳＣの増殖を分析した結果を示す写真である。 ソフトアガーにて、Ｃｅａｃａｍ１発現ｈＧＳＣは、それらの親細胞（ｃｏｎｔ）よりも大きいコロニーを形成したことを示す写真である。 Ｃｅａｃａｍ１発現ｈＧＳＣを注入したマウスの生存曲線（実線）及びそれらの親細胞を注入したマウスの生存曲線（点線）を示すグラフである。 Ｃｅａｃａｍ１発現ｈＧＳＣ由来のグリオーマ標本をヘマトキシリン・エオシン染色にて分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中のスケールバーは１００μｍを示す。
　＜グリオーマの治療方法＞
　本発明は、対象における、Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能を抑制する、グリオーマの治療方法を提供する。
　本発明において「グリオーマ」とは、神経幹細胞、神経系前駆細胞、及び神経膠細胞から発生した腫瘍の総称であり、例えば、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、星細胞腫（アストロサイトーマ）、随芽腫、脳室上位腫、オリゴデンドログリオーマ、脈絡叢乳頭腫、特に退形成アストロサイトーマ、退形成オリゴデンドロアストロサイトーマ、退形成オリゴデンドログリオーマが挙げられるが、これらの疾病に限定されない。
　なお、本発明にかかるグリオーマの治療とは、例えば、グリオーマ細胞の増殖能の抑制、グリオーマ細胞の腫瘍形成能の抑制、グリオーマ細胞の組織浸潤能の抑制、グリオーマ幹細胞の腫瘍塊形成能の抑制、グリオーマにおける血管形成の抑制等を介して行われるものが挙げられる。
　本発明の治療方法における「対象」は、グリオーマ患者である。ヒト以外の動物におけるグリオーマの治療を目的とする場合には、対象は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、鳥等が挙げられる。
　本発明の治療方法における「遺伝子の機能の抑制」は、遺伝子の発現の抑制（転写の抑制、翻訳の抑制）並びに、転写産物（ｍＲＮＡ）及び翻訳産物（タンパク質）の機能の抑制の双方を含む意である。
　本発明において、機能の抑制の対象となる「Ｅｖａ１遺伝子」は、ヒト由来のものであれば典型的には配列番号１に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子であり、マウス由来のものであれば典型的には配列番号３に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このような天然の変異体も、機能の抑制の対象となりうる。
　本発明において、機能の抑制の対象となる「Ｃｅａｃａｍ１遺伝子」は、ＢＧＰ（胆汁糖タンパク質、ＢＩＬＩＡＲＹ　ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ）、ＢＧＰ１（ＢＩＬＩＡＲＹ　ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ　１、）又はＣＤ６６（ＣＤ６６抗原）遺伝子とも称され、ヒトにおいては１９ｑ１３．２に、マウスにおいては７番染色体に座乗している遺伝子である。ヒト由来のものであれば、典型的には、配列番号１３に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ヒトＣｅａｃａｍ１－Ｌ遺伝子）及び配列番号１５に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ヒトＣｅａｃａｍ１－Ｓ遺伝子）である。また、マウス由来のものであれば、典型的には、配列番号１７に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子（マウスＣｅａｃａｍ１－Ｌ遺伝子）及び配列番号１９に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子（マウスＣｅａｃａｍ１－Ｓ遺伝子）である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このような天然の変異体も、機能の抑制の対象となりうる。
　また、後述の実施例において示す通り、ヒトグリオーマ幹細胞においてはＣｅａｃａｍ１－Ｌ遺伝子とＣｅａｃａｍ６遺伝子とが発現していることが明らかになっているため、本発明の治療方法においては、Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子と併せて、Ｃｅａｃａｍ６遺伝子の機能を抑制してもよい。
　なお、本発明において、「Ｃｅａｃａｍ６遺伝子」は、ＮＣＡ（非特異的交差反応性抗原、ＮＯＮＳＰＥＣＩＦＩＣ　ＣＲＯＳＳＲＥＡＣＴＩＮＧ　ＡＮＴＩＧＥＮ）、正常交差反応性抗原（ＮＯＲＭＡＬ　ＣＲＯＳＳＲＥＡＣＴＩＮＧ　ＡＮＴＩＧＥＮ）、ＣＥＡＬ（ＣＥＡ様タンパク質、ＣＥＡ－ＬＩＫＥ　ＰＲＯＴＥＩＮ）遺伝子とも称され、ヒトにおいては１９ｑ１３．２に座乗している遺伝子である。ヒト由来のものであれば、典型的には、配列番号２１に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このような天然の変異体も、機能の抑制の対象となりうる。また、Ｃｅａｃａｍ６遺伝子の機能を抑制する場合には、後述の「Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能の抑制」する場合と同様に、抗Ｃｅａｃａｍ６タンパク質抗体、Ｃｅａｃａｍ６タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、Ｃｅａｃａｍ６遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡを用いて行うことができ、これらの分子は後述の＜グリオーマの治療薬＞の項に記載の方法に沿って調製することができる。
　「Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能の抑制」は、後述の「Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能を抑制する分子（以下、「Ｅｖａ１遺伝子等の機能を抑制する分子」とも称する）」、例えば、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体、Ｅｖａ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体、Ｃｅａｃａｍ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、Ｃｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡを用いて行うことができる。
　当該分子を対象に投与する方法としては、例えば、脳内への直接投与や静脈注射等により行うことができる。Ｅｖａ１遺伝子等の機能を抑制する分子を脳内に直接投与する方法としては、例えば、定位脳手術方法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じてグリオーマに投与する方法が挙げられる。Ｅｖａ１遺伝子等の機能を抑制する分子を脳内に直接投与しない場合には、当該分子に脳関門透過物質を結合させて投与する方法を利用することができるが、これに制限されない。対象がＧＢＭを羅患している生体である場合は、血管新生が生じた脳腫瘍内血管に正常な脳にある脳関門（ＢＢＢ）が形成されていないことから、脳関門透過物質を結合させなくとも、Ｅｖａ１遺伝子等の機能を抑制する分子を静脈注射等によってＧＢＭに送達することができる。
　脳関門透過物質としては、例えば、狂犬病ウィルス由来の２９アミノ酸からなる糖タンパク質（Ｋｕｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年７月５日、４４８巻、３９～４３ページ　参照）が挙げられるが、これに制限されない。
　＜グリオーマの治療薬＞
　本発明は、Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分とするグリオーマの治療薬を提供する。
　「Ｅｖａ１遺伝子等の機能を抑制する分子」としては、例えば、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体、Ｅｖａ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体、Ｃｅａｃａｍ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド、Ｃｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡが挙げられる。
　なお、後述の実施例において示す通り、Ｅｖａ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡやＣｅａｃａｍ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡによってグリオーマの増殖等が抑制されることが明らかになり、ひいてはＥｖａ１遺伝子又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の機能の抑制と、グリオーマの増殖等の抑制との間に因果関係があることも明らかになった。また、抗Ｅｖａ１抗体が、グリオーマ幹細胞の腫瘍細胞塊形成を阻害することが明らかとなった。従って、ｓｈＲＮＡや抗体を含め、これら遺伝子の機能を抑制する分子を用いることにより、グリオーマの増殖等を抑制できることは明白である。
　抗Ｅｖａ１タンパク質抗体又は抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体（以下、「抗Ｅｖａ１タンパク質抗体等」とも称する）としては、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、Ｅｖａ１タンパク質又はＣｅａｃａｍ１タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体などが挙げられる。
　また、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体等には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び、これら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を治療薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。
　本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８－２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，２５５－２５８、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１３，６５－９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ１９９１，２２２，５８１－５９７、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，１５，１４６－１５６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：７２２－７２７、特開平１０－１４６１９４号公報、特開平１０－１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１－２０６３８７号公報、特表平８－５０９６１２号公報、特表平１１－５０５１０７号公報）。
　また、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体等には、望ましい活性（Ｅｖａ１タンパク質又はＣｅａｃａｍ１タンパク質への結合活性、坑グリオーマ活性、及び／又は他の生物学的特性など）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、又はペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、さらに、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６－８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ　＆　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５－４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０－２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ　＆　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，　２１：３４５－３５１（２００８））。
　改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。アミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対象抗体（例えば、本実施例に記載の抗体）と同等であることが好ましい。抗原への結合活性は、例えば、フローサイトメーター、ＥＬＩＳＡ，ウェスタンブロッティング、免疫沈降法等を用いて解析することにより評価することができる。
　さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
　抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ－結合又はＯ－結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失などの公知の方法で行うことができる（特開２００８－１１３６６３、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。
　本発明の治療薬に用いられる抗Ｅｖａ１タンパク質抗体等は、後述の＜グリオーマへの送達方法、グリオーマへの送達のための薬剤＞の項に記載したように、細胞傷害剤などのグリオーマの治療のための物質が結合されていてもよい。このような抗体を用いることにより、いわゆるミサイル療法を行うことが可能である。
　グリオーマの治療薬の有効成分として含有されるＥｖａ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチドとしては、例えば、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列の置換、欠失、付加及び／又は挿入が施されたポリペプチドが挙げられる。好ましくは後述の実施例において示すＥｖａ１タンパク質の細胞外領域からなるペプチドである。
　また、グリオーマの治療薬の有効成分として含有されるＣｅａｃａｍ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチドとしては、例えば、配列番号１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列の置換、欠失、付加及び／又は挿入が施されたポリペプチドが挙げられる。
　グリオーマの治療薬の有効成分として含有されるＥｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ（以下、「Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ等」とも称する）としては、Ｅｖａ１タンパク質若しくはＣｅａｃａｍ１タンパク質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）又は該ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが挙げられる。
　ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）のいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスＤＮＡと、該ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスＤＮＡを含み、該アンチセンスＤＮＡ及び該センスＤＮＡより、それぞれアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させることができる。また、これらのアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡよりｄｓＲＮＡを作製することができる。
　ｄｓＲＮＡの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡ及びセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する構成である。
　また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３’末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。
　また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡ及びセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる構成である。なお、上記ｄｓＲＮＡは、当業者であればそれぞれの鎖を化学合成して調製することも可能である。
　本発明に用いるｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｐｉｎ　ＲＮＡ）が好ましい。ｓｉＲＮＡは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味する。また、ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがスぺーサー配列を配置した１本鎖のＲＮＡであり、細胞内等でセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとの間で水素結合が生じ、スぺーサー配列がヘアピン構造となるもので、該ヘアピン構造が細胞内で切断されることにより、ｓｉＲＮＡとなり得るものを意味する。
　さらに、標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。ｄｓＲＮＡの鎖長は、例えば、１５～４９塩基対であり、好適には１５～３５塩基対であり、さらに好適には２１～３０塩基対である。
　ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定することができる。
　本発明における「Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ等」の他の態様としては、Ｅｖａ１遺伝子の転写産物又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）や、Ｅｖａ１遺伝子の転写産物又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ（リボザイム）をコードするＤＮＡも挙げられる。
　本発明のＥｖａ１遺伝子等の機能を抑制する分子には、上記の脳関門透過物質が結合されていても良い。本発明の治療薬は、Ｅｖａ１遺伝子等の機能を抑制する分子に加え、他の成分を含むことができる。他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩などが挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
　＜グリオーマの検査方法＞
　本発明は、対象における、Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の発現を検出する、グリオーマの検査方法を提供する。
　また、後述の実施例に示す通り、グリオーマ患者の生存率とその患者由来のグリオーマにおけるＥｖａ１遺伝子又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の発現との間に強い相関が見出されたことから、本発明の検査方法によれば、グリオーマに罹患しているか否かの検査のみならず、グリオーマ患者の予後の検査も行うことができる。かかる検査としては特に制限はないが、例えば、図２０又は２７に示したグラフを指標にグリオーマ患者の予後を判定することができる。
　本発明の検査方法における「対象」としては、生体及び生体から分離された試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液など）が挙げられる。「生体」は、グリオーマ患者に限らず、健常者（グリオーマのおそれがある者を含む）であってもよい。ヒト以外の動物におけるグリオーマの検査を目的とする場合には、「生体」としては、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、鳥等の動物である。
　本発明において、発現を検出する「Ｅｖａ１遺伝子」は、ヒト由来のものであれば典型的には配列番号１に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子であり、マウス由来のものであれば典型的には配列番号３に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このような天然の変異体も、検出対象となりうる。
　また、本発明において、発現を検出する「Ｃｅａｃａｍ１遺伝子」は、ヒト由来のものであれば、典型的には、配列番号１３に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ヒトＣｅａｃａｍ１－Ｌ遺伝子）及び配列番号１５に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ヒトＣｅａｃａｍ１－Ｓ遺伝子）である。また、マウス由来のものであれば、典型的には、配列番号１７に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子（マウスＣｅａｃａｍ１－Ｌ遺伝子）及び配列番号１９に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子（マウスＣｅａｃａｍ１－Ｓ遺伝子）である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このような天然の変異体も、検出対象となりうる。
　本発明において「遺伝子の発現を検出する」とは、遺伝子の発現の有無の検出及び発現の程度の検出の双方を含む意である。遺伝子の発現量は、絶対量として又は相対量として把握することができる。相対量を把握する場合には、例えば、用意した標準試料の遺伝子の発現量と比較して判断することができる。「標準試料」は、標的遺伝子を発現しているか否かが事前に特定されている試料である。例えば、既にグリオーマの存在している部位が特定されている病理組織を、本発明の標準試料とすることができる。また、グリオーマに罹患していない組織（正常組織）も、本発明の標準試料とすることができる。
　さらに、本発明において「遺伝子の発現」とは、遺伝子の転写及び翻訳の双方を含む意である。従って、本発明における「遺伝子の発現の検出」には、転写レベル（ｍＲＮＡレベル）及び翻訳レベル（タンパク質レベル）での検出の双方が含まれる。
　本発明における遺伝子の発現の検出には、公知の手法を用いることができる。転写レベルで検出する方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法が挙げられる。また、翻訳レベルで検出する方法としては、例えば、免疫組織化学的染色法、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、イムノブロッティング、抗体アレイ、ｉｎ　ｖｉｖｏ　イメージング等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が挙げられる。本発明においては、簡便性の観点から、翻訳レベルで検出する方法が好ましく、特に抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が好ましい。
　本発明の検査方法においては、標識物質を結合させた抗体を使用することができる。標識物質を結合させた抗体を用いることにより、Ｅｖａ１タンパク質に結合した抗体量又はＣｅａｃａｍ１タンパク質に結合した抗体量を直接測定することができる。また、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法や二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法などの間接的検出方法を利用することもできる。ここで「二次抗体」とは、上記本発明の抗体に特異的な結合性を示す抗体である。例えば、上記本発明の抗体をウサギ抗体として調製した場合には、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体を使用することができる。ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、本発明の抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択し、本発明において使用することができる。二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることも可能である。
　グリオーマの患者を対象として、本発明の方法を実施して得られた情報は、当該患者の病態の評価ないし把握、治療効果の評価などに利用できる。例えば、グリオーマの治療と並行して本発明の方法を実施すれば、結果として得られる情報を基に治療効果を評価することができる。具体的には、薬剤投与後に本発明の方法を実施することで病理組織におけるＥｖａ１遺伝子及び／又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の発現の変化を調べ、Ｅｖａ１遺伝子量及び／又はＣｅａｃａｍ１遺伝子量の増減の推移から治療効果を判定することができる。このように本発明の方法を治療効果のモニターに利用してもよい。
　グリオーマの検査は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む。以下同じ。）によって行われるが、本発明の方法によって得られる、病理組織におけるＥｖａ１遺伝子の発現量及びＣｅａｃａｍ１遺伝子の発現量に関するデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
　＜グリオーマの検査薬＞
　本発明は対象におけるＥｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の発現産物に結合する分子を有効成分とする、グリオーマの検査薬を提供する。
　本発明における「Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の発現産物」とはＥｖａ１遺伝子及び／又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）又は翻訳産物（タンパク質）のことをいう。Ｅｖａ１遺伝子又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物に結合することができる分子としては、例えばＲＴ－ＰＣＲにおいて用いられるプライマー、ＤＮＡマイクロアレイ解析法やノーザンブロッティング等に用いられるプローブが挙げられる。当該分子は、Ｅｖａ１遺伝子又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物の塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドである。好ましくは、Ｅｖａ１遺伝子又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物の塩基配列に相補的な連続する１５塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
　Ｅｖａ１遺伝子又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の翻訳産物に結合することができる分子としては、例えば抗Ｅｖａ１タンパク質抗体、抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体が挙げられる。「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、Ｅｖａ１タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体などが挙げられる。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（Ｅｖａ１タンパク質又はＣｅａｃａｍ１タンパク質、それらの部分ペプチド、又はこれらを発現する細胞など）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、例えば、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられ、組換えＤＮＡ法としては、例えば、上記本発明の抗体又はペプチドをコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法が挙げられる（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。
　本発明の「Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の発現産物に結合する分子」としては、これら分子に標識物質を結合させたものを使用することができる。当該標識を検出することにより、Ｅｖａ１遺伝子の発現産物又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の発現産物に結合したこれら分子の量を直接測定することが可能である。標識物質としては、これら分子に結合することができ、化学的又は光学的方法で検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などが挙げられる。
　本発明の検査方法における対象が生体の場合には、Ｅｖａ１遺伝子の発現産物又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の発現産物に結合する分子の投与は、前記＜グリオーマの治療方法＞の項に記載した方法を選択することができる。
　本発明の検査薬は、Ｅｖａ１遺伝子の発現産物又はＣｅａｃａｍ１遺伝子の発現産物に結合する分子に加え、＜グリオーマの治療薬＞の項で記載した他の成分を含むことができる。
　＜グリオーマへの送達方法、グリオーマへの送達のための薬剤＞
　本発明は、所望の物質が結合された抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び所望の物質が結合された抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体のうちの少なくともいずれか１つの抗体を対象に投与する、所望の物質を対象におけるグリオーマに送達させる方法、並びに、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体のうちの少なくともいずれか１つの抗体を有効成分とする、所望の物質を対象におけるグリオーマに送達させるための薬剤を提供する。
　本発明における「所望の物質」としては特に制限はない。グリオーマの治療目的の場合には、当該物質としては、例えば、細胞傷害剤、特にリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）、すなわち、サポリン、リシン、志賀毒等が挙げられる。グリオーマの検査目的の場合には、当該物質としては、上記の標識物質が挙げられる。グリオーマを標的とした研究開発目的の場合、例えば、グリオーマへの作用を評価するための被験物質が挙げられる。
　所望の物質が結合される「抗Ｅｖａ１タンパク質抗体」及び「抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体」としては、前記＜グリオーマの検査薬＞の項又は＜グリオーマの治療薬＞の項に記載した抗体と同様である。また、所望の物質が結合された抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び／又は所望の物質が結合された抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体を対象に投与する方法としては、前記＜グリオーマの治療方法＞の項に記載した方法を選択することができる。
　グリオーマに送達させるための薬剤は、抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び／又は所望の物質が結合された抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体に加え、＜グリオーマの治療薬＞の項で記載した他の成分を含むことができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例は、以下に記載した実験方法に基づいて行った。
　＜動物及び試薬類＞
　マウスは、理化学研究所　発生・再生科学総合研究センター（ＣＤＢ）の動物資源開発室及び日本チャールズリバー株式会社から入手した。また、マウスに関する全ての実験プロトコールは理研ＣＤＢ動物実験委員会の承認を受けたものである。試薬及び成長因子は、特に記載される場合を除き、シグマアルドリッチジャパン及びぺプロテック社から各々購入した。
　＜細胞培養＞
　マウス神経幹細胞（ＮＳＣ）、マウスＮＳＣＬ６１、及び、ヒトグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ）は、下記文献に記載している通りに調製を行い、ＮＳＣ培地（試薬、ｂＦＧＦ　（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ社製））中で培養した（Ｋｏｎｄｏ　Ｔら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、２００４年、１８巻、２９６３～２９７２ページ、及び、Ｈｉｄｅ　Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、２００９年、６９巻、７９５３～７９５９ページ　参照）。
　また、ＯＰＣＬ６１の樹立は下記の通りに行った。すなわち、先ず、オリゴデンドロ前駆細胞（ＯＰＣ）への分化誘導を、マウス由来のｐ５３欠損神経幹細胞（ｐ５３－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ＮＳＣ）をＯＰＣ培地（試薬、ＰＤＧＦＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、及び０．２５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ））を用いて培養することによって行った後、イムノパニング（ｉｍｍｕｎｏｐａｎｎｉｎｇ、Ｋｏｎｄｏ　Ｔら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、２００４年、１８巻、２９６３～２９７２ページ　参照）を逐次行うことによって精製した。そして、得られたＯＰＣ　２×１０６個を、ＨＲａｓの恒常的活性型（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｆｏｒｍ）及びＧＦＰをコードしているｐＣＭＳ－ＥＧＦＰ－ＨＲａｓＬ６１　１０μｇを含有するマウスＮＳＣ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（ＬＯＮＺＡ社製）１００μｌ中に懸濁した。そして、このプラスミドベクターを遺伝子導入装置（製品名：Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ＬＯＮＺＡ社製）を用いてＯＰＣに導入した。遺伝子導入されたＯＰＣを、最適化した培地中で培養し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリー（製品名：ＪＳＡＮセルソーター、ベイバイオサイエンス株式会社製）を用いて単離した。
　グリオーマ（神経膠芽腫）細胞株（Ｃ６、Ｔ９８Ｇ、Ｔｐ４８３、ＳＦ１２６、Ｕ８７、及び、Ｕ２５１）は１０％　ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ペニシリンＧ、及び、１００ｕｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＤＭＥＭ中で維持した。Ｅｖａ１染色に関しては、細胞をＮＳＣ培地中で７日間培養し、フローサイトメトリーを用いて解析した。ＳＦ１２６はＨＳ研究資源バンクより購入した。
　＜蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）＞
　ｈＧＩＣ及びグリオーマ細胞株は、ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）、及びＡｌｅｘａ５６８で標識されたヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製、１／４００に希釈して使用）によって免疫標識した。そして免疫標識した細胞は、ＪＳＡＮセルソーター（ベイバイオサイエンス株式会社製）を通し、二波長の励起光（４８８ｎｍ固体レーザー及び６３８ｎｍ半導体レーザー）を用いて分析した。なお、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性細胞（例えば、死細胞）は、この分析から除外した。
　＜免疫染色＞
　解剖したマウスの脳を、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定した。固定後、１２～１８％スクロース含有ＰＢＳを用いて脳を凍結保護し、ＯＣＴコンパウンド中に包埋した。そして、大脳皮質から冠状切片（厚さ１０μｍ）を調製した。なお、Ｅｖａ１は、ＨｉｓｔｏＶＴ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を、その使用説明書に従って用いて賦活化した。次に、抗体を浸透させるために、切片は０．３％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳをもって前処理し、次いでブロッキング溶液（２％　スキムミルク、，０．３％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＰＢＳ）中で１時間処理した。そして、一次抗体とともに４℃で１６時間インキュベーションした。固定した細胞の免疫染色は下記文献に記載の通りに行った（Ｋｏｎｄｏ　Ｔ，ら、ＥＭＢＯ　Ｊ、２０００年、１９巻、１９９８～２００７ページ　参照）。また、以下の抗体は細胞内抗原を検出するのに用いた。
ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）
マウス由来の抗ラットＮｅｓｔｉｎモノクローナル抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、１／４００に希釈して使用）
ラット由来の抗ＧＦＰモノクローナル抗体（ナカライテスク社製、１／５００に希釈して使用）
マウス由来の抗ＣＤ３１モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社製、１／２００に希釈して使用）
マウス由来の抗Ｃｅａｃａｍ１モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製、１／５０に希釈して使用）
これらの抗体は、Ａｌｅｘａ５６８標識ヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製、１／４００に希釈して使用）、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ若しくは抗ラットＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製、１／４００に希釈して使用）、又はＣｙ３標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製、１／４００に希釈して使用）を用いて検出した。また、核を可視化するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１μｇ／ｍｌ）により、細胞を対比染色した。
　＜ヒト脳腫瘍＞
　ヒト由来のグリオーマ幹細胞であるｈＧＩＣ（ｈＧＩＣ１及びｈＧＩＣ２）は、「Ｈｉｄｅ　Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、２００９年、６９巻、７９５３～７９５９ページ」に記載のものを用いた。また、ヒト由来のｐｒｉｍａｒｙ　ＧＢＭ（ｐｒｉｍａｒｙ　Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、原発性多形神経膠芽腫）組織、ヒト原発性グリオーマ組織は、熊本大学医学部脳外科教室より提供を受けた。そして、これらのヒト由来の試料は、理研ＣＤＢ及び熊本大学大学院医学教育部の倫理委員会での承認を得て、それぞれの研究ガイドラインに従って使用した。なお、ｈＧＩＣ、ｈＧＩＣ１及びｈＧＩＣ２は各々ｈＧＳＣ、ｈＧＳＣ１及びｈＧＳＣ２とも称する。
　また、これらの試料から、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて調製し、ｃＤＮＡはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いて合成した。
　また、パラフィン包埋したヒト脳腫瘍は厚さ６μｍの切片に調製した。そして、Ｅｖａ１染色に関しては、ＨｉｓｔｏＶＴ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を、その使用説明書に従って用いて、抗原を賦活化した。次に、切片は５％スキムミルク含有ＴＰＢＳ中にて室温下で３０分間前処理し、ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体（１／５０に希釈して使用）と共に室温下で２時間インキュベーションし、次いで、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製、１／４００に希釈して使用）を用いて免疫染色を行った。また、全ての核を可視化するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１μｇ／ｍｌ）により、細胞を対比染色した。
　＜ヌードマウスの脳への頭蓋内細胞移植＞
　ＮＳＣＬ６１及びｈＧＩＣは５μｌの培地中に懸濁し、そして前もって１０％ペントバルビタールで麻酔をかけておいた５～８週齢の雌ヌードマウスの脳内に注入した。注入部位の定位座標は、ラムダから２ｍｍ前方、矢状縫合から２ｍｍ後方、５ｍｍの深部とした。
　＜ＲＴ－ＰＣＲ＞
　ＲＴ－ＰＣＲは下記文献に記載の通りに行った（Ｋｏｎｄｏ　Ｔ，ら、ＥＭＢＯ　Ｊ、２０００年、１９巻、１９９８～２００７ページ　参照）。サイクルパラメーターは、９４℃で２０秒、５７℃で３０秒、７２℃で３５秒の３５サイクルとした。なお、ｇａｐｄｈの増幅に関しては、９４℃で１５秒、５３℃で３０秒、７２℃で９０秒の２２サイクルとした。また、各遺伝子の増幅には、表１に示すオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成して用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜ベクターの構築＞
　全長マウスｅｖａ１は、マウスＮＳＣ　ｃＤＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲ及びＫＯＤｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、使用説明書に従って増幅し、そしてｐＭＯＳＢｌｕｅベクター（ロシュ社製）にクローニングした。なお、ヌクレオチド配列はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｋｉｔ　ｖｅｒｓｉｏｎ３．１（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＡＢＩシークエンサーモデル３１３０ｘｌ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて確認した。そして、マウスｅｖａ１ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３－２ｘＦＬＡＧ－ｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入し、ｐｃＤＮＡ３－ｅｖａ１－２ｘＦＬＡＧ－ｃを得た。
　なお、全長マウスｅｖａ１ｃＤＮＡを増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した。
５’プライマー：５’－ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＴＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＧＣ－３’（配列番号：７）
３’プライマー：５’－ＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＧＴＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＡＡＣＡ－３’ （配列番号：８）。
　また、ヒト及びマウスｃｅａｃａｍ１－Ｌ　ｃＤＮＡフラグメントを各々ｐｃＤＮＡ３－２ｘＦＬＡＧベクターに挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１－ｈｃｅａｃａｍ１－Ｌ－２ｘＦＬＡＧ－ｃ及びｐｃＤＮＡ３．１－ｍｃｅａｃａｍ１－Ｌ－２ｘＦＬＡＧ－ｃを得た。
　なお、全長マウスｃｅａｃａｍ１－Ｌ　ｃＤＮＡフラグメントを増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した。
５’プライマー：５’－ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡ－３’（配列番号：７１）
３’プライマー：５’－ＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡ－３’（配列番号：７２）。
　また、全長ヒトｃｅａｃａｍ１－Ｌ　ｃＤＮＡフラグメントを増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した。
５’プライマー：５’－ＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣ－３’（配列番号：７３）
３’プライマー：５’－ＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＴＡ－３’（配列番号：７４）。
　また、マウスｅｖａ１、ヒトｅｖａ１、マウスｃｅａｃａｍ１及びヒトｃｅａｃａｍ１をノックダウンするために、これらのヘアピン配列をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ　ｓｉＲＮＡ　Ｗｉｚａｒｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｒｎａｗｉｚａｒｄ．ｃｏｍ／）を用いて作製し、ｐｓｉＲＮＡ－ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ　Ｇ１発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）に各々挿入し、ｐｓｉＲＮＡ－ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ－ｍｅｖａ１ｓｈ、ｐｓｉＲＮＡ－ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ－ｈｅｖａ１ｓｈ、ｐｓｉＲＮＡ－ｈ７ＳＫ－ｍＣＣ１ｓｈ及びｐｓｉＲＮＡ－ｈ７ＳＫ－ｈＣＣ１ｓｈを得た。
　なお、マウスｅｖａ１の標的配列は、５’－ＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＡＧＡＴＧＴＴ－３’（配列番号：９）であり、ヒトｅｖａ１の標的配列は、５’－ＧＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＣＴＴＣＴＣＴ－３’（配列番号：１０）であり、本実施例において、これらのベクターから発現されたＥｖａ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡを「Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡ」、「Ｅｖａ１ｓｈ」又は「ｅｖａ１ｓｈ」と称する。
　マウスｃｅａｃａｍ１の標的配列は、５’－ＧＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＴＡＧＡ－３’（配列番号：７５）であり、ヒトｃｅａｃａｍ１の標的配列は、５’－ＧＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＧＴＣＡＡＡＴＴＧＴ－３’（配列番号：７６）である。また、本実施例において、これらのベクターから発現されたＣｅａｃａｍ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡを「ｃｅａｃａｍ１ｓｈＲＮＡ」又は「ｃｅａｃａｍ１　ｓｈ」と称する。
　コントロールｓｈＲＮＡ（ＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｈＲＮＡ）の標的配列は、５’－ＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡ－３’（配列番号：１１）である。
　また、トランスフェクションは、Ｈｉｄｅ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、２００９年、６９巻、７９５３～７９５９ページ、Ｈｉｄｅ，Ｔ．ら、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、２０１１年、２９巻、４号、５９０～５９９ページに記載した通り、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ社製）を用いて、その製造会社の説明書に従って行った。
　＜細胞毒性アッセイ＞
　細胞毒性アッセイは、ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクロ―ナル抗体、及び、リボソーム不活化タンパク質　サポリンが結合している抗ウサギＩｇＧ抗体（製品名：Ｒａｂ－ＺＡＰ、ＡｄｖａｎｃｅｄＴａｒｇｅｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、使用説明書に従って行った。すなわち、ウサギ由来のコントロールＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）又は抗Ｅｖａ１抗体を、Ｒａｂ－ＺＡＰ（１００ｎｇ）と共に、９６ウェルプレートにおいて、各々室温下で３０分間インキュベートした。５０００個のｈＧＩＣ１を各ウェルに播種し、ＣＯ２インキュベーター内において、３７℃で２日間培養した。細胞の生存率は下記文献に記載の通りにＭＴＴアッセイによって測定した（Ｈｉｄｅ　Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、２００９年、６９巻、７９５３～７９５９ページ　参照）。
　＜遺伝子マイクロアレイ分析＞
　ＤＮＡマイクロアレイ分析は、３Ｄ－Ｇｅｎｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｏｌｉｇｏ　ｃｈｉｐ　２４ｋ（検出遺伝子数：２３，５２２、東レ社製）を用いて行った。分析に用いたトータルＲＮＡは、アミノアリルメッセージＡＭＰ　ＩＩ　ａＲＮＡ増幅キット（Ａｍｉｎｏ　Ａｌｌｙｌ　Ｍｅｓｓａｇｅ　ＡＭＰ　ＩＩ　ａＲＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＣｙ５標識した。そして、得られたＣｙ５標識ａＲＮＡプールを製造会社のプロトコール（ｗｗｗ．３ｄ－ｇｅｎｅ．ｃｏｍ）に従ってマイクロアレイにハイブリダイズした。また、ハイブリダイゼーションシグナルはスキャンアレイエクスプレススキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｓｃａｎｎｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてスキャンし、得られたデータはＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏバージョン５．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて処理した。さらに、各スポットの生データは、９５％信頼区間における全ブランクスポットのシグナル強度によって決定されたバックグラウンドシグナルの平均強度に置換することによって正規化した。そして、生データの強度において、バックグラウンドシグナル強度の２標準偏差（ＳＤ）より大きいものを有効と評価した。また、各遺伝子おいて検出されたシグナルはグローバルノーマライゼーション（ｇｌｏｂａｌ　ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）法によって正規化した（検出されたシグナル強度の中央値を２５になるように調整した）。
　＜ウェスタンブロッティング＞
　ウェスタンブロッティングは、下記文献に記載の通りに行った（Ｔａｋａｎａｇａ　Ｈ，ら、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、２００９年、２７巻、１６５～７４ページ　参照）。なお、ウェスタンブロッティングの分析には、ｐｃＤＮＡ３－ｅｖａ１－２ｘＦＬＡＧ－ｃ等をＣｏｓ７細胞にトランスフェクションすることにより導入し、そのトランスフェクションの２日後に細胞から抽出したタンパク質を供した。また、ブロットしたメンブレンを、ウサギ由来の抗Ｅｖａ１抗体（１／５００に希釈して使用）、マウス由来の抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製、１／１０００に希釈して使用）、又はマウス由来の抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、１／１０００に希釈して使用）を用いてプローブした。さらに、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を検出のために用いた。
　＜統計解析＞
　ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍバージョン４ソフトウェアを用い、カプラン・マイヤー法によって、有意性について生存データを解析した（ｐ値はＬｏｇ－ｒａｎｋ検定を用いて算出した）。
　（実施例１）
　＜ペプチド抗体の作製＞
　先ず、本発明にかかる抗体（抗Ｅｖａ１抗体）を作製した。すなわち、先ずヒト由来のＥｖａ１タンパク質（ｈＥｖａ１、配列番号２の細胞外領域（１～１５０アミノ酸）から、抗原として８６～１０２アミノ酸（ＰＭＳＧＲＦＫＤＲＶＳＷＤＧＮＰＥ、配列番号１２、図１参照）を抗原として選択した。次に選択したアミノ酸配列からなる合成ペプチドを作製し、これを用いてウサギに免疫付与した。そして、かかるウサギから血清を採取し、ペプチドアフィ二ティーカラムを用いて精製して、ウサギ由来の抗Ｅｖａ１ポリクローナル抗体を調製した。
　また、得られた抗Ｅｖａ１抗体の特異性はウェスタンブロッテングにより評価した。得られた結果は図２に示す。図２に示した結果から明らかなように、ｐｃＤＮＡ３－ｅｖａ１－２ｘＦＬＡＧ－ｃが導入されたＣｏｓ７細胞由来のタンパク質を用いたウェスタンブロッテングにおいては、本発明にかかる抗体は抗ＦＬＡＧタグ抗体同様に、２ｘＦＬＡＧタグが結合されたＥｖａ１タンパク質（ｈＥｖａ１－２ｘＦＬＡＧ）を検出できることが確認された。また、コントロールベクター（ｐｃＤＮＡ３）のみを発現させた細胞由来のタンパク質を用いたウェスタンブロッテングにおいては、本発明にかかる抗体は、Ｅｖａ１以外のタンパク質を非特異的に検出しないことも確認された。さらに、ｈＥｖａ１　ｓｈＲＮＡによってｈＥｖａ１－２ｘＦＬＡＧの発現が抑制されている細胞由来のタンパク質を用いたウェスタンブロッテングにおいては、本発明にかかる抗体は抗ＦＬＡＧタグ抗体同様に、細胞内に発現した少量のＥｖａ１タンパク質を特異的に検出できることが確認された。
　（実施例２）
　＜グリオーマ幹細胞におけるＥｖａ１の発現＞
　グリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１、ＯＰＣＬ６１、ｈＧＩＣ１、ｈＧＩＣ２）及び正常細胞（ＮＳＣ、ＯＰＣ、ＮＢ（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔ、神経幹細胞））におけるＥｖａ１のｍＲＮＡレベルでの発現を調べるため、ＲＴ－ＰＣＲを行った。得られた結果を図３に示す。
　また、これらの細胞におけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、抗Ｅｖａ１抗体を用いた免疫染色を行った。得られた結果を図４に示す。さらに、ＮＳＣ６１又はｈＧＩＣをヌードマウスの脳に移植することによって形成されたグリオーマにおけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、抗Ｅｖａ１抗体を用いた免疫染色を行った。得られた結果を図５～６に示す。また、ヒト由来のｐｒｉｍａｒｙ　ＧＢＭ組織におけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、抗Ｅｖａ１抗体を用いた免疫染色を行った。得られた結果を図７に示す。
　さらに、マウスの脳の発生過程におけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、マウス脳の矢状断面（胎生１８日（Ｅ１８）、生後１日（Ｐ１）、生後１００日（Ｐ１００））を、抗Ｅｖａ１抗体及び抗Ｎｅｓｔｉｎ（神経幹細胞のマーカータンパク質）抗体を用いた免疫染色を行った。得られた結果を図８に示す。
　図３に示した結果から明らかなように、マウス由来のグリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１、ＯＰＣＬ６１）及びヒト由来のグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ１、ｈＧＩＣ２）ではｅｖａ１は発現しているものの、ＯＰＣ及びＮＢにおいては発現しておらず、ＮＳＣにおいてもごくわずかな発現しか認められなかった。また、図４に示した結果からも明らかなように、マウス由来のグリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１）及びヒト由来のグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ１、ｈＧＩＣ２）ではＥｖａ１は発現しているものの、正常な細胞（ＮＳＣ）においてはごくわずかな発現しか認められなかった。
　さらに、図５～７に示した結果から明らかなように、ヌードマウス脳内に形成されたグリオーマ幹細胞由来の腫瘍組織、及びヒト由来のｐｒｉｍａｒｙ　ＧＢＭ組織においても、Ｅｖａ１の発現が確認された。特に、ＮＳＣＬ６１由来の腫瘍組織においては、腫瘍組織全体よりも腫瘍辺縁部において、Ｅｖａ１を高発現している細胞が存在していることが確認された。
　また、図８に示した結果から、Ｅｖａ１の発現は発生段階（Ｅ１８、Ｐ１）の脳の神経幹細胞に限局して検出され、成体（Ｐ１００）の脳においてはその発現は消失していることが明らかになった。これは、図３及び図４に示した結果と一見矛盾しているようにも思われるが、図３及び図４で使用したＮＳＣは長期間（３カ月以上）試験管内で培養しているため、図８に示した成体（Ｐ１００）の脳における神経幹細胞と同様に、Ｅｖａ１の発現は、図３及び図４で使用したＮＳＣにおいて低下したことが考えられる。
　（実施例３）
　＜グリオーマ組織及びグリオーマ細胞株におけるＥｖａ１の発現＞
　次に、実施例２において明らかになったグリオーマ組織におけるＥｖａ１の発現を詳細に調べるために、外科手術で取り除かれたグリオーマ組織におけるＥｖａ１のｍＲＮＡレベルでの発現を調べるためＲＴ－ＰＣＲを行った。なお、調べたグリオーマ組織は下記の通りである
　ＧＢＭ：ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、多形神経膠芽腫（ＷＨＯ診断基準のグレード４）
　ＡＯ：Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ、退形成性乏突起膠腫（ＷＨＯ診断基準のグレード３）
　ＡＯＡ：Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ｏｌｉｇｏ－ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ、退形成性乏突起星細胞腫（ＷＨＯ診断基準のグレード３）
　ＯＬＩ：Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ、乏突起膠細胞腫（ＷＨＯ診断基準のグレード２）
　また、前記グリオーマ組織と併せて、正常脳組織（ＮＢ：Ｎｏｒｍａｌ　ｂｒａｉｎ又はＣＢ：Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ）、及び、実施例２において用いたｈＧＩＣについても、ＲＴ－ＰＣＲを行った。得られた結果を図９に示す。
　さらに、ヒトＧＢＭ由来のグリオーマ細胞株及びラットグリオーマ細胞株におけるＥｖａ１のｍＲＮＡレベルでの発現を調べるため、ＲＴ－ＰＣＲを行った。なお、調べたグリオーマ細胞株は下記の通りである
　Ｔ９８Ｇ：ヒトグリオーマ細胞（Ｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９７９年、９９巻、４３～５４ページ　参照）
　Ｔｐ４８３：ヒトグリオーマ細胞（Ｌａｗら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅｔ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．、２００５年、１６０巻、１～１４ページ　参照）
　ＳＦ１２６：ヒトグリオーマ細胞（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８１年、６巻、２２７～２３５ページ　参照）
　Ｕ８７：ヒトグリオーマ細胞（Ｃｌａｒｋら、ＰＬｏＳ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０年、６巻、１号、ｅ１０００８３２　参照）
　Ｕ２５１：ヒトグリオーマ細胞（Ｂｉｇｎｅｒら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９８１年、４０巻、２０１～２２９ページ　参照）
　Ｃ６：ラットグリオーマ細胞（Ｂｅｎｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６８年、１６１巻、３７０～３７１ページ　参照）
　また、前記グリオーマ細胞株と併せて、実施例２において用いたＮＳＣ、ＮＳＣＬ６１、及びｈＧＩＣ２、並びにＮＳＣＬ６１の基となったｐ５３－／－ＮＳＣ（ｐ５３欠損神経幹細胞）についても、ＲＴ－ＰＣＲを行った。得られた結果を図１０に示す。
　図９及び図１０に示した結果から明らかなように、ｅｖａ１は調べた殆どのＧＢＭ組織において発現しており、また、いくつかのＧＢＭ由来のグリオーマ細胞株においてもｅｖａ１の発現は確認された。
　（実施例４）
　＜グリオーマ幹細胞及びグリオーマ細胞株におけるＥｖａ１の発現＞
　次に、ヒトグリオーマ幹細胞及びヒトグリオーマ細胞株におけるＥｖａ１のタンパク質レベルでの発現を調べるため、抗Ｅｖａ１抗体を用いたＦＡＣＳによる分析を行った。なお陰性対照として、二次抗体（Ａｌｅｘａ５６８で標識されたヤギ由来の抗ウサギＩｇＧ抗体）のみを各細胞と反応させたもの、コントロール抗体（ウサギＩｇＧ）のみを各細胞と反応させたものを用意し、ＦＡＣＳにて分析を行った。得られた結果を図１１に示す。
　図１１に示した結果から明らかなように、Ｅｖａ１はヒトグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ１及びｈＧＩＣ２）において強く発現していることが確認された。しかしながら、グリオーマ細胞株においては、Ｅｖａ１の発現をＦＡＣＳにて検出することはできなかった。
　なお、一般的にグリオーマ細胞株を脳内に移植しても実際の脳腫瘍と同じ病理的所見を見つけることは出来ず、一方、グリオーマ幹細胞においては、実際の脳腫瘍と同様の病理的所見を容易に見つけられることが知られている。
　従って、実施例２～４の記載の通り、成体の脳の正常組織では発現せず、グリオーマ幹細胞及びグリオーマ組織（特にＧＢＭ）において高発現しているＥｖａ１は、グリオーマのマーカーとしての利用のみならず、これらの治療標的としても利用できることが考えられる。また、このような特異的な発現、特にＧＢＭにおいて高発現しているということから、Ｅｖａ１はグリオーマ患者の予後診断（グリオーマ患者の術後の生存率並びに生存期間を予測すること）にも利用できることが考えられる。以下の実施例において、これらの可能性について検証する。
　（実施例５）
　＜抗Ｅｖａ１抗体による、グリオーマ幹細胞の腫瘍細胞塊形成の阻害＞
　グリオーマ幹細胞の特徴として、無血清培地中で培養した際に非接着性の腫瘍細胞塊（スフィア）を形成することが知られている（Ｖｅｓｃｏｖｉら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ＣＡＮＣＥＲ、２００６年６月、６巻、６号、４２５～４３６ページ　参照）。そこで、抗Ｅｖａ１抗体によるグリオーマ幹細胞の腫瘍細胞塊形成への影響を調べた。すなわち、ｈＧＩＣ１又はｈＧＩＣ２を、１０μｇ／ｍｌ　抗Ｅｖａ１抗体（又はコントロール抗体として、ウサギＩｇＧ）を添加したＮＳＣ培地（無血清）中にて５日間培養した。得られた細胞塊は、軽くピペッティング処理を施して、位相差倒立顕微鏡による観察に供した。得られた結果を図１２に示す。図１２に示した結果から明らかなように、本発明にかかる抗体によって、グリオーマ幹細胞の腫瘍細胞塊形成は阻害された。
　（実施例６）
　＜抗Ｅｖａ１抗体を用いた細胞毒性アッセイ＞
　本発明にかかる抗体がグリオーマへのデリバリー方法に用いることが可能かどうかを検証するため、Ｒａｂ－ＺＡＰを用いた細胞毒性アッセイを行った。得られた結果を図１３に示す。なお、Ｒａｂ－ＺＡＰはリボソーム不活化タンパク質　サポリンが結合している抗ウサギＩｇＧ抗体である。そのため、細胞に結合しているウサギＩｇＧと、Ｒａｂ－ＺＡＰとが結合すると、該細胞にサポリンが導入されることにより、細胞死が生じることになる。
　図１３に示した結果から明らかなように、ｈＧＩＣ１及びｈＧＩＣ２において、コントロール抗体（ｃｏｎｔ　Ａｂ）とＲａｂ－ＺＡＰとをこれら細胞の培地中に添加したものよりも、抗Ｅｖａ１抗体（αＥｖａ１　Ａｂ）とＲａｂ－ＺＡＰとを添加したものの方が生存率は低かった。また、その生存率は添加した抗体の濃度依存的に低くなった。
　従って、本発明にかかる抗体は、所望の物質（例えば、Ｒａｂ－ＺＡＰ）をグリオーマに送達させる方法に用いることができるということが実証された。
　（実施例７）
　＜Ｅｖａ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡの、グリオーマ幹細胞の細胞増殖並びに腫瘍形成に対する抑制効果の検証＞
　本発明にかかるＥｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ（Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡ）がＥｖａ１タンパク質の発現をノックダウンすることにより、グリオーマ幹細胞の細胞増殖を抑制することが可能かどうかを検証した。すなわち、Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ－ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ－ｍｅｖａ１ｓｈ又はｐｓｉＲＮＡ－ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ－ｈｅｖａ１ｓｈ）を導入したヒト由来又はマウス由来のグリオーマ幹細胞の細胞増殖を、５－ｂｒｏｍｏ－２’－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）を取り込んだ細胞（ＢｒｄＵ＋ｃｅｌｌｓ）の割合（％）を指標に評価した。得られた結果を図１４に示す。
　また、Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡ（Ｅｖａ１ｓｈ）がグリオーマ幹細胞の腫瘍形成を抑制することが可能かどうかを検証した。すなわち、Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡを恒常的に発現させたヒトグリオーマ幹細胞をヌードマウスの脳に移植（頭蓋内細胞移植）し、移植してから２０日間後に脳内に形成された腫瘍を観察、並びにその大きさを計測した。なお、コントロールとして、ＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｈＲＮＡを恒常的に発現させたヒトグリオーマ幹細胞を頭蓋内に細胞移植した。得られた結果を図１５～１８に示す。
　図１４に示した結果から明らかなように、ヒト由来のグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ１、ｈＧＩＣ２）及びマウス由来のグリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１）において、Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡが細胞内に導入されることにより、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞の割合の低下、すなわち増殖可能な細胞の割合が低下することが示された。
　さらに、図１５～１８に示した結果から明らかなように、ヒト由来のグリオーマ幹細胞（ｈＧＩＣ１及びｈＧＩＣ２）において、Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡが細胞内に導入されることにより、コントロールｓｈＲＮＡを導入した場合と比較して、得られた腫瘍の大きさは小さいものだった。
　従って、本発明にかかるＥｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ（Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡ）はＥｖａ１タンパク質の発現をノックダウンして、その機能を抑制することにより、グリオーマ幹細胞の細胞増殖並びに腫瘍形成も抑制できることが明らかになった。
　（実施例８）
　＜Ｅｖａ１遺伝子の機能を抑制する分子の、グリオーマの組織浸潤に対する抑制効果の検証＞
　本発明にかかるＥｖａ１遺伝子の機能を抑制する分子が、グリオーマの組織浸潤を抑制することが可能かどうかを、Ｅｖａ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチドを用いて検証した。すなわち、先ず、ｐＥＦ－Ｆｃプラスミドベクターに、Ｅｖａ１タンパク質の細胞外領域（配列番号２に記載のアミノ酸配列中の１～１５０アミノ酸）をコードする遺伝子を挿入し、Ｅｖａ１タンパク質の細胞外領域とヒトＩｇＧ－Ｆｃとの融合タンパク質（Ｅｖａ１－ＩｇＧ－Ｆｃ）を細胞内にて発現させることができるプラスミドを作製した（ｐＥＦ－Ｆｃプラスミドベクターについては「Ｓｕｄａら、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．、１９９４年、１７９巻、８７３～８７９ページ」参照）。次に、このプラスミドをマウス由来のグリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１）に導入して、Ｅｖａ１－ＩｇＧ－Ｆｃを恒常的に発現するＮＳＣＬ６１細胞株（ＮＳＣＬ６１＋Ｅｖａ１－ＩｇＧ－Ｆｃ）を樹立した。そして、樹立して得られた細胞、Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡを恒常的に発現させたＮＳＣＬ６１細胞（ＮＳＣＬ６１＋Ｅｖａ１ｓｈＲＮＡ）、又はコントロールｓｈＲＮＡを恒常的に発現させたＮＳＣＬ６１細胞（ＮＳＣＬ６１＋ｃｏｎｔｒｏｌｓｈＲＮＡ）を頭蓋内に細胞移植し、移植してから３週間前後に脳内に形成された腫瘍を観察した。得られた結果を図１９に示す。
　図１９に示した結果から明らかなように、グリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１＋ｃｏｎｔｒｏｌｓｈＲＮＡ）は、移植された全マウスの脳室内において浸潤性のＧＢＭを形成することが確認された。一方、Ｅｖａ１遺伝子の機能を抑制する分子（Ｅｖａ１－ＩｇＧ－Ｆｃ又はＥｖａ１ｓｈＲＮＡ）を恒常的に発現させたグリオーマ幹細胞は、脳室外に高頻度に腫瘍を形成することが明らかになった。
　従って、Ｅｖａ１遺伝子の機能を抑制する分子は、グリオーマ幹細胞の細胞増殖並びに腫瘍形成の抑制のみならず、ＧＢＭの組織浸潤をも抑制できることが明らかになった。
　（実施例９）
　＜Ｅｖａ１の発現とグリオーマ患者の生存率との相関＞
　Ｅｖａ１の発現を指標として、グリオーマ患者の予後診断ができるかどうかを検証した。すなわち、米国国立がん研究所の脳腫瘍データベース　ＲＥＭＢＲＡＮＴ（ＲＥｐｏｓｉｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢＲＡｉｎ　Ｎｅｏｐｌａｓｉａ　ＤａＴａ）を用いて、患者由来のグリオーマにおけるＥｖａ１のｍＲＮＡレベルでの発現と、その患者の生存率との相関の有無について調べた。得られた結果を図２０に示す。
　図２０に示した結果から明らかなように。グリオーマにおいてＥｖａ１遺伝子が高発現していた患者の生存期間は予後調査を始めてから５００日以内と短いのに対して、Ｅｖａ１遺伝子が低発現していた患者の術後４０００日における生存率は１００％と高いものであった。
　従って、Ｅｖａ１の発現とグリオーマ患者の生存期間並びに生存率との間には強い相互関係があることが明らかになり、Ｅｖａ１遺伝子の発現を検出することはグリオーマの検査、特にグリオーマ患者の予後診断に有効であることが実証された。
　（実施例１０）
　グリオーマ幹細胞は腫瘍形成性内皮細胞（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ）に分化形質転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）できるという知見（「Ｒｉｃｃｉ－Ｖｉｔｉａｎｉ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年、４６８巻、８２４～８２８ページ」、「Ｗａｎｇ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年、４６８巻、８２９～８３３ページ」）を考慮し、ヒトグリオーマ幹細胞（ｈＧＳＣ１及びｈＧＳＣ２）及びヒト初代培養ＧＢＭ細胞における、Ｅｖａ１と内皮細胞のマーカー：ＣＤ３１との発現を免疫染色法により分析した。得られた結果を図２１に示す。また、グリオーマ幹細胞（ｈＧＳＣ２又はＮＳＣL６１）由来のグリオーマにおける、Ｅｖａ１とＣＤ３１との発現を免疫染色法により分析した。得られた結果を図２２に示す。
　図２１及び２２に示した結果から明らかなように、Ｅｖａ１陽性細胞において、インビトロ（図２１）及びインビボ（図２２）ともに、内皮マーカーであるＣＤ３１タンパク質が発現していることが明らかになった。
　従って、Ｅｖａ１陽性グリオーマ幹細胞（Ｅｖａ１＋　ＧＳＣ）においてＣＤ３１が発現しているというこの結果と、グリオーマ幹細胞（ＧＳＣ）は腫瘍形成性内皮細胞に分化形質転換するという知見等（「Ｒｉｃｃｉ－Ｖｉｔｉａｎｉ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年、４６８巻、８２４～８２８ページ」、「Ｗａｎｇ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年、４６８巻、８２９～８３３ページ」、「Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ、２００７年、１１巻、６９～８２ページ」）から、ＧＢＭにおいてＧＳＣを維持するのに役立っている腫瘍血管ニッチをＥｖａ１＋／ＣＤ３１＋　ＧＳＣが形成していることが示唆された。
　（実施例１１）
　次に、Ｅｖａ１はどのようにしてＧＳＣ悪性腫瘍に影響を与えているかを調べるために、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、ＮＳＣＬ６１とｅｖａ１ｓｈ発現ＮＳＣＬ６１（ＮＳＣＬ６１＋ｅｖａ１ｓｈ）との間の遺伝子発現の差を分析した。得られた結果を図２３に示す。
　その結果、ｅｖａ１ｓｈ発現ＮＳＣＬ６１において、コントロールのＮＳＣＬ６１と比較して、１２０８遺伝子の発現は亢進しており、６５０遺伝子の発現は低下していたことが明らかになった（図２３）。そして、ｅｖａ１の発現抑制に最も影響を受けている遺伝子としてｃｅａｃａｍ１を見出した。
　次に、ｃｅａｃａｍ１を含め、ｅｖａ１ｓｈの発現抑制に影響を受けている遺伝子の発現パターンを、ＮＳＣＬ６１、ｈＧＳＣ２、及びｅｖａ１ｓｈが発現しているこれらの細胞をＲＴ－ＰＣＲにより分析した。得られた結果を図２４に示す。
　また、ｃｅａｃａｍ１のマウス神経幹細胞（ＮＳＣ）及びグリオーマ幹細胞（ＮＳＣＬ６１、ｈＧＳＣ１及びｈＧＳＣ２）におけるｃｅａｃａｍ１等の発現をＲＴ－ＰＣＲにより分析した。得られた結果を図２５に示す。
　さらに、ＧＢＭ（多形神経膠芽腫）、ＡＡ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ、退形成性星細胞腫）、ＡＯＡ（退形成性乏突起星細胞腫）、ＡＯ（退形成性乏突起膠腫）、ＣＢ（正常脳組織）及びｈＧＳＣにおけるｃｅａｃａｍ１等の発現をＲＴ－ＰＣＲにより分析した。得られた結果を図２６に示す。
　図２４に示す通り、ＤＮＡマイクロアレイ分析並びにＲＴ－ＰＣＲ分析によって、Ｃｅａｃａｍ１以外にも、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ　イソ酵素１（ｐｄｋ１）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｐｌａｕ）、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（ｍｍｐ１３）及びプロテインキナーゼＤ１（ｐｒｋｄ１）といった沢山の癌関連遺伝子の発現にＥｖａ１ノックダウンは影響を及ぼすことが明らかになった。そして、これらの因子は、転移、血管形成及び癌細胞の増殖において必須の役割を果たしていることから、ＧＳＣの悪性特性（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ）をＥｖａ１が調整していることが示唆される。
　また、図２５及び２６に示す通り、Ｅｖａ１同様に、Ｃｅａｃａｍ１は正常な脳の組織では発現しておらず、グリオーマ幹細胞や主にＧＢＭにて発現していることが明らかになった。
　（実施例１２）
　Ｅｖａ１同様に、Ｃｅａｃａｍ１の発現を指標としてグリオーマ患者の予後診断ができるかどうかを検証した。すなわち、米国国立がん研究所の脳腫瘍データベース　ＲＥＭＢＲＡＮＴを用いて、患者由来のグリオーマにおけるＣｅａｃａｍ１のｍＲＮＡレベルでの発現と、その患者の生存率との相関の有無について調べた。得られた結果を図２７に示す。
　図２７に示した結果から明らかなように。グリオーマにおいてＣｅａｃａｍ１遺伝子が高発現していた患者の生存期間は予後調査を始めてから５００日以内と短く、Ｃｅａｃａｍ１の発現とグリオーマ患者の予後との間に有意な相関関係が認められた。従って、Ｃｅａｃａｍ１遺伝子の発現を検出することはグリオーマの検査、特にグリオーマ患者の予後診断に有効であることが実証された。なお、図には示さないが、同様の分析において、ｆｇｆ５の発現とグリオーマ患者の予後との間に有意な相関関係が認められなかった。
　（実施例１３）
　Ｃｅａｃａｍ１の細胞内局在を免疫染色にて分析した。得られた結果を図２８に示す。また、Ｃｅａｃａｍ１の組織内局在を免疫染色にて分析した。得られた結果を図２９及び３０に示す。
　図２８に示した結果から明らかなように、ＮＳＣＬ６１及びｈＧＳＣの細胞表面において、Ｃｅａｃａｍ１が発現していることが確認された。また、図２９及び３０に示す通り、ヒトｐｒｉｍａｒｙ　ＧＢＭ組織（ＧＢＭ１及びＧＢＭ２）においてＣｅａｃａｍ１陽性細胞が存在していることが明らかになり、さらに、Ｅｖａ１の場合同様に、Ｃｅａｃａｍ１は腫瘍塊（Ｔｕｍｏｒ　ｍａｓｓ）の中のｈＧＳＣ上よりも、浸潤（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）しているｈＧＳＣ上に主に存在していることも明らかになった。
　（実施例１４）
　Ｃｅａｃａｍ１のスプライシングバリアントには、Ｎ末端可変Ｉｇ様領域、保存された膜貫通領域及び短い細胞質ドメインから構成されているＣｅａｃａｍ－Ｓと、Ｎ末端可変Ｉｇ様領域、保存された膜貫通領域及び長い細胞質ドメインから構成されているＣｅａｃａｍ－Ｌが存在していることが知られている。
　また、悪性腫瘍において共に発現しているＣｅａｃａｍ１－Ｓ及びＣｅａｃａｍ６は、Ｃｅａｃａｍ１－Ｌのホモダイマー形成を阻害し、その血管形成活性を増大させることによって、Ｃｅａｃａｍ１－Ｌの抑制シグナルをブロックすることができるということ（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、２００９年、１８７巻、５６９～５８１ページ、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｂ．Ｂ．ら、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ、２０１０年、５、ｅ８７４７）も報告されている。
　そこで、ヒト及びマウスのグリオーマ幹細胞における、Ｃｅａｃａｍ１－Ｌ及びＣｅａｃａｍ１－Ｓの発現をＲＴ－ＰＣＲにて分析した。得られた結果を図３１に示す。また、悪性グリオーマ及びヒトグリオーマ幹細胞における、Ｃｅａｃａｍ１及びＣｅａｃａｍ６の発現をＲＴ－ＰＣＲにて分析した。得られた結果を図３２に示す。
　図３１に示した結果から明らかなように、ヒトグリオーマ幹細胞においては、Ｃｅａｃａｍ－Ｓではなく、主にＣｅａｃａｍ１－Ｌが発現していた。一方、マウスグリオーマ幹細胞においては、両方のバリアントが発現していた。また、図３２に示した結果から明らかなように、ｈＧＳＣ及び全てのヒト悪性グリオーマにおいて、Ｃｅａｃａｍ６は発現していた。
　（実施例１５）
　実施例１４に示した、Ｃｅａｃａｍ１－Ｓ、Ｃｅａｃａｍ１－Ｌ及びＣｅａｃａｍ６のグリオーマにおける発現と、腫瘍の悪性度又は抗腫瘍活性との関連を調べるために、グリオーマ幹細胞においてｃｅａｃａｍ１ｓｈを過剰発現させた。得られた結果を図３４に示す。また、グリオーマ幹細胞にＣｅａｃａｍ１－Ｌを強制発現させた。得られた結果を図３５～３７に示す。
　なお、本実施例においてｃｅａｃａｍ１の発現を抑制させるために用いたｃｅａｃａｍ１ｓｈ（ｃｅａｃａｍ１ｓｈＲＮＡ）及びＣｅａｃａｍ１－Ｌの発現を亢進させるために用いたＣｅａｃａｍ１－２×ＦＬＡＧの有効性は、図３３に示す通り、マウスにおいてもヒトにおいてもウェスタンブロッティングにより確認している。
　図３４に示した結果から明らかなように、ｃｅａｃａｍ１ｓｈの過剰発現は、ＮＳＣＬ６１及びｈＧＳＣの増殖を阻害した。対照的に、図３５～３７に示した結果から明らかなように、Ｃｅａｃａｍ１－Ｌの強制発現によって、ソフトアガー上でのｈＧＳＣのコロニー形成が増大しただけでなく（図３５　参照）、インビボにおけるｈＧＳＣの悪性度の亢進も認められた（図３６及び３７　参照）。すなわち、Ｃｅａｃａｍ１－Ｌ過剰発現ｈＧＳＣが移植されたマウスの平均生存時間（４８ｄｐ＝０．００４４及び４６ｄ，ｐ＝０．００３９）は、コントロールｈＧＳＣを移植したマウスのそれ（６０ｄ及び６２ｄ）と比較して減少することが明らかになった（図３６　参照）。従って、これらの結果からグリオーマ幹細胞の悪性度にＣｅａｃａｍ１が関与していることが明らかになり、Ｃｅａｃａｍ１もＥｖａ１同様に、グリオーマを治療及び検査するための有効な標的となることが実証された。
　以上説明したように、Ｅｖａ１及び/又はＣｅａｃａｍ１を標的としてグリオーマの検査や治療が可能であり、また、所望の物質をグリオーマに送達させることも可能である。したがって、本発明は特に、グリオーマに対する医療の分野に大きく貢献しうるものである。
配列番号１
＜２２３＞　ヒトＥｖａ１
配列番号３
＜２２３＞　マウスＥｖａ１
配列番号５～８
＜２２３＞　人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号９～１１
＜２２３＞　ｓｈＲＮＡ標的配列
配列番号１３
＜２２３＞　ヒトＣｅａｃａｍ１－４Ｌ
配列番号１５
＜２２３＞　ヒトＣｅａｃａｍ１－４Ｓ
配列番号１７
＜２２３＞　マウスＣｅａｃａｍ１－２Ｌ
配列番号１９
＜２２３＞　マウスＣｅａｃａｍ１－２Ｓ
配列番号２１
＜２２３＞　ヒトＣｅａｃａｍ６
配列番号２３～７４
＜２２３＞　人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号７５～７６
＜２２３＞　ｓｈＲＮＡ標的配列

Claims (8)

  1. 　対象における、Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能を抑制する、グリオーマの治療方法。
  2. 　Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分とする、グリオーマの治療薬。
  3. 　Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の機能を抑制する分子が、下記（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載の分子である、請求項２に記載の治療薬。
    （ａ）抗Ｅｖａ１タンパク質抗体
    （ｂ）Ｅｖａ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド
    （ｃ）Ｅｖａ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ
    （ｄ）抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体
    （ｅ）Ｃｅａｃａｍ１タンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するペプチド
    （ｆ）Ｃｅａｃａｍ１遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ
  4. 　対象における、Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の発現を検出する、グリオーマの検査方法。
  5. 　Ｅｖａ１遺伝子及びＣｅａｃａｍ１遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの遺伝子の発現産物に結合する分子を有効成分とする、グリオーマの検査薬。
  6. 　抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体のうちの少なくともいずれか１つの抗体を有効成分とする、請求項５に記載の検査薬。
  7. 　所望の物質が結合された抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び所望の物質が結合された抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体のうちの少なくともいずれか１つの抗体を対象に投与する、所望の物質を対象におけるグリオーマに送達させる方法。
  8. 　抗Ｅｖａ１タンパク質抗体及び抗Ｃｅａｃａｍ１タンパク質抗体のうちの少なくともいずれか１つの抗体を有効成分とする、所望の物質を対象におけるグリオーマに送達させるための薬剤。
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