JP2009232705A - グリオーマの由来の判別方法およびグリオーマ治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】グリオーマ細胞、特にＧＢＭに特異的に発現する分子を見出し、これをガンの診断や治療等に用いること。
【解決手段】グリオーマ細胞の由来の判別方法であって、グリオーマ細胞におけるＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質またはそのフラグメント、あるいはＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列からの転写物の存在の有無を検出し、グリオーマ細胞がこれらのうちのいずれかを有している場合に、グリオーマ細胞がオリゴデンドロサイト由来であると判別することを特徴とする方法、ならびにＣｏｘ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を含む、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマに対して有効なグリオーマ治療用医薬組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、グリオーマの由来の判別方法に関する。詳細には、本発明は、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質またはそのフラグメントを発現するグリオーマをオリゴデンドロサイト由来であると判別する方法に関する。さらに本発明は、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマを治療するための医薬組成物に関する。該医薬組成物はＣｏｘ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を含む。

グリオーマは日本の原発性脳腫瘍の約２５％を占める脳の悪性腫瘍の代表格である。その中でも悪性グリオーマにおいては、この数十年間、手術を基本として放射線治療および化学療法を補助療法とする治療がほとんど変わっておらず、新しい治療法の確立が待たれている。最近の研究から、中枢神経系組織における悪性グリオーマのうち最も悪性である多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）がガン幹細胞を含むことが示された（非特許文献１−４）。ガン幹細胞は無期限に自己再生を繰り返し、腫瘍を形成する。これまでにガン幹細胞は組織の幹細胞や分化した細胞から生じると予想されてきたが、白血病以外にはどの細胞に由来するか知られていなかった（非特許文献５および６）。

本発明者らは、近年、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）においてＲａｓシグナル経路の活性を調節すると、ガン幹細胞の性質、すなわち、腫瘍、特にグリオーマを形成する能力を示すことを見出した（特許文献１および非特許文献７−１０）。このことは、グリオーマ細胞がオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）に由来することを示唆する。しかしながら、グリオーマ細胞、特にＧＢＭの由来について指標となるものは見出されておらず、グリオーマの由来を判別することは困難であった。
特願２００７−１０９５３９ Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F. & Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature 414, 105-111 (2001). Singh, S. K., Clarke, I. D., Hide, T., & Dirks, P. B. Cancer stem cells in nervous system tumors. Oncogene 23, 7267-7273 (2004). Kondo, T. Brain cancer stem-like cells. Eur. J. Cancer 42, 1237-1242 (2006). Vescovi, A. L., Galli, R., & Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nat. Rev. Cancer 6, 425-364 (2006). Huntly, B. J., & Gilliland, D. G. Leukaemia stem cells and the evolution of cancer-stem-cell research. Nat. Rev. Cancer 5, 311-321 (2005). Krivtsov, A. V., & Armstrong, S. A. MLL translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat. Rev. Cancer 7, 823-833 (2007). Liepelt, U. et al. Differentiation potential of a monoclonal antibody-defined neural progenitor cell population isolated from prenatal rat brain by fluorescence-activated cell sorting. Brain Res. Dev. Brain Res. 51, 267-278 (1990). Johe, K. K. et al. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996). Rao, M. S,, Noble, M. et al., A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3996-4001 (1998). Wang, S. et al. A role for the helix-loop-helix protein Id2 in the control of oligodendrocyte development. Neuron 29, 603-14 (2001).

したがって、本発明の解決課題は、悪性腫瘍、特にグリオーマ細胞に特異的に発現している分子を見出し、これをガンの診断や治療等に用いることであった。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマに特異的なマーカー（ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド）を見出した。さらに本発明者らは、Ｃｏｘ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を組み合わせて用いることにより、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマを効果的に治療できることも見出した。そして本発明者らは、これらの知見から本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は：
（１）グリオーマ細胞の由来の判別方法であって、グリオーマ細胞におけるＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質またはそのフラグメント、あるいはＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列からの転写物の存在の有無を調べ、グリオーマ細胞がこれらのうちのいずれかを有する場合に、グリオーマ細胞がオリゴデンドロサイト由来であると判別することを特徴とする方法、
（２）該ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質またはそのフラグメントが下記アミノ酸配列のいずれか：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメントのアミノ酸配列
を有するものである、（１）記載の方法、
（３）該転写物が配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から転写されるｍＲＮＡである、（１）記載の方法、
（４）該ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質またはそのフラグメントの存在の有無を免疫染色法により調べる、（１）または（２）の方法、
（５）Ｃｏｘ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を含む、オリゴデンドロサイトに由来するグリオーマを治療するための医薬組成物、
（６）Ｃｏｘ２阻害剤がセレコキシブであり、ＥＧＦＲ阻害剤がゲフィチニブである、（５）記載の医薬組成物
を提供する。

本発明によれば、グリオーマ、特に最も悪性である多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）を包含するグリオーマの由来を判定することができ、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマである場合に、Ｃｏｘ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を組み合わせて用いることにより、これを治療することができる。

本発明は、１の態様において、グリオーマ細胞の由来の判別方法であって、グリオーマ細胞におけるＤＢＣＣＲ１Ｌ（Ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｇｉｏｎ １ Ｌｉｋｅ）タンパク質（別名：ＦＡＭ５Ｃタンパク質）またはそのフラグメント、あるいは前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列からの転写物の存在の有無を検出し、グリオーマ細胞がこれらのうちのいずれかを有する場合に、グリオーマ細胞がオリゴデンドロサイト由来であると判別することを特徴とする方法を提供する。本発明の方法により由来を判別できるグリオーマ細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の動物あるいは鳥類のものであり、好ましくはヒトのグリオーマ細胞である。動物対象からの生検試料の取得は公知の手法により行うことができる。

対象において本発明の判別方法を実施する場合には、グリオーマ細胞におけるＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質またはそのフラグメントの存在の有無を検出することができる。対象がヒトである場合には、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するものであってもよく、あるいは配列番号：１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、例えば、１〜９個、好ましくは、１〜５個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；ならびに配列番号：１のアミノ酸配列と５０％以上の相同性、好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上の相同性、より好ましくは８５％以上、９０％以上の相同性、さらに好ましくは９３％、９５％、９７％、あるいは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。すなわち、本明細書においては、上記のようなＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質の変異体もまたＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質に包含されるものとする。また、本発明の判別方法を実施する場合には、グリオーマにおけるＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質のフラグメントの有無を調べてもよい。したがって、本明細書において、特に断らないかぎり、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質という場合には、上記の変異体に加えて、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質のフラグメントも包含するものとする。また、本明細書において、「ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質」を「ＤＢＣＣＲ１Ｌポリペプチド」と言い換えることがある。ここで、本発明におけるフラグメントとは、全長のＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質のポリペプチド鎖の一部分をいう。また、対象がヒト以外の動物、例えば、マウス、ラット、ウシなどの他の動物の場合であっても、それらのＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質は本明細書にいうＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質に包含されうる。

本発明において、グリオーマ細胞におけるＤＢＣＣＲ１Ｌポリペプチドの存在の有無を調べるために、公知の手段・方法を用いることができる。例えば、免疫染色法、蛍光抗体法、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、ＥＬＩＳＡ法、ツーハイブリッドシステムなどの免疫学的なタンパク質の検出方法を含むが、ＤＢＣＣＲ１Ｌポリペプチドを検出できる方法であれば、これらだけに限らない。最も好ましくは免疫染色法である。

また、対象において本発明の判別方法を実施する場合には、グリオーマ細胞におけるＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質（配列番号：１）をコードするヌクレオチド配列から転写された転写物の存在の有無を調べることができる。本発明における転写物とは、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列から転写された産物を意味し、例えば、ｍＲＮＡまたはあらゆる他のタイプのＲＮＡ、ならびにこれらのフラグメントなどであってよい。

本発明において、グリオーマ細胞における上記転写物の存在の有無を調べるために、当業者間で一般的な手法を用いてもよい。例えば、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法、ノ−ザンブロット法、ドットブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法などのポリヌクレオチドの検出法を含んでよい。また、マイクロアレイ（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ、ｍｉｃｒｏＲＮＡマイクロアレイ、プロテインマイクロアレイなど）を用いた遺伝子解析方法を行ってもよいが、これら以外の方法であってもよい。

本発明において、グリオーマとは神経膠細胞から発生した腫瘍の総称である。本発明の判別方法にて由来を判別できるグリオーマは、上述のごとく動物、好ましくはヒトに由来するものであり、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、アストローマ（星細胞腫）、髄芽腫、脳室上位腫、乏突起膠腫、脈絡叢乳頭腫などが例示されるが、これらのグリオーマ細胞に限らない。最も好ましくはＧＢＭである。これまでに、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマ（オリゴデンドログリオーマ）のマーカーとして、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２およびＭｙｅｌｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）が周知であったが、これらのタンパク質または遺伝子はほとんどのＧＢＭにおいて検出されるため、オリゴデンドロサイト由来のＧＢＭのマーカーとして使用できなかった。本発明では、ＤＢＣＣＲ１Ｌをマーカーとして用いることにより、ＧＢＭを包含するオリゴデンドロサイト由来のグリオーマを検出できる点が最大の技術的特徴である。

グリオーマ細胞がＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質、そのフラグメント、または上記転写物を有しているとの判別は、生検試料において、前記タンパク質、そのフラグメント、または転写物が上記方法により腫瘍部位において他の正常部位または正常な時期と比較して高いレベルで検出されることをいい、それらは腫瘍部位のみで検出されることが好ましいが、それ以外の正常部位または正常な時期より高いレベルで検出される場合であってもよい。本発明の判別に用いることができる検出方法として最も好ましいのは免疫染色法であり、免疫染色法にて陽性と判断された場合に、グリオーマ細胞が上記タンパク質またはフラグメントを有していると判別することができる。なお、免疫染色法の手法は当業者によく知られており、当業者は、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質およびそのフラグメントの有無を容易に調べることができる。

また、本発明の判別に用いることができる検出方法として、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法であってもよく、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法にて陽性と判断された場合に、グリオーマ細胞が上記転写物、特にｍＲＮＡを有していると判別することができる。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は当業者間において一般的な手法であり、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列から転写されたｍＲＮＡを容易に検出することができる。

本発明の別の態様では、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマと判別された細胞または部位を除去する工程を含むオリゴデンドロサイト由来のグリオーマの治療方法を提供する。例えば、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質に対する抗体に細胞を除去するための物質を結合させることによりグリオーマ細胞を除去する工程を含んでもよいが、これ以外のグリオーマ細胞を除去する工程を含んでもよい。

本発明の判別方法は、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマを除去または治療した後、すなわち予後において、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマの存在またはその量を判別するためにも使用することができる。

本発明は、もう１つの態様において、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマの治療のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、Ｃｏｘ（シクロオキシゲナーゼ）−２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を含むものである。かかる薬剤の組み合わせは新規である。Ｃｏｘ−２阻害剤として、例えば、セレコキシブ（アステラス製薬）、メロキシカム、バルデコキシブ、パレコキシブ、パレコキシブナトリウム、デコラキシブ、ロフェコキシブ、エトリコキシブ、シミコキシブなどを含んでよいが、これらだけに限定されず、好ましくはセレコキシブである。一方、ＥＧＦＲ阻害剤として、例えば、ゲフィチニブ（アストラゼネカ株式会社）、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＣＩ−１０３３（ファイザー株式会社）、ＧＷ２０１６（グラクソ・スミスクライン株式会社）、ＥＫＢ−５６９（ワイス株式会社）、ＰＫＩ−１６６（ノバルティスファーマ株式会社）、ＣＰ−７２４、７１４（ファイザー株式会社）、およびＢＩＢＸ−１３８２（ベーリンガーインゲルハイム）などであってよいが、これらだけに限定されず、好ましくはゲフィチニブである。本発明におけるＣｏｘ２阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤との組み合わせは、例えば、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、アストローマ（星細胞腫）、髄芽腫、脳室上位腫、乏突起膠腫、脈絡叢乳頭腫などの脳神経系のグリオーマ、特にＧＢＭに対して有効である。

本発明の医薬組成物は、上述のごとく有効成分としてＣｏｘ２阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤の両方を含有する。本発明の医薬組成物は、これらの物質に加えて任意の一般的に使用される制ガン剤や担体などの成分を含有してもよい。本発明の医薬組成物に使用されうる制ガン剤としては、テモゾロマイド、シスプラチンなどが例示されるが、これらだけに限らない。本発明に使用することができる担体は、投与形態および剤形に応じて選択することができ、経口投与用には、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等を使用してもよい。さらに、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。非経口投与用には、公知方法により、希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解または懸濁させ、必要に応じて殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を添加して調製してもよい。

本発明の医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される動物種、患者の年齢、体重、症状によって適宜決定され、一定ではないが、一般には製剤中に含有される有効成分の量が１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の医薬組成物の有効成分であるセレコキシブとゲフィチニブの投与量は、セレコキシブについては、好ましくは１日あたり６０ｍｇ／ｋｇであり、ゲフィチニブについては、好ましくは１日あたり２００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の医薬組成物の投与経路は、経口、非経口（例えば筋肉注射、皮内、腫瘍内、静脈内、又は皮下、又は直接注射）、局所、経皮などを含み、当業者により適宜決定されうるが、好ましくは経口投与である。また、本発明の医薬組成物と従来の制ガン療法、例えば放射線治療や化学療法などを併用してもよい。

次に、下記の実施例に用いた主な材料および方法を示すが、本発明を限定するものではない。

動物および試薬類
動物を理化学研究所発生・再生科学総合研究センター（ＣＤＢ）変異マウス開発チームおよび日本チャールズ・リバー株式会社から得た。全てのマウス実験を理研ＣＤＢの動物管理使用委員会に認可された以下のプロトコールで実施した。遺伝子型の解析を以前に記載した通りにＰＣＲにより行った（Tsukada, T. et al. Oncogene 8, 3313-3322 (1993).）。特に記載がない限り、試薬類および増殖因子をそれぞれＳｉｇｍａおよびＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。

グリオーマ細胞塊の細胞株の樹立
ヒトグリオーマを、以前に記載した通りに、ＰＢＳで２回洗浄し、酵素で解離させ、ヒトグリオーマ細胞塊の細胞株ＧＳＣ１とＧＳＣ２を樹立した（Singh, S.K. et al., Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003)）。ＧＳＣ１は未分化なオリゴデンドロサイト（ＷＨＯグレードＩＩＩ）に由来すると判断されている。次いで、グリオーマ細胞塊をヒトＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、サンタクルーズ、カタログ番号ｓｃ−４３７７）を含有する完全マウスＮＳＣ培地中で培養した。

ヒト脳腫瘍
１１種のＧＢＭ、５種の未分化アストロサイトーマ、５種の未分化オリゴデンドログリオーマ、３種の未分化オリゴアストロサイトーマ、１種のオリゴデンドログリオーマ、１種の毛様細胞性アストロサイトーマ、１種の神経膠肉腫、および２種のＧＳＣ（ＧＳＣ１とＧＳＣ２）を理化学研究所発生・再生科学総合研究センターと熊本大学医学研究科の研究指針に従って使用した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをグリオーマ細胞塊からＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ精製キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて調製し、ｃＤＮＡをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて合成した。

ヌードマウスの脳への頭蓋内細胞移植
コントロール細胞およびトランスフェクト細胞を５μｌの培養培地中に懸濁させ、５〜８週齢の雌のヌードマウスの脳に、１０％ペントバルビタールで麻酔した後に注入した。注入部位の定位はラムダの前方２ｍｍ、矢状縫合の側方２ｍｍおよび深さ５ｍｍであった。

形質転換細胞を注入したマウスへの薬物の経口投与
ＥＧＦＲ阻害剤ゲフィチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ／日、アストラゼネカ株式会社）、およびＣｏｘ−２阻害剤セレコキシブ（６０ｍｇ／ｋｇ／日、アステラス製薬）を、ディスポーザル可動型動物摂食ニードル（フチガミ器械）を用いて手術後毎日経口投与した。

ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲを以前に記載した通りに行った（Kondo, T. & Raff, M. Science 289, 1754-1757 (2000).）。サイクルパラメーターは、９４℃２０秒、５８℃４０秒および７２℃４５秒を３５サイクルであった。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーを合成した：ｄｂｃｃｒ１ｌ用、５’プライマー、５’−ＧＡＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧ−３’（配列番号：２）、３’プライマー、５’−ＣＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＣ−３’（配列番号：３）。

ヒトグリオーマの免疫組織化学的染色
ヒトグリオーマ試料を組織学的解析用にホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した。切片（３μｍの厚さ）をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、ＤＢＣＣＲ１Ｌで免疫標識した。免疫検出をＥｌｉｔｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎ ＡＢＣシステム（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行った。免疫標識した切片をヘマトキシリンで染色することにより核を標識した。

免疫染色法
免疫染色法を以前に記載した通りに実施した（Kondo, T. & Raff, M. Science 289, 1754-1757 (2000).）。ウサギ抗ＤＢＣＣＲ１Ｌ（１：５０；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ）を用いて抗原を検出し、この抗体をヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３（１：４００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。核を可視化するために、細胞を４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１μｇ／ｍｌ）で対比染色した。

統計的解析
生存データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ４ソフトウェアを用いるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により分析して有意性を求めた（ｐ−値をＬｏｇ−ｒａｎｋ検定で計算した）。

以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。

本発明者らは、胚期１３．５日のｐ５３（−／−）マウス（Tsukada, T., et al., Oncogene 8, 3313-3322 (1993)）の脳から細胞を分離し、神経上皮細胞から神経幹細胞（ＮＳＣ）を調製し、次いでこの細胞から一定条件下でアストロサイト（ＡＳＴ）およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）をすでに誘導している（特願２００７−１０９５３９、Liepelt, U. et al., Brain Res. Dev. Brain Res. 51, 267-278 (1990)、Johe, K. K. et al., Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996)、Rao, M. S,, Noble, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3996-4001 (1998)、およびWang, S. et al., Neuron 29, 603-14 (2001)）。さらに本発明者らは、これらの細胞にコントロールベクター（ＧＦＰ）またはＨＲａｓ^Ｌ６１発現ベクターをトランスフェクトし、Ｒａｓ活性とｐ５３欠失の組み合わせがＡＳＴではなくＮＳＣとＯＰＣを形質転換させることを示した（特願２００７−１０９５３９およびBizub, D., Blair, D., Alvord, G. & Skalka, A. M., Oncogene 3, 443-448 (1988)）。ＨＲａｓ^Ｌ６１発現ベクターにより形質転換された細胞をそれぞれＮＳＣ−Ｌ６１、ＡＳＴ−Ｌ６１、ＯＰＣ−Ｌ６１と名付けた（特願２００７−１０９５３９）。インビボへの細胞移植実験、組織学的な観察、および遺伝子発現解析などにより、これらの形質転換された細胞のうちＯＰＣ−Ｌ６１は腫瘍形成能、すなわちガン幹細胞としての性質を有することが示唆された（特願２００７−１０９５３９）。本発明者らは、これらの形質転換された細胞およびヒトグリオーマから樹立させた細胞（ＧＳＣ１とＧＳＣ２）を用いて以下の実験を行った。

本発明者らは、ＮＳＣ−Ｌ６１またはＧＳＣ２ではなく、ＯＰＣ１−Ｌ６１とＧＳＣ１の両方がＯＰＣの新規マーカーであるＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質を発現していることを知見した。まず、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列からのｍＲＮＡの転写がＯＰＣ、ＯＰＣ−Ｌ６１およびＧＳＣ１において行われることを示した（図３）。ここで、ＧＳＣ１はオリゴデンドロサイト由来であると判断されている（ＷＨＯグレードＩＩＩ）。次に、ＤＢＣＣＲ１Ｌのタンパク質レベルにおける発現を免疫染色法を用いて調べ、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質の存在をＮＳＣ−Ｌ６１（図４ａ）およびＧＳＣ２（図４ｄ）では陽性と判断できないのに対して、ＯＰＣ−Ｌ６１（図４ｂ）およびＧＳＣ１（図４ｃ）においては明らかに陽性であると判断できることがわかった。さらに、ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質がＯＰＣ−Ｌ６１とＧＳＣ１でより強く発現されることをＤＢＣＣＲ１Ｌ抗体陽性の細胞数の割合をカウントすることにより定量的に確認した（図５）。以上の結果は、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマがＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質、そのフラグメント、またはＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列からの転写物を有することを示すものである。

次いで、Ｃｏｘ−２シグナル経路およびＥＧＦＲシグナル経路の阻害剤がグリオーマに対して有効性を示すかどうかを調べた。すなわち、かかる組み合わせがＧＢＭに有効であるかどうかを検討するために、ＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣ−Ｌ６１、ＧＳＣ１、およびＧＳＣ２における効果を試験した。ＥＧＦＲ阻害剤ゲフィチニブおよびＣｏｘ−２阻害剤セレコキシブが濃度依存的にＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣ−Ｌ６１およびヒトＧＳＣの増殖を抑制し、この組み合わせが相加効果であることを示したが、コントロールのＮＳＣとＯＰＣにも影響した（図１ａ−ｄ）。次いで、この組み合わせが、インビボにおいて、ＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣ−Ｌ６１またはヒトＧＳＣによって引き起こされる腫瘍形成を阻害するかどうかを調べた。ＯＰＣ−Ｌ６１を注入したマウスの生存時間は、コントロール（２３．０±１．９ｄ）と比較して薬物処理マウス（３４．１±９．５ｄ、ｐ＝０．００５）では有意に長かった。一方、この組み合わせはＮＳＣ−Ｌ６１細胞を注入したマウスには効果がなかった（処理では２１±２．９ｄ ｖｓ コントロールでは１９．７±６．９ｄ）（図２ａとｂ）。さらに、ＧＳＣ１を注入したマウスの生存時間はコントロールマウス（４４．５±３．４ｄ）と比較して薬物処理マウス（５６．２±８．２ｄ、ｐ＝０．００２７）において長くなった。一方、この組み合わせはＧＳＣ２を注入したマウスには効果がなかった（薬物処理マウスでは３７．６±１．１ｄ ｖｓ コントロールでは３４．６±２．９ｄ）（図２ｃとｄ）。これらのデータは、この組み合わせがＤＢＣＣＲ１Ｌ陽性の悪性グリオーマの患者に有効であることを示唆する。

上で説明したように、ＤＢＣＣＲ１Ｌを発現する悪性グリオーマがＣｏｘ−２阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせで処理することに感受性があることを示した。ＥＧＦＲ経路が放射線と化学治療に対する耐性を媒介すること（Nyati, M. K., Morgan, M. A., Feng, F. Y., & Lawrence, T. S., Nat. Rev. Cancer 6, 876-885 (2006).）、セレコキシブが放射線感受性を高めること（Choy, H., & Milas, L., J. Natl. Cancer Inst. 95, 1440-1452 (2003).）が知られている。これらのことから、本発明のＣｏｘ−２阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせが照射／化学治療の効率を上昇させることとあいまって、オリゴデンドロサイト由来のグリオーマの治療に極めて有効であるといえる。それゆえ、本発明は最新かつガン幹細胞特異的な治療の新しい臨床アプローチの可能性を指し示すものである。

本発明は、オリゴデンドロサイトに由来するグリオーマを判別し、それを治療する医薬組成物を提供する。そのため、悪性グリオーマの診断方法、グリオーマの新規治療方法および新薬の開発をはじめとする多くの産業分野において利用可能である。

Ｃｏｘ−２阻害因子とＥＧＦＲ阻害因子の組み合わせがＤＢＣＣＲ１Ｌを発現する悪性グリオーマ細胞による腫瘍形成を遅延させることを示す。形質転換されたグリオーマ細胞（ａ、ｂ中の黒色の柱、ａはＮＳＣ−Ｌ６１、ｂはＯＰＣ−Ｌ６１）、その親細胞（ａ、ｂ中の白色の柱、ａはＮＳＣ、ｂはＯＰＣ）およびヒトグリオーマ細胞塊の細胞株ＧＳＣ１（ｃ）とＧＳＣ２（ｄ）におけるゲフィチニブとセレコキシブの細胞毒性の効果を示す。 Ｃｏｘ−２阻害因子とＥＧＦＲ阻害因子の組み合わせがＤＢＣＣＲ１Ｌを発現する悪性グリオーマ細胞による腫瘍形成を遅延させることを示す。ヌードマウスにＮＳＣ−Ｌ６１（ａ）、ＯＰＣ−Ｌ６１（ｂ）、ＧＳＣ１（ｃ）またはＧＳＣ２（ｄ）を移植し、薬物の組み合わせ（Ｃ＋Ｇ）で処理した後の生存曲線を示す。コントロールマウスには水を投与した（黒色の線）。 ＤＢＣＣＲ１ＬがＯＰＣおよびＯＰＣ由来の悪性グリオーマ細胞で特異的に発現されることを示す。各細胞（ＮＳＣ、ＮＳＣ−Ｌ６１、ＯＰＣ、ＯＰＣ−Ｌ６１、ＧＳＣ１およびＧＳＣ２）において、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＤＢＣＣＲ１Ｌの発現を調べた図である。 ＤＢＣＣＲ１ＬがＯＰＣ由来の悪性グリオーマの新規マーカーであることを示す図である。ＤＢＣＣＲ１Ｌは、ＮＳＣ−Ｌ６１（ａ）とＧＳＣ２（ｄ）に比べてＯＰＣ−Ｌ６１（ｂ）とＧＳＣ１（ｃ）において強く発現される。ＤＢＣＣＲ１Ｌに対する免疫反応性を検出し、核をＤＡＰＩで染色した。 ＤＢＣＣＲ１ＬがＯＰＣ由来の悪性グリオーマの新規マーカーであることを示す図である。マウスグリオーマ幹細胞株（ａ）とヒトＧＳＣ（ｂ）におけるＤＢＣＣＲ１Ｌ陽性細胞の割合をグラフに表した。

SEQ ID NO:2: 5' primer for dbccr1l
SEQ ID NO:3: 3' primer for dbccr1l

Claims (6)

1. グリオーマ細胞の由来の判別方法であって、グリオーマ細胞におけるＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質またはそのフラグメント、あるいはＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列からの転写物の存在の有無を調べ、グリオーマ細胞がこれらのうちのいずれかを有する場合に、グリオーマ細胞がオリゴデンドロサイト由来であると判別することを特徴とする方法。
2. 該ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質またはそのフラグメントが下記アミノ酸配列のいずれか：
   （ａ）配列番号：１のアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
   （ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列；あるいは
   （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列のフラグメントのアミノ酸配列
   を有するものである、請求項１記載の方法。
3. 該転写物が配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から転写されるｍＲＮＡである、請求項１記載の方法。
4. 該ＤＢＣＣＲ１Ｌタンパク質またはそのフラグメントの存在の有無を免疫染色法により調べる、請求項１または２記載の方法。
5. Ｃｏｘ２阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を含む、オリゴデンドロサイトに由来するグリオーマを治療するための医薬組成物。
6. Ｃｏｘ２阻害剤がセレコキシブであり、ＥＧＦＲ阻害剤がゲフィチニブである、請求項５記載の医薬組成物。

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