JP2006506041A - Ｏｘ４０ｒ結合剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＯＸ４０受容体（ＯＸ４０Ｒ）と結合でき、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用を阻害できる、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）細胞外領域から分離されたペプチドを開示する。このようなペプチド、それらを含む融合タンパク質、並びにそれらの配列に基づいてデザインされたペプチドおよびその他の分子は、活性化Ｔ細胞にかかわる疾患の予防および／または治療においてＯＸ４０Ｒ仲介細胞情報伝達をブロッキングするために、天然ＯＸ４０Ｌと競合するＯＸ４０Ｒ結合剤として使用できる。

Description

本発明は、ＯＸ４０受容体とＯＸ４０リガンドとの相互作用を調節できる新しいペプチドに関する。

ＯＸ４０受容体（文献ではＯＸ４０Ｒ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０抗原、ＴＮＦＲＳＦ４、またはＣＤ１３４とも表示される）の膜タンパク質、およびＯＸ４０リガンド（文献ではＯＸ４０Ｌ、糖タンパク質ｇｐ３４、ＡＣＴ−４−Ｌ、ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ１３４リガンド、またはＣＤ１３４Ｌとも表示される）によって構成される細胞調節系は、腫瘍壊死因子リガンド／受容体スーパーファミリーに属するその他のタンパク質と同様、免疫反応の調節、並びに二次リンパ組織の形成において重要な役割を有する（グラベンスタイン（Ｇｒａｖｅｓｔｅｉｎ）Ｌおよびボルスト（Ｂｏｒｓｔ）Ｊ、１９９８；ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）Ａ、２００２）。臨床観察、および例えば遺伝子ターゲティング実験などの動物モデルによって、これらの活動の多くの証拠が提供されている（チェン（Ｃｈｅｎ）Ａら、１９９９、コップ（Ｋｏｐｆ）Ｍら、１９９９；ムラタ（Ｍｕｒａｔａ）Ｋら、２０００）。

ＯＸ４０受容体（以下ＯＸ４０Ｒ）は、ＴＮＦＲファミリーのメンバーの細胞表面抗原であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）結合に続いて一過性に発現され、同時刺激の受容体として働く。これはＴ細胞のための高度に特異的なＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺活性化マーカーと考えられ、多発性硬化症または関節リウマチなどにおけるような、免疫学的病理に関連した炎症部位、並びに腫瘍浸潤リンパ球、および移植片対宿主病の動物モデルの末梢血で過剰発現されることが多い。

ＯＸ４０リガンド（以下、ＯＸ４０Ｌ）は、本来ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１感染症およびＣＤ４０活性化によって刺激されるタンパク質として同定された膜貫通タンパク質であり（ミウラ（Ｍｉｕｒａ）Ｓら、１９９１）、ＴＮＦと構造的類似性を有して細胞結合性または分泌性三量体を形成できる。これは、活性化された抗原提示ＢおよびＴ細胞、並びに樹状細胞、脈管内皮細胞およびその他の非造血性組織（例えば心臓、骨格筋、および膵臓）上に提示される。

ＯＸ４０Ｌは、高親和性（Ｋｄ＝０．２〜０．４ｎＭ）を持つホモ三量体としてＯＸ４０Ｒと相互作用し、このシステムについて様々な結合アッセイが試験されている（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｌら、２００２；テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｌおよびシュヴァルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）Ｈ、２００１；アル−シャムカニ（Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ）Ａら、１９９７）。しかしこれまでに立体構造は解明されておらず、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用の機構に関するさらに詳しい分子の詳細を提供するための詳細な構造−活性度の研究も実施されていない。

ＯＸ４０ＬとＯＸ４０Ｒの間の相互作用は、ＯＸ４０Ｒ発現エフェクターＴ細胞に対して同時刺激効果を有し、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２）によるサイトカイン生成の上方制御と、活性化誘導細胞死の阻害を通じたメモリーＴ細胞の増大した生存とによって、より強い細胞反応をもたらす。機能的ＯＸ４０Ｌ遺伝子が欠損した形質転換マウス、およびＯＸ４０ＲとＯＸ４０Ｌの相互作用のブロッキング、またはＯＸ４０ＲポジティブＴ細胞の枯渇により、自己免疫の臨床的徴候が減少することが実証された己免疫動物モデルにおいて、追認する証拠も得られた。

さらにＯＸ４０ＬはＯＸ４０Ｒ結合時に、Ｃ−ＣケモカインＲＡＮＴＥＳをはじめとするいくつかの遺伝子の発現を誘発し、ＯＸ４０Ｒ-ＯＸ４０Ｌ系が活性化Ｔ細胞血管外遊走の調節に関与するように見える内皮モデルにおいて得られた結果が追認される（コタニ（Ｋｏｔａｎｉ）Ａら、２００２）。

累積的にこれらの発現および機能データは、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用によって制御されるシグナル伝達経路が、抗原特異的増殖性反応を延長する一助になる、さもなければエフェクター／メモリーＴ細胞集団の持続、分化、または再活性化に影響するかもしれない可能性を高める。

ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ系に対する関心は、細胞内情報伝達機構が未だ完全に理解されていなくとも、ＯＸ４０Ｒの発現プロフィールによってこのタンパク質が、例えば自己反応性Ｔ細胞を除去することが必要な多発性硬化症のような臨床状況において、ＣＤ４⁺Ｔ細胞仲介疾患のための特有のターゲットになるという事実に関連している。仮説では、ＯＸ４０Ｒの活性度を調節する生成物は、全てのＴ細胞をターゲットとする、自己免疫疾患および移植拒絶反応に対する従来の免疫抑制療法の重篤な副作用を有さないかもしれないとされる。

ＯＸ４０ＬとＯＸ４０Ｒの間の相互作用を調節する治療上の可能性は、ＯＸ４０Ｌ標的免疫毒素（ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）Ａら、１９９６）、抗ＯＸ４０Ｒ抗体（バンサル−パカラ（Ｂａｎｓａｌ−Ｐａｋａｌａ）Ｐら、２００１）、抗ＯＸ４０Ｌ抗体（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６；ヨシオカ（Ｙｏｓｈｉｏｋａ）Ｙら、２０００；ツカダ（Ｔｓｕｋａｄａ）Ｎら、２０００）、およびＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ融合タンパク質（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ＬＭら、１９９９；ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）Ａら、１９９９）を用いて得られた、生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）生じた結果によって認識された。これらの化合物は、（炎症部位での活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の蓄積を防止するため）ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用に拮抗する、あるいは（癌などのその他のいくつかの病的病状におけるように）ＯＸ４０Ｒを活性化することのいずれかが意図される。

ＯＸ４０Ｒの作用薬または拮抗剤のいずれかである様々なＯＸ４０Ｒ結合剤が、免疫付与および癌治療に対してポジティブな効果を有するものとして、先行技術で開示されている（国際公開第９５／２１９１５号パンフレット；国際公開第９５／２１２５１号パンフレット；欧州特許第９７８２８７号明細書；国際公開第９９／４２５８５号パンフレット；国際公開第０２／６６０４４号パンフレット；米国特許明細第６３１２７００号明細書）。しかし実際には、ＯＸ４０Ｌ全細胞外領域または抗体などの大型分子のみが、効果的なＯＸ４０Ｒ結合剤であるとして開示される。これはまた、この相互作用を特性決定するための実際の構造−活性度研究が実施されておらず、その他のＴＮＦ／ＴＮＦＲタンパク質構造分析から信頼できる情報を推論することもできないという事実に起因する（ボードマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ＪＬら、２００２）。

既知のＯＸ４０Ｒ結合剤は、治療上および診断上の作用物質として有用であることが立証されているので、上述の大型分子の結合およびＯＸ４０Ｌ競合特性を維持して、生成するのがより容易な化合物を同定し、ペプチドまたはその他の小型分子を開発することが望ましいであろう。

ＯＸ４０Ｌ細胞外領域に由来する特異的ペプチドが、ＯＸ４０Ｒ結合剤として使用できることが今や発見されている。より具体的には、２つの異なる信頼できるスクリーニング技術によって示されるように、ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸９４〜１２４に対応するペプチド、並びにヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸１０７〜１１６を含むこのペプチドの断片が、高い親和性でヒトＯＸ４０Ｒと相互作用することが見いだされた。このようなペプチド、それらの配列を含む異種のタンパク質、並びにそれらの配列に基づいてデザインされたペプチドおよびその他の分子は、異なる治療上の用途のために、天然ＯＸ４０Ｌと競合するＯＸ４０Ｒ結合剤として使用できる。本発明のその他の特徴と利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

先行技術で開示された証拠に照らして、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用を阻害するためのＯＸ４０Ｒ結合剤として有用たり得る、ＯＸ４０Ｌ細胞外領域中への特異的ペプチド配列の指摘はない。

ＯＸ４０Ｌ細胞外領域に由来する一連のペプチドをスクリーニングすることで、高い親和性でＯＸ４０Ｒと相互作用し、ＯＸ４０Ｌと競合する短いアミノ酸配列が意外にも同定され、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用の阻害剤として特性決定された。

したがって本発明は、ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸９４〜１２４（Ｐ５；配列番号：６）に対応するペプチド配列である新しいＯＸ４０Ｒ結合剤を開示する。

本発明は、１つ以上のアミノ酸が欠落し、ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸１０７〜１１１（ペプチドＰ５−１ａ；配列番号：１３）を含む、アミノ酸９４〜１２４（ペプチドＰ５；配列番号：６）に対応するペプチド配列からなるヒトＯＸ４０Ｌのペプチド配列であるＯＸ４０Ｒ結合剤を開示する。特にこれらのペプチドは５〜１０個のアミノ酸を有し、さらにヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸１０７〜１１６（ペプチドＰ５−１；配列番号：８）、または１０７〜１１１（ペプチドＰ５−１ａ；配列番号：１３）に対応する配列を有する。

上で定義されたペプチドＰ５、並びにＰ５断片は、本願明細書の実施例において、ヒトＯＸ４０Ｒタンパク質に結合することが示され（または推論され）ている。この結合活性度は、組み換え型ＯＸ４０ＬおよびＯＸ４０Ｒを用いた生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイを使用して試験され、特許請求されるペプチド配列によってＯＸ４０Ｌが効果的に競合されることが実証されている。したがって本発明によって、ヒト疾患に関連した望ましくないＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用と細胞情報伝達を阻害するための新しい手段が提供される。

ＯＸ４０Ｌの別称であるヒトＡＣＴ−４−Ｌの細胞外領域の断片が、ＯＸ４０Ｌ（国際公開第９５／２１９１５号パンフレット）の細胞外領域における、機能的または構造的領域に関連する可能なＯＸ４０Ｒ結合剤として開示されている。しかし文献では、ペプチドＰ５、またはペプチドＰ５−１およびＰ５−１ａなどのその断片に対応するヒトＯＸ４０Ｌの機能的または構造的領域が、ＯＸ４０Ｌに対して競合活性を有するという証拠は提供されていない。マウスＯＸ４０Ｌ細胞外領域配列に基づいてデザインされたペプチドは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体を生成するための抗原として使用されている（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６）が、この領域におけるマウスおよびヒトＯＸ４０Ｌの限定的保存に照らして（図５Ａおよび６Ａ）、これらのいずれかの配列がヒトＯＸ４０Ｒに対するヒトＯＸ４０Ｌの結合と効率的に競合できるとは推論できない。

本願明細書は、同一タンパク質ファミリーに属するその他のリガンド−受容体対を比較して（ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ＪＬら、２００２）、またはＰＲＥＤＡＴＯＲ、ＰＨＤまたはＨＮＮ（例えばｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｓｅｒｖｅｒ．ｈｔｍｌでアクセスできる）などのタンパク質構造予測に対する周知のアルゴリズムを使用して、機能的または構造的ドメインが明確に予測できなくても、このようなペプチドが意外にもＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用を阻害できるＯＸ４０Ｒ結合剤として効果的であることを成功裏に実証する。

「ペプチド」と言う用語は、普通は、通常４〜２０個の近接するアミノ酸である、４〜４０個以上の近接するアミノ酸を含有するポリペプチド鎖に適用される。このようなペプチドは、より大きなタンパク質の部分的タンパク分解性切断、化学合成、または遺伝子工学ををはじめとする、当業者に既知の方法によって生成できる。

「活性の」と言う用語は、本発明のペプチドについて実証されるＯＸ４０Ｒ結合特性を示す化合物を定義する。

ペプチドＰ５、およびペプチドＰ５−１およびＰ５−１ａによって例証されるその特異的断片の特性は、それらの活性変異体中で維持でき、あるいは強化することすらできる。この分子カテゴリーは、１つ以上のアミノ酸残基が保存的に置換されているこれらの配列の類似体を含むが、ただしそれらは、技術分野で既知のまたは下の実施例で開示される手段により測定されるように、本発明で特性決定された同一生物学的活性度に匹敵するまたはより高いレベルで示す。

本発明に従って、これらの活性変異体における好ましい変化は、一般に「保存的」または「安全」置換として知られる。保存的アミノ酸置換は、分子の構造および生物学的機能を保存するために、十分に類似した化学特性を有するアミノ酸を有するのもである。特に例えば１０個未満、好ましくは３個未満である少数のアミノ酸のみが挿入または欠落に関与し、あるいはタンパク質またはペプチドの機能的高次構造に重大な意味を持つアミノ酸を除去または置換しないならば、それらの機能を変更することなく、上で定義された配列中でアミノ酸の挿入および欠落があっても良いことが明らかである。

文献は、天然タンパク質の配列および／または構造に関する統計学的および物理化学的な研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の選択が実施できる多くのモデルを提供する（ロゴブ（Ｒｏｇｏｖ）ＳＩおよびネクラソブ（Ｎｅｋｒａｓｏｖ）ＡＮ、２００１）。タンパク質デザイン実験は、アミノ酸の特異的サブセットの使用により、折りたためる活性タンパク質が生成できることを示し、タンパク質構造中により容易に収容できるアミノ酸の「同義」置換の分類の一助となる（マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ＬＲら、２０００）。同義のアミノ酸群、およびより好ましい同義の群は、表Ｉで定義されたものである。

これらの代替えの化合物では、本願明細書で開示された基本的特性、特にＯＸ４０Ｒに結合して阻害するその能力に関して影響しないヒトＯＸ４０Ｌの選択配列の変化によって、分子を理解することが意図される。類似化合物は、従来のコード化ＤＮＡの特定部位の突然変異誘発技術から、コード化ＤＮＡ配列またはアミノ酸の組み合わせ技術（ＤＮＡ混合、ファージ・ディスプレイ／選択など）から、コンピューター利用のデザイン研究から、あるいは当業者により先行技術および本願明細書実施例に示される教示を使用して日常的に得られて試験される、実質的に対応する変異ペプチドの有限のセットを提供する、適切なあらゆるその他の既知の技術から得られても良い。

本願明細書は、アミノ酸配列Ｐ５、Ｐ５−１、Ｐ５−１ａを含む融合ポリぺプチドまたはペプチド、あるいは上述のそれらのいずれかの活性変異体、およびヒトＯＸ４０Ｌ以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列である、新しいＯＸ４０結合剤を開示する。この異種の後者の配列は、ＯＸ４０Ｒ結合活性度を大幅に損なうことなしに追加的特性を提供すべきである。このような追加的特性の例は、より容易な精製手順、体液中でのより長く持続する半減期、または細胞外局在化である。この後者の特性は、本願明細書でＯＸ４０Ｒ結合剤として特性決定されたペプチドが、これらのペプチドの分離および精製が促進されるだけでなく、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０Ｒが自然に相互作用する空間に局在化できるようにするので、上の定義に含まれる融合またはキメラタンパク質の特異的な群を定義するのに、特に重要である。

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤をはじめとする融合タンパク質に含まれることができる追加的なタンパク質配列は、膜結合タンパク質、膜結合タンパク質の細胞外領域、免疫グロブリン定常部、多量体化領域、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、搬出シグナル含有タンパク質の中から選択できる。

ＯＸ４０結合剤に融合させるための１つ以上のこれらの配列の選択は、前記作用物質の特定用途の関数である。一般的手順としてこれらのタンパク質は、遺伝子副体または非／相同的組み込みベクター、並びに形質転換−、感染症−、または形質移入−ベースの技術を使用して、原核または真核宿主細胞を修飾するために使用されるウィルスまたはプラスミド起源の複製可能なベクター中で、一般的遺伝工学技術を使用してクローン化し、それらをコード化する核酸セグメントを作り出すことにより生成できる。これらのベクターは、前記細胞内で恒常的に活性または誘発性であるように選択されるそれら自身の転写開始／終了制御配列の調節の下で、ＯＸ４０Ｒ結合剤をはじめとする融合タンパク質が、原核または真核宿主細胞内で発現できるようにすべきである。次にこのような細胞内で実質的に富化される細胞系を分離して、安定細胞系が提供できる。特に修飾されて本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤を発現する細胞が直接的に使用または投与される場合は常に、好ましい細胞はＯＸ４０Ｌを通常発現するヒト細胞、特にヒトＢ細胞である。

細胞外、搬出シグナル、またはシグナル−ペプチド含有タンパク質の配列におけるように、追加的タンパク質配列によって、ＯＸ４ＯＲ結合ドメインが細胞外空間に分泌されるようになる場合、さらなる加工の観点から、作用物質が培養細胞からより容易に収集、精製でき、または代案として細胞は直接的に使用または投与できる。

膜結合タンパク質の配列におけるように、追加的タンパク質によってＯＸ４０Ｒ結合剤が細胞表面に固定されるようになる場合、さらなる加工の観点から、作用物質を培養細胞から収集、精製するのはより困難になることができるが、細胞は直接的に使用または投与でき、天然ＯＸ４０Ｌの１つに対応する形態で作用物質が提供され、もしかするとその特性が改善されるかも知れない。

最後にＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用に、タンパク質の多量体化、特に三量体化が関与することは既知である（アル−シャムカニ（Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ）Ａら、１９９７）。したがって融合タンパク質は、免疫グロブリン定常部、膜結合タンパク質の細胞外領域、または技術分野でＴＮＦＲ−様（国際公開第００／３９２９５号パンフレット）またはその他のタンパク質（国際公開第０１／４９８６６号パンフレット、国際公開第９９／１０５１０号パンフレット、国際公開第０１／９８５０７号パンフレット）中に存在することが既知の三量体化領域などの得られたタンパク質が多量体化できるようにする配列も含んでも良い。含めることができるその他の有用なタンパク質配列は、アフィニティークロマトグラフィーによる精製手段を提供するものである（コンスタンス（Ｃｏｎｓｔａｎｓ）Ａ、２００２；ロウ（Ｌｏｗｅ）ＣＲら、２００１）。

本発明のポリぺプチドおよびペプチドは、所望の使用および／または生成方法に従って好ましくあることができる、例えば活性画分、前駆物質、塩、または誘導体などの代替の形態であることができる。

「画分」と言う用語は、化合物それ自体のポリペプチド鎖の単独での、または例えば糖またはリン酸残基、あるいは元のポリぺプチドまたはペプチドの凝集塊などの結合した関連分子または残基との組み合せでの、あらゆる断片を指す。このような分子は、例えばペプチドの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）化学誘導体化（アセチル化またはカルボキシル化）、あるいはペプチドの合成および加工またはさらなる加工ステップにおいて、そのリン酸化（ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン残基の導入）またはグリコシル化（例えば哺乳類のグリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響する酵素にペプチドを曝露することによる）パターンの修飾によって作られるものなどの通常、一次配列を変更させないその他の修飾からも得ることができる。例えばＰ５およびＰ５−１は潜在的グリコシル化部位（ヒトＯＸ４０Ｌ中のアミノ酸１１４〜１１６）を含有し、これは宿主細胞内での組換え体発現中、または化学合成中に適宜修飾できる。

「前駆物質」は、細胞または身体への投与の前後に、代謝的および酵素的処理によって本発明の化合物に変換できる化合物である。

「塩」と言う用語は、ここではカルボキシル基の塩、および本発明のペプチド、ポリぺプチド、またはそれらの類似体のアミノ基の酸付加塩の双方を指す。カルボキシル基の塩は技術分野で既知の手段によって形成しても良く、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩などの無機塩が挙げられ、有機塩基を持つ塩としては、例えばトリエタノールアミンなどのアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどを用いて形成するものなどのが挙げられる。例えば酸付加塩としては、例えば塩酸または硫酸などの鉱酸を有する塩と、例えば酢酸またはシュウ酸などの有機酸を有する塩とが挙げられる。このような塩のいずれもが、本発明のペプチドおよびポリぺプチドまたはそれらの類似体に実質的に類似した活性度を有するべきである。

「誘導体」と言う用語は、ここでの用法では、既知の方法に従って、アミノ酸部分の側鎖上、あるいはＮ−またはＣ−末端基上に存在する官能基から調製できる誘導体を指す。このような誘導体としては、例えばカルボキシル基のエステルまたは脂肪族アミド、および遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離水酸基のＯ−アシル誘導体が挙げられ、例えばアルカノイル−またはアロイル−基などのアシル基を用いて形成される。

本発明の別の目的は、ペプチドＰ５のペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）（ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）とも称される）、ペプチドＰ５−１およびｐ５−１ａによって例証されるその特異的断片、その中でペプチドまたはポリぺプチドの性質が、アミノ酸側鎖、アミノ酸掌性、および／またはペプチド主鎖のレベルで化学的に修飾されている、上で定義された対応する活性変異体からなる、新しいＯＸ４０Ｒ結合剤である。これらの修正は、（改善されていないとすれば）類似した治療上、診断上、および／または薬物動態学的特性を有するＯＸ４０Ｒ結合剤を提供することを意図する。

例えばペプチドが被験者への注射に続いてペプチダーゼによる切断を被りやすいことが問題である場合、特に感受性の高いペプチド結合を非切断性ペプチドミメティックで置換することで、より安定し、従って治療薬としてより有用なペプチドを提供できる。同様に、Ｌ−アミノ酸残基の置き換えは、ペプチドのタンパク質分解に対する感受性を低くし、最終的にはペプチド以外の有機化合物により類似させる標準法である。ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テイル、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、および２，４，−ジニトロフェニルなどのアミノ−末端ブロッキング基もまた有用である。増大した強度、長期にわたる活性、精製の容易さ、および／または増大した半減期を提供する多くのその他の修飾は、技術分野で既知である（国際公開第０２／１０１９５号パンフレット；ビラン（Ｖｉｌｌａｉｎ）Ｍら、２００１）。ペプチドミメティックをはじめとする好ましい代案、アミノ酸の「同義」群は、表ＩＩで定義されるものである。

ペプチドミメティック、並びに非ペプチドミメティックの合成および開発技術は、技術分野で周知である（ソーヤー（Ｓａｗｙｅｒ）ＴＫ、１９９７；フルビー（Ｈｒｕｂｙ）ＶＪおよびバルセ（Ｂａｌｓｅ）ＰＭ、２０００；ゴレビオウスキー（Ｇｏｌｅｂｉｏｗｓｋｉ）Ａら、２００１；キム（Ｋｉｍ）ＨＯおよびカーン（Ｋａｈｎ）Ｍ、２０００）。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）翻訳系の双方を使用して、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込み、タンパク質の構造および機能を調べ、および／または改善する様々な方法論もまた文献で開示される（ドゥガーティ（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ）ＤＡ、２０００）。

新しいＯＸ４０Ｒ結合剤は、ペプチドＰ５と、ペプチドＰ５−１およびＰ５−１ａによって例証されるその特異的断片と、あるいは上で定義された対応する活性変異体の構造および／または配列を利用するコンピューター支援薬剤デザイン方法によって同定される、ペプチド、ペプチドミメティック、または非ペプチドミメティックであることができる。別々の分子または複合体としてのＯＸ４０ＬおよびＯＸ４０Ｒの立体構造は未だに解明されていないが、本願明細書で提供される開示により、ひとたびこの情報が利用できるようになれば、これらのそしてその他のシミュレーション技術を使用して、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０Ｒの間の相互作用の研究がより効率的にできるようになる（コクラン（Ｃｏｃｈｒａｎ）Ａら、２００１；クレーマー−ペコール（Ｋｒａｅｍｅｒ−Ｐｅｃｏｒｅ）ＣＭら、２００１）。このようなコンピューター支援分析を活用して、合成有機分子またはペプチド（例えば４〜２０個のアミノ酸を有する）の形態の改善されたペプチドまたは非ペプチドミメティック薬剤が開発できる。ひとたびこれらの化合物がスクリーニングされ、ＯＸ４０Ｒと結合しＯＸ４０Ｌと競合できることが分かると、次にそれは細胞または動物モデルを使用して、それらの有用性について評価される。

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤の有用な接合体または複合体は、（国際公開第９５／２１２５１号パンフレットで抗ＯＸ４０Ｒ抗体について示されるように）技術分野で既知の分子および方法を使用して生成され、（放射性または蛍光標識、ビオチンによって）それらの検出、（細胞毒性作用物質によって）それらの治療上の有効性、および／または（ポリエチレングリコールとその他の天然または合成ポリマーによって）それらのデリバリを改善できる（ピライ（Ｐｉｌｌａｉ）Ｏおよびパンチャングヌラ（Ｐａｎｃｈａｇｎｕｌａ）Ｒ、２００１）。

ペプチドＰ５、その特異的断片、ペプチドＰ５−１およびＰ５−１ａによって例証される対応する活性変異体、およびそれらを含有する融合タンパク質は、既知の化学合成によって、または組換えＤＮＡをベースとする技術によって調製できる。

本発明の別の目的は、実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む、本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤のための核酸コード化である。

「実質的に同一であるヌクレオチド配列」は、遺伝子コードの縮重のおかげで特定のアミノ酸配列もコードする、あらゆるその他の核酸配列を含む。

本発明は、本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤をコードする核酸が発現できるようにするウィルスまたはプラスミド起源のベクター、およびこのようなベクターによって形質転換された原核または真核宿主細胞も含む。これらの形質転換細胞内で実質的に富化される安定細胞系は、例えばヒトＢ細胞などの細胞膜上で分泌または発現されることができるＯＸ４０Ｒ結合剤の発現特徴に基づいて分離できる。

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤は、上で述べた宿主細胞を適切な培養液中で培養し、ＯＸ４０Ｒ結合剤を収集する方法によって生成できる。

本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切なベクター中に挿入してライゲートできる。ひとたび形成すると、発現ベクターを適切な宿主細胞内に導入し、次にそれがベクターを発現して所望のタンパク質が生じる。

ここで述べる本発明の組換えタンパク質のいずれかの発現は、適切な発現ベクターを使用して、真核細胞（例えば酵母、昆虫または哺乳類の細胞）または原核細胞内でもたらすことができる。技術分野で既知のあらゆる方法を用いることができる。

例えば上の方法のいずれかによって得られたタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、技術分野で周知の技術によって、適切に構築された発現ベクターに挿入される。二重鎖のｃＤＮＡは、ホモポリマーテーリングによって、または合成ＤＮＡリンカー、または平滑末端ライゲーション技術の使用が関与する制限連結によって、プラスミドベクターに連結される。ＤＮＡリガーゼを使用してＤＮＡ分子を結合し、望ましくない連結は、アルカリホスファターゼでの処理によって回避される。

所望のタンパク質を発現できるために、発現ベクターは、遺伝子発現およびタンパク質生成ができるように所望のタンパク質をコードするＤＮＡに連結された、転写および翻訳制御情報を含有する特異的ヌクレオチド配列も含まなくてはならない。まず遺伝子が転写されるために、それはＲＮＡポリメラーゼによって認識可能なプロモーターによって先行されなくてはならず、それにポリメラーゼが結合することによって、転写過程が開始する。種々のこのようなプロモーターが使用され、異なる効率で働く（強弱プロモーター）。

真核ホストでは、ホストの性質次第で異なる転写および翻訳制御配列を用いても良い。それらは、制御シグナルが高レベルの発現を有する特定遺伝子に結びつく、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルスなどのウィルス起源に由来しても良い。例は、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。抑制および活性化ができるようにする転写開始制御シグナルを選択して、遺伝子発現を調節できるようにしても良い。

所望の遺伝子配列を宿主細胞内に組み込める、作動可能に連結された転写性および翻訳制御シグナルを有するベクター内に、本発明のタンパク質のヌクレオチド配列コードを含むＤＮＡ分子を挿入する。

導入されたＤＮＡによって安定に形質転換された細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞を選択できるようにする１つ以上のマーカーを導入することによっても選択できる。マーカーはまた、栄養要求株ホストに光合成能、例えば抗生物質、または銅などの重金属の殺生剤への抵抗性を提供しても良い。選択性マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接的に連結し、または同時形形質移入によって同一細胞に導入することができる。

ベクターの追加的要素もまた、本発明のタンパク質の最適な生成を得るのに有用であるかも知れず、特にベクターを含有する受容細胞をベクターを含有しない受容細胞から認識し選択する容易さ、特定ホストにおいて所望のベクターのコピー数、そしてベクターを異種の宿主細胞間で「シャトル」できることが望ましいかどうかなど、プラスミドまたはウィルスベクターを含有する特定細胞を選択するために有用であるかもしれない。

ひとたびコンストラクトを含有するベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために調製されると、形質転換、形質移入、接合、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リン酸カルシウム−沈殿、直接的ミクロ注入などの種々の適切な手段のいずれかによって、ＤＮＡコンストラクトを適切な宿主細胞に導入しても良い。

宿主細胞は、原核または真核のどちらかであっても良い。好ましい真核ホストは、正確な折りたたみ、または正確な部位のグリコシル化をはじめとする翻訳後修飾をタンパク質分子に提供することから、例えばヒト、サル、マウス、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類の細胞である。また酵母細胞は、グリコシル化をはじめとする翻訳後ペプチド修飾をすることができる。強いプロモーター配列と高いコピー数のプラスミドを使用するいくつかの組換えＤＮＡストラテジーが存在し、それは酵母内で所望のタンパク質を生成するために使用できる。酵母はクローン化哺乳類の遺伝子生成物上でリーダー配列を認識し、リーダー配列を持つペプチドを分泌する（すなわちプレペプチド）。

ベクターの導入後に、ベクター含有細胞の生育について選択する選択培地中で宿主細胞を生育させる。クローン化遺伝子配列の発現からは、所望のタンパク質の生成が帰結する。

本発明のこれらの目的は、本願明細書によって提供される組換えＯＸ４０Ｒ結合剤に関する開示を、一般的分子生物学技術の知識と組み合わせることによって達成できる。オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）発行のシリーズ中のいくつかのタイトル「実際的アプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（「ＤＮＡクローン化２：発現のシステム（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」１９９５；「ＤＮＡクローン化４：哺乳類のシステム（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」１９９６；「タンパク質発現（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」１９９９；「タンパク質精製技術（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」２００１）などのように、多数のレビュー（マクライズ（Ｍａｋｒｉｄｅｓ）ＳＣ、１９９９）および書籍が、ベクターおよび原核または真核宿主細胞を使用して、組換えタンパク質をクローンおよび製造する方法に関する教示を提供する。

それらがペプチドまたはペプチドミメティックの形態である場合に、本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤を製造するために指示される化学合成技術の例は、固相合成および液相合成である。例えば固相合成として、合成するペプチドのＣ−末端に対応するアミノ酸が有機溶剤に不溶性の支持体に結合され、反応の交互の反復によって、それらのアミノ基および側鎖官能基が適した保護基で保護されるアミノ酸が、Ｃ−末端からＮ−末端の順で１つずつ縮合され、樹脂またはペプチドのアミノ基の保護基に結合したアミノ酸が放出され、かくしてペプチド鎖はこの様式で延長する。

固相合成法は、使用される保護基のタイプに応じて、ｔＢｏｃ方およびＦｍｏｃ法によって大まかに分類される。典型的に使用される保護基としては、アミノ基のためのｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、およびＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）、グアニジノ基のためのＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、そして水酸基のためのｔＢｕ（ｔ−ブチル）が挙げられる。所望のペプチドの合成後、それを脱保護反応させて固体支持体から切断する。このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法のためにはフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸、Ｆｍｏｃ法のためにはＴＦＡを用いて実施しても良い。

組換えＤＮＡまたは化学合成技術によって得られるＯＸ４０Ｒ結合剤に、最終的に１つ以上の精製ステップを施す。精製は、この目的のために知られるあらゆる方法、すなわち抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを伴うあらゆる従来の手順によって実施できる。例えばＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）が使用できる。溶出は、一般にタンパク質精製のために用いられる水−アセトニトリルベースの溶剤を使用して実施できる。本発明は、本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤の精製品を含む。精製品とはここでの用法では、乾燥重量で本発明の化合物の少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％である製剤を指す。

上述の本発明の化合物（タンパク質、ペプチド、有機化合物）は、薬物としてヒトＯＸ４０Ｌの拮抗剤、ＯＸ４０Ｌの活性度に関する文献に照らしてＲＡＮＴＥＳ発現の誘発物質（コタニ（Ｋｏｔａｎｉ）Ａ．ら、２００２）、そしてヒトＲＡＮＴＥＳの拮抗剤であることができる。

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤は、医薬組成物中で自己免疫疾患、炎症、または感染症の予防および／または治療のための活性成分として使用できる。

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤はひとたびＯＸ４０Ｒに結合すると、ＯＸ４０Ｌの拮抗剤として作用し、このような分子の治療上の可能性は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞活性化の阻害が有利である、自己免疫疾患（例えば炎症腸疾患、関節リウマチ、および多発性硬化症）、炎症または感染症の予防および／または治療にある。この後者の効果はまた、ＯＸ４０Ｒを発現するＣＤ４⁺Ｔ細胞の集団を減少させるためにも使用できる。

本発明は、活性成分として本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤の１つを含む、ＣＤ４⁺Ｔ細胞に関係した疾患の予防および／または治療のための医薬組成物も提供する。これらの医薬組成物は、薬学上許容可能なキャリア、賦形剤、安定剤、または希釈剤と組み合わせて調剤できる。作用物質の特性次第で、医薬組成物は、自己免疫疾患、炎症、または感染症などのＣＤ４⁺Ｔ細胞に関係した疾患に対して有用であることができる。

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤を含む医薬組成物としては、前記化合物を治療的有効量、すなわち処置した動物において医学的に望ましい結果を達成するのに効果的な量で含有するあらゆる組成物が挙げられる。医薬組成物は、適切な薬学上許容可能なキャリア、動物に投与するのに適切な生物学的に適合性のビヒクル（例えば生理食塩水）を含有しても良く、最終的に薬剤的に使用できる製剤への活性化合物の加工を促進する添加剤（賦形剤、安定剤または希釈剤など）を含む。

医薬組成物は、投与様式の要求を満たすいずれかの許容可能なやり方で調剤しても良い。薬剤デリバリーのための医用材料およびその他のポリマーの使用、並びに投与の特定の様式を確認するための異なる技術とモデルについては、文献で開示されている（ルオ（Ｌｕｏ）Ｂおよびプレストウィッチ（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ）ＧＤ、２００１；クレランド（Ｃｌｅｌａｎｄ）ＪＬら、２００１）。血液脳関門の貫通を改善するための本発明の化合物の修飾もまた有用であろう。経血管ドラッグデリバリー分野におけるバイオミメティック輸送および合理的なドラッグデリバリーのその他の方法については、技術分野で既知である（ラネー（Ｒａｎｎｅｙ）ＤＦ、２０００）。

投与のあらゆる許容された様式が使用でき、当業者によって決定される。例えば投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、経口、または頬側径路などの様々な径路によって実施されても良い。非経口的投与は、大量瞬時投与、または長時間にわたるゆっくりとした灌流によっても良い。非経口的投与のための製剤としては、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられ、それらは技術分野で既知の補助的作用物質または賦形剤を含んでも良く、日常的な方法に従って調製できる。さらに適切な油性注射懸濁液として、活性化合物の懸濁液を投与しても良い。例えば適切な親油性の溶剤またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばごま油、または合成脂肪酸エステル、例えばごま油、または例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。懸濁液の粘度を増大させる物質を含有しても良い水性注射懸濁液としては、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランが挙げられる。任意に懸濁液は安定剤も含有しても良い。医薬組成物は、注射による投与のための適切な溶液を含み、賦形剤と共に約０．０１〜９９％、好ましくは約２０〜７５％の活性化合物を含有する。直腸投与できる組成物としては坐薬が挙げられる。

投与される投薬量は、受容者の年齢、性別、健康、および体重、あれば併用治療の種類、治療の頻度、および所望の効果の性質に左右されるものと理解されている。投薬量は、当業者によって理解され決定されるように個々の被験者のために調整される。各治療に要する総用量は、複数用量または単一用量によって投与されても良い。本発明の医薬組成物は、単独で、または病状を対象とする、または病状のその他の症状を対象とするその他の治療薬と併せて投与しても良い。通常、活性成分の一日の投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇからなる。

本発明の化合物は、生理食塩水などの薬学上許容可能なキャリア中で、患者に静脈内投与しても良い。例えばリポソーム経由のデリバリなどのペプチドの細胞内デリバリーの標準方法が使用できる。このような方法は、当業者には周知である。本発明の調合物は、静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内などの非経口的投与のために有用である。

医学分野では周知のように、あらゆる一患者に対する投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定化合物、性別、投与の時間と径路、一般的健康、および併用して投与されるその他の薬剤をはじめとする多くの要因に左右される。

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤は、膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域の検出のために使用できる。明らかにこの利用法は、ＯＸ４０Ｒタンパク質を発現する活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の検出に広げることができる。

これらの利用法をベースとする検出方法は、サンプルを作用物質または細胞に接触させる第１のステップと、ＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域間の相互作用をこれらの要素の存在を示すために直接的に（既述したように、作用物質または細胞に関連したいずれかの標識の手段によって）、または間接的に（例えばＯＸ４０Ｒタンパク質またはＯＸ４０Ｒ−発現細胞上のこの結合の効果の手段によって）検出する第２のステップとを含む。

作用物質または細胞は、サンプルと接触させる前後に支持体上に固定化でき、これによって、膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒ細胞外領域、またはＯＸ４０Ｒ発現細胞の検出だけでなく、精製および／または濃縮ができるようになる。それ故これらの支持体は、サンプルを支持体、または本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤を発現する細胞に接触させることにより、前記サンプル中の膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒ細胞外領域、またはＯＸ４０Ｒ発現細胞の検出、精製、および／または濃縮方法で使用できる。この検出方法および既述の検出方法を使用して、減少したまたは増大したＣＤ４⁺Ｔ細胞または可溶性ＯＸ４０Ｒタンパク質の存在に関連した病状が診断できる。

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤、またはそれらを発現する細胞は、自己免疫疾患、炎症、または感染症の予防および／または治療方法で投与できる。

本発明は、本願明細書の実施例で提供されるように、
ａ）ｉ）本発明で述べられた化合物、細胞、および支持体の中から選択されるＯＸ４０Ｒ結合剤を構成する要素、
ｉｉ）ＯＸ４０Ｒ細胞外領域を含むタンパク質、その表面にＯＸ４０Ｒ細胞外領域を発現する細胞系、およびＯＸ４０Ｒ細胞外領域を分泌する細胞系の中から選択されるＯＸ４０Ｒ部分を構成する要素、および
ｉｉｉ）ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用の阻害剤として試験される化合物の要素、を含むサンプルを形成するステップと、
ｂ）要素（ｉ）と（ｉｉ）との間の相互作用に対する化合物（ｉｉｉ）の効果を直接的または間接的に検出するステップと、
ｃ）（ｂ）において、（ａ）の要素の質および／または量の点で異なるサンプル間で検出された効果を比較するステップと
を含む、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用を阻害する化合物の性質および活性度の判定のためのスクリーニング検査も開示する。

プラスチックマイクロタイタープレートまたはビーズなどの支持体上に固定化された結合要素を使用することによる、これらの類のスクリーニングはより効率的で迅速であるため、上で開示された支持体は好ましい要素を表す。

本発明は、患者から得られたサンプル中の減少したまたは増大したＣＤ４⁺Ｔ細胞または可溶性ＯＸ４０Ｒタンパク質の存在に起因する病状の診断も可能にする、ＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域（膜結合または可溶性タンパク質として）、または活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞を検出するための）ＯＸ４０Ｒ結合剤、それらを発現する細胞、またはそれらを含む支持体を含む新しいキットも提供する。

最後に本発明は、異なるタグ配列を有する融合タンパク質として膜結合性タンパク質の細胞外部分とタンパク質リガンドとを含む、タンパク質リガンドと膜結合性タンパク質との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングするためのキットも提供する。

参照した文献は、あらゆるデータ、表、図、および引用文献に示されるテキストをはじめとして全てその内容全体を本願明細書に引用したものとする。さらに参照した文献中で引用される文献のあらゆる内容は、全てその内容全体を本願明細書に引用したものとする。既知の方法ステップ、従来の方法ステップ、既知の方法または従来の方法への言及は、本発明の態様、既述または実施態様が、関連技術で開示、教示または提案されたと認めるものでは決してない。

ひとたび本願明細書で開示された方法および生成物の特徴が理解されれば、先行技術、並びに本発明の基本的詳細といくつかの応用について述べる制限を意図しない以下の図面と実施例をレビューすることで、追加的ステップの必要性および種類が容易に推論できる。

実施例１：アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMをベースとする競合アッセイを使用してＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用を検出するための実験デザイン
方法
タンパク質
ヒトＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁融合タンパク質については、以前に述べられている（ゴドフリー（Ｇｏｄｆｒｅｙ）ら、１９９４）。組換えタンパク質は、ｐＣＥＰ４（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をベースとする哺乳類の発現ベクターを構築して調製し、その中でヒトＯＸ４０Ｒの細胞外部分をコード化するｃＤＮＡ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃ．番号Ｐ４３４８９のアミノ酸１〜２０８）は、ヒトＩｇＧ₁の定常部をコード化するｃＤＮＡの５’末端にインフレーム融合される（ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃ．番号Ｐ０１８５７のアミノ酸９８〜３３０）。組換えＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁は、ＯＸ４０Ｒのシグナル配列のために分泌タンパク質として発現される。

ハイグロマイシンの選択性マーカー遺伝子を含有する発現コンストラクトと共に、リン酸カルシウム技術を使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を形質移入した。細胞を２×１０⁵細胞／ｍｌの密度で、増殖培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）１０％ウシ胎児血清および４ｍＭＬ−グルタミンを補充；シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））に播種した。翌日２％ウシ胎児血清および４ｍＭＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）で培地を置き換えた。１時間後、細胞を形質移入して、５％ＣＯ₂含有の加湿大気中３７℃で４時間インキュベートし、次に培地を変更して１０％ウシ胎児血清含有増殖培地に戻した。形質移入の２日後、選択作用物質（ハイグロマイシンＢ；３００μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。選択された細胞中からＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁を正確に発現するクローンを分離した。

分離クローンから生成される細胞培養上清から、組換えＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧを精製した。遠心分離（５００×ｇで１０分間）によって上清を清澄にし、引き続いて０．４５および０．２２μｍ孔径のＰＶＤＦ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用して濾過した。同時にバイオ・ロジック（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ）ＦＰＬＣシステム（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ））を使用して、その上に組換えタンパク質Ｇ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））が固定される３８ｍｌの樹脂を含有する精製カラムを添加液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０）で平衡化した。２０カラム容積（ＣＶ）の添加液での平衡化の後、流速１ｍｌ／分でサンプルをカラムに適用した。１０ＣＶの添加液でカラムを洗浄し、樹脂に非特異的に結合したタンパク質を除去した。０．１グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３．０）溶出緩衝液を使用してステップ傾斜法により、ＩｇＧ₁部分を通じてタンパク質Ｇ上に固定化されたＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁融合タンパク質を溶出した。得られた画分を１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）で直接的に中和し、酸性溶出緩衝液中でのタンパク質分解を防止した。最後にＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５カラム（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使用して、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁融合タンパク質を含有する画分を脱塩し、アッセイに使用するまで−８０℃でアリコートで保存した。

ヒトＯＸ４０Ｌ−マウスＣＤ８および抗マウスＣＤ８ビオチン化抗体は市販され（アンセル（Ａｎｃｅｌｌ））、並びにスラミン（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））も市販される。プラスミド中でＧＳＴに融合したＯＸ４０Ｌの細胞外部分のクローン化によって、バキュロウイルス発現系（ゲートウェー（Ｇａｔｅｗａｙ）^TM、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））において、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）との融合タンパク質として組み換えヒト可溶性ＯＸ４０Ｌを調製し、次にそれを使用してＳＦ９細胞を形質移入した。発現および精製は、製造元の説明書に従って実施した。

アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMアッセイ
アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM修飾アクセプターおよび供与体ビーズを購入した（バイオシクンッルパッカード（Ｂｉｏｓｉｇｎａｌ Ｐａｃｋａｒｄ）。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁およびＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８融合タンパク質をタンパク質Ａ−接合アクセプタービーズ上に、ビオチン化抗ＣＤ８抗体の手段によってストレプトアビジン接合供与体ビーズ上に、それぞれ固定化した。

コスター（Ｃｏｓｔａｒ）（登録商標）３８４ウェル白色ポリスチレンプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））を使用して、結合アッセイを実施した。３８４ウェルプレートの各ウェルは、２５μＬ容積の反応混合物を含有した。反応混合物の５つの各構成成分（ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ１、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８、ビオチン化抗ＣＤ８、ストレプトアビジン接合供与体ビーズ、およびタンパク質Ａ接合アクセプタービーズ）を５μＬ容積で添加した。あらゆる希釈は、ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）あり、またはなしのアッセイ緩衝液（リン酸緩衝食塩水および０．１％ＢＳＡ）で行った。

標準アッセイでは、ＯＸ４０−ＩｇＧ₁およびＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８を共に３０分間インキュベートし、次にビオチン化抗ＣＤ８抗体（１０ｎＭ）を添加した。さらに３０分間のインキュベーション時間に続いて、個々のウェルにストレプトアビジン供与体ビーズ（２０μｇ／ｍｌ）およびタンパク質Ａアクセプタービーズ（２０μｇ／ｍｌ）を添加した。１秒間／ウェルの読み取り時間に設定したパッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）フュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）^TMリーダー（バイオシグナルパッカード（Ｂｉｏｓｉｇｎａｌ Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、１時間後にプレートをカウントした。供与体およびアクセプタービーズの光感受性のために、実験は青色光の下で実施し、あらゆるインキュベーション時間は室温で実施した。より短い発光波長５２０〜６２０ｎｍと組み合わせた励起波長６８０ｎｍでプレートを読み取った。

データ分析
Ｋ_D、ＩＣ₅₀、およびＥＣ₅₀値は全てプリズム（Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）ソフトウェア（グラフパッドソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ））を使用して計算した。ＩＣ₅₀値のＫ_i値への転換は、チェング（Ｃｈｅｎｇ）−プルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）方程式（チェング（Ｃｈｅｎｇ）ＹＣおよびプルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）ＷＨ、１９７３）を使用して実施した。

結果
文献で既知のＯＸ４０Ｌ結合アッセイとしては、ＦＡＣＳベースの分析（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｌら、２００２）、またはビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）^TMベースの分析（アル−シャムカニ（Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ）Ａら、１９９７）が挙げられる。これらの技術は高速大量処理スクリーニングには不適切であるので、ルミネッセンス酸素チャネリングイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＬＯＣＩ；欧州特許第５１５１９４号明細書；ウルマン（Ｕｌｌｍａｎ）Ｅら、１９９４）をベースとする方法である、増幅ルミネッセンス近接均質アッセイスクリーン（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ Ｓｃｒｅｅｎ）（アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM；パッカードバイオサイエンス（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））と称される市販の技術を利用して、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用に対するＯＸ４０Ｌ由来ペプチドの可能な阻害特性を確立するためのより効率的なシステムが創設された。

簡単に述べると、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM技術は、特にタンパク質／タンパク質相互作用アッセイのために、生体分子の相互作用および活動に対する化合物の効果の容易で信頼できる判定を提供する。アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMは、特異的分子接合のための官能基を提供するヒドロゲル層でそれぞれが被覆された、「供与体」および「アクセプター」ポリスチレンビーズの使用に依存する。固定化した分子間の生物学的相互作用によってビーズが近づくと、化学反応のカスケードが開始して、大幅に増幅されたシグナルが生じる。６８０ｎｍでのレーザー励起時に、「供与体」ビーズ中の光増感剤は、周囲の酸素をさらに励起された一重項状態に変換する。励起された一重項状態酸素分子は、迅速に減衰する前に最大距離２００ｎｍにわたり拡散する。アクセプタービーズが近接している場合、これらの酸素分子は、アクセプタービーズに含有されるケミルミネッサー（チオキセン誘導体など）と反応して、化学ルミネセンスを生じる。引き続いて活性化蛍光体は、５２０〜６２０ｎｍで発光する。特異的生物学的相互作用の不在時、供与体ビーズによって生じる一重項状態酸素分子は、アクセプタービーズの近接状態なしでは検出されない。アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM技術によって、サブナノモル／ミクロモル範囲の親和性の相互作用が検出できるようになる。

本例では、外来性の標識群の使用を避けた短い生物学的リンカーを有する異なる親和性タグを使用して、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMビーズ上に固定化した基本的結合パートナーのみを使用して、実験的設定を最初に試験した。シグナルは、ビオチン化抗ＣＤ８抗体ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８とＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁によって形成する複合体のお陰で、ストレプトアビジン供与体とタンパク質Ａアクセプタービーズとが、２００ｎｍ未満の距離で隔てられている場合にのみ検出されるべきである（図１）。可溶性ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８と共にＯＸ４０ＲのＩｇＧ₁標識細胞外領域をインキュベートして複合体を形成した。適切なタグのために、この複合体はタンパク質Ａアクセプタービーズと結合でき、ビオチン化抗ＣＤ８抗体の存在下でストレプトアビジン供与体ビーズと結合でき、検出できるアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルを生じる。ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用と競合する化合物の存在下では、供与体およびアクセプタービーズはもはや近接せず、シグナルはもはや検出されない。

このアッセイの実施可能性を判定するために実施された最初の実験では、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルは、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁の添加に伴い用量依存的な様式で増大した（図２Ａ）。５または１０ｎＭのＯＸ４０−ＩｇＧ₁をそれぞれ使用して計算されたＥＣ₅₀値（−ｌｏｇＥＣ₅₀±ＳＥＭ、平均の標準誤差）は、７．７×１０^-9Ｍ（８．１１±０．０４）および７．９×１０^-9Ｍ（８．１０±０．０１）であった。次にこの結合アッセイで使用する最適濃度を求めるために、より幅広い受容体濃度（２．５〜８０ｎＭ）を使用して実験を繰り返した。全部で７種類の濃度を試験し、結果は、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（図２Ｂ）とのインキュベーションに続いて、各濃度で、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルにおいて、シグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比に用量依存性の増大が生じたことを実証した。あらゆる場合において、ナノモル範囲に留まった計算されたＥＣ₅₀値の間に顕著な差はなかった。

これらの結果を考慮して、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（１０ｎＭ）およびＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（４０ｎＭ）の濃度でさらに実験を実施し、作業するための良好なＳ／Ｂウィンドウを可能にし、またこれらの融合タンパク質の最小濃度のみを使用することでアッセイの費用効率が高いことを裏付けた。

次にＴＮＦ−様タンパク質とそれらの受容体との相互作用を阻害する小型分子であるスラミン（１ｍＭ）存在下で測定された、非特異的結合に起因するシグナルを差し引いてＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁のためのＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８のＫ_Dを計算した（アルザーニ（Ａｌｚａｎｉ）Ｒら、１９９５）。ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８の特異的結合は、可飽和で高親和性（図３）であり、Ｋ_D値は２０．７±５．２ｎＭと計算された。これはビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）センサーチップ方法を使用してＯＸ４０Ｒに対するＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４の結合親和性を測定した際の文献値（アル−シャムカニ（Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ）Ａら、１９９７）と一致し、概してＴＮＦ受容体ファミリーのその他のメンバーについて、それらの各リガンドに対して得られたＫ_D値に類似する。

このアッセイにおいてＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８不在下では、それ自身はアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルを生じることができない、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用に対する２つの既知の競合相手（未標識組み換えヒト可溶性ＯＸ４０Ｌおよびスラミン）が、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁からＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８を排除する能力を調べた。およそのＫ_D値を考慮して、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（１０ｎＭ）の４倍のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（４０ｎＭ）濃度で、排除実験を実施した。ＯＸ４０−ＩｇＧ₁（１０ｎＭ）およびＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（４０ｎＭ）も含有する反応混合物に、増大する濃度のＯＸ４０Ｌ（３μＭ〜０．１ｐＭ）またはスラミン（１ｍＭ〜１ｎＭ）を添加した。双方の化合物は、用量依存的な様式でＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８結合について競合し、得られたＩＣ₅₀値（−ｌｏｇＩＣ₅₀±ＳＥＭ）は、それぞれ５．９×１０^-9Ｍ（８．２３±０．３５）および７．９×１０^-5Ｍ（４．１０±０．０６）であった（図４）。これらの値は、チェング（Ｃｈｅｎｇ）−プルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）方程式（チェング（Ｃｈｅｎｇ）ＹＣおよびプルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）ＷＨ、１９７３）によって、ＯＸ４０Ｌに対して２．０ｎＭ、スラミンに対して２６．３μＭのＫ_i値に転換できる。このスラミンに対する後者の値は、ＴＮＦ受容体に対するＴＮＦ−α結合の阻害について報告された値と類似する（グレイ（Ｇｒａｙ）ＰＷら、１９９０）。

アッセイを実施するためアッセイのさらなる最適化を行って、病状をより良く定義した。アッセイはシグナルを失うことなく、濃度１％までのジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）に耐えられた。最初の添加ステップでＯＸ４０−ＩｇＧ₁、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８、およびビオチン化抗ＣＤ８抗体を組み合わせ、第２のステップでストレプトアビジン供与体およびタンパク質Ａアクセプタービーズを組み合わせ、総インキュベーション時間を６０分間に保つことで、アッセイは効率的に実施できた。双方の混合物は、プレートへの添加に先だって調製できる。

最初、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用を競合的に阻害するＯＸ４０Ｌ由来ペプチドを検出するために開発された、上で述べたアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM技術は、このような相互作用のあらゆるその他の選択的小型分子またはペプチド阻害剤をスクリーニングするのにも適切であろう。このアッセイは、均質で高感度、強力で３８４ウェルフォーマットでの自動化に適するので、同アプローチは、膜結合性タンパク質の細胞外部分とタンパク質リガンドを異なるタグ配列を持つ融合タンパク質（本例ではそれぞれＩｇＧ₁およびＣＤ８）として単に発現させることで、膜結合性タンパク質と相互作用する多くのその他のタンパク質リガンドの生化学スクリーニングの開発に潜在的に応用可能である。

実施例２：ＯＸ４０Ｒに結合するＯＸ４０Ｌ由来ペプチドの同定
方法
ペプチド
エピトップ（Ｅｐｙｔｏｐ）（フランス）によって、８５〜９７％の範囲の純度でペプチド（１０〜３１アミノ酸）を合成し、−２０℃で凍結乾燥形態で保存した。使用前に、ＰＢＳ中０．１ｍＭのＮａＯＨでペプチドを可溶化した。各ペプチドの名称、配列、およびヒトＯＸ４０Ｌ中の対応するアミノ酸を表ＩＩＩに示す。

アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイ
最初の添加ステップ中に、５μＬ容積の様々な濃度の各ペプチドと共に、可溶性構成成分（ＯＸ４０−ＩｇＧ₁、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８、およびビオチン化抗ＣＤ８抗体）をＯＸ４０Ｌとスラミンの競合アッセイ（図４）について既述した濃度で混合した。ストレプトアビジン供与体およびタンパク質Ａアクセプタービーズを３０分後に添加した。実施例１で述べたようにより短い発光波長５２０〜６２０ｎｍと組み合わせた長い励起波長６８０ｎｍで読み取る前に、プレートを暗中、室温で振盪して２時間インキュベートした。

蛍光消光アッセイ
前述のようにして蛍光消光アッセイを実施した（ゴラベク（Ｇｏｌａｂｅｋ）Ａら、２０００）。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（３５μｇ）を５００μＬのＰＢＳ中に溶解し、スリットを５ｎｍに設定した分光蛍光計（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ＬＳ５０Ｂ）を使用して、励起波長２９０ｎｍで蛍光スペクトルを２９５〜４２０ｎｍで記録した。次に１５分間の平衡化後に、ヒトＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁の蛍光スペクトルを増大する濃度（５〜１０００ｎＭ）のＰ５およびＰ５−１ペプチド存在下で記録した。３３６ｎｍでの蛍光変化をペプチド濃度に対してプロットし、得られた曲線をプリズム（Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）ソフトウェア（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ））で非線形回帰適合によって分析した。

結果
タンパク質のアミノ酸５１〜１８３に対応するヒトＯＸ４０Ｌ細胞外領域の配列に基づいて、一連の部分的に重なるペプチドをデザインした（図５Ａ；表ＩＩＩ）。この領域では、抗ＯＸ４０Ｌ抗体を作るために、マウスＯＸ４０Ｌの配列に基づいて２つのぺプチドが以前デザインされている（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６）。

実施例１で述べたアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイにおいて、第１の一連のペプチドを使用して、薬理学的に妥当な親和性値であるミクロモル範囲で、ＯＸ４０Ｌに対するＯＸ４０Ｒの結合を阻害できるペプチド（Ｐ５）を定義することが可能であった（図５Ｂ）。

Ｐ５ペプチドの配列に基づいて第２の一連の部分的に重なるペプチドを試験して、この阻害分子をさらに減少させた（図６Ａ；表ＩＩＩ）。この逐次スクリーニングの結果、ミクロモル範囲（それぞれＫｄ〜１０および６２ミクロモル）で、アミノ酸１０７〜１１６（Ｐ５−１）に対応するペプチドがＯＸ４０ＲのＯＸ４０Ｌへの結合をなおも阻害できるため、ヒトＯＸ４０Ｌ（Ｐ５）のアミノ酸９４〜１２４を含む領域は最小領域でなかった。その他の試験されたペプチドは、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用に対する効果を全くあるいはほとんど示さなかった（図６Ｂ）。

Ｐ５−１ペプチドのＣ−末端の６個のアミノ酸を含有するＰ４ペプチドは、ＯＸ４０Ｒと非常に不十分に結合することが立証されるので、例えば配列ＧＹＦＳＱ（ペプチドＰ５−１ａ；ヒトＯＸ４０Ｌ中のアミノ酸１０７〜１１１；配列番号：１３）などのＰ５−１ペプチドのＮ−末端アミノ酸が、ＯＸ４０Ｒ結合剤として機能的に活性の最小ペプチド配列を表すかも知れないことも推論される。マウスＯＸ４０Ｌ由来ペプチドＰ−ＯＸ−１（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６）と比較すると、このペプチドは、２個の非保存的置換を含有する（図６Ａ）。

この実施例で競合アッセイによって同定されるＰ５およびＰ５−１ペプチドの配列により、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用において重要な役割を果たすＯＸ４０Ｌ中の構造が同定でき、ＯＸ４０Ｌが特異的ペプチド配列によって効果的に競合できることが実証される。これらのファミリーに属するタンパク質間の接触領域は、リガンド−受容体の対の中で非常に多様であるので、これらの知見は、これらのタンパク質の構造−活性度関係にかかわる現状技術、あるいはその他のＴＮＦ／ＴＮＦＲ−様タンパク質の分析からは予測可能でなかった（ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ＪＬら、２００２）。

実施例１でＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用の阻害剤として同定されるペプチドの親和性は、自然な状態でビーズまたはその他の支持体なしに、溶液中でこのような測定ができるようにする技術である、蛍光消光分光分析によって評価された。この方法は、別のタンパク質（Ｐ５またはＰ５−１）との結合時に、タンパク質（ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ１）の内部蛍光の変化をモニターすることに基づく。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁と、増大する濃度のＰ５またはＰ５−１ペプチドとのインキュベーションにより、ペプチドＰ５およびＰ５−１濃度に対してＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁の蛍光変化をプロットすると、その内部蛍光に双曲線の形状である変化が起きる（図７Ａおよび７Ｂ）。データの非線形回帰分析からは、それぞれ、ＯＸ４０ＲでＫＤ〜７．９ｎＭ、ペプチドＰ５およびＰ５−１でＫＤ〜２４．６ｎＭである見かけの解離定数が明らかになる。これらの値からは、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁と選択されたペプチドの間の高親和性相互作用が実証されるので、それはＯＸ４０Ｌ拮抗剤として使用できる。

本実施例で提示した知見は、ＯＸ４０Ｒに効率的に結合する特異的ＯＸ４０Ｌ由来ペプチドを使用することで、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用が効果的に阻害できることを示し、ＯＸ４０Ｒ径路をターゲットととし、その調節下での異常なまたは望ましくない生理的事象を阻害する薬剤開発のための新しい機会が提供される。次にこれらのＯＸ４０Ｒ結合剤は、技術分野で既知の動物および細胞生物学アッセイを使用して、ＯＸ４０Ｒとの相互作用においてＯＸ４０Ｌの拮抗剤としてさらに詳しく特性決定され（国際公開第９９／４２５８５号パンフレット；イムラ（Ｉｍｕｒａ）Ａら、１９９７；ノハラ（Ｎｏｈａｒａ）Ｃら、２００１；ピッピグ（Ｐｉｐｐｉｇ）ＳＤら、１９９９；コタニ（Ｋｏｔａｎｉ）Ａ．ら、２００２）、妥当なモデルにおいて、その他の可能な使用制限的副作用を試験することで、さらに有効性確認できる（コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）ＲＡら、２００１）。

参考文献
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ピッピグ（Ｐｉｐｐｉｇ）ＳＤら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６３：６５２０〜６５２９、１９９９
ラネー（Ｒａｎｎｅｙ）ＤＦ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５９：１０５〜１１４、２０００
ロゴブ（Ｒｏｇｏｖ）ＳＩおよびネクラソブ（Ｎｅｋｒａｓｏｖ）ＡＮ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ、１４：４５９〜４６３、２００１
ソーヤー（Ｓａｗｙｅｒ）ＴＫ、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」より、ヴィーラパンディアン（Ｖｅｅｒａｐａｎｄｉａｎ）Ｐ編、マーセル・デッカー・インコーポレイテッド（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ）、５５７〜６６３ページ、１９９７
ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８３：９７９〜９８９、１９９６
テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｌおよびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）Ｈ、Ｊ Ｉｍｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５５：６７〜７２、２００１
テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｌら、Ｊ Ｌｅｕｋ Ｂｉｏｌ、７２：５２２〜５２９、２００２
ツカダ（Ｔｓｕｋａｄａ）Ｎら、Ｂｌｏｏｄ、９５：２４３４〜２４３９、２０００
ウルマン（Ｕｌｌｍａｎ）Ｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、９１：５４２６〜５４３０、１９９４
ヴィラン（Ｖｉｌｌａｉｎ）Ｍら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、８：６７３〜９、２００１
ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）Ａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ、２：１８３〜１８９、１９９６
ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）Ａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６２：１８１８〜１８２６、１９９９
ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）Ａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３：１０２〜１０９、２００２
ヨシオカ（Ｙｏｓｈｉｏｋａ）Ｙら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３０：２８１５〜２８２３、２０００

ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用の研究のためのこのアプローチの実施可能性を実証するために最初開発された、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMアッセイの実験デザイン。 アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMアッセイを使用して検出されたＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁へのＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８の用量依存性結合。（Ａ）増大する濃度のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８を濃度５ｎＭ（○）または１０ｎＭ（●）のＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁と共に３０分間インキュベートした。次にビオチン化抗ＣＤ８抗体（１０ｎＭ）を添加し、３０分後、ストレプトアビジン供与体（２０ｍｇ／ｍｌ）およびタンパク質Ａアクセプター（２０ｍｇ／ｍｌ）ビーズを添加した。これらの添加の１時間後、プレートをフュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）^TMリーダー上でカウントした。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（黒四角）不在下では、非常に弱いシグナルのみが検出された。（Ｂ）シグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比に対する増大するＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁濃度の効果。Ｓ／Ｂ比は、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（１００ｎＭ）存在下で得られたカウントをバックグラウンドカウント（ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８不在下）で除して計算された。データは平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表され、全ての実験は、三連で３回実施した。 ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁のためのＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８のＫ_D定量。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（１０ｎＭ）を増大する濃度のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８存在下でインキュベートした。スラミン（１ｍＭ）存在下で求めた全結合（黒四角）と非特異的結合（●）の差として、特異的結合（□）を計算した。三連で実施した３回の実験からの平均±ＳＥＭとしてデータを表した。 ＯＸ４０ＬとスラミンによるＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８結合に対する競合作用。ビオチン化抗ＣＤ８抗体（１０ｎＭ）の添加に先だって、ＯＸ４０−ＩｇＧ（１０ｎＭ）、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（４０ｎＭ）、および増大する濃度の可溶性ＯＸ４０Ｌ（●）またはスラミン（○）を３０分間インキュベートした。３０分後、ストレプトアビジン供与体およびタンパク質Ａアクセプタービーズを添加した。グラフは、（阻害剤の不在下で得られた）最大アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルの阻害率を表す。三連で実施した３回の実験からの平均±ＳＥＭとしてデータを表した。 ＯＸ４０Ｌ断片のＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁への結合。（Ａ）アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイによって試験されたペプチド、またはマウスＯＸ４０Ｌ由来Ｐ−ＯＸ−１およびＰ−ＯＸ−２ペプチド（配列の下；非同一アミノ酸を表示）に対応する配列と共に、主要タンパク質領域の位置（配列の上）が表示されるヒトＯＸ４０Ｌ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃ．番号Ｐ２３５１０）の配列。（Ｂ）ペプチドＰ４、Ｐ５によるＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８に対する結合の阻害、およびペプチドなしの対照。 マウスＯＸ４０Ｌ由来ペプチドＰ−ＯＸ−１（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６；表Ｉに示す§は非保存的置換を示し、そして・は保存的置換を示す）、およびアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイで試験したＰ５由来ペプチドの配列と並べた、ペプチドＰ５のＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（Ａ）配列に対するＰ５由来ペプチドの結合。ペプチドＰ５−１ａは、Ｐ５−１で囲まれた配列である。（Ｂ）ペプチドＰ５のその他の断片によって提供される効果と比較した、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイにおける、ペプチドＰ５−１によるＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８に対する結合の阻害。 蛍光消光分光分析を使用して測定したペプチドＰ５（Ａ）およびＰ５−１（Ｂ）とのＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁相互作用。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁蛍光変化の非線形回帰分析からは、２個のペプチドのＫｄ値として示されるＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁−ペプチド複合体の解離定数と共に、可飽和結合が明らかになる。

Claims (34)

1. ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸９４〜１２４（配列番号：６）のペプチド配列に対応するＯＸ４０Ｒ結合剤。
2. １つ以上のアミノ酸が欠落し、ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸１０７〜１１１（配列番号：１３）を含む、アミノ酸９４〜１２４（配列番号：６）に対応するペプチド配列からなるヒトＯＸ４０Ｌのペプチド配列であるＯＸ４０Ｒ結合剤。
3. ５〜１０個のアミノ酸を有するヒトＯＸ４０Ｌのペプチド配列である、請求項２に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤。
4. ヒトＯＸ４０Ｌの１０７〜１１６（配列番号：８）、または１０７〜１１１（配列番号：１３）に対応する配列を有するペプチドである、請求項３に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤。
5. １つ以上のアミノ酸が保存的に置換されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドの活性変異体であるＯＸ４０Ｒ結合剤。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のアミノ酸配列と、ヒトＯＸ４０Ｌ（配列番号：１）以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列とを含む、融合ポリぺプチドまたはペプチドであるＯＸ４０Ｒ結合剤。
7. 融合ポリぺプチドまたはペプチドが、膜結合タンパク質、膜結合タンパク質の細胞外領域、免疫グロブリン定常部、多量体化領域、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、搬出シグナル含有タンパク質の１つ以上のタンパク質配列に属するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤の活性画分、前駆物質、塩、または誘導体であるＯＸ４０Ｒ結合剤。
9. 請求項４に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤の配列および／または構造に基づいてデザインされた、ペプチド、ペプチドミメティック、または非ペプチドミメティックであるＯＸ４０Ｒ結合剤。
10. 分子が、放射性標識、ビオチン、蛍光標識、細胞毒性作用物質、およびドラッグデリバリー作用物質の中から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤の活性接合体または複合体である、ＯＸ４０Ｒ結合剤。
11. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤をコードする核酸。
12. 請求項１１に記載の核酸によってコードされたＯＸ４０Ｒ結合剤の発現を可能にする、ウィルスまたはプラスミド起源のベクター。
13. 請求項１２に記載の発現ベクターで形質転換されている、原核または真核宿主細胞。
14. 請求項１３に記載の細胞内で実質的に富化された分離安定細胞系。
15. ＯＸ４０Ｒ結合剤が細胞膜上で分泌または発現される、請求項１４に記載の細胞系。
16. 請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の細胞を培養するステップと、前記結合剤を収集するステップとを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤を製造する方法。
17. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤の精製品。
18. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤の薬物としての使用。
19. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤のヒトＯＸ４０Ｌ拮抗剤としての使用。
20. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤のヒトＲＡＮＴＥＳ拮抗剤としての使用。
21. 自己免疫疾患、炎症、または感染症の予防および／または治療のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤の医薬組成物中の活性成分としての使用。
22. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤を活性成分として含む、ＣＤ４⁺Ｔ細胞に関する疾患の予防および／または治療のための医薬組成物。
23. 薬学上許容可能なキャリア、賦形剤、安定剤、および／または希釈剤と組み合わせた、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. ＣＤ４⁺Ｔ細胞に関する疾患が、移植自己免疫疾患、炎症、または感染症である、請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
25. 膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域の検出のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤、または請求項１４または１５に記載の細胞の使用。
26. 活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の検出のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤、または請求項１４または１５に記載の細胞の使用。
27. 膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒ細胞外領域の、または活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の検出、精製、および／または濃縮のための支持体であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤を固定化形態で有する支持体。
28. サンプルを請求項２７に記載の支持体、または請求項１４または１５に記載の細胞に接触させるステップを含む、前記サンプル中の膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒ細胞外領域の、または活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の検出、精製、および／または濃縮方法。
29. 減少したまたは増大したＣＤ４⁺Ｔ細胞または可溶性ＯＸ４０Ｒタンパク質の存在に関連した病状を診断するために使用される、請求項２８に記載の方法。
30. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤または請求項１４または１５に記載の細胞を投与するステップを含む、自己免疫疾患、炎症、または感染症の予防および／または治療方法。
31. ａ）ｉ）請求項１〜１０に記載の化合物、請求項１４または１５に記載の細胞、および請求項２７に記載の支持体の中から選択されるＯＸ４０Ｒ結合剤を構成する要素、
    ｉｉ）ＯＸ４０Ｒの細胞外領域を含むタンパク質、その表面にＯＸ４０Ｒの細胞外領域を発現する細胞系、およびＯＸ４０Ｒの細胞外領域を分泌する細胞系の中から選択されるＯＸ４０Ｒ部分を構成する要素、および
    ｉｉｉ）ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用モジュレーターとして試験される化合物
    の要素を含むサンプルを形成するステップと、
    ｂ）要素（ｉ）と（ｉｉ）との間の相互作用に対する化合物（ｉｉｉ）の効果を直接的または間接的に検出するステップと、
    ｃ）（ｂ）において、（ａ）の要素の質および／または量の点で異なるサンプル間で検出された効果を比較するステップと
    を含む、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用を調節する化合物の性質および活性度の判定のためのスクリーニング検査。
32. 請求項１〜１０に記載のＯＸ４０Ｒ結合剤、請求項１４または１５に記載の細胞、または請求項２７に記載の支持体を含む、ＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域または活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞を検出するためのキット。
33. 患者から得られたサンプル中の減少したまたは増大したＣＤ４⁺Ｔ細胞または可溶性ＯＸ４０Ｒタンパク質の存在による病状の診断のための請求項３２に記載のキット。
34. 異なるタグ配列を有する融合タンパク質として膜結合性タンパク質の細胞外部分とタンパク質リガンドとを含む、タンパク質リガンドと膜結合性タンパク質との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングするためのキット。

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