CN109422801A - 多功能靶向多肽rap及其在制备肿瘤靶向递送系统中的用途 - Google Patents

多功能靶向多肽rap及其在制备肿瘤靶向递送系统中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属药学领域，涉及多功能靶向多肽RAP，具体涉及多功能靶向多肽RAP及其药物复合物和修饰的纳米递药系统以及其在制备肿瘤靶向递送系统中的用途。经试验结果显示，所述多肽均被高表达LRP1的细胞特异性摄取，可跨越血‑脑屏障，靶向肿瘤新生血管和跨血‑肿瘤屏障，靶向肿瘤拟态血管与肿瘤细胞；多肽RAP修饰的药物，或修饰的高分子载体材料所构建的纳米递药系统可更有效地将所携带药物或纳米递药系统所包载药物递送至靶组织，如脑组织、肿瘤新生血管、拟态血管、肿瘤细胞，显著提高抗肿瘤药效。所述多肽在肿瘤诊断和靶向治疗中具备良好的应用前景。

Description

多功能靶向多肽RAP及其在制备肿瘤靶向递送系统中的用途
技术领域
本发明属药学领域，涉及多功能靶向多肽RAP，具体涉及多功能靶向多肽RAP及其药物复合物和修饰的纳米递药系统及其在制备肿瘤靶向递送系统中的用途。
背景技术
现有技术公开了肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病，死亡率高居所有疾病死亡率首位。传统的化疗作为肿瘤药物治疗的主要手段，存在对肿瘤组织选择性差、毒性大、治疗窗窄、易产生多药耐药等缺陷。因此，为克服传统治疗手段的局限性，近年来，主动靶向成为提高肿瘤组织靶向效率的重要策略。主动靶向策略主要针对肿瘤组织中高表达的受体或转运体，利用与特异性受体或转运体具有识别、结合能力的对应配体，将药物或纳米递药系统递送至肿瘤组织或细胞中；配体修饰后的药物或纳米递药系统可通过细胞表面受体或转运体与配体的特异性识别、结合、内化，将药物递送至肿瘤组织和细胞内，从而实现对肿瘤的主动靶向。研究显示，目前的配体大多数只是针对某一受体或某一细胞的靶向，然而肿瘤组织不只有肿瘤细胞，还有肿瘤拟态血管、肿瘤新生血管和血-肿瘤屏障(BTB)等；脑部肿瘤还存在血-脑屏障(BBB)，使约98％小分子化疗药物和几乎100％蛋白类等大分子药物无法透过BBB进入脑内，导致药物治疗几乎无效。因此，开发具有多功能靶向配体对肿瘤的主动靶向治疗具有重要的临床意义。
研究报道了低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(Low-density lipoproteinreceptor-related protein-1,LRP1)，是一种细胞表面蛋白，属于一种内吞性受体，是低密度脂蛋白受体(LDLR)家族中的一员；LRP1在脑毛细血管内皮细胞、肿瘤新生血管和多种肿瘤或者中枢神经系统的病灶部位过表达，例如阿尔茨海默症、恶性星形细胞瘤，特别是胶质母细胞瘤，肝癌、乳腺癌、肺癌等。受体相关蛋白(receptor asscicated protein,RAP)是LRP1的配体之一，它是一种常驻内质网蛋白，分子量为39kDa，目前已证实是LDLR家族的分子伴侣，对该家族受体由内质网向细胞膜运输、正确折叠成熟及成熟过程中免受其他配体结合的攻击起到至关重要的作用。有研究显示RAP蛋白与LRP1有高度的亲和力，已成为研究LDLR家族受体的良好工具，但是大分子量的RAP蛋白生产困难，作为配体在修饰递药系统时存在分子量过大、修饰难度大、不易纯化等缺点，因而目前并未见有将RAP蛋白作为配体的研究报道以及应用于靶向递药系统中。根据RAP蛋白与LRP1的X-单晶衍射结构分析发现，RAP蛋白分为domain 1(d1)、domain 2(d2)、domain 3(d3)三个结构域，其中d3结构域在与LRP1的结合中发挥主要作用，并且，第256位、第270位的赖氨酸是RAP D3区域与LRP1结合的关键位点，第253位的赖氨酸也有一定的作用，但不如256与270位作用关键。
基于现有技术现状，本发明利用计算机辅助设计方法，将RAP蛋白缩简为一段包含K253、K256和K270位点的含22个氨基酸的短肽RAP22和DRAP22，并进一步简化为含K253、K256位点的12个氨基酸的短肽RAP12和DRAP12，使其保持与LRP1的高亲和力，具有跨血-脑屏障(BBB)、血-肿瘤屏障(BTB)靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞的多重靶向功能。同时，构建所述RAP多肽修饰的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的递药系统，从而更为有效地发挥对脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向诊治作用。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供一种多功能靶向多肽RAP及其药物复合物和修饰的纳米递药系统，该多功能多肽可特异性亲和低密度脂蛋白受体LRP1，可靶向脑毛细血管内皮细胞并跨越血-脑屏障、靶向肿瘤新生血管内皮细胞并跨越血-肿瘤屏障，同时靶向肿瘤拟态血管和肿瘤细胞。
本发明还提供了多功能靶向多肽RAP在制备肿瘤靶向递送系统中的用途；所述肿瘤尤其涉及脑部肿瘤或具有脑转移特征的外周肿瘤。
本发明所述的纳米递药系统包括修饰的高分子载体材料及其所构建的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统，
本发明中采用一种与低密度脂蛋白受体LRP1高亲和的，可靶向脑毛细血管内皮细胞并跨越血-脑屏障、靶向肿瘤新生血管内皮细胞并跨越血-肿瘤屏障，同时靶向肿瘤拟态血管和肿瘤细胞的多功能靶向多肽RAP(LRAP22(L构型氨基酸序列为EAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLR)及其逆序翻转D肽DRAP22(D构型氨基酸序列DRDLDKDEDHDADIDEDLDQDKDQDYDHDNDHDKDEDIDKDADE)和LRAP12(L构型氨基酸序列EAKIEKHNHYQK)及其逆序翻转D肽DRAP12(D构型氨基酸序列DKDQDYDHDNDHDKDEDIDKDADE))，并用其修饰药物分子和高分子载体材料，构建RAP-药物复合物、RAP修饰的纳米递药系统，以提高药物对脑、脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向诊疗效果。
本发明中，所述的多肽RAP，巯基化后能与含有马来酰亚胺基团的影像物质X反应，通过共价键连接得到的RAP-X复合物，其中X是荧光物质Fluorescein，近红外染料Cy7、IR820、DiR，磁共振影像剂Gd-DTPA，放射影像剂99mTc-DTPA，可用于高表达LRP1的脑部肿瘤或外周肿瘤的影像诊断和示踪；
本发明中，所述的多肽RAP，通过pH敏感的腙键、pH敏感的硼酸脂键、二硫键与治疗药物连接，或直接与多肽药物缩合，获得RAP-Y复合物，其中Y是抗肿瘤药物中的阿霉素和表阿霉素等蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇和卡巴他赛等紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱和伊立替康等喜树碱类药物、长春新碱和长春瑞滨等长春花碱类药物、硼替佐米等佐米类药物、p53激活肽等多肽类药物，可用作脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向治疗。
本发明中，所述的多肽RAP，巯基化后能与马来酰亚胺化的聚乙二醇-Z复合物连接，得到RAP-聚乙二醇-Z复合物，其中Z是磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)；其中的RAP-聚乙二醇-磷脂复合物可用于脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统和聚合物圆盘递药系统的制备；其中的RAP-聚乙二醇-聚乳酸复合物，RAP-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物，RAP-聚乙二醇-聚己内酯复合物可用于聚合物胶束递药系统、纳米粒递药系统的制备；所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统，可用于包载诊断药物，进行高表达LRP1的脑部肿瘤或外周肿瘤的影像诊断和示踪；所包载药物是荧光物质香豆素6、FAM，近红外染料Cy7、IR820、DiR、DiD，磁共振影像剂Gd-DTPA，可用于脑部肿瘤或外周肿瘤的影像诊断和示踪；
所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统可用于包载肿瘤治疗药物；所包载得肿瘤治疗药物是阿霉素和表阿霉素等蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇和卡巴他赛等紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱和伊立替康等喜树碱类药物、长春新碱和长春瑞滨等长春花碱类药物、硼替佐米和卡非佐米等蛋白酶体抑制剂、小白菊内酯等内酯类药物、p53激活肽和蜂毒肽、蝎毒肽和抗菌肽等多肽类药物，可用于脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向治疗。
更具体的，本发明根据计算机辅助设计，设计并合成了多肽靶向分子RAP(LRAP22(L构型氨基酸序列为EAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLR)及其逆序翻转D肽DRAP22(D构型氨基酸序列DRDLDKDEDHDADIDEDLDQDKDQDYDHDNDHDKDEDIDKDADE)和LRAP12(L构型氨基酸序列EAKIEKHNHYQK)及其逆序翻转D肽DRAP12(D构型氨基酸序列DKDQDYDHDNDHDKDEDIDKDADE))，其与低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP1具有高亲和力，可发挥跨越血-脑屏障和血-肿瘤屏障，并靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞的多功能靶向作用。
本发明所设计的多肽RAP连接半胱氨酸后，可利用其分子中巯基与马来酰亚胺功能化影像物质(如Fluorescein、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、磁共振影像剂Gd-DTPA、放射影像剂99mTc-DTPA等)反应而形成复合物。
本发明所设计的多肽RAP修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成pH敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱和长春瑞滨等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成pH敏感硼酸脂(涉及硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及p53激活肽等多肽药物)的RAP-药物复合物。
本发明所设计的多肽RAP连接半胱氨酸后，可修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)等高分子载体材料上，可用于多肽RAP修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统的构建。
本发明所设计的多肽RAP修饰的纳米递药系统可包载阿霉素和表阿霉素等蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇和卡巴他赛等紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱和9-硝基喜树碱和伊立替康等喜树碱类药物、长春新碱和长春瑞滨等长春碱类药物、硼替佐米和卡非佐米等蛋白酶体抑制剂、小白菊内酯等内酯类药物、p53激活肽、蜂毒肽和蝎毒肽等多肽毒素、抗菌肽等抗肿瘤药物；也可包载影像物质，如香豆素6、FAM，近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、DiD，磁共振影像剂Gd-DTPA等。
本发明所设计的多肽RAP均可介导药物或纳米递药系统通过LRP1受体途径跨越血-脑屏障和血-肿瘤屏障，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞，用于脑、脑部肿瘤或具有脑转移特征外周肿瘤的靶向诊断和治疗。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
1.合成多肽RAP、RAP-Cys及其荧光标记物(RAP-FAM)
采用Boc多肽固相合成方法合成多肽RAP以及连接半胱氨酸的多肽RAP。通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了RAP-FAM。HPLC、MS表征结构。
2.合成RAP-DTPA-Gd、RAP-DTPA-99mTc
通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了RAP-DTPA和RAP-DTPA，螯合Gd或99mTc得RAP-DTPA-Gd或RAP-DTPA-99mTc。
3.多肽RAP与LRP1亲和性评价
采用表面等离子共振法测定多肽RAP与LRP1蛋白的结合常数KD值，评价其亲和性。
4.多肽RAP体外靶向能力评价
考察RAP-FAM与高表达LRP1受体的细胞如：脑毛细血管内皮细胞bEnd.3、人脐静脉内皮细胞HUVEC和模型肿瘤细胞(如：脑胶质瘤细胞U87)的体外靶向性。考察体外3D肿瘤球模型对RAP-FAM的摄取能力。
5.制备RAP-药物复合物
连接半胱氨酸后的多肽RAP与药物的马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含pH敏感腙键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物。
连接半胱氨酸后的多肽RAP与药物的3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱、长春瑞滨等含羟基或氨基的药物。
多肽RAP通过修饰上多巴胺进而与药物的硼酸基团反应，形成含pH敏感硼酸脂的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物。
多肽RAP通过固相合成直接与多肽药物缩合，其中所涉及药物包括p53激活肽等多肽药物。
6.多肽RAP修饰的纳米递药系统的构建与表征
首先合成多肽RAP修饰的高分子材料RAP-PEG-PLA、RAP-PEG-DSPE、RAP-PEG-PLGA以及RAP-PEG-PCL等。通过连接半胱氨酸的多肽上游离巯基与Mal-PEG-PLA、Mal-PEG-DSPE所含马来酰亚胺的反应实现材料的合成。Mal-PEG-PLGA、Mal-PEG-PCL等所含马来酰亚胺的反应实现材料的合成，即：将Mal-PEG-DSPE、Mal-PEG-PLA、Mal-PEG-PLGA、Mal-PEG-PCL等分别溶解在乙腈中，旋转蒸发，成膜，分别加入含巯基多肽RAP的PBS(pH7.2)反应制备，得到多肽RAP修饰的高分子材料。
然后制备多肽RAP修饰的纳米递药系统。一定量的多肽RAP修饰的高分子材料和一定量必要的组分以及上述药物，采用适宜的方法制备相应的多肽RAP修饰脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、聚合物纳米粒等纳米递要系统；激光散射粒度仪表征纳米递药系统粒径和粒径分布。
7.多肽RAP修饰的纳米递药系统的体内外靶向性评价
考察多肽RAP修饰的纳米递药系统的跨BBB、BTB转运能力。
考察多肽RAP修饰的纳米递药系统在跨BBB之后靶向肿瘤球的能力。
通过正常小鼠尾静脉注射包载荧光物质的多肽RAP修饰的纳米递药系统，考察其脑组织的分布。
通过荷U87原位瘤模型裸鼠尾静脉注射包载荧光物质的多肽RAP修饰的纳米递药系统，考察其在各时间点的肿瘤内分布。
8.多肽RAP修饰的纳米递药系统的体内外抗肿瘤效果评价
以MTT法考察包载肿瘤治疗药物的多肽RAP修饰纳米递药系统对U87细胞和HUVEC细胞的体外生长抑制效果，对肿瘤新生血管和拟态血管形成的抑制效果。
通过荷U87原位瘤模型裸鼠尾静脉注射包载肿瘤治疗药物的多肽RAP修饰纳米递药系统，以生存时间、肿瘤组织细胞凋亡、新生血管数量为指标评价体内抗肿瘤效果。
本发明提供了多肽RAP制备和性质考察以及上述所修饰的药物复合物和纳米递药系统用于肿瘤诊疗的物质基础。本发明的试验结果表明：多肽RAP与LRP1具有高亲和力，具有良好的跨越血-脑屏障和血-肿瘤屏障能力，在模型动物体内具有良好的脑和肿瘤组织靶向能力和影像效果，并表现出更优脑部肿瘤靶向能力；多肽RAP修饰的纳米递药系统显示出了良好的肿瘤靶向性能和更强的抗肿瘤效果。
附图说明
图1.LRAP22-Cys的HPLC和ESI-MS图谱
色谱方法：色谱柱(YMC，C18)：150×4.6mm；流动相A：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：0-45min，5％B-65％B；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；检测：UV 214nm，保留时间：13.5min。ESI-MS：2845.6，与理论分子量相符合。
图2.L RAP12-Cys的HPLC和ESI-MS图谱
色谱方法同上，保留时间：11.5min。ESI-MS：1626.0，与理论分子量相符合。
图3.LRAP22-FAM的HPLC和ESI-MS图谱
色谱方法同上，保留时间：16.7min。ESI-MS：3273.0，与理论分子量相符合。
图4.LRAP12-FAM的HPLC和ESI-MS图谱
色谱方法同上，保留时间：15.7min。ESI-MS：2053.8，与理论分子量相符合。
图5.LRAP22-PEG3000-PLA2000和LRAP12-PEG3000-PLA2000的1H-NMR图谱
Mal-PEG3000-PLA2000的核磁图谱于7.0ppm显示出马来酰亚胺峰，而RAP22-PEG3000-PLA2000和RAP12-PEG3000-PLA2000的核磁图谱中该峰消失，显示Mal-PEG3000-PLA2000中的马来酰亚胺基团已连接上多肽。
图6.LRAP22和LRAP12与LRP1结合活性
LRAP22和LRAP12与LRP1的结合解离模式为慢结合慢解离模式。拟合结果可见LRAP22、LRAP12均与LRP1蛋白有高亲和活性，LRAP12稍弱于LRAP22，KD值分别为62.52nM和196.9nM。
图7.脑胶质瘤细胞U87对荧光素标记多肽的摄取
图A和图B分别为FAM标记的LRAP22和LRAP12与U87细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。可见U87细胞对LRAP22和LRAP12有明显摄取，显著高于游离荧光素，但二者之间无显著性差异。
图8.脐静脉内皮细胞HUVEC对荧光素标记多肽的摄取
图A和图B分别为荧光素标记的LRAP22和LRAP12与HUVEC细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。可见HUVEC细胞对LRAP22和LRAP12有明显摄取，显著高于游离荧光素，但二者之间无显著性差异。
图9.脑毛细血管内皮细胞bEnd.3对荧光素标记多肽的摄取
图A和图B分别为FAM标记的LRAP22和LRAP12与bEnd.3细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果。可见bEnd.3细胞对LRAP22和LRAP12多肽有明显摄取，显著高于游离荧光素，但二者之间无显著性差异。
图10.人肝脏细胞HL7702对荧光素标记多肽的摄取
LRAP22和LRAP12分别与HL7702细胞作用4h后流式细胞荧光检测结果表明，HL7702细胞对LRAP22和LRAP12几乎无摄取，表明了多肽LRAP22和LRAP12可被高表达LRP1受体的细胞更多地摄取。
图11.荧光素标记多肽的体外跨血-脑屏障(BBB)转运
结果表明，37℃孵育条件下，LRAP22和LRAP12的BBB转运呈现时间依赖性，随着时间的延长，二者转运量均增加。4h时，LRAP22下室的转运量为 15.2±1.00％，LRAP12为 17.6±0.88％，两者无显著性差异。
图12.荧光素标记多肽的体外跨血-肿瘤屏障(BTB)转运
结果表明，37℃孵育条件下，LRAP22和LRAP12的BTB转运呈现时间依赖性，随着时间的延长，二者转运量均增加。4h时，LRAP22下室的转运量为10.27±0.21％，LRAP122为9.64±0.60％，两者无显著性差异。
图13.荧光素标记多肽的体外跨BBB后U87肿瘤球摄取
作用4h后的共聚焦照片结果表明，LRAP22和LRAP12均能有效地介导跨越体外BBB模型并被下室U87肿瘤球摄取，具备良好的体外跨BBB并靶向脑胶质瘤的特性。
图14.LRAP22和LRAP12修饰的胶束体外跨血-脑屏障(BBB)和跨血-肿瘤屏障(BTB)转运
图A为跨BBB转运。结果显示，LRAP22和LRAP12修饰的胶束在各时间点下室转运量均显著高于未修饰胶束组(p<0.001)。4h时，LRAP22胶束组和LRAP12胶束组下室的转运量分别为未修饰胶束组的2.2倍和2.1倍，具有显著性差异；
图B为跨BTB转运。结果显示，LRAP22和LRAP12修饰的胶束组能够有效跨BTB，转运量均显著高于未修饰胶束组(p<0.001)。4h时，LRAP22胶束组和LRAP12胶束组下室的转运量分别为未修饰胶束组的2.3倍和2.2倍，具有显著性差异。
图15.LRAP22和LRAP12修饰胶束的体外跨BBB后U87肿瘤球摄取
作用4h后的共聚焦照片结果表明，相比未修饰胶束组，LRAP22修饰的胶束和LRAP12修饰的胶束均能更好地跨越体外BBB模型并被下室U87肿瘤球摄取，显示出良好的体外跨BBB并靶向脑胶质瘤的特性。
图16.载近红外荧光染料DiR的LRAP22和LRAP12修饰胶束的正常小鼠脑组织分布
图A为Micelle/DiR、LRAP22-Micelle/DiR和LRAP12-Micelle/DiR组在2h时的正常小鼠离体脑组织内分布，图B为定量数据，结果表明，LRAP22和LRAP12修饰的胶束在脑部荧光分布均明显高于未修饰胶束(p<0.01)，提示LRAP22和LRAP12修饰后均能促进胶束跨BBB入脑。
图17.载近红外荧光染料DiR的LRAP22和LRAP12修饰胶束对原位脑胶质瘤靶向性
图A为Micelle/DiR、LRAP22-Micelle/DiR和LRAP12-Micelle/DiR在荷脑胶质瘤原位肿瘤模型鼠的在体脑内分布。图B为24h离体脑内分布及其他主要脏器分布。图C为离体荷瘤脑荧光强度的半定量数据。结果显示，LRAP22和LRAP12修饰的胶束在脑内的分布主要集中在脑肿瘤区域，且荧光强度高于Micelle组。提示LRAP22与LRAP12修饰后均可促进胶束靶向至脑胶质瘤。
图18.载香豆素-6的LRAP胶束对原位瘤中肿瘤血管、肿瘤细胞的靶向性
图A和C为Micelle/DiR、LRAP22-Micelle/DiR和LRAP12-Micelle/DiR与血管标记物CD31共定位结果，图B和图D为各给药组与低密度脂蛋白标记物LRP1共定位的结果，结果显示LRAP22与LRAP12修饰的胶束在肿瘤内荧光强度明显高于未修饰组，且与CD31、LRP1良好共定位。提示LRAP22和LRAP12均能有效介导胶束靶向LRP1受体高表达的肿瘤新生血管和肿瘤组织或细胞。
图19.载紫杉醇的LRAP22或LRAP12修饰的胶束的粒径
图为Micelle/PTX、LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX的表征，各组胶束大小和形态均无显著差异，粒径在30nm左右。
图20.载紫杉醇的LRAP22或LRAP12修饰胶束对体外U87细胞和HUVEC抑制曲线
图A和图B分别为胶束对U87和HUVEC细胞的抑制曲线图。结果显示，LRAP22-Micelle/PTX与LRAP12-Micelle/PTX对U87细胞的IC50分别为9.55nM和11.2nM，相比Micelle/PTX(IC50＝23.4nM)和泰素(IC50＝24.0nM)药效更强，LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX对HUVEC细胞的IC50分别为1.66nM和1.55nM，相比Micelle/PTX(IC50＝3.89nM)和泰素(IC50＝2.88nM)抑制效果更显著。
图21.载紫杉醇的LRAP22或LRAP12修饰胶束体外对新生血管形成的抑制
图A为LRAP22-Micelle/PTX、LRAP12-Micelle/PTX、Micelle/PTX和泰素对新生血管体外模型的抑制照片，图B为各组新生血管形成率的统计结果。结果显示，相比于Micelle/PTX和泰素，LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX能更显著地抑制新生血管的形成。
图22.载紫杉醇的LRAP22或LRAP12修饰胶束体外对拟态血管形成的抑制
图A为LRAP22-Micelle/PTX、LRAP12-Micelle/PTX、Micelle/PTX和泰素对拟态血管体外模型的抑制照片，图B为各组拟态血管形成率的统计结果，结果显示，相比于Micelle/PTX和泰素，LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX能更显著地抑制拟态血管的形成。
图23.载紫杉醇的LRAP22或LRAP12修饰胶束体内抗原位脑胶质瘤药效
LRAP22-Micelle/PTX组、LRAP12-Micelle/PTX组、Micelle/PTX组、泰素组和生理盐水组的中位生存时间分别为33天、32天、26天、26.5天和25天。相比生理盐水、泰素和Micelle/PTX，LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX显著延长了模型鼠的生存时间(p<0.001)
图24.CD31染色结果
图A为LRAP22-Micelle/PTX组、LRAP12-Micelle/PTX组、Micelle/PTX组、泰素组和生理盐水组抑制新生血管形成的CD31染色照片(bar＝100μm)，其中新生血管细胞核呈棕黄色或棕褐色。图B为新生血管密度统计结果。结果显示，LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX均对肿瘤新生血管有明显的抑制作用，且相比Micelle/PTX、泰素和生理盐水有显著性差异。
图25.TUNEL染色结果
图A为LRAP22-Micelle/PTX组、LRAP12-Micelle/PTX组、Micelle/PTX组、泰素组和生理盐水组促进脑胶质瘤凋亡的TUNEL染色照片，其中凋亡的阳性细胞被染成棕色，细胞核为蓝色，图B为凋亡阳性率的统计结果。结果显示，与Micelle/PTX、泰素和生理盐水相比，LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX均能显著促进肿瘤组织的凋亡。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。
实施例1
LRAP22和LRAP12、LRAP22-FAM和LRAP12-FAM、LRAP22-药物复合物和LRAP12-药物复合物、LRAP22-PEG-PLA和LRAP12-PEG-PLA的合成与表征1)LRAP22和LRAP12的合成与表征
采用Boc固相多肽合成法，合成LRAP22和LRAP12。具体方法：在MBHA树脂上按序列依次接入氨基酸，以HBTU/DIEA为缩合剂、TFA为脱保护剂进行反应，反应完成后，将树脂用含p-cresol的氟化氢进行切割，冰浴搅拌反应1h，反应结束后减压抽去管中氟化氢，冰乙醚沉淀并洗涤沉淀3次，沉淀以20％乙腈重新溶解，收集滤液后旋蒸，得到多肽粗品溶液。多肽粗品用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。HPLC和ESI-MS分别表征纯度和分子量(Mw)。液相和质谱图如图1、图2所示；
2)LRAP22-FAM和LRAP12-FAM的合成与表征
如上，待所有氨基酸接入树脂后，再接入一个半胱氨酸，连接半胱氨酸的LRAP22(LRAP22-Cys)或LRAP12(LRAP12-Cys)溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，FAM-MAL溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待多肽反应完全后停止反应，制备液相纯化，用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。冷冻干燥得LRAP22-FAM和LRAP12-FAM纯品。液相和质谱图如图3、图4所示；
3)LRAP22-DTPA-Gd和LRAP12-DTPA-Gd、LRAP22-DTPA-99mTc和LRAP12-DTPA-99mTc的制备
LRAP22-Cys或LRAP12-Cys溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，maleimide-DTPA溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待反应完全后经制备液相，用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。冷冻干燥得LRAP22-DTPA或LRAP12-DTPA纯品，螯合Gd或99mTc即得LRAP22-DTPA-Gd和LRAP12-DTPA-Gd或LRAP22-DTPA-99mTc和LRAP12-DTPA-99mTc；
4)LRAP-药物复合物的制备
以LRAP22-阿霉素复合物制备作为LRAP22连接含酮或醛基药物的实施例。LRAP22-Cys多肽溶于3mL磷酸盐缓冲液(0.1mM，pH7.0)，加入10倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，于4℃搅拌20min。然后加入4倍摩尔量的阿霉素-6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h。反应液用制备液相纯化，冷冻干燥得LRAP22-阿霉素复合物；
以LRAP22-紫杉醇复合物LRAP22通过二硫键连接含羟基或氨基药物的实施例。200mg紫杉醇溶于10mL氯仿中，冷却至0-5℃，先后加入40mg DCC及60.4mg3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜。反应液过滤，经柱层析纯化(CHCl3/MeOH＝50:1-15:1，V/V洗脱)得紫杉醇-3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物。紫杉醇-3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在5mL DMF中，1.5倍摩尔量的LRAP22-Cys溶解在PBS/DMF中，溶液pH值保持4～5，将紫杉醇-3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至多肽溶液中，于室温反应6h，经制备液相纯化冻干得LRAP22-紫杉醇复合物；
以LRAP22-硼替佐咪复合物作为LRAP22连接含硼酸基团药物的实施例。依照LRAP22的合成在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，三氟乙酸脱去氮端的Boc保护。加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与DIEA的DMF溶液，于室温反应30min，洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以HBTU/DIEA为缩合剂，于室温反应1h。树脂用HF切割，并经制备型HPLC纯化得多肽-多巴胺衍生物。在pH 7.4的缓冲液中，多肽-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1:1混合即得LRAP22-硼替佐咪复合物；
以LRAP22-PMI(一种p53激活肽)作为RAP22连接多肽药物的实施例。直接通过固相多肽合成法制得，具体方法为：确定LRAP22-PMI多肽序列后，按与制备LRAP22相同的方法依次接入氨基酸，经HF切割并纯化后得LRAP22-PMI复合物；
5)LRAP22-PEG3000-PLA2000和LRAP12-PEG3000-PLA2000的合成与表征
将LRAP22-Cys或LRAP12-Cys溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.4)，取Mal-PEG3000-PLA2000溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待Mal-PEG3000-PLA2000反应完全后停止反应，过量的LRAP多肽和DMF透析(截留分子量3.5kDa)除去，冷冻干燥得LRAP22-PEG3000-PLA2000或LRAP12-PEG3000-PLA2000，NMR表征其结构(如图5所示)。
实施例2 多肽LRAP22和LRAP12与LRP1蛋白结合活性实验
通过biacore系统进行预结合分析，选取pH 4.5为最佳LRP1蛋白与CM5芯片结合pH。将重组人LRP1蛋白偶联至CM5芯片上，RU值达到目标值，将LRAP22和LRAP12多肽分别配置成一系列梯度浓度的样品溶液，从低到高依次进样，用Biacore T200Evaluation software软件分析LRAP22、LRAP12多肽与LRP1蛋白的结合活性，并分别计算其结合常数Ka值，解离常数Kd值，亲和常数KD值(如图6所示)。
实施例3 多肽LRAP22和LRAP12的体外细胞靶向性验证
1)LRAP22-FAM和LRAP12-FAM对脑胶质瘤细胞U87的体外靶向性
取对数生长期的单层培养的U87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的FAM、LRAP22-FAM和LRAP12-FAM溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片见附图7A。另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图7B所示；
2)LRAP22-FAM和LRAP12-FAM对人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外靶向性
取对数生长期的单层培养的HUVEC细胞，同上试验。细胞内化照片见附图8A，流式细胞结果如图8B所示；
3)LRAP22-FAM和LRAP12-FAM对人脑毛细血管内皮细胞bEnd.3的体外靶向性
取对数生长期的单层培养的bEnd.3细胞，同上试验，药液浓度为20μM。细胞内化照片见附图9A，流式细胞结果如图9B所示；
4)LRAP22-FAM和LRAP12-FAM靶向选择性实验
取对数生长期的人肝脏细胞HL7702同上方法进行流式细胞仪分析，结果图10所示。
实施例4 LRAP22-FAM和LRAP12-FAM体外跨生物膜屏障能力验证
1)LRAP22-FAM和LRAP12-FAM体外跨血-脑屏障BBB能力验证
4周龄SD大鼠断头后取脑，于冰冷的D-Hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，除去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和DNA酶。37℃消化90min后，1000r/min离心8min，弃去上清，转移至20％的BSA中，1000g/min 4℃离心20min，弃去上层溶液，将底部微血管转移至培液中，1000r/min离心5min后，底部微血管段用含20％胎牛血清的DMEM培养液配成微血管段悬液，接种于预先铺有鼠尾胶原的24孔transwell中，将transwell移入二氧化碳培养箱中，37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养24h使微血管段贴壁后，换成含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72h后，再换成不含嘌呤霉素的内皮专用培养液培养72h，测得跨膜电阻(TEER)超过250Ω·cm2后表明体外BBB建模成功；
用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为50μM LRAP22-FAM和LRAP12-FAM溶液。将transwell上室培养液吸出，加入上述溶液100μL，下室加入600μL DMEM培养液，37℃孵育，分别于各时间点取出下室溶液进行荧光定量，并补加等量的新鲜DMEM培养液，结果如图11所示；
2)LRAP22-FAM和LRAP12-FAM体外跨血-肿瘤屏障BTB能力验证
取对数生长期的HUVEC细胞和U87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液。将HUVEC细胞接种于24孔transwell的上室，每孔体积0.5mL；将U87细胞接种于transwell的下室，每孔体积1.5mL，每孔HUVEC与U87的细胞的数量比为1:5。将transwell培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养三天后，即可形成BTB模型；
用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为50μM LRAP22-FAM和LRAP12-FAM溶液。将transwell上室培养液吸出，加入上述溶液100μL，下室加入600μL DMEM培养液，37℃孵育，分别于各时间点取出下室溶液进行荧光定量，并补加等量新鲜DMEM培养液，结果如图12所示；
3)LRAP22-FAM和LRAP12-FAM体外跨血-脑屏障后U87肿瘤球摄取能力验证
将2％的低分子琼脂糖溶液趁热加入48孔板中，每孔150μL，室温放置冷却凝固后，每孔接种400μL U87细胞悬液，细胞密度为4×103个/孔，置于二氧化碳培养箱中，37℃、5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养7天即形成肿瘤球，将肿瘤球转移至体外BBB模型transwell下室构建体BBB/U87肿瘤球模型，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为50μM的LRAP22-FAM和LRAP12-FAM溶液，将体外BBB模型transwell上室的培养液吸出，给予上述溶液，给药4h后，取下室肿瘤球，用PBS洗2次，4％的多聚甲醛溶液固定30min，PBS洗净后，置于共聚焦荧光显微镜下观察，结果如图13所示。
实施例5 LRAP22和LRAP12修饰胶束的体外跨生物膜屏障能力验证
1)载香豆素-6胶束的制备及表征
称取1mg LRAP22-PEG-PLA或LRAP12-PEG-PLA，9mg mPEG-PLA和20μg香豆素-6(C6)，溶解在2mL甲醇中，37℃水浴，减压(～0.085MPa)蒸干，成膜，室温真空干燥过夜，加入2mL生理盐水水化，0.1μm水系膜过滤3次除去游离药物，制得包载C6的LRAP22修饰胶束(LRAP22-Micelle/C6)或LRAP12修饰胶束(LRAP12-Micelle/C6)，4℃保存，备用，动态光散射法测定粒径分布；2)LRAP22和LRAP12修饰胶束的体外跨BBB转运
用PBS配制香豆素-6浓度为10μg/mL的LRAP22-Micelle/C6、LRAP12-Micelle/C6与mMicelle/C6，将体外BBB模型transwell上室培养液吸出，分别加入上述溶液100μL，下室加入600μL PBS，于37℃孵育，分别于各时间点取出下室溶液进行荧光定量，并补加新鲜PBS，结果如图14A所示；
3)LRAP22和LRAP12修饰胶束的体外跨BTB转运
用PBS配制香豆素-6浓度为10μg/mL的LRAP22-Micelle/C6、LRAP12-Micelle/C6与Micelle/C6，将体外BTB模型transwell上室培养液吸出，分别加入上述溶液100μL，下室加入600μL PBS，于37℃孵育，分别于各时间点取出下室溶液进行荧光定量，并补加新鲜PBS，结果如图14B所示；
4)LRAP22和LRAP12修饰胶束的体外跨BBB后U87肿瘤球摄取能力验证
用含10％FBS的DMEM培养液配制香豆素-6浓度为10μg/mL的LRAP22-Micelle/C6、LRAP12-Micelle/C6与Micelle/C6。将体外BBB/U87模型transwell上室的培养液吸出，给予上述溶液。给药4h后，取下室肿瘤球，用PBS洗2次，4％的多聚甲醛溶液固定30min，PBS洗净后，置于共聚焦荧光显微镜下观察，结果如图15所示。
实施例6 LRAP22和LRAP12修饰胶束的体内跨BBB能力验证
1)制备载DiR胶束
载DiR胶束的制备方法同载C6胶束的制备；
2)LRAP22-Micelle/DiR和LRAP12-Micelle/DiR的体内BBB能力验证
ICR小白鼠(体重20g)尾静脉分别注射Micelle/DiR、LRAP22-Micelle/DiR和LRAP12-Micelle/DiR，2h后，乙醚麻醉，生理盐水心脏灌流，4％多聚甲醛灌流固定，取脑组织和各主要脏器组织器官(心、肝、脾、肺、肾)，通过活体成像仪观察并进行荧光半定量计算，结果如图16所示。
实施例7 LRAP22和LRAP12修饰胶束的体内肿瘤靶向性验证
取对数生长期的U87细胞，每只裸小鼠接种5×105个细胞(分散于5μL PBS缓冲液中)。裸小鼠麻醉后，用脑立体定位仪固定，细胞接种于纹状体右部(前囟前0.6mm，侧1.8mm，深3mm)，定期观察裸小鼠状态；
裸鼠接种肿瘤细胞后第7天，尾静脉分别注射Micelle/DiR、LRAP22-Micelle/DiR和LRAP12-Micelle/DiR，于注射后24h活体成像仪摄像记录DiR荧光体内分布，然后心脏灌流，取荷瘤脑组织于活体成像仪成像并进行荧光半定量计算，结果如图17所示；
裸鼠接种肿瘤细胞后第7天，尾静脉分别注射Micelle/DiR、LRAP22-Micelle/DiR和LRAP12-Micelle/DiR，给药后2h，心脏灌流，取出荷瘤脑组织，4％多聚甲醛固定过夜，蔗糖溶液梯度脱水3天，之后O.C.T包埋，制作冰冻切片，切片于4℃条件下，用2％BSA封闭非特异性免疫，30min后，PBS洗3次，每次5min，然后加入用2％BSA稀释的一抗(CD31、LRP1)，4℃孵育过夜。第二天，PBS洗3次，每次5min。然后加入2％BSA稀释的二抗Cy3，37℃孵育1h后，PBS洗3次，每次5min。DAPI染色5min，PBS洗，之后防淬灭剂封片，共聚焦显微镜进行观察，结果如图18所示。
实施例8 LRAP22和LRAP12修饰胶束的体外药效学试验
1)载紫杉醇胶束的制备及表征
载紫杉醇(PTX)胶束的制备方法同载C6胶束的制备。粒径、包封率和载药量如图19所示；
2)LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX的体外药效试验
采用MTT法测定细胞存活率。以5.0×103个/孔将U87细胞或HUVEC细胞接种于96孔板，24h后，将培养液吸出，加入200μL一系列浓度的LRAP22-Micelle/PTX、LRAP12-Micelle/PTX、Micelle/PTX或泰素，共培养72h，然后加入MTT溶液继续培养4h，弃去培养液，加入150μL DMSO，37℃空气浴摇床缓慢振荡至紫色颗粒溶解，用酶标仪在490nm处测定吸光度值，计算细胞存活率和半数致死剂量(如图20所示)；
3)LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX对新生血管形成的抑制试验
取24孔培养板每孔加入80μL基质胶Matrigel，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化HUVEC细胞，用含100ng/ml紫杉醇的LRAP22-Micelle/PTX、LRAP12-Micelle/PTX、Micelle/PTX或泰素的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔2×105个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养12h后观察新生血管样结构形成，并计算形成率(如图21所示)；
4)LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX对拟态血管形成的抑制试验
取24孔培养板每孔加入50μL基质胶，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化U87细胞，用含100ng/ml紫杉醇的LRAP22-Micelle/PTX、LRAP12-Micelle/PTX、Micelle/PTX或泰素的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔2×105个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养12h后观察拟态血管结构形成，并计算形成率(如图22所示)。
实施例9 LRAP22和LRAP12修饰胶束的体内药效学试验
1)LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX体内药效学试验
原位胶质瘤模型鼠尾静脉分别注射生理盐水、泰素、LRAP22-Micelle/PTX、LRAP12-Micelle/PTX或Micelle/PTX各100μL。紫杉醇的给药总剂量为30mg/kg，分别在肿瘤种植后第5、7、9、11、13天给药，记录裸鼠的生存时间和体重变化。结果见附图23。与其他组别相比，LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX显著延长原位肿瘤裸鼠生存时间；
2)LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX对肿瘤新生血管抑制试验
荷瘤裸鼠如上给药结束后第二天处死，取出脑用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行CD31免疫组化染色。在普通光学显微镜下连续观察3个高倍视野计数CD31阳性血管数，计算血管密度，阳性结果为血管呈棕红色，将生理盐水组的血管密度设为100％，计算其他各组的肿瘤新生血管抑制百分比(如图24所示)；
3)LRAP22-Micelle/PTX和LRAP12-Micelle/PTX促凋亡试验
荷瘤裸鼠如上给药结束后第二天处死，取出脑用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片；采用末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)介导的dUTP缺口末端标记法(Terminaldeoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡程度。主要步骤为：石蜡切片常规脱蜡至水；PBS漂洗3次，每次3min；0.3％H2O2溶液室温处理20min；20μg/mL蛋白酶K 37℃消化20min；PBS漂洗3次，每次3min；每张切片滴加TUNEL混合液(TDT和biotin-dNTP)30μL，置于湿盒中37℃孵育60min；阳性结果为细胞核呈棕黄色或棕褐色，细胞核内棕色颗粒阳性即判定为凋亡细胞，在普通光学显微镜下连续观察5个高倍视野，计数阳性细胞数，视野内细胞中阳性细胞数所占的百分比为凋亡指数，结果如图25所示。

Claims (11)

1.多功能靶向多肽RAP，其特征在于，包括LRAP22：L构型氨基酸序列为EAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLR，及其逆序翻转D肽DRAP22：D构型氨基酸序列DRDLDKDEDHDADIDEDLDQDKDQDYDHDNDHDKDEDIDKDADE和LRAP12：L构型氨基酸序列EAKIEKHNHYQK及其逆序翻转D肽DRAP12：D构型氨基酸序列DKDQDYDHDNDHDKDEDIDKDADE；
所述的多肽RAP与低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP1具有高亲和力。
2.按权利要求1所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，巯基化后与含有马来酰亚胺基团的影像物质X反应，通过共价键连接得到的RAP-X复合物。
3.按权利要求2所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，所述的RAP-X复合物中X是荧光物质Fluorescein，近红外染料Cy7、IR820、DiR，磁共振影像剂Gd-DTPA，放射影像剂99mTc-DTPA。
4.按权利要求1所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，通过pH敏感的腙键、pH敏感的硼酸脂键、二硫键与治疗药物连接，或直接与多肽药物缩合，获得RAP-Y复合物。
5.按权利要求1所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，所述的RAP-Y复合物中Y是抗肿瘤蒽环类药物如阿霉素和表阿霉素、紫杉烷类药物如紫杉醇和多烯紫杉醇和卡巴他赛、喜树碱和羟基喜树碱和喜树碱类药物伊立替康、长春花碱类药物如长春新碱和长春瑞滨、佐米类药物如硼替佐米、多肽类药物如p53激活肽。
6.按权利要求1所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，巯基化后与马来酰亚胺化的聚乙二醇-Z复合物连接，得到RAP-聚乙二醇-Z复合物。
7.按权利要求6所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，所述的RAP-聚乙二醇-Z复合物中Z是磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)。
8.按权利要求6所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，其中的RAP-聚乙二醇-磷脂复合物用于制备脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统和聚合物圆盘递药系统。
9.按权利要求6所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，其中的RAP-聚乙二醇-聚乳酸复合物，RAP-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物或RAP-聚乙二醇-聚己内酯复合物用于制备聚合物胶束递药系统、纳米粒递药系统。
10.按权利要求8或9所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，其中的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统包载诊断药物；所包载药物是荧光物质香豆素6、FAM，近红外染料Cy7、IR820、DiR、DiD或磁共振影像剂Gd-DTPA。
11.按权利要求8或9所述的多功能靶向多肽RAP，其特征在于，其中的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统包载肿瘤治疗药物；所包载的肿瘤治疗药物是阿霉素，表阿霉素、紫杉醇，多烯紫杉醇，卡巴他赛、喜树碱，羟基喜树碱，伊立替康、长春新碱，长春瑞滨、硼替佐米，卡非佐米、小白菊内酯、p53激活肽，蜂毒肽、蝎毒肽或抗菌肽。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112315909A (zh) * 2020-11-05 2021-02-05 南开大学 一种功能化聚合物胶束pm-tlk及其制备方法和应用
CN112641953A (zh) * 2019-10-10 2021-04-13 复旦大学 一种靶向功能分子修饰的抗体复合物
CN113337468A (zh) * 2021-05-27 2021-09-03 上海市伤骨科研究所 一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101861334A (zh) * 2007-03-21 2010-10-13 雷普特药品公司 受体相关蛋白（rap）环肽
CN104558117A (zh) * 2013-10-25 2015-04-29 复旦大学 一种乙酰胆碱受体介导靶向的d构型多肽及其应用
CN104968359A (zh) * 2012-11-14 2015-10-07 萨吉堤斯生物技术有限公司 用于血脑屏障运输的多肽

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101861334A (zh) * 2007-03-21 2010-10-13 雷普特药品公司 受体相关蛋白（rap）环肽
CN104968359A (zh) * 2012-11-14 2015-10-07 萨吉堤斯生物技术有限公司 用于血脑屏障运输的多肽
CN104558117A (zh) * 2013-10-25 2015-04-29 复旦大学 一种乙酰胆碱受体介导靶向的d构型多肽及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENJAMI OLLER-SALVIA 等: "Blood–brain barrier shuttle peptides: an emerging paradigm for brain delivery", 《ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY》 *
KLAVS DOLMER 等: "Quantitative Dissection of the Binding Contributions of Ligand Lysines of the Receptor-associated Protein (RAP) to the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1)", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
MIN LIU等: "D-Peptides as Recognition Molecules and Therapeutic Agents", 《THE CHEMICAL RECORD》 *
PATRICK VLIEGHE等: "Peptide-based vectors for blood–brain barrier targeting and delivery of drugs to the central nervous system", 《THERAPEUTIC DELIVERY》 *
REINHARD GABATHULER 等: "Approaches to transport therapeutic drugs across the blood–brain barrier to treat brain diseases", 《NEUROBIOLOGY OF DISEASE》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112641953A (zh) * 2019-10-10 2021-04-13 复旦大学 一种靶向功能分子修饰的抗体复合物
CN112315909A (zh) * 2020-11-05 2021-02-05 南开大学 一种功能化聚合物胶束pm-tlk及其制备方法和应用
CN112315909B (zh) * 2020-11-05 2023-02-17 南开大学 一种功能化聚合物胶束pm-tlk及其制备方法和应用
CN113337468A (zh) * 2021-05-27 2021-09-03 上海市伤骨科研究所 一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用

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