CN112641953A - 一种靶向功能分子修饰的抗体复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药学技术领域，涉及一种靶向功能分子修饰的抗体复合物，本发明将靶向功能分子与抗体通过一定的方式连接形成复合物，用于改善抗体在治疗脑部疾病时，如脑肿瘤(血‑脑屏障和血‑脑肿瘤屏障)、阿尔兹海默症和帕金森病(血‑脑屏障)由于无法跨越相关生物屏障而影响其疗效的问题，经试验结果显示：本发明的靶向功能分子修饰的抗体复合物不影响抗体的活性，能克服生物屏障的限制，促使抗体跨生物屏障进入病灶部位，并在病灶部位微环境响应下释放抗体，显著改善抗体对脑部疾病的治疗效果，具有良好的临床应用前景。

Description

一种靶向功能分子修饰的抗体复合物
技术领域
本发明属药学技术领域，涉及一种靶向功能分子修饰的抗体复合物。该复合物利用靶向功能分子使抗体在治疗脑部疾病时可跨越生物屏障，增强其向病灶部位的递送，并可在病灶的微环境中释放抗体，达到增强药效的目的。
背景技术
随着生物医学技术的迅猛发展，生物大分子药物被广泛应用于疾病的预防、治疗和诊断，具有良好的药物研究开发前景。抗体类药物作为一种生物大分子药物，以其高特异性、有效性、和安全性的优势，在肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫病等多种疾病的诊断和治疗中占据重要地位。例如在抗肿瘤领域，FDA批准的适用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌等的pembrolizumab和nivolumab(PD-1抗体)，适用于膀胱癌与非小细胞肺癌的Atezolizumab(PD-L1抗体)都具有非常好的抗肿瘤效果。这类免疫检查点抗体通过结合T淋巴细胞表面的PD-1或肿瘤细胞表面高表达的PD-L1，阻止T淋巴细胞与肿瘤细胞的检测点识别，从而避免肿瘤细胞发生免疫逃逸。但是，对于同样高表达PD-L1的脑肿瘤，免疫检查点抗体的治疗效果并不乐观，临床试验结果显示，免疫检查点抗体对脑肿瘤的治疗响应率低，Atezolizumab(PD-L1抗体)的治疗并未显著提高生存期。这是由于脑肿瘤存在生物屏障(包括血-脑屏障、血-脑肿瘤屏障)，而抗体作为生物大分子药物，其分子尺度大，难以跨越生物屏障进入脑肿瘤部位，因此免疫检查点抗体在用于脑肿瘤治疗时达不到预期的效果。除了脑肿瘤外，其它脑部疾病如神经退行性疾病同样存在生物屏障的问题，这导致相关疾病的抗体药物由于没法跨屏障而无效。
基于现有技术现状，本申请的发明人拟构建一种抗体复合物，通过靶向功能分子与抗体连接的方式，介导抗体跨越血-脑屏障、血-肿瘤屏障等生物屏障递送入脑内，并在病灶部位释放抗体，提高抗体对脑内疾病的治疗效果并降低其毒副作用。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术现状，构建一种抗体复合物，具体涉及一种靶向功能分子修饰的抗体复合物，该抗体复合物通过靶向功能分子与抗体连接的方式，介导抗体跨越血-脑屏障、血-肿瘤屏障等生物屏障递送入脑内，并在病灶部位释放抗体，提高抗体对脑内疾病的治疗效果并降低其毒副作用。
本发明将靶向功能分子与抗体通过一定的连接方式形成靶向功能分子修饰的抗体复合物。
本发明中，所述的一定的连接方式为共价连接和/或非共价连接。其中，共价连接是通过靶向功能分子与抗体之间的化学反应连接，或通过基因工程将靶向功能分子与抗体融合表达；非共价连接是通过亲和素与生物素的亲和偶联方式将靶向功能分子与抗体间接连接。
本发明中，所述的靶向功能分子包括靶向分子和特定敏感结构。
本发明中，所述的靶向分子为具有跨血-脑屏障和/或血-脑肿瘤屏障的分子。
优选地，所述的靶向分子为小分子化合物，如：对羟基苯甲酸(pHA)及其衍生物，脂肪酸如肉豆蔻酸(MC)。
优选地，所述靶向分子为多肽分子或蛋白分子；其中多肽分子为：VAP多肽、cVAP多肽、SVAP多肽、DVAP多肽，pHA-VAP多肽、pHA-SVAP多肽及pHA-DVAP多肽，MC-VAP多肽、MC-SVAP多肽及MC-DVAP多肽，D8多肽、D8-VAP多肽、D8-SVAP多肽及D8-DVAP多肽，WSW多肽、DWSW多肽、WSW-VAP多肽、DWSW-SVAP多肽及DWSW-DVAP多肽，TGN多肽、DTGN多肽、TGN-VAP多肽、DTGN-SVAP多肽及DTGN-DVAP多肽；A7R多肽、cA7R多肽、DA7R多肽，pHA-A7R多肽及pHA-DA7R多肽，MC-A7R多肽及MC-DA7R多肽，D8-A7R多肽及D8-DA7R多肽，WSW-A7R多肽及DWSW-DA7R多肽，TGN-A7R多肽及DTGN-DA7R多肽；RGD多肽、Stapled-RGD多肽，pHA-RGD多肽，MC-RGD多肽，D8-RGD多肽，WSW-RGD多肽，TGN-RGD多肽；RW多肽、mn多肽，pHA-RW多肽及pHA-mn多肽，MC-RW多肽及MC-mn多肽，D8-RW多肽及D8-mn多肽，WSW-RW多肽及DWSW-mn多肽，TGN-RW多肽及DTGN-mn多肽；T7多肽及DT7多肽；RAP12多肽及DRAP12多肽；其中蛋白分子为转铁蛋白和乳铁蛋白等，本发明上述多肽分子或蛋白分子中可以一种或任意种组合使用。
本发明中，多肽的氨基酸序列书写顺序为氨基端向羧基端；其中，VAP多肽为GRP78蛋白的配体；D8多肽为穿膜肽；WSW多肽为群体感应多肽；TGN多肽为噬菌体展示获得的脑靶向多肽；A7R多肽为VEGFR2和NRP-1受体的配体；RGD多肽、RW多肽、mn多肽为整合素的配体；T7多肽为转铁蛋白受体的配体；RAP12多肽为低密度脂蛋白受体相关蛋白-1的高结合活性多肽。
表1
Figure BDA0002228656690000031
Figure BDA0002228656690000041
Figure BDA0002228656690000051
Figure BDA0002228656690000061
本发明中，所述的特定敏感结构可响应疾病病灶部位微环境，解离释放抗体。
优选地，所述的特定敏感结构为酶敏感多肽或pH敏感化学键，更优选地，所述的酶敏感多肽为基质金属蛋白酶的多肽底物。
本发明中，所述的抗体为作用于PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3等免疫检查点的抗体或作用于HER-2、VEGFR、EGFR、GD2、PDGF-Rα、gp100、MAGE-1等肿瘤相关抗原的抗肿瘤抗体；或作用于Aβ、Tau等用于阿尔兹海默症(AD)治疗的抗体；或作用于富亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)、α-突触核蛋白(α-synuclein)、DJ-1、RAB8A和RAB10等用于帕金森病(PD)治疗的抗体；或以上抗体通过基因工程手段改造的抗体片段组合，包括Fab片段、单域抗体、Fv片段、单链抗体、双价小分子抗体、微抗体、纳米抗体等。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案中包括随机位点修饰方法和定点位点修饰方法：其中，
随机位点修饰：将抗体中游离氨基活化为马来酰亚胺基团，再将其与带有巯基的靶向功能分子共价连接，得到靶向功能分子修饰的抗体复合物；
定点位点修饰：通过亲和偶联作用将靶向功能分子与抗体连接，具体为利用生物工程技术将链霉亲和素(SA)表达于抗体的Fc片段上，然后将SA-抗体与生物素化靶向功能分子混合，得到靶向功能分子修饰的抗体复合物。
本发明提供了一种靶向功能分子修饰的抗体复合物及其制备方法，并进行了生物活性、体内外靶向性及体内外药效评价，结果表明，本发明的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其靶向功能分子的修饰对抗体的生物活性影响较小，能使抗体克服血-脑屏障等生物屏障，能增加对脑内病灶的抗体药物递送，并在病灶特定微环境条件下释放出抗体，显著增强了抗体的治疗效果。
本发明实验结果表明，所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物具有跨越生物屏障的优势，可提高抗体对脑部疾病的治疗效果，对拓展抗体的临床应用范围有重要意义，应用前景好。
附图说明
图1、pHA的HPLC与质谱图，其中
色谱方法：色谱柱(YMC，C18)：150×4.6mm；流动相A：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：0-45min，5％B-65％B；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；检测：UV 214nm，保留时间：8.89min，ESI-MS：415.2Da，与理论分子量相符合。
图2、mRAP的HPLC与质谱图，其中，
色谱方法：色谱柱(YMC，C18)：150×4.6mm；流动相A：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：0-45min，5％B-65％B；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；检测：UV 214nm，保留时间：14.63min，ESI-MS：2321.8Da，与理论分子量相符合。
图3、mCDX的HPLC与质谱图，其中，
色谱方法：色谱柱(YMC，C18)：150×4.6mm；流动相A：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：0-45min，5％B-65％B；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；检测：UV 214nm，保留时间：17.49min，ESI-MS：2775.0Da，与理论分子量相符合。
图4、靶向功能分子-PDL1抗体复合物的质谱表征结果，
其中显示，靶向功能分子-PDL1抗体复合物的分子量较未修饰抗体分子量增加，平均分子量增加约5-7个靶向功能分子，证实了复合物成功制备；且mRAP-αPDL1与mCDX-αPDL1可被MMP酶解后，分子量降低，还原为未修饰抗体分子量，表明酶解作用能脱去其靶向功能分子。
图5、靶向功能分子-PDL1抗体复合物的凝胶电泳表征结果，
其中显示，靶向功能分子-PDL1抗体复合物的轻链与重链的分子量均较未修饰抗体分子量增加，表明靶向功能分子在抗体的轻链与重链上均有修饰，进一步证实复合物成功制备；而且mRAP-αPDL1与mCDX-αPDL1可被MMP酶解后，分子量降低，表明酶解作用能脱去其靶向功能分子。
图6、靶向功能分子-PDL1抗体复合物的功能性结合活性表征，其中，
图A为在体外应用Elisa法验证靶向功能分子-PDL1抗体复合物与PDL1蛋白的结合活性，图B为应用SPR技术验证靶向功能分子-PDL1抗体复合物与PDL1蛋白的结合活性，结果显示，靶向分子对于靶向功能分子-PDL1抗体复合物的功能性结合活性的影响较小。
图7、靶向功能分子-PDL1抗体复合物与肿瘤细胞表面PDL1结合作用，其中，
图A为靶向功能分子-PDL1抗体复合物能阻断肿瘤细胞表面的PDL1蛋白与其他PDL1抗体结合的荧光照片，图B为进一步定量验证靶向功能分子-PDL1抗体复合物对PDL1蛋白阻断作用的流式定量结果，结果显示，靶向功能分子-PDL1抗体复合物与未修饰抗体同样能阻断肿瘤细胞表面的PDL1蛋白结合。
图8、靶向功能分子-PDL1抗体复合物抑制PD通路激活对CD3+T细胞的杀伤作用，其中，
图A为靶向功能分子-PDL1抗体复合物对抑制PD通路激活诱发的CD3+T细胞凋亡作用的流式图，图B为其定量结果(n＝3)，结果显示，pHA-αPDL1能与αPDL1具有相当的PD通路抑制能力，mRAP-αPDL1与mCDX-αPDL1也能抑制T细胞凋亡。
图9、靶向功能分子-PDL1抗体复合物的体外跨BBB能力评价，
显示了靶向功能分子-PDL1抗体复合物体外跨BBB评价(n＝3)，靶向分子能介导抗体跨过体外BBB模型屏障，与未修饰抗体组比较具有显著性差异。
图10、靶向功能分子-PDL1抗体复合物的正常小鼠体内靶向性评价，其中，
图A为尾静脉注射8h时，靶向功能分子-PDL1抗体复合物在正常C57BL/6小鼠的脑内分布(n＝3)，图B为尾静脉注射8h时，靶向功能分子-PDL1抗体复合物在正常小鼠的主要脏器的分布，图C为尾静脉注射24h时，靶向功能分子-PDL1抗体复合物在正常C57BL/6小鼠的脑内分布(n＝3)，图D为尾静脉注射24h时，靶向功能分子-PDL1抗体复合物在正常小鼠的主要脏器的分布，结果显示，靶向功能分子-PDL1抗体复合物在正常脑内的分布比未修饰抗体增多，PDL1抗体能在靶向分子的介导下跨越完整的血脑屏障。
图11、靶向功能分子-PDL1抗体复合物在荷原位脑肿瘤小鼠体内靶向性评价，其中，
图A为尾静脉注射靶向功能分子-PDL1抗体复合物8h时，其在荷原位脑肿瘤C57BL/6模型鼠的脑内分布(n＝3)，图B为尾静脉注射靶向功能分子-PDL1抗体复合物8h时，其在荷原位脑肿瘤C57BL/6模型鼠的主要脏器的分布，图C为尾静脉注射靶向功能分子-PDL1抗体复合物24h时，其在荷原位脑肿瘤C57BL/6模型鼠的脑内分布(n＝3)，图D为尾静脉注射靶向功能分子-PDL1抗体复合物24h时，其在荷原位脑肿瘤C57BL/6模型鼠的主要脏器的分布，结果显示，靶向功能分子-PDL1抗体复合物在脑肿瘤内的分布比未修饰抗增多，PDL1抗体能够在靶向分子的介导下更多地蓄积到脑肿瘤部位。
图12、靶向功能分子-PDL1抗体复合物在正常小鼠的药动学研究结果，
显示了靶向功能分子-PDL1抗体复合物经尾静脉注射后在正常小鼠体内的药动学曲线及药动学参数(n＝4)，结果表明，pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1与未修饰αPDL1药动学行为无明显差异，mCDX-αPDL1血液清除较快。
图13、靶向功能分子-PDL1抗体复合物对荷GL261原位瘤的C57BL/6模型的药效结果，
其中，图A为荷瘤C57BL/6小鼠的生存曲线(n＝8)，表明与未修饰抗体组及PBS组相比，靶向功能分子-PDL1抗体复合物显著延长生存期；图B、C为荷瘤C57BL/6小鼠的脑肿瘤切片ki67和tunnel免疫组化示例照片及其定量结果，说明靶向功能分子-PDL1抗体复合物组的恶性细胞较少，且细胞凋亡较多，与药效结果一致。
图14、靶向功能分子-PDL1抗体复合物对原位脑胶质瘤的免疫调节效应，
其中，图A-F荷原位脑胶质瘤模型小鼠的脑肿瘤部位的免疫效应(n＝3)，图G-I为荷瘤小鼠的颈部淋巴结的免疫效应，图J-L为荷瘤小鼠的脾脏的免疫效应，与未修饰抗体及PBS组相比，靶向功能分子-PDL1抗体复合物组的免疫抑制细胞明显减少，效应细胞明显增多，可改善肿瘤及机体的免疫抑制环境。
图15、靶向功能分子-PDL1抗体复合物的毒副作用，其中，
图A为给药后血液的ATL生化指标(n＝3)，图B与图C为给药后血液中炎症因子的含量，结果显示，靶向功能分子-PDL1抗体复合物的肝脏功能指标与PBS组接近，未修饰抗体组则肝脏毒性较大，同时血液中炎症因子水平进一步确证了靶向功能分子-PDL1抗体复合物递送系统具有更低的毒副作用。
通过下述实施方式将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。
具体实施方式
实施例1靶向分子的合成与表征
pHA靶向分子的合成与表征：采用固相合成技术制备多肽，首先称取MBHA树脂(取代度为0.54mmol/g)，加入N,N-二甲基甲酰胺溶胀后，加入20％哌啶-DMF溶液以脱去树脂上的Fmoc保护基，洗净后，加入8.8倍量的Fmoc-氨基酸(溶解于HBTU/HOBT/DIEA的DMF溶液中)，置于空气摇床中(37℃，180rpm)振摇45min。反应结束后，新鲜DMF洗涤并抽干树脂，加入20％哌啶-DMF溶液以脱去α-氨基上的Fmoc保护基。按照序列(pHA序列：p-Hydroxybenzoic acid-SSC)重复上述操作。待所有氨基酸缩合完毕，将树脂洗净抽干，加入多肽切割试剂(TFA/TIPS/H2O＝95/2.5/2.5,v/v)搅拌2h后，旋蒸除去TFA，经冰乙醚沉淀后过滤收集得到多肽粗品。用制备液相纯化，冻干，HPLC和ESI-MS对pHA多肽分子进行表征，结果如图1所示。
mRAP靶向分子的合成与表征：按上述方法合成mRAP，其氨基酸序列为CGPLGIAGQEAKIEKHNHYQK，HPLC和ESI-MS表征结果如图2所示。
mCDX靶向分子的合成与表征：按上述方法合成mCDX，其氨基酸序列为greirtgraerwsekfGPLGIAGQC(小写为D构型氨基酸，大写为L构型氨基酸)，HPLC和ESI-MS表征结果如图3所示。
实施例2靶向功能分子-PDL1抗体复合物的制备与表征
靶向功能分子-PDL1抗体复合物的制备：
在αPDL1溶液中，加入Sulfo-SMCC(1mg/mL)，室温反应30min，脱盐柱除去过量的Sulfo-SMCC。加入pHA的PBS溶液(2mg/mL)108μL，混匀，置于4℃反应12h后，于14K Da透析袋内，纯水透析2次(每次30min)，收集透析袋内液体，得pHA修饰的PDL1抗体复合物(pHA-αPDL1)。同法制备mRAP-αPDL1与mCDX-αPDL1。
MMP酶解验证：
MMP-2加入1μL APMA(1M)用反应试液稀释至100μL，37℃孵育1h。激活后，取50μL酶与50μL的mRAP-αPDL1与mCDX-αPDL1混匀，37℃孵育2h后，透析。
靶向功能分子-PDL1抗体复合物的表征：
上述产物分别用MALDI-TOF与凝胶电泳进行表征，MALDI-TOF结果如图4所示，其中凝胶电泳方法为：配制12％的分离胶，分别取0.35mg/mL的pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1、mCDX-αPDL1、mRAP-αPDL1+MMP与mCDX-αPDL1+MMP溶液60μL，加入0.6μL的DTT(1M)溶液，DTT终浓度为10mM，4℃放置过夜后，加入15μL上样缓冲液，100℃水浴煮沸5min，冷却至室温，上样20μL。以80V电压浓缩样品，以120V分离样品，用纯水洗3次，每次5min；SimpleBlue染色，室温轻摇1h；纯水洗1h，共洗2次，拍照，结果如图5所示。
实施例3靶向功能分子-PDL1抗体复合物的功能性结合活性表征
ELISA结合活性：
用鼠源的PD-L1蛋白100μL/well包被96孔ELISA板，室温放置2小时，洗板2次，加入室温下BSA封闭1h，加入系列浓度梯度的pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1、mCDX-αPDL1或未修饰的αPDL1(600ng/mL，400ng/mL，200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2ng/mL)，置于37℃恒温摇床孵育1h，洗板后，加入anti-rat Ig(H+L)/HRP孵育1h，加入100μL显色液室温放置10min，加入100μL 1M硫酸终止反应，酶标仪测定吸光度值，检测波长450nm。结果见附图6(A)。
SPR结合活性：
利用表面等离子共振(SPR)技术，考察pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1、mCDX-αPDL1与PDL1蛋白的结合活性。通过biacore系统进行预结合分析，选取CM5芯片。将重组鼠PDL1蛋白偶联至CM5芯片上，RU值达到目标值。将未修饰的αPDL1、pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1、mCDX-αPDL1分别配置成浓度为0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25和50nM的样品溶液。按浓度从低到高依次进样，用Biacore T200 Evaluation software软件分析靶向功能分子-PDL1抗体复合物与PDL1蛋白的结合活性，并分别计算其KD值。结果见附图6(B-E)。
PD通路阻断：
PD通路阻断是利用有荧光素标记的PDL1抗体(PE-αPDL1)竞争靶向功能分子修饰的PDL1抗体复合物与PDL1蛋白的结合，考察靶向功能分子-PDL1抗体复合物与PDL1蛋白的结合阻断能力。将GL261细胞消化分散，以每孔5×103个细胞的密度接种于激光共聚焦细胞培养皿，每孔加入含有IFN-γ的细胞培养液，于细胞培养箱培养48h,使表面PDL1蛋白高表达。弃去培养液，PBS洗涤，4％多聚甲醛固定15min,DAPI染核10min，PBS再次洗涤后，同上述方法加样孵育，用激光共聚焦显微镜观测多肽修饰抗体对细胞表面PDL1蛋白的阻断作用。结果如附图7。
进一步进行复合物对PD通路的阻断作用的定量考察，将GL261细胞用IFN-γ刺激48h，使表面PDL1蛋白高表达，取PDL1蛋白高表达的GL261细胞用胰酶消化，培养液中和胰酶后，离心，在PBS缓冲液中重新分散。在4℃下，将IgG、αPDL1、pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1、mCDX-αPDL1分别加至高表达PDL1的肿瘤细胞中，共孵育5min，再加入PE-αPDL1共孵育15min，PBS洗涤并重悬至200μL PBS缓冲液中，用流式细胞计数仪对阳性细胞计数，考察修饰后的αPDL1的生物活性，结果如图7所示。
实施例4体外CD3+T细胞杀伤实验
小鼠CD3+T细胞的提取：
将C57BL/6小鼠腹部皮下接种106个GL261细胞，接种肿瘤第5天后，取小鼠脾脏，研磨成单细胞，磁珠分选出CD3+T细胞，培养于包被有anti-CD3 antibody的U型板上，再加入anti-CD28 antibody共刺激，培养48h。
T细胞介导的细胞杀伤实验：
将GL261细胞用IFN-γ刺激48h，使表面PDL1蛋白高表达。将高表达PDL1蛋白的肿瘤细胞接种于96孔板内(5×103个/孔)，加入或不加等摩尔量的IgG、αPDL1、pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1、mCDX-αPDL1。再加刺激后的CD3+T细胞(105个/孔)共培养24h。用凋亡试剂盒染色后，流式细胞计数仪检测，结果如图8所示。
实施例5靶向功能分子-PDL1抗体复合物的靶向性评价
体外跨BBB能力：
4周龄SD大鼠断头后取脑，于冰冷的D-Hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，除去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和DNA酶，消化，离心，将底部微血管转移至培液中，接种于预先铺有鼠尾胶原的24孔transwell中，将transwell移入二氧化碳培养箱中，37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养24h使微血管段贴壁后，换成含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72h后，再换成不含嘌呤霉素的内皮专用培养液培养72h，测得跨膜电阻(TEER)超过250Ω·cm2后表明体外BBB建模成功。
将αPDL1、pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1、mCDX-αPDL1分别以BCA法定量并用PBS稀释至相同浓度(1.0mg/mL)，取10μL加入transwell上室每孔，再补加90μL含有培养因子的EBM-2培养液，下室加入600μL的EBM-2培养液。在0.5h和1h收集60μL下室溶液，并补液60μL。CD274包被的ELISA板测定收集样品中的抗体含量，结果如图9所示。
体内脑靶向性验证：
60μL αPDL1抗体溶液(0.5mg/mL)，加放射剂量为0.78mCi的125I，20μL PBS，于Iodogen管(80μg)中反应5min(约34-37℃)。转移后经2次水洗，Sephadex G-25小柱纯化得125I标记的αPDL1，测得其放射剂量为660μCi，标记率约81％，比活度为21.06μCi/μg。用125I标记的αPDL1再分别制备125I标记的pHA-αPDL1、125I标记的mRAP-αPDL1、125I标记的mCDX-αPDL1。
选取12只正常小鼠，每组三只，组别为αPDL1、pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1、mCDX-αPDL1，每只小鼠给药的放射剂量为15μCi。在8h、24h取脑，称重，测定放射量，以考察复合物在正常小鼠体内的脑及主要组织分布情况，结果如图10所示。
同时，选取体重约20g的雄性C57BL/6，于脑立体定位仪定位至前囟向右1.8mm,向前0.6mm,纵深3mm的纹状体区域，注射入1×106个处于对数生长期的悬浮GL261细胞(分散于5μL PBS缓冲液)，接种肿瘤后饲养于SPF环境，定期观察模型鼠生存状况。取接种原位脑胶质瘤的小鼠，共12只，分为4组，同上述组别。在接种肿瘤后第7天，同法进行放射性组织分布实验，每只小鼠给药的放射剂量为15μCi。在8h、24h取脑瘤，称重，测定放射量，结果如图11所示。
实施例6靶向功能分子-PDL1抗体复合物在正常小鼠中的药动学评价
将16只雄性C57BL/6小鼠，随机分成4组每组4只，尾静脉注射αPDL1、pHA-αPDL1、mRAP-αPDL1、mCDX-αPDL1，剂量为相当于含有5mg/kg的αPDL1，于5min,15min,30min,1h,2h,4h,6h,8h眼眶取血，用ELISA法测定PDL1抗体含量，绘制药时曲线并计算药动学参数，结果如图12所示。
实施例7靶向功能分子-PDL1抗体复合物对的原位瘤小鼠模型药效学评价
将33只雄性C57BL/6小鼠接种原位脑胶质瘤细胞GL261(1×106个/只)，将其随机分成3组，接种肿瘤为第0天。分别于第3天、第5天、第7天、第9天，尾静脉注射PBS、αPDL1、pHA-αPDL1，剂量为相当于含有5mg/kg的αPDL1，观察并记录死亡时间，绘制生存曲线。最后一次给药结束后24h，即第10天，每组取3只小鼠的脑组织进行石蜡包埋，切片后进行Ki67、TUNEL免疫组化染色，考察各给药组肿瘤增殖能力及凋亡情况，结果如图13所示。
实施例8靶向功能分子-PDL1抗体复合物对原位脑胶质瘤的免疫调节效应
将12只雄性C57BL/6小鼠接种原位脑胶质瘤细胞GL261(1×106个/只)，将其随机分成3组每组4只，接种肿瘤为第0天。分别于第3天、第5天、第7天、第9天，尾静脉注射PBS、αPDL1、pHA-αPDL1，剂量相当于αPDL1的5mg/kg。于第10天取脑肿瘤、颈部淋巴结、脾脏，处理为单细胞悬液，加入流式细胞表面抗体先用CD8、CD4、PD-1、CD62L、CD44、CD25荧光标记抗体染色，而后破细胞核膜染Foxp3；另一部分细胞加入Brefeldin A培养箱孵育6小时，经细胞表面染色后，破细胞膜染胞内抗体IFN-γ、TNF-α。确定其中CD8+T细胞、CD4+T细胞、IFN-γ+T细胞、TNF-α+、PD-1+T细胞及Treg细胞数目，及其比例变化，结果如图14所示。
实施例9靶向功能分子-PDL1抗体复合物的毒副作用
将12只雄性C57BL/6小鼠接种原位脑胶质瘤细胞GL261(1×106个/只)，将其随机分成3组每组4只，接种肿瘤为第0天。分别于第3天、第5天、第7天、第9天，尾静脉注射PBS、αPDL1、pHA-αPDL1，剂量为相当于αPDL1的5mg/kg。检测并记录每只小鼠体重。于第10天取血液，4000rpm/min离心10分钟，取血浆用ELISA法测定血液中TNF-α、IFN-γ因子；并检测ALT、AST肝功指标，评价其安全性。结果如图15所示。

Claims (12)

1.一种靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，由靶向功能分子与抗体通过共价连接和/或非共价连接方式形成抗体复合物。
2.按权利要求1所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的靶向功能分子为靶向分子或靶向分子和特定敏感结构组成的功能分子。
3.按权利要求1所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的抗体是针对免疫检查点或相关抗原的抗肿瘤抗体，或用于阿尔兹海默症AD治疗的抗体，或用于帕金森病PD治疗的抗体，或上述抗体的改造形式。
4.按权利要求2所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的靶向功能分子为具有跨血-脑屏障和/或跨血-脑肿瘤屏障的小分子、多肽分子或蛋白分子，包括：pHA，Mc，VAP多肽、cVAP多肽、SVAP多肽、DVAP多肽，pHA-VAP多肽、pHA-SVAP多肽及pHA-DVAP多肽，MC-VAP多肽、MC-SVAP多肽及MC-DVAP多肽，D8多肽、D8-VAP多肽、D8-SVAP多肽及D8-DVAP多肽，WSW多肽、DWSW多肽、WSW-VAP多肽、DWSW-SVAP多肽及DWSW-DVAP多肽，TGN多肽、DTGN多肽、TGN-VAP多肽、DTGN-SVAP多肽及DTGN-DVAP多肽；A7R多肽、cA7R多肽、DA7R多肽，pHA-A7R多肽及pHA-DA7R多肽，MC-A7R多肽及MC-DA7R多肽，D8-A7R多肽及D8-DA7R，WSW-A7R多肽及DWSW-DA7R多肽，TGN-A7R多肽及DTGN-DA7R多肽；RGD多肽、Stapled-RGD多肽，pHA-RGD多肽，MC-RGD多肽，D8-RGD多肽，WSW-RGD多肽，TGN-RGD多肽；RW多肽、mn多肽，pHA-RW多肽及pHA-mn多肽，MC-RW多肽及MC-mn多肽，D8-RW多肽及D8-mn多肽，WSW-RW多肽及DWSW-mn多肽，TGN-RW多肽及DTGN-mn多肽；T7多肽及DT7多肽；RAP12多肽及DRAP12多肽；转铁蛋白和乳铁蛋白或上述多肽分子或蛋白分子中的一种或任意组合。
5.按权利要求2所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的特定敏感结构为响应疾病病灶微环境发生解离的结构域或化学键，优选地，所述的特定敏感结构为酶敏感多肽或pH敏感化学键。更优选地，所述的酶敏感多肽为基质金属蛋白酶的多肽底物。
6.按权利要求5所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的酶敏感多肽为基质金属蛋白酶的多肽底物。
7.按权利要求3所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的抗肿瘤抗体为作用于PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3免疫检查点的抗体，或作用于HER-2、VEGFR、EGFR、GD2、PDGF-Rα、gp100、MAGE-1肿瘤相关抗原的抗体。
8.按权利要求3所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的用于阿尔兹海默症治疗的抗体为作用于Aβ、Tau的抗体。
9.按权利要求3所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的用于帕金森病PD治疗的抗体为作用于富亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)、α-突触核蛋白(α-synuclein)、DJ-1、RAB8A和RAB10的抗体。
10.按权利要求3所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的抗体改造形式为利用基因工程技术将抗体改造为的Fab片段、单域抗体、Fv片段、单链抗体、双价小分子抗体、微抗体或纳米抗体。
11.按权利要求1所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的共价连接是通过靶向功能分子与抗体之间的化学反应方式将靶向功能分子与抗体直接连接，或通过基因工程直接将靶向功能分子与抗体融合表达。
12.按权利要求1所述的靶向功能分子修饰的抗体复合物，其特征在于，所述的非共价连接是通过亲合素与生物素的亲和偶联方式将靶向功能分子与抗体间接连接。
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