CN107365361B

CN107365361B - 与pd-l1结合的重复域锚定蛋白及其用途

Info

Publication number: CN107365361B
Application number: CN201710716986.6A
Authority: CN
Inventors: 高向东; 宋潇达; 陈晓菲; 刘利; 田浤; 姚文兵
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2037-08-21
Also published as: CN107365361A

Abstract

本发明涉及与PD‑L1结合的重复域锚定蛋白及其用途。该重复域锚定蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；其中，第30位、第32位、第40位、第41位、第53位、第54位、第57位、第58位、第61位、第63位、第71位、第72位、第86位、第87位、第88位、第89位、第92位、第94位、第102位、第103位、第117位、第118位、第119位、第120位的Xaa分别为任意氨基酸。该蛋白用途为用于制备抗肿瘤药物或药物组合物。本发明的重组锚定蛋白能与PD‑L1分子特异结合，并起到阻断PD‑1/PD‑L1途径的作用，从而起到治疗相关肿瘤的作用。

Description

与PD-L1结合的重复域锚定蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及一种与PD-L1结合的重复域锚定蛋白，该蛋白能用于制备治疗肿瘤的药物或药物组合物，属于生物医药技术领域。

背景技术

近些年来，最有希望激活抗肿瘤免疫治疗的方法就是免疫检查点阻断。免疫检查点是指一系列与免疫系统相关的抑制途径，免疫检查点对于维持细胞自身耐受性并调节外周组织中生理学免疫应答的持续时间和幅度至关重要，它能够尽量减少周围组织损伤。在T细胞中，共刺激信号和抑制信号(即免疫检查点)之间的平衡调节着T细胞受体(TCR)识别抗原启动免疫反应的幅度和质量。在正常生理条件下，免疫检查点能够维持自身耐受也就是预防自身免疫，当免疫系统对病原性感染有反应时也能保护组织免受损伤。但是，肿瘤能够通过某些免疫检查点途径来形成免疫抵抗或者免疫逃离，尤其是针对肿瘤抗原特异性的T细胞的免疫逃离，这也是T细胞无法消灭肿瘤的一个重要原因。PD-1/PD-L1途径是当前已知的肿瘤细胞产生免疫逃离的重要免疫检查点之一。它是由PD-1与PD-L1之间的相互作用引发的，因此，通过抗体阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用可以对肿瘤的免疫治疗效果进行有效的调节。

通过靶向PD-1/PD-L1途径治疗癌症在以下方面具有独特优势：

首先，靶向PD-1/PD-L1途径的治疗作用主要是针对肿瘤位点局部进行的。虽然PD-L1在肿瘤细胞上是高表达的，但是在大多数正常组织中并不存在PD-L1；PD-L1可以在肿瘤微环境中通过细胞因子IFN-γ由正在进行的免疫应答诱导表达。这种PD-L1具有的肿瘤定位效果决定了无论采用靶向配体的抗体还是采用靶向受体的抗体都能够于正在进行免疫应答的肿瘤微环境中起作用。

其次，靶向PD-1/PD-L1途径能够修复肿瘤相关的免疫缺陷。PD-L1分子是肿瘤介导免疫逃离机制中的关键分子。PD-L1与PD-1的相互作用通过数种不同机制导致T细胞功能缺陷，包括：对抗原刺激的无反应性，T细胞功能耗竭，细胞凋亡，诱导免疫抑制细胞和分泌抑制性细胞因子如IL-10。另外，肿瘤细胞上PD-L1的逆转信号被视为是一种“分子屏障”，可以保护肿瘤免受CTL细胞的杀伤。同时，PD-1/PD-L1相关的免疫缺陷不是永久性的，它可以通过终止该信号途径，尤其是通过采用PD-L1的抗体或PD-1的抗体阻断该信号途径来修复该免疫缺陷。

第三，对PD-1/PD-L1途径的阻断旨在使抗肿瘤免疫反应正常化，但一般不会过度激活免疫反应。阻断PD-L1或PD-1不是简单地扩大免疫能力，而是将抗肿瘤免疫反应重新调整到所需水平。

针对PD-1和PD-L1的免疫检查点抑制剂已经在超过15种癌症(包括黑色素瘤、非小细胞肺癌NSCLC、肾细胞癌RCC、膀胱癌和霍奇金淋巴瘤等)中证实了前所未有的临床疗效。因此，FDA批准了两个抗PD-1的单抗药物nivolumab和pembrolizumab，及一个抗PD-L1的药物MPDL320A来治疗多种肿瘤。迄今为止，靶向PD-1/PD-L1的抗肿瘤免疫治疗是最有效的癌症治疗方法之一，该疗法具有良好的耐受性，可以作为单一疗法使用。然而，该疗法也存在一定缺陷，并非完美，虽然有很多患者在接受该疗法后状况有所改善，但是并不是对所有患者都起到这样的效果。另外，在肿瘤环境中使用靶向抗体有一个常见的问题，即渗透性不够。IgG分子过大，在肿瘤组织中的分布就要受到血管、摄入口、细胞密度等因素的限制。因此，研发出高亲和力高渗透性的低分子量类抗体药物十分有意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种与PD-L1结合的重复域锚定蛋白，能通过与PD-L1分子特异性结合来阻断PD-1与PD-L1的相互作用，避免肿瘤细胞免疫逃离，从而起到抑制肿瘤生长和/或杀伤肿瘤细胞的作用。同时还提供该蛋白的用途。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种与PD-L1结合的重复域锚定蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；其中，第30位、第32位、第40位、第41位、第53位、第54位、第57位、第58位、第61位、第63位、第71位、第72位、第86位、第87位、第88位、第89位、第92位、第94位、第102位、第103位、第117位、第118位、第119位、第120位的Xaa分别为任意氨基酸。

发明人在实践研究中发现，上述重组锚定蛋白能与PD-L1分子特异结合，并起到阻断PD-1/PD-L1途径的作用；同时，上述位点均为可变位点。

本发明进一步完善的技术方案如下：

优选地，第30位、第32位、第40位、第41位、第61位、第63位、第71位、第72位、第92位、第94位、第102位、第103位的Xaa按以下两种情况之一确定具体氨基酸：

情况一、第32位Xaa为Asp，第41位Xaa为Trp，第63位Xaa为Asp，第72位Xaa为Asn，第94位Xaa为Asn，第103位Xaa为Thr；第30位Xaa为Phe、Val之一，第40位Xaa为Asp、Arg之一，第61位Xaa为Asn、Lys之一，第71位Xaa为Lys、Phe之一，第92位Xaa为His、Pro之一，第102位Xaa为Val、Arg之一；

情况二、第30位Xaa为Phe，第32位Xaa为Asp，第40位Xaa为Asp，第41位Xaa为Trp，第61位Xaa为Asn，第63位Xaa为Asp，第71位Xaa为Lys，第72位Xaa为Asn，第92位Xaa为His，第94位Xaa为Asn，第102位Xaa为Val，第103位的Xaa为Thr；或，

第30位Xaa为Val，第32位Xaa为Arg，第40位Xaa为Pro，第41位Xaa为Ala，第61位Xaa为Lys，第63位Xaa为Phe，第71位Xaa为Phe，第72位Xaa为Arg，第92位Xaa为Pro，第94位Xaa为Leu，第102位Xaa为Arg，第103位的Xaa为Asp；或，

第30位Xaa为Phe，第32位Xaa为Met，第40位Xaa为Gly，第41位Xaa为Gln，第61位Xaa为Ser，第63位Xaa为Arg，第71位Xaa为Lys，第72位Xaa为Gln，第92位Xaa为Gly，第94位Xaa为Glu，第102位Xaa为Lys，第103位的Xaa为Ser；或，

第30位Xaa为Lys，第32位Xaa为Leu，第40位Xaa为Arg，第41位Xaa为Gly，第61位Xaa为Asn，第63位Xaa为Asp，第71位Xaa为Lys，第72位Xaa为Asn，第92位Xaa为Ile，第94位Xaa为Gln，第102位Xaa为Phe，第103位的Xaa为Tyr；或，

第30位Xaa为Gly，第32位Xaa为Glu，第40位Xaa为Arg，第41位Xaa为Lys，第61位Xaa为Leu，第63位Xaa为Pro，第71位Xaa为Ser，第72位Xaa为Val，第92位Xaa为His，第94位Xaa为Asn，第102位Xaa为Val，第103位的Xaa为Thr；或，

第30位Xaa为Trp，第32位Xaa为Val，第40位Xaa为Thr，第41位Xaa为Gly，第61位Xaa为Ser，第63位Xaa为Arg，第71位Xaa为Lys，第72位Xaa为Gln，第92位Xaa为Tyr，第94位Xaa为Lys，第102位Xaa为Gly，第103位的Xaa为Ser；或，

第30位Xaa为Lys，第32位Xaa为Leu，第40位Xaa为Pro，第41位Xaa为Asp，第61位Xaa为Phe，第63位Xaa为Arg，第71位Xaa为Gly，第72位Xaa为Ala，第92位Xaa为Val，第94位Xaa为Arg，第102位Xaa为Pro，第103位的Xaa为Ala；或，

第30位Xaa为Phe，第32位Xaa为Met，第40位Xaa为Gly，第41位Xaa为Gln，第61位Xaa为Lys，第63位Xaa为Phe，第71位Xaa为Phe，第72位Xaa为Arg，第92位Xaa为Pro，第94位Xaa为Leu，第102位Xaa为Arg，第103位的Xaa为Asp。

更优选地，第53位Xaa为Gln，第54位Xaa为Pro，第57位Xaa为Asp，第58位Xaa为Val，第86位Xaa为Gly，第87位Xaa为Gly，第88位Xaa为Asp，第89位Xaa为Val，第117位Xaa为Gly，第118位Xaa为Gly，第119位Xaa为Asp，以及第120位Xaa为Val。

发明人经研究发现，本发明蛋白的骨架结构具有十个阿尔法螺旋，相邻螺旋之间的氢键维持骨架结构保持相对恒定，该骨架结构的活性中心能与PD-L1分子特异结合。其中，第53位、第54位、第57位、第58位、第86位、第87位、第88位、第89位、第117位、第118位、第119位、第120位的Xaa不但远离活性中心，而且不会改变或影响各螺旋结构及其相互之间的氢键，因此可取任意氨基酸而仍然使整个蛋白保持活性；而第30位、第32位、第40位、第41位、第61位、第63位、第71位、第72位、第92位、第94位、第102位、第103位的Xaa均位于活性中心处，经实验验证可取上述限定的氨基酸而保持蛋白活性。

优选地，所述重复域锚定蛋白与PD-L1分子结合的解离常数Kd低于1×10^-5M。

本发明还提供：

前文述及重复域锚定蛋白用于制备抗肿瘤药物或药物组合物的用途。所述肿瘤为细胞表面表达PD-L1分子的肿瘤。所述肿瘤的宿主为哺乳动物。

前文述及重复域锚定蛋白用于制备PD-L1阻断药物或药物组合物的用途。

编码前文述及重组锚定蛋白的核酸。

一种药物组合物，含有前文述及的重组锚定蛋白或前文述及的核酸。

本发明的重组锚定蛋白能与PD-L1分子特异结合，并起到阻断PD-1/PD-L1途径的作用，从而起到治疗相关肿瘤的作用，具有制备抗肿瘤药物的前景。

附图说明

图1为本发明重复域锚定蛋白的空间结构示意图。

图2为本发明实施例3中DARPin蛋白与高表达PD-L1肿瘤细胞结合情况示意图。图A为阳性细胞数百分比；图B为DARPin蛋白的平均荧光强度。

图3为本发明实施例4中各浓度梯度DARPin#1蛋白结合PD-L1的BLI分析结果示意图。将偶联人PD-L1的探头浸泡到各种浓度的DARPin溶液中，利用传感器检测生物膜厚度改变情况。

图4为本发明实施例5中DARPin蛋白对肿瘤细胞直接杀伤性研究结果示意图。

图5为本发明实施例6中DARPin#1蛋白在小鼠血清中的药时曲线。

图6为本发明实施例7中DARPin#1蛋白在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果示意图。

图7为本发明实施例7中各给药组小鼠肿瘤最终大小结果示意图。

具体实施方式

以下为与本发明相关的术语具体释义。

术语“蛋白”指的是多肽，所述多肽至少部分具有确定的三维结构，或能够通过在其多肽链之内和/或之间形成二级、三级或四级结构来取得确定的三维结构。如果一个蛋白包含两种或更多种多肽，其个体多肽链可以非共价或共价连接，例如两个多肽之间形成二硫键。蛋白若能够单独具有、或能够通过形成二级或三级结构取得确定的三维结构，则该结构称为“蛋白结构域”。所述蛋白或蛋白结构域的概念为本领域技术人员所熟知。

如在重组蛋白、重组蛋白结构域、重组结合蛋白等中所用的术语“重组”，指的是，所述多肽通过使用相关领域技术人员所熟知的重组DNA技术产生。例如，编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)可以被克隆到细菌表达质粒(如pQE30，Qiagen)，酵母表达质粒或哺乳动物表达质粒中。例如，当所述构建重组细菌表达质粒插入到合适的细菌(如大肠杆菌)中时，所述细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。相应产生的多肽被称为重组多肽。

在本发明的上下文中，术语“多肽”由一条或多条由多个(即两个或更多个)通过肽键连接的氨基酸组成的链组成。多肽优选由八个以上通过肽键连接的氨基酸组成。

术语“多肽标记”指的是连接到多肽/蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列用于所述多肽/蛋白的纯化、检测或靶定，或其中所述氨基酸序列增强所述多肽/蛋白的物理化学行为，或其中所述氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的各多肽标记、部分和/或结构域可直接或通过多肽接头彼此连接。这些多肽标记均为本领域熟知，且为本领域技术人员可获得。多肽标记的例子包括小多肽序列，例如，组氨酸(His)，原癌基因(myc)和FLAG，或链球菌(Strep)标记或部分，如酶(例如内切酶样碱性磷酸酶)，其允许对所述多肽/蛋白或部分进行检测，可用于靶向(如免疫球蛋白或其片段)和/或作为效应分子。

术语“聚合物部分”指的是蛋白聚合物部分或非蛋白聚合物部分。“蛋白聚合物部分”优选是不形成稳定三级结构的多肽。蛋白聚合物部分的例子包括XTEN(Amunix的注册商标；WO 2007/10351)多肽，或如WO 2008/155134所述的包含脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基的多肽。所述蛋白聚合物部分可以通过使用标准DNA克隆技术产生基因融合多肽，随后通过标准的表达和纯化，从而共价连接于例如本发明的结合域。

“非蛋白聚合物部分”是不由多肽构建的聚合物部分。非蛋白聚合物部分的例子包括羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，或聚氧化烯。术语“聚乙二醇化”(PEG化)是指PEG部分共价连接至，例如，本发明的多肽。本发明的聚合物部分的分子量可以广泛地变化。所述聚合物部分优选由多肽接头连接至结合域。具体而言，PEG部分或任何其它非蛋白聚合物可以，例如，通过马来酰亚胺接头连接到半胱氨酸硫醇，其中该半胱氨酸经由肽接头与本文所述的结合域的N端或C端结合。

术语“结合蛋白”是指包含一个或多个结合域、一种或多种生物活性化合物和一种或多种聚合物部分的蛋白，下文将进一步解释。优选地，所述结合蛋白包含最多四个结合域。更优选地，所述结合蛋白包含最多两个结合域。最优选地，所述结合蛋白只包含一个结合域。此外，任何所述结合蛋白均可以包括不是结合域的附加蛋白结构域、多聚化结构部分、多肽标记、多肽接头和/或一个或多个Cys残基。多聚化部分的示例包括配对提供功能性免疫球蛋白Fc结构域的免疫球蛋白重链恒定区，以及亮氨酸拉链或多肽，其包括在两个所述多肽之间形成分子间二硫键的游离硫醇。Cys残基可用于将其它部分连接到多肽上，例如，通过使用本领域技术人员所熟知的马来酰亚胺化学接连。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。同样优选地，结合蛋白的结合域具有不同的靶向特异性。

术语“生物活性化合物”指的是，当用于患有所述疾病的哺乳动物时，能够进行疾病调节的化合物。生物活性化合物可以具有拮抗性质或激动性质，并且可以是蛋白质生物活性化合物或非蛋白质生物活性化合物。所述蛋白的生物活性化合物可以，例如，通过使用标准DNA克隆技术产生基因融合多肽，随后通过标准的表达和纯化，从而共价连接于例如本发明的结合域。可以通过化学方法，例如通过马来酰亚胺接头连接到半胱氨酸硫醇，其中该半胱氨酸经由肽接头与本文所述的结合域的N端或C端结合，将所述非蛋白质生物活性化合物共价连接于例如本发明的结合域，如本文所述。蛋白质生物活性化合物的示例包括，具有不同靶向特异性(例如通过结合来中和生长因子)的结构域，细胞因子(如白介素)，生长因子(如生长激素)，抗体及其片段，激素(例如，GLP-1)，毒素(如绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A)和任何可能的蛋白质药物。非蛋白的生物活性化合物的示例是，靶向GPCR的小分子，抗生素及任何可能的非蛋白质药物。

术语“结合域”是指作为表现出与蛋白骨架相同的“折叠”(三维结构)且具有定义如下的预定性质的蛋白结构域。所述结合域可以通过推导获得，或最常见的，通过本领域已知的组合蛋白工程技术和技能获得(Binz et al.,2005,loc.cit.)。例如，可以通过如下方法来获得具有预定性质的结合域，包括以下步骤：(a)提供如下所述表现出与蛋白骨架相同的折叠的蛋白域的多样性集合；以及(b)从所述多样性集合中筛选和/或选择，以获得至少一种具有所述预定性质的蛋白结构域。可以根据所使用的筛选和/或选择系统，通过几种方法提供蛋白结构域的多样性集合，并且可以包括利用本领域技术人员公知的方法，例如噬菌体展示或核糖体展示方法。所述结合域优选是重组结合域。

术语“蛋白骨架”是指具有高度耐受氨基酸插入、替代或缺失的暴露表面区域的蛋白。可以用来产生本发明的结合域的蛋白骨架例子包括抗体或其片段，如单链Fv或Fab片段，来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A，来自大菜粉蝶(Pierisbrassicae)的胆汁三烯结合蛋白或其它脂质运载蛋白，锚蛋白重复蛋白蛋白或其它重复蛋白，以及人纤连蛋白。蛋白骨架是本领域技术人员已知的(Binz et l.,2005,loc.cit.；Binz et al.,2004,loc.cit.)。

术语“靶(Target)”指的是个体分子，例如核酸分子、多肽或蛋白、碳水化合物，或任何其它天然分子，包括所述个体分子的任意部分，或两个或更多此类分子的复合物。所述靶可以是全细胞或组织样品，或它可以是任何非天然分子或部分。靶是优选天然或非天然多肽或含有化学修饰的多肽，例如通过天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化修饰。在本发明的具体应用中，所述靶是PD-L1。

术语“预定性质”指的是一种性质，例如结合靶、阻断靶、活化靶介导的反应、酶活性，和相关的其他特性。根据期望性质类型，普通技术人员将能够确定筛选和/或选择具有期望性质的结合域的形式和必要的步骤。所述预定性质优选为与靶结合。

术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复域的蛋白。优选地，每个所述重复蛋白包含最多四个重复域。更优选地，每个所述重复蛋白包含最多两个重复域。最优选的是，每个重复蛋白的仅包括一个重复域。此外，所述重复蛋白可以包含另外的非重复蛋白结构域、多肽标记和/或多肽接头。

术语“重复域”是指包含两个或更多个连续的重复单元(模块)为结构单元的蛋白结构域，其中，所述结构单元具有相同的折叠，并紧密堆叠以构成具有共同疏水核心的超螺旋结构。优选地，重复域还包含N端和/或C端加帽单元(或模块)。更优选地，所述N端和/或C端加帽单元(或模块)为加帽重复序列。

术语“结构单元”是指多肽的局部有序部分，由沿多肽链彼此靠近的两个或更多二级结构片段之间的三维相互作用形成。所述结构单元呈现结构基序。术语“结构基序”指的是存在于至少一个结构单元中的二级结构元件的三维结构。结构基序是本领域技术人员所公知的。结构单元不能单独获得确定的三维结构；然而，它们的连续结构，例如在重复域中作为重复模块，可使得超螺旋结构中相邻单元相互稳定。

术语“重复单元”是指包含一个或多个天然重复蛋白的重复序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”存在多个拷贝，且对限定所述蛋白的折叠的所有所述基序具有共同的确定折叠拓扑形态。所述重复单元对应于重复蛋白的“重复结构单元(重复序列)”如Forrer et al.,2003,loc.cit.所述，或者对应于重复蛋白的“连续同源结构单元(重复序列)”，如Binz et al,2004,loc.cit.所述。所述重复单元包含骨架残基和相互作用残基。所述重复单元的示例包括犰狳重复单元，富含亮氨酸的重复单元，锚蛋白重复单元，三十四肽(tetratricopeptide)重复单元，HEAT重复单元，和富含亮氨酸的变体的重复单元。含有两个或更多所述重复单元的天然蛋白被称为“天然重复蛋白”。当相互比较时，重复蛋白的各重复单元的氨基酸序列可具有显著数量的突变，取代，添加和/或缺失，同时仍基本上保留重复单元的通用模式(或基序)。

因此，术语“锚蛋白重复单元”指的是重复单元，例如根据Forrer et al.,2003,loc.cit.所述的锚蛋白重复序列。锚蛋白重复序列是本领域技术人员所公知的。术语“锚蛋白重复序列结构域”指的是包含两个或更多个连续的锚蛋白重复单元(模块)作为结构单元。

术语“骨架残基”涉及对折叠拓扑形态有贡献的重复单元的氨基酸残基或重复模块的对应氨基酸残基，即其对所述重复单元(或模块)的折叠或与相邻单元(或模块)的相互作用有贡献。所述贡献可以是与重复单元(或模块)中其它残基的相互作用，或对多肽骨架构象如α螺旋或β折叠的影响，或形成线性多肽或环的氨基酸段。

术语“固定位置”指的是重复序列基序中设定为特定氨基酸的氨基酸位置。多数情况下，所述固定位置对应于具有特定靶特异性的骨架残基和/或靶相互作用残基的位置。术语“随机位置”是指重复序列基序中可允许两个或以上氨基酸存在的氨基酸位置，例如，通常可以允许二十种天然氨基酸中的任意一种，或者可以允许二十种天然氨基酸中的大多数氨基酸，如除半胱氨酸以外，或除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。大多数情况下，所述随机位置对应于靶相互作用残基的位置。但是，骨架残基的一些位置也可以被随机化。

术语“折叠拓扑”指的是所述重复单元或重复模块的三级结构。折叠拓扑由形成至少部分α螺旋或β折叠的氨基酸段，或形成线性多肽或环形结构的氨基酸段，或α螺旋，β折叠和/或线性多肽/环形结构的任意组合所决定。例如，锚蛋白重复序列单元/模块包括β转角，后面两个反平行α螺旋和连接下一个重复单元/模块的转角的环形结构。

术语“连续的”是指一种结构，其中所述重复单元或重复单元串联排列。在设计重复蛋白中，有至少2个，通常为约2至6个，特别是至少约6个，经常20个或更多的重复单元(或模块)。在多数情况下，重复域的重复单元(或模块)呈现高度序列一致性(对应位置的氨基酸残基相同)或高度序列相似性(氨基酸残基不同，但物理化学性质相似)，且部分氨基酸残基可能是高度保守的关键残基。但是，只要重复单元(或模块)还维持共同折叠拓扑形态，就有可能因为重复域的不同重复单元(或模块)之间的氨基酸插入和/或缺失，导致高度的序列变异性。

本发明的重复域锚定蛋白包含三个锚蛋白重复域，具体而言，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中，第1位至第29位为头部，第30位至第60位为第一个重复域，第61位至第91位为第二个重复域，第92位至第122位为第三个重复域，第123位至第147位为尾部。

本发明的重复域锚定蛋白能与PD-L1分子特异性结合，也即对PD-L1分子具有选择性亲和力。具体而言，该重复域锚定蛋白结合PD-L1分子的解离常数(Kd)低于1×10^-5M，优选低于1×10^-6M。

本发明的重复域锚定蛋白具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。该蛋白的第30位、第32位、第40位、第41位、第53位、第54位、第57位、第58位、第61位、第63位、第71位、第72位、第86位、第87位、第88位、第89位、第92位、第94位、第102位、第103位、第117位、第118位、第119位、第120位的Xaa均为可变位点。

作为进一步地限定，第30位、第32位、第40位、第41位、第61位、第63位、第71位、第72位、第92位、第94位、第102位、第103位的Xaa按以下两种情况之一确定具体氨基酸：

在上述限定的基础上，以下位点可采用固定的具体氨基酸，即：

第53位Xaa为Gln，第54位Xaa为Pro，第57位Xaa为Asp，第58位Xaa为Val，第86位Xaa为Gly，第87位Xaa为Gly，第88位Xaa为Asp，第89位Xaa为Val，第117位Xaa为Gly，第118位Xaa为Gly，第119位Xaa为Asp，以及第120位Xaa为Val。

该蛋白的空间结构示意图如图1所示，该蛋白的骨架结构具有十个阿尔法螺旋，相邻螺旋之间的氢键维持骨架结构保持相对恒定，该骨架结构的活性中心能与PD-L1分子特异结合。其中，第53位、第54位、第57位、第58位、第86位、第87位、第88位、第89位、第117位、第118位、第119位、第120位的Xaa不但远离活性中心，而且不会改变或影响各螺旋结构及其相互之间的氢键，因此可取任意氨基酸而仍然使整个蛋白保持活性；而第30位、第32位、第40位、第41位、第61位、第63位、第71位、第72位、第92位、第94位、第102位、第103位的Xaa均位于活性中心处，经实验验证可取上述限定的氨基酸而保持蛋白活性。

本发明还涉及前述重复域锚定蛋白用于制备抗肿瘤药物或药物组合物的用途。所述肿瘤为细胞表面表达PD-L1分子的肿瘤。所述肿瘤的宿主为哺乳动物。

术语“共有序列”是指一种氨基酸序列，其中所述共有序列由多个重复单元的结构和/或序列的对齐比对而获得。使用两种或更多经结构和/或序列比对的重复单元，并允许比对中存在缺口，则能够确定各位置上最频繁出现的氨基酸残基。共有序列是包含最常在各位置上出现的氨基酸的序列。当单一位置上超常存在两个或以上氨基酸时，共有序列可以包括所述氨基酸的子集。所述两个或更多重复单元可从单一重复蛋白或两个或更多重复蛋白中包含的重复单元中获得。

“共有氨基酸残基”是共有序列的特定位置上的氨基酸。如果所述两个或以上重复单元中两个或更多(例如三个，四个或五个)氨基酸残基具有相似的存在几率，则所述共有氨基酸可以是最常见的氨基酸之一或所述两个或更多氨基酸残基的组合。

在一实施例中，任何本文所述重组PD-L1结合蛋白或结构域可以被共价结合到一个或多个其他部分，包括，例如，与其他靶结合以创建双特异性结合剂的部分，生物活性化合物，标记部分(如荧光标记(如荧光素)或放射性示踪剂)，便于蛋白纯化的部分(例如，小肽标记，如His-或Strep-标记)，为提高疗效提供效应器功能的部分(例如，用于提供抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用的抗体Fc部分，毒蛋白部分(例如铜绿假单胞菌外毒素A(ETA)或小分子毒性剂如美登素或DNA烷化剂)，或用于改进药物动力学的部分。药物动力学的改善可以根据感观治疗需要来评估。通常需要提高生物可用性和/或提高剂量给药之间的时间，这可能通过增加给药后血清中的可用蛋白维持时间来达成。在一些例子中，需要提高蛋白血清浓度的时间持续性(例如，降低给药后短时间内的浓度与下一次给药前短时间内的浓度之间的差异)。倾向于减缓蛋白的血液清除率的部分包括羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，糖(例如唾液酸)，耐受性良好的蛋白部分(例如Fc片段或血清白蛋白)，和对大量血清蛋白具有特异性和亲和性的结合域或肽，例如抗体Fc片段或血清白蛋白。本发明的重组结合蛋白可以附着到令哺乳类(例如小鼠，大鼠，或人)多肽清除速率降低到比未修饰多肽低三倍以上的部分上。

在又一实施例中，本发明涉及编码所述重复域锚定蛋白、特定重组结合蛋白、特定锚蛋白重复域、特定锚蛋白重复模块的核酸分子。另外，还涉及包含所述核酸分子的载体。

此外，还涉及一种药物组合物，其包含一种或多种上述重复域锚定蛋白、尤其是包含编码重复域锚定蛋白的核酸分子，以及可选地包含药学上可接受的载体和/或稀释剂。所述药学上可接受的载体和/或稀释剂是本领域技术人员已知的。甚至进一步，还涉及了一种诊断组合物，其含有一种或多种上述重组结合蛋白，尤其是包含重复域的结合蛋白。

本发明所述的重复域锚定蛋白或锚蛋白重复域可通过几种方法获得和/或改进，例如噬菌体表面展示(WO 1990/002809，WO 2007/006665)或细菌细胞表面展示(WO1993/010214)，核糖体展示(WO 1998/048008)，质粒展示(WO 1993/008278)，或通过使用共价RNA重复蛋白杂交构建体(WO 2000/032823)，或细胞内表达和选择/筛选，例如通过蛋白互补法(WO 1998/341120)筛选。所述方法是本领域技术人员所熟知的。

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例

下面公开的所有初始原料和试剂均是本领域技术人员已知的，且可从市售获得，或可利用公知技术制备。

实验材料

化学药品购自Sigma-Aldrich公司(美国)。除非另有说明，DNA聚合酶，限制性内切酶和缓冲液均购自New England Biolabs公司(美国)。克隆和蛋白生产菌株是大肠杆菌DH10B(Thermo Fisher Scientific，美国)或BL21(Novagen公司，美国)。生物素化PD-L1是通过使用标准生物素化试剂和方法(Pierce,USA)，将生物素部分与蛋白化学连接获得的。

分子生物学

除非另有说明，实验方法按照已记载的实验方案(Sambrook J.,Fritsch E.F.andManiatis T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory 1989,New York)进行。

所述锚蛋白重复蛋白文库的设计可在与靶相互作用的已知锚蛋白重复域结构的指导下进行。所述结构的例子的蛋白数据库(Protein Data Bank，PDB)唯一查询码或识别码(PDB-ID)是1WDY，3V31，3V30，3V2X，3V2O，3UXG，3TWQ-3TWX，1N11，1S70和2ZGD。

设计锚蛋白重复蛋白文库的例子，如N2C和N3C设计锚蛋白重复蛋白文库，已被记载(WO 2002/020565；Binz et al.2003,loc.cit.；Binz et al.2004,loc.cit.)。N2C和N3C中的数字描述了N端和C端加帽模块之间的随机重复模块数目。

实施例1：对包含PD-L1结合特异性锚蛋白重复域的选择

利用细菌表面展示技术，从如Binz et al.2004(loc.cit.)所述的DARPins文库中选择了许多设计PD-L1结合特异性锚蛋白重复蛋白(DARPins)。使用多轮筛选后测序评估所选定的克隆对特异性目标(PD-L1)的结合，结果表明成功选定了多种PD-L1结合蛋白。例如，SEQ ID NO.11所示的锚蛋白重复域构成了包含PD-L1结合特异性锚蛋白重复域的选定结合蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO.1至9中含有源自所述PD-L1结合特异性锚蛋白重复域的个体锚蛋白重复模块。

(1)通过细菌表面展示技术筛选PD-L1特异性锚蛋白重复蛋白

通过细菌表面展示技术，使用人PD-L1作为靶蛋白，并使用上述的设计锚蛋白重复蛋白文库对PD-L1特异性锚蛋白重复蛋白进行筛选。每次筛选周期后，将正选阳性细胞、阴性部分、两次洗脱部分分别取适量稀释后涂板并计数。收集所有阳性正选克隆作为第二轮筛选的起始菌液，重复上述筛选过程，共筛选四轮。取最后一轮筛选得到的正选阳性平板，挑取平板上的克隆。

(2)通过流式细胞术选定克隆与PD-L1的特异性结合

使用流式细胞术来选定筛选得到的表达于细菌表面的PD-L1结合DARPin。取上一步筛选得到菌株，按照1:100(v/v)的比例加到含有Amp的液体LB培养基的96深孔板中，37℃，220rpm过夜培养。将种子液扩培至新鲜的含有100μg/mL Amp的液体LB培养基的96深孔板中，37℃，220rpm，培养至菌液OD600约为0.8时加入终浓度为1mM的阿拉伯糖诱导OmpA-DARPin融合蛋白表达并培养继续4小时。收集发酵液，6000rpm离心5min，收集菌体沉淀。用1mL碳酸盐缓冲轻轻吹打，重悬菌体后，6000rpm离心5min，收集菌体沉淀。用1mL碳酸盐缓冲液重悬菌体，取100μL菌液，加入100μL生物素标记的PD-L1，混匀后，150rpm室温孵育1h，6000rpm离心5min，收集菌体沉淀。用1mL碳酸盐缓冲液轻轻吹打，洗涤菌体，6000rpm离心5min，收集菌体沉淀，重复三次，100μL碳酸盐缓冲液轻轻吹打重悬菌体。向菌液中加入5μLPE标记的链霉亲和素，轻轻吹打混匀后，4℃暗处孵育30min。6000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用500μL碳酸盐缓冲液洗涤一次，重悬于终体积为1mL的碳酸盐缓冲液中，上机检测。以筛选过程中确定的不与PD-L1结合的菌株作阴性对照，比较样品与阴性对照的平均荧光强度并分析阳性细胞所占百分数。选定的PD-L1结合特异性锚蛋白重复域氨基酸序列的例子提供于SEQ ID NO.11中。

将所述PD-L1结合特异性锚蛋白重复域克隆到基于pET、可提供纯化标签以便于简单蛋白纯化(如下所述)的表达载体中。例如，构建了编码如以下DARPins的表达载体：

DARPin#1(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO.1)；

DARPin#2(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO.2)；

DARPin#3(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO.3)；

DARPin#4(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO.4)；

DARPin#5(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO.5)；

DARPin#6(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO.6)；

DARPin#7(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO.7)；

DARPin#8(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO.8)；

DARPin#9(N端融合有组氨酸标记的SEQ ID NO.9)。

(3)DARPins的高水平可溶性表达

在大肠杆菌BL21细胞中表达上述在流式检测中表现出PD-L1结合特异性的选定克隆，并利用其组氨酸标记以标准实验方法进行纯化，以进行进一步分析。挑取单克隆按照1:100(v/v)的比例加到含有Kan的液体LB培养基，37℃，220rpm过夜培养。将种子液扩培至新的1L含有50μg/mL Kan的液体LB培养基中(加入1％种子液)，37℃，220rpm，培养至菌液OD600约为0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导后继续37℃摇菌8h，诱导目的蛋白表达。将菌液8000rpm 4℃离心20min收集菌体，以洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0)洗涤一次菌体，称量湿菌重量。按照1:10(m/v)的比例根据湿菌重量加入菌体超声缓冲液，玻璃棒搅拌充分重悬菌体，冰浴超声菌体，超声功率为400W，工作3s，间歇3s，超声时间为30min。将超声反应液12000rpm，4℃离心20min，收集超声上清。使用Ni氮基三乙酸柱(2.5ml柱体积)，根据厂商说明(QIAgen,Germany)进行蛋白纯化。可选地，通过阴离子交换层析及后续的尺寸排阻层析，依照本领域技术人员已知的标准树脂和实验方法，来纯化缺乏6xHis标记的DARPins或选定重复域。从1L大肠杆菌培养物中，可以纯化得到多至100mgPD-L1结合特异性的高可溶性DARPins，纯度>90％(从SDS-15％PAGE估计)。使用所述纯化的DARPins进行进一步表征分析。实施例2：MST分析DARPins与PD-L1亲和力

使用Monolith NT.115仪，并根据本领域技术人员已知的标准程序测定MST。制备带标记的结合物，将已透析至碳酸盐缓冲液中的靶蛋白PD-L1溶液按照公式：蛋白浓度(μM)＝蛋白浓度(mg/mL)*1000/蛋白分子量(kDa)换算得到其浓度，13000rpm离心五分钟，取上清用标记缓冲液(碳酸盐缓冲液)将蛋白浓度调节至2-20μM。向100μL蛋白溶液中加入4.6μLDy647染料，混匀体系后，室温避光孵育30min。倒掉柱B中的储存液，用8mL碳酸盐缓冲液平衡柱子，使缓冲液依靠重力从柱B中流出来。将向标记溶液中加入400μL碳酸盐缓冲液，混匀后，加到柱B中间位置，让反应液完全浸入柱B中，弃去流出的液体。加入600μL的碳酸盐缓冲液，收集洗脱下来的液体将Monolith NT毛细管直接插到标记好的溶液中，吸取标记完成溶液，Monolith NT.115进样扫描，检测标记蛋白荧光强度，稀释蛋白至荧光强度在100-1500之间。围绕预期的Kd值，将各DARPin蛋白计算摩尔浓度后，稀释8种不同浓度的滴定组，按照两倍浓度制样，从20μM到0.16μM，每个样品10μL。向稀释好的梯度未标记结合物中，加入10μL已标记的PD-L1蛋白，吹打混匀溶液，室温避光孵育30min。孵育完成后，将结合液转移至Monolith NT毛细管中。吸入样品后，垂直拿好并晃动毛细管，使液体移动至Monolith NT毛细管中间位置，注意不要接触毛细管中间光学检测部分。将毛细管按浓度顺序放入样品托盘的管槽中，并推入仪器中，设置LED Power为20％，MST Power分别为20％、40％、80％，在红光中进行检测，获得各DARPin与PD-L1结合曲线，通过MO.Affinity Analysis软件分析各蛋白亲和力高低趋势并计算解离常数Kd。

如表1所示，各DARPin的解离常数Kd均低于1×10^-5M，有的甚至低于1×10^-6M。

表1、MST检测DARPin与人PD-L1相互作用的Kd值

注：nM＝1×10^-9M

实施例3：流式检测DARPins与肿瘤细胞表面受体亲和力

使用流式细胞术来检测各DARPin与表面高表达PD-L1的结肠癌细胞株CT26细胞的亲和力的高低，方法如下：

将需要检测的蛋白完成生物素标记，并最终透析至PBS缓冲液中。将胰酶消化下来的CT26细胞经1200rpm离心5min，轻轻弃去细胞上清后，用1mL PBS重悬细胞沉淀，1200rpm离心5min，轻轻弃去上清，用1mL PBS重悬细胞沉淀，并通过血球计数板在显微镜下对细胞计数。取50μL细胞加入50μL已生物素化的蛋白，4℃孵育1h。1200rpm离心5min，轻轻弃去上清，用1mL PBS洗涤细胞沉淀两次，50μL PBS重悬细胞。加入5μL PE标记的链霉亲和素，4℃避光孵育30min。500μL PBS洗涤一次后，500μL PBS重悬细胞，上机检测。以确定不与PD-L1结合的DARPin蛋白作阴性对照，首先在FSC/SSC散点图中选取正常细胞的门，定义为R1；在R1中比较样品与阴性对照的平均荧光强度并分析阳性细胞所占百分数。图2中提供了DARPin#1、#4和#6的平均荧光强度结果。其中，DARPin#1蛋白与阴性对照有极显著性差异。

实施例4：BLI分析DARPins与PD-L1亲和力

将PD-L1进行生物素标记，利用Pall FortrBio公司的Octet QKe检测蛋白与PD-L1的亲和力，方法如下：

取SA偶联传感器，先于碳酸盐缓冲液中浸泡5min，随后浸入含有生物素标记的PD-L1溶液的96孔板中，设定控制程序为Loading，转速为1000rpm，时间为300s，使生物素与传感器上链霉亲和素充分结合，制备PD-L1结合传感器；将D3蛋白以含0.1％BSA/0.05％Tween20的碳酸盐缓冲液1:1稀释7个梯度，浓度分别为6μM、3μM、1.5μM、0.75μM、0.38μM、0.19μM、0.1μM，加入96孔板，最后一排为碳酸盐缓冲液；利用PD-L1结合传感器对96孔板中各浓度梯度蛋白亲和力进行检测，设置检测条件为：封闭120s，结合300s，解离600s。随后使用自带软件对获得的数据进行分析，并拟合得到Kd值。作为举例，表2总结了一些DARPins的Kd值，图3为DARPin#1的BLI结果。

如表2所示，各DARPin的解离常数Kd与实施例2的结果基本相符，且均低于1×10^- ⁵M，有的甚至低于1×10^-6M。

表2：BLI检测DARPin与人PD-L1相互作用的Kd值

注：nM＝1×10^-9M

实施例5：DARPins对肿瘤细胞杀伤性研究

CT26细胞复苏后，用含10％胎牛血清的RMPI-1640培养基转入培养瓶中，在37℃，5％CO₂的条件下培养，当细胞长到整个培养瓶的90％左右，弃去培养基，用0.25％的胰酶消化，每2天按照1:10比例传代。取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞密度为30000cell/mL。向96孔板中加入100μL细胞悬液，在37℃下培养至细胞贴壁完全后(约24h)加入倍比稀释的浓度分别为12.5-200μM的DARPin蛋白，对照孔细胞中加入PBS为对照。给药24h与48h后，每孔加入10μL的MTT溶液，继续培养4h后，终止培养。小心吸去孔内培养液，每孔加入200μL的二甲亚砜，置于摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上测量OD490nm处各孔的吸光度。计算细胞存活率，考察不同浓度DARPin蛋白对CT26细胞的杀伤作用。

获得的结果显示于图4，图4显示DARPin蛋白对CT26细胞的增殖率的影响随着浓度的改变无明显变化，说明该蛋白不会直接杀死肿瘤细胞。

实施例6：DARPins在小鼠中血浆清除率的确定

为了评估对PD-L1具有结合特异性的DARPin在血浆中清除情况，利用DARPin蛋白含有的his标签，将蛋白注射进首次用于实验的Balb/c小鼠的尾静脉中，分别0min、3min、10min、30min、60min、120min、720min、1440min时间点采取眼眶后静脉丛取血的方式采集各组小鼠血样；室温静置30min后，3000rpm离心20min；吸取血清，ELISA检测血清中蛋白的含量。图5中为DARPin#1的药时曲线，表3为DARPin#1蛋白的药代参数。

表3：DARPin#1蛋白的药代参数

实施例7：PD-L1结合特异性DARPin蛋白对肿瘤生长的抑制作用

Balb/c雌性小鼠(6-8周龄)，38只，体重18±2g，每只鼠腋下皮下注射200μL共2×10⁶个CT26细胞悬液，正常喂养，每两天检查一次肿瘤生长状态，根据公式π×ab²/6来计算肿瘤体积。当肿瘤大小达到50-100mm³时，认为造模成功；将造模成功的小鼠随机分为5组，每组6只，分为生理盐水组、低剂量组(1mg/kg)、中剂量组(4mg/kg)、高剂量组(16mg/kg)与5-氟尿嘧啶组(10mg/kg)。每组每两天瘤周皮下给药一次，每天测量小鼠的肿瘤体积并称重。以DARPin#1为例，图6所示为肿瘤体积对蛋白处理时间的作图。图7所示为最终给药后肿瘤体积大小作图。

在小鼠中观察到有效的抗肿瘤作用的耐受性剂量；在高剂量和中剂量给药组给药过程中，肿瘤大小维持在一个较稳定的大小，相对阴性组无明显增长。低剂量组与五氟尿嘧啶相比，肿瘤增长趋势明显更小。总体给药组与生理盐水对照组相比，肿瘤大小明显被控制在较小的范围内。说明该蛋白有较好的抑瘤效果。

实施例8：DARPin蛋白的空间结构

将实施例1设计得到的各DARPin序列导入Swiss Model(http://www.swissmodel.expasy.org/interactive)进行同源模建；与此同时，利用DiscoveryStudio软件对实施例1的各DARPin序列进行模建；在综合两种软件比对结果后，确定各DARPin蛋白的结构均由十个阿尔法螺旋加贝塔转角结构组成，每个结构单元紧密排列，空间上形成L型结构。所建立DARPin蛋白空间结构模型如图1所示，十个螺旋均位于蛋白的外侧，蛋白的内侧基本形成平台区，该平台区为蛋白与PD-L1结合的位点。

根据建模结果，第30位、第32位、第40位、第41位、第61位、第63位、第71位、第72位、第92位、第94位、第102位、第103位的Xaa位于DARPin蛋白内侧的平台区，可与PD-L1结合。第53位、第54位、第57位、第58位、第86位、第87位、第88位、第89位、第117位、第118位、第119位、第120位的Xaa位于螺旋上，也即蛋白的外侧，不会影响DARPin与PD-L1的结合，因此可以随意替换。

实施例9：与DARPin#1-9蛋白相近的其余序列

基于实施例8的结果，发明人随机选定了一些序列，检测其与PD-L1结合的解离常数Kd。

选定的序列以SEQ ID NO.10为基础，第53位Xaa为Gln，第54位Xaa为Pro，第57位Xaa为Asp，第58位Xaa为Val，第86位Xaa为Gly，第87位Xaa为Gly，第88位Xaa为Asp，第89位Xaa为Val，第117位Xaa为Gly，第118位Xaa为Gly，第119位Xaa为Asp，以及第120位Xaa为Val。且，第32位Xaa为Asp，第41位Xaa为Trp，第63位Xaa为Asp，第72位Xaa为Asn，第94位Xaa为Asn，第103位Xaa为Thr。

其余位点为第30位、第40位、第61位、第71位、第92位、第102位Xaa，分别选定为不同的氨基酸，并进行组合。具体如下表所示。

采用实施例2的方法，对这些序列进行MST分析。受篇幅所限，具体实验数据不再一一列出。结果表明，各序列的解离常数Kd均低于1×10^-5M，即均能与PD-L1特异性结合。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国药科大学

<120> 与PD-L1结合的重组锚定蛋白及其用途

<160> 10

<210> 1

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Phe Gly Asp

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Asn Gly Asp Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Lys Asn Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala His Gly Asn Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Val Thr Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Val Gly Arg

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Pro Ala Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Lys Gly Phe Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Pro Gly Leu Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Arg Asp Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 3

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Phe Gly Met

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Gly Gln Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Ser Gly Arg Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Lys Gln Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gly Gly Glu Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Lys Ser Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 4

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Lys Gly Leu

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Gly Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Asn Gly Asp Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Lys Asn Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Ile Gly Gln Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Phe Tyr Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 5

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Lys Gly Leu

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Gly Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Asn Gly Asp Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Lys Asn Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Ile Gly Gln Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Phe Tyr Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 6

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Gly Gly Glu

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Lys Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Leu Gly Pro Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Ser Val Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala His Gly Asn Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Val Thr Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 7

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Trp Gly Val

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Thr Gly Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Ser Gly Arg Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Lys Gln Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Tyr Gly Lys Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Gly Ser Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 8

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Lys Gly Leu

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Pro Asp Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Phe Gly Arg Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Gly Ala Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Val Gly Arg Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Pro Ala Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 9

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Phe Gly Met

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Gly Gln Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Lys Gly Phe Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Pro Gly Leu Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Arg Asp Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 10

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<222> (30,32,40,41,53,54,57,58,61,63,71,72,86,87,88,89,92,94,102,103,117,118,119,120)

<223> Xaa为任意氨基酸，或为限定的多种氨基酸之一

<400> 10

Met Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Asp Ala Xaa Gly Xaa

20 25 30

Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly His Pro Glu Ile Val Lys

35 40 45

Ile Leu Leu Leu Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Asp Ala Xaa Gly Xaa Thr

50 55 60

Ala Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Leu Gln Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Xaa Gly Xaa Thr Ala

85 90 95

Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly His Pro Glu Ile Val Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys

115 120 125

Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu

130 135 140

Ile Leu Gln

145

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<222> (1,3,11,12)

<223> Xaa为任意氨基酸

<400> 11

Xaa Gly Xaa Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly His Pro Glu

1 5 10 15

Ile Val Lys Ile Leu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Asp Val Asp Ala

20 25 30

Claims

1. 一种与PD-L1结合的重复域锚定蛋白，其特征是，该蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.权利要求1所述重复域锚定蛋白用于制备抗肿瘤药物或药物组合物的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征是，所述肿瘤为细胞表面表达PD-L1分子的肿瘤。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征是，所述肿瘤的宿主为哺乳动物。

5.编码权利要求1所述重复域锚定蛋白的核酸。

6.一种药物组合物，含有权利要求1所述的重复域锚定蛋白或权利要求5所述的核酸。

7. 一种与PD-L1结合的重复域锚定蛋白，其特征是，该蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2至SEQ ID NO.9之一所示。