KR101782623B1 - 복합 막횡단 단백질의 세포막외 펩타이드 항원 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 복합 막횡단 단백질(multi-transmembrane protein)의 세포외 루프(extracellular loop)의 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단이 고체 기질(solid sunstrate)에 부착되어 고정되거나 또는 N-말단 및 C-말단이 동일한 링커의 양 말단에 각각 부착되어 환형구조(cyclic structure)를 이루는 복합 막횡단 단백질 항원, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세포신호 전달 등 질환관련 현상에 중요하게 작용하는 복합 막횡단 단백질에 대한 항체의 효율적인 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 루프형 항원은 생체 내 복합 막횡단 단백질의 루프의 입체적 구조를 완벽하게 모사함으로써 기존의 선형 항원에 비해 훨씬 강한 친화력을 가진다.
본 발명은 효율적인 항체의 스크리닝에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 사용된 막횡단 단백질의 특성에 따라 암 예방 및 치료용 조성물, 염증의 예방 및 치료용 조성물, 신뢰도 높은 진단용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

복합 막횡단 단백질의 세포막외 펩타이드 항원 및 그의 용도{Antigen Derived from Extracellular Domain of Multi-transmembrane Protein and Uses Thereof}

본 발명은 복합 막횡단 단백질의 세포막외 루프 부위의 펩타이드로 이루어진 항원 및 이를 항체 생산 및 스크리닝에 이용하는 방법에 관한 것이다.

막횡단 단백질(transmembrane protein)은 인간유전체 상에 많은 숫자(7천개 이상)가 존재하며 세포신호 전달 등 질환관련 현상에 중요하게 작용하기 때문에 항체 치료제의 주요한 목표 항원으로 선택되어 왔다. 세포막을 1-2회 통과하는 단백질로는 수용체(receptor) 단백질(약 400종), 효소 단백질(약 500종) 및 기타 세포막 단백질(약 500종) 정도가 존재하며 세포막 통과 3회 이상의 복합 막횡단 단백질은 수용체 단백질(약 1000종)과 대부분의 수송(transporter) 단백질(약 800종) 그리고 세포와 세포사이의 밀착결합(tight junction)에 필요한 단백질 등 매우 다양하다. 다양한 막횡단 단백질들을 이용하여 유용한 항체를 제작 및 개발하기 위해서는 자연상태 그대로의 형태를 지닌 고품질의 항원을 확보하는 것이 필수적이다. 특히 단백질 항원의 경우 단백질의 순도 뿐 아니라 3차원 구조와 생리활성이 검증되어야 고품질의 항체를 제작할 수 있다는 것은 공지의 사실이다. 많은 기존의 연구자들이 다양한 막횡단 단백질을 활용하여 항원을 제조하였으나, 선형으로 제작하여 활용하는 경우가 대부분이어서 막횡단 단백질의 특성상 우수한 항체를 제조하는 것이 어려웠다. N-말단 혹은 C-말단 부위의 세포질이나 세포막외 부분으로 노출된 부분을 항원으로 하여 항체를 제조하는 것이 대부분이며, 이 경우 항체로서의 충분한 기대효과를 가져오지 못하는 경우가 대부분이다. 막횡단 단백질의 경우 세포와 세포간 또는 조직과 조직간에 있어서 생체 내 중요 역할을 수행하고 있어 질병연구에 매우 좋은 소재이나, 재조합 단백질등으로 제조 시 2개 이상의 복합적인 막횡단 부위를 가지는 경우 생체 내에서 막과 결합된 천연의 모습을 그대로 지니기가 어려우며 지질성분과의 혼재 등으로 인해 항원으로 활용하기가 매우 어려워 고품질의 항체를 얻는 것이 힘든 실정이다. 많은 연구진들이 생물학적인 방법을 이용하여 막횡단 단백질을 발현시킨 산물을 그대로 항원으로 활용하거나 특정부위를 선별적으로 합성하여 항원으로 사용하는 경우가 대부분이었다. 또 다른 연구자들은 다양한 막횡단 단백질의 항원 제작을 위해 막횡단 단백질과 인간항체의 Fc를 융합하여 개별적으로 동물 세포주를 통해 발현시키는 연구를 다양하게 진행 중이나, 이 경우 역시 발현 단백질이 동물 세포주에서 원활하게 발현되어 막횡단 단백질로 제시되는 확률이 낮을 뿐 아니라 개발에 많은 시간과 경제적인 어려움이 수반되는 단점이 있다. 2개 이상의 막횡단 부위를 가지는 복합 막횡단 단백질의 경우 자연스럽게 세포막외 루프를 가진다는 점을 착안하여 본 발명자들은 이 부위를 그대로 모사함으로써 링커 등을 활용하여 단일 루프형 펩타이드를 항원으로 사용하는 방법을 고안하였다.

항체는 면역 시스템에 의해 만들어지는 단백질로, 저분자(small molecule)에 비하여 특이적인 항원에 대해 고도의 특이성을 가지고 있으며, 인체의 자연면역 시스템으로 이용하여 항원을 불활성화하거나 제거하며, 이러한 특성을 바탕으로 부작용이 적은 매우 효율적인 치료제가 될 수 있다. 예를 들어, 암세포 표면에서 특이적인 발현 양상을 보이는 막횡단 단백질등을 표적으로 한 면역세포 혹은 면역조절물질을 이용하여 암세포를 제거하는 항체 치료제로 적용할 수 있다. 또한 항체는 방사성 동위원소 및 독성물질의 운반체로 사용하여 암세포만 선택적으로 치료할 수 있다(Antibody-directed enzyme prodrug therapy, ADEPT). 한편 인간항체는 치료용 항체로서 가장 이상적인 형태임에도 불구하고, 지금까지 인간 세포를 사용한 하이브리도마 기술에 의한 생산이 불가능하여 그 개발이 지연되어 왔다. 그러나, 최근에는 인간 하이브리도마 기술에 의존하지 않고 인간 단클론 항체를 제조할 수 있는 파지 디스플레이 기술이 큰 주목을 받고 있다.

막횡단 단백질과 암의 연관관계에 대한 연구 대상 중 클라우딘 과(family)에 대한 다양한 연구가 집중되고 있다. 클라우딘 과는 4개의 막횡단 영역으로 이루어지고 밀착 접합부를 갖는, 분자량이 대략 20-34 kDa 크기인 세포막 단백질의 과이다. 클라우딘 과는 인간과 마우스에 23-24개의 군을 포함하고 있으며, 클라우딘의 각 맴버는 각각의 상피세포 유형에 따라 매우 독특한 발현 패턴을 나타낸다고 알려졌다(Furuse and Tsukita, TRENDS in Cell Biology 16: 181(2006)), (Wilcox, et al., Cell 104: 165(2001)), (Rahner, et al., GASTROENTEROLOGY 120: 411 (2001)). 상피 세포의 시트에서, 메카니즘은 세포 간 공간에서의 물질의 누출(확산)을 막는 작업을 하고, 밀착 접합부로 불리는 세포-세포 부착 시스템은 누출을 막는 메카니즘에서 실제로“장벽”으로서의 중심 역할을 한다고 나타나 있다. 클라우딘 단백질의 일반적인 구조는 도 1(Lai-Nag M et.al Genomic Biology 2009, 10:235(2009)) 자세히 설명되어 있다. 클라우딘 단백질의 발현은 암과 밀접하게 관련이 있더고 보고 되고 있는데, 특히 클라우딘-1은 유방암과 전립선암을 억제시키며, 식도암종 세포에서 클라우딘-7 발현의 감소는 E-카드헤린의 손실에 의한 암세포의 증가원인으로 알려져 있다. 인체 암조직에서의 특이성 높은 클라우딘 단백질의 발현의 증감 여부는 암 생성에 대한 예측 지시인자로 사용할 수 있어 암의 발견, 진단 및 치료에 있어 유용한 바이오마커로 이용될 수 있다. 특히 CLDN 3 및 4의 경우에는 매우 다양한 암에서 발현 증가를 나타내고 있으며, 특히 아직까지는 유용한 치료약물이 개발되지 못한 난소암의 바이오마커로 집중 연구중이다(Choi et al., Histol Histopathol 22:1185~1195(2007)). CLDN 3 및 4를 이용한 항체의 개발은 대부분 선형의 가상적인 펩타이드를 항원으로 하여 제작하여 활용중이다.

한편 CD151은 PETA-3 또는 SFA-1 라고도 일컫어지는 테트라스패닌 패밀리 (tetraspanin family)에 속하는 막 단백질이다(Boucheix and Rubinstein, Cell Mol. Life Sci. 58:1189-1205(2001); 대한민국 공개특허 제2011-0010708호; Hemler ME, J. Cell Biol. 155:1103-1107(2001)). 인간에서, CD151은 253개의 아미노산을 가지고 4개 막 단편 및 세포외 루프(extracellular loop)라고 불리는 2개의 세포외 도메인 EC1(18개 아미노산, [40-57] 서열) 및 EC2(109개 아미노산, [113-221] 서열)을 포함한다. CD151은 뉴클레오타이드 서열에서, CD151의 두 가지 변형체, 즉 395번 및 409번 위치에서 각각 뉴클레오타이드 A 및 C 를 가지는 변이(Fitteret al., Blood 86(4):1348-1355(1995)) 및 이와 동일한 위치에서 뉴클레오타이드 A 및 C 대신에 뉴클레오타이드 G 및 T 를 가지는 다른 변이(Hasegawa et al., J. Virol. 70(5):3258-3263(1996))가 지금까지 확인되어 왔다. 이는 펩타이드 서열 상에서 132번 및 137번 위치에서 각각 K(Lys) 및 P(Pro) 잔기가 R(Arg) 및 S (Ser)잔기로 돌연변이되는 변이체임이 확인되었다. CD151은 세포의 표면 상에서 다양한 막 단백질들과 상호작용한다. 구체적으로, 라미닌 수용체 인테그린(laminin receptor integrins)과, 보다 구체적으로는 바람직한 리간드가 라미닌 5 이기도 한 인테그린 α3β1 또는 α6β4 과 형성하는 일정 계면활성제(detergents)의 작용에 저항하는 매우 안정한 복합체가 확인되어 왔다(Yauch et al., Mol. Biol. Cell 9:2751-2765 (1998); Lammerding et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 100:7616-7621(2003)). 이 복합체는 CD151 및 인테그린의 세포외 도메인을 포함한다. ECL2 루프에 위치하는 CD151의 QRD [194-196] 서열은 이 부위의 돌연변이가 일정 인테그린과의 상호작용을 소실시키기 때문에 이 연결에 있어서 매우 중요하다(Kazarov et al., J. Cell Biol. 158:1299-1309(2002)).

몇 가지 이전 연구들은 CD151의 과다 발현이 폐, 직장 및 전립선 암과 같은 일정 암의 공격성과 연관되고, 이것은 나쁜 예후에 대한 인자로 고려될 수 있음을 보여주었다(Tokuhara et al., Clin. Cancer Res. 7:4109-4114(2001); Hashida et al., Br. J. Cancer 89:158-167(2003); Ang et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13:1717-1721(2004)). 이들 사례에서, 사실상 평균 생존율이 CD151을 발현하는 종양을 가진 환자에서는 CD151을 발현하지 않는 종양을 가진 환자의 생존율에 비하여 감소하였다. 다양한 인간 종양 주(HeLa, RPMI14788, A172, HT1080)에서, 해당 유전자의 형질전환에 의해 발생하는 CD151의 과다 발현이 감염된 세포의 운동, 이동 및 침습의 증가를 야기하며, 이러한 현상은 항-CD151 항체의 존재 하에서 억제되기 때문에(Testa et al., Cancer Res. 59:3812-3820(1999); Kohno et al., Int. J. Cancer 97:336-343(2002)), 항암 치료제 개발에 있어서의 매우 주요한 타깃이 될 수 있다.

CD9 역시 약 24-27 kD의 테트라스파닌계(tetraspanin family)의 멤버에 속하는 세포표면 당단백질 수용체로서, 세포 발달, 활성, 성장 및 운동성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 신호전달 작용(signal transductionevents)을 조절한다고 알려져 있으며, 세포 부착(Anton, E. S., et al., J. Neurosci. 15:584-595 , 1995) 및 세포 이동(Klein-Soyer, C., et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20:360-369, 2000)을 조절할 수 있고, 혈소판-유발 내피세포 증식(platelet-induced endothelial cell proliferation)에 관여(Masellis Smith, A., and Shaw, A. R., J. Immunol. 152:2768-2777(1994))하는 혈소판 활성화와 집성(aggregation)을 유도한다고 알려졌으며, 근육세포 융합(muscle cell fusion)을 촉진하고 근관 유지(myotube maintenance)에 기여하는 등과 같이 세포 내의 다양한 현상에 관여하는 것으로 알려져 있다. CD9 역시 두 번째 세포외 루프(extracellular loop2; ECL2)가 세포 부착에 중요하다는 보고가 있고(George, A., et al., Blood 100: 4502-4511, 2002), DT(Diphteria Toxin)에 대한 DTR의 활성을 증가시키는데 중요하다는 보고가 있다(Hidetoshi, H., et al. 289:782-790(2001)). 또한 테트라스파닌 계열의 많은 단백질들이 ECL2 도메인이 글리코실화(Glycosylate)되어 있는 경우도 있지만, CD9은 ECL1 도메인이 글리코실화되어 있어 차별화 된다. CD9는 아울러 세포 운동성(cell motility) 및 종양 전이(tumor metastasis)와 관련된다고 보고되어지고 있는데(Miyake, M. and Hakomori, S., Biochemistry 30:3328-3334, (1991)), 암에서 CD9는 조직-특이적(tissue-specific)인 특성을 나타내는 것으로 추정된다. CD9는 대장암(Mori, M., et al., Clin. Cancer Res. 4:1507-1510 (1998)), 유방암(Miyake, M., et al., Cancer Res. 55:4127-4131(1995)), 폐암(Higachiyama, M., et al., Cancer Res. 55:6040-6044(1995); Funakoshi, T., et al., Oncogene 22:674-687(2003)) 및 췌장암(Sho, M., et al., Int. J. Cancer 79:509-516(1998)) 환자들에서 발현이 감소되었으며, 이 경우 침윤(invasion), 전이(metastasis) 및 환자의 나쁜 예후와 관련된다고 보고되었다. 그러나 머리 및 목 등의 편평상피세포암(Erovic, B. M., et al., Head Neck 25:848-857(2003)) 및 위암(Hori, H., et al., J. Surg. Res. 117:208-215(2004))에서는 암의 진행 정도가 높을수록 CD9 발현이 증가된다고 보고되었다.

유로플라킨(Uroplakin 1B, UPK1B) 역시 또 다른 인간의 테트라스파닌계 멤버로서 4개의 소수성 영역의 존재가 특징인 세포 표면 단백질이다. 세포 발달, 활성화, 성장 및 운동성에 중요한 역할을 하는 신호 변환을 매개하며, 특히 불균형 단위막 (AUM)과 세포골격과의 상호 작용이 암과의 연관관계가 있으며, UPK1B 프로모터의 CpG 섬의 메틸화와 방광암에 대한 연관 관계 등이 잘 알려져있다(Varga AE, Leonardos L, Jackson P, Marreiros A, Cowled PA., Neoplasia. Mar-Apr; 6(2):128-35(2004)).

상기 언급한 다양한 막단백질들은 최근 많은 암과의 연관성이 논문에 언급되고 있으며, 특정 부위를 이용한 항체의 개발도 일부 이어지고 있으나 대부분 선형의 가상적인 펩타이드를 항원으로 하고 있거나 일부 발현 단백질을 이용한 항원이 대분분이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 세포신호 전달 등 질환관련 현상에 중요하게 작용하는 복합 막횡단 단백질에 대한 항체의 효율적인 생산방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 막횡단 부위 사이를 연결하는 루프(loop)를 모사하는 단일 루프형 펩타이드를 항원으로 활용할 경우 매우 우수하고 효율적인 항체를 수득할 수 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 복합 막횡단 단백질(multi-transmembrane protein) 항원을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 복합 막횡단 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 복합 막횡단 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 복합 막횡단 단백질(multi-transmembrane protein)의 세포외 루프(extracellular loop)의 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단이 고체 기질(solid sunstrate)에 부착되어 고정된 것을 특징으로 하는 복합 막횡단 단백질 항원을 제공한다.

본 발명자들은 세포신호 전달 등 질환관련 현상에 중요하게 작용하는 복합 막횡단 단백질에 대한 항체의 효율적인 생산방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 막횡단 부위 사이를 연결하는 루프(loop)를 모사하는 단일 루프형 펩타이드를 항원으로 활용할 경우 매우 우수하고 효율적인 항체를 수득할 수 있다는 사실을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“폴리펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형(linear)의 분자를 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 분자생물학적인 방법과 함께 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 명세서에서 용어“복합 막횡단 단백질(multi-transmembrane protein)”은 2개 이상의 막횡단 부위를 가져 이들을 연결하는 세포외 루프(loop) 부위를 가지는 막 단백질을 의미한다.

본 발명에 따르면, 세포막 외 루프 부위의 폴리펩타이드를 모사하여 항원을 제작할 경우, 막횡단 단백질을 그대로 발현시킨 선형의 가상적인 폴리펩타이드를 이용하는 기존의 항원과 비교하여 항체에 대한 훨씬 우수한 친화도과 결합력을 가진다. 본 발명은 세포외 루프 부위의 폴리펩타이드 양 말단을 고체 기질에 고정함으로써, 생체 내에서 막에 부착된 상태의 복합 막횡단 단백질 내에 있어 인접한 막 횡단 부위를 연결하는 루프의 입체적 구조를 완벽하게 모사함으로서 항원으로서의 효율성 및 특이성을 크게 증가시켰다.

본 발명에서 이용되는 고체 기질(solid sunstrate)은 펩타이드 잔기와의 공유 또는 비공유 결합을 통해 폴리펩타이드 사슬을 부착시킬 수 있는 것으로서 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 고체 기질이 제한없이 사용될 수 있다.

상술한 높은 효율성 및 특이성으로 인하여, 본 발명의 항원은 막단백질의 수용체 단백질의 조절, 막단백질의 물질이동 경로 단백질의 조절 및 막단백질의 세포끼리의 밀착결합(tight junction)관련 단백질의 조절 등에 이용됨으로써, 궁극적으로 세포의 신호전달 기작을 연구하는데 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 복합 막횡단 단백질의 세포외 루프의 폴리펩타이드는 서열목록 제 1 서열 내지 제 21 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제 1 서열 내지 제 21 서열의 아미노산 서열은 각각 복합 막횡단 단백질인 CD-151-1 내지 CD-151-6; 클라우딘 3 내지 7, 9 및 17; CPE; CD9-1 내지 3; 및 UP1b-1 내지 3의 세포외 루프 아미노산 서열이다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 복합 막횡단 단백질의 세포외 루프의 폴리펩타이드는 서열목록 제 3 서열 또는 서열목록 제 4 서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다.

서열목록 제 3 서열 및 서열목록 제 4 서열의 아미노산 서열은 각각 클라우딘 3(CLDN 3) 및 클라우딘 4(CLDN 4)의 세포외 루프 부위의 폴리펩타이드에 대한 아미노산 서열이다. 따라서, 이들 항원으로부터 생산되는 항체는 CLDN 3 또는 CLDN 4의 발현이 증가되는 다양한 암에 대한 진단 조성물 또는 치료제 스크리닝의 수단으로써 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 복합 막횡단 단백질(multi-transmembrane protein)의 세포외 루프(extracellular loop)의 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단이 동일한 링커의 양 말단에 각각 부착되어 환형구조(cyclic structure)를 이루는 것을 특징으로 하는 복합 막횡단 단백질 항원을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 복합 막횡단 단백질의 세포외 루프의 폴리펩타이드에 대해서는 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피히가 위하여 이를 생략한다.

본 명세서에서 용어“링커”는 본 발명의 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단에 공유 또는 비공유 결합을 통해 결합하여 양 말단을 연결하는 분자를 말한다. 본 발명의 링커는 분자 전체를 환형구조로 만들어 생체 내에서 인접한 막 횡단 부위를 연결하는 루프의 천연구조와 가장 유사한 3차원적 구조가 재현될 수 있도록 한다. 본 발명의 링커는 폴리펩타이드가 최적의 입체구조를 가지도록 적합한 길이의 것이 선택될 수 있으며, 바람직하게는 아미노헥사노익엑시드, 글라이신폴리머 및 알라닌폴리머로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 링커는 수용성 레진에 부착된다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 항원은 수용성 지지체인 레진에 부착되어 보다 간편하고 효율적인 항체 스크리닝에 이용될 수 있다. 특히 고체 상합성을 통해 항체를 수득하는 경우 본 발명의 링커가 레진을 통해 고정되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용되는 레진은 당업계에서 사용되는 모든 천연 수지 및 합성 수지를 포함하며, 바람직하게는 클로로 트리틸 클로라이드(chloro trityl chloride; CTL) 레진이다. 바람직하게는 본 발명의 레진은 수용성의 특성을 부과하기 위하여 폴레에틸렌클라이콜(PEG)로 둘러싸여 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 복합 막횡단 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 명세서에서 용어“항체의 항원 결합 단편”(또는“항체 단편”)은 본 발명의 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 임의의 하나 이상의 단편을 의미한다. 예시적인 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, dAb 단편, CDR을 함유하는 단편, 또는 분리된 CDR을 포함하나 이에 한정되지 않는다. Fab 및 F(ab')2 단편은 완전한 항체의 Fc 단편이 결여되어 있으며, 동물 또는 식물의 순환으로부터 더 빨리 제거되고, 완전한 항체보다 비특이적 조직 결합성을 더 적게 가질 수 있다.

본 발명의 항원에 대한 항체 또는 이의 하원 결합 단편은 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 본 발명의 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다. 항체의 항원 결합 단편 역시 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 스크리닝한다.

본 명세서에서 용어“특이적으로 결합하는”은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 안정한 생리학적 조건 하에 항원과의 복합체를 안정적으로 생성함을 의미하며, 특이적 결합은 최소한 약 1x10^-6 M 이하의 평형 해리상수를 가지는 경우를 말한다. 2개의 분자가 특이적으로 결합하는지를 결정하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 평형투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 생물활성적 제제와 접합될 수 있다. 본 명세서에서 용어“생물활성적 제제”는 항원에 결합하면서 목적하는 생물학적 효과를 매개하여 세포 내에서 원하는 활성을 증가시키는 모든 합성 또는 자연발생적인 화합물을 말한다. 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 세포독소, 화학요법 약물, 면역억제제 또는 방사성 동위 원소와 같은 면역접합체에 접합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 복합 막횡단 단백질 항원을 인간화 항체 라이브러리에 접촉시키는 단계를 포함하는 막횡단 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체는 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 파아지 라이브러리 디스플레이(phage library display) 법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))을 이용할 수 있다. 예시적으로, 비드(bead)에 결합된 본 발명의 항원 펩타이드와 인간화 항체 라이브러리 솔루션을 반응시킨 후 비드를 회수하고 막 여과 튜브(membrane filter tube)에서 인간화 항체 라이브러리를 분리시킨다. 분리된 인간화 항체 라이브러리 솔루션을 세포에 접종하고 배양 후 헬퍼파아지를 접종하여 배양액을 원심분리한 후 상층액을 회수하는 과정을 반복한다. 세포에서 패닝된 라이브러리 후보들의 역가를 측정함으로써 높은 반응성의 항체가 스크리닝될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 복합 막횡단 단백질(multi-transmembrane protein)의 세포외 루프(extracellular loop)의 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단이 고체 기질(solid sunstrate)에 부착되어 고정되거나 또는 N-말단 및 C-말단이 동일한 링커의 양 말단에 각각 부착되어 환형구조(cyclic structure)를 이루는 복합 막횡단 단백질 항원, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 세포신호 전달 등 질환관련 현상에 중요하게 작용하는 복합 막횡단 단백질에 대한 항체의 효율적인 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

(c) 본 발명의 루프형 항원은 생체 내 복합 막횡단 단백질의 루프의 입체적 구조를 완벽하게 모사함으로써 기존의 선형 항원에 비해 훨씬 강한 친화력을 가진다.

(d) 본 발명은 효율적인 항체의 스크리닝에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 사용된 막횡단 단백질의 특성에 따라 암 예방 및 치료용 조성물, 염증의 예방 및 치료용 조성물, 신뢰도 높은 진단용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 복합 막횡단 단백질의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2는 루프형 펩타이드의 합성을 위한 모식도를 나타낸 그림이다.
도 3은 합성된 펩타이드중 서열목록 제1서열에 대한 HPLC 및 Mass 그림이다.
도 4는 루프형 단백질을 생산하기 위한 모식도를 나타낸 그림이다.
도 5는 발현된 서열목록 제2서열의 루프형 펩타이드에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 그림이다.
도 6은 제작한 루프형 항원을 이용한 라이브러리 스크리닝의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 7은 복합 막횡단 단백질의 항원을 스크리닝한 패닝 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 선정한 루프형과 선형 항체의 효능을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 선정한 루프형과 선형 항체의 효능을 FACS로 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 10 은 선정한 루프형과 선형 항체의 효능을 SPR로 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 선형 항원으로부터 유래된 항체단편인 C3E6(위 왼쪽 패널), C3B12(위 오른쪽 패널) 및 루프형 항원으로부터 유래된 항체단편인 3CH12(아래 패널)의 결합력을 다양한 농도별로 KD 값(해리 상수)를 조사하여 결합력을 측정하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1 : 루프형 펩타이드의 합성

서열목록 제1서열의 루프형 펩타이드 항원을 제작하기위해 아래와 같이 두 단계로 합성을 진행 하였으며, 도 2에서 나타난 합성의 모식도와 같이 합성을 시도하였다

1) 보호기 부착 펩타이드의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응 용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분 간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Ile-OH 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분 간 반응시킨 후, 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 DMF로 2회, MC로 1회, 다시 DMF로 3분씩 1회 세척하여 Ile-CTL 레진을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF용액을 넣고 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 용해시켰다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 용해시킨 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrine Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Tyr(tBu)-Ile-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 도 1과 같이 선정된 아미노산 서열에 의거하여 연쇄반응을 시켜 Fmoc-KWTLALKSDYISLLASGTYLATAYI-CTL 레진을 제조하였다. 해당 펩타이드는 모든 잔기가 보호된 상태이며 펩티딜 레진은 DMF, MC, 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한 뒤 탈루 용액(0.1% 트리플로로화 초산 (Trifluroacetic acid) 30 ml)을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 이를 소량의 0.1% TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 피리딘 등으로 중화하고 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전물을 수집하고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 1.18 g 합성하였다(수율: 47.6%).

2) 수용성 레진의 제작 (2잔기 기준)

PDB Data 등에 언급된 막 단백질의 기저부위의 간극을 정확히 측정한 뒤 루프형 펩타이드의 합성을 위해 1-10잔기 정도의 아미노헥산산(aminohexanoic acid) 혹은 글리신 잔기를 포함하는 링커를 제작하였다. 레진과의 원활한 부착을 위해 중간 잔기에는 L-Lys(Mtt)를 위치시켰다(예를 들어, Fmoc-Gly-Gly-Glu(OAll) -Gly-Gly-COOH, Fmoc-AHX- AHX-Lys(Mtt)-AHX-AHX-COOH). Novagel-HMBA 레진 (Novagen)에 부착한 뒤 N-말단의 아미노기를 탈보호 하여 선택적으로 N-말단을 열어 두었다. 본 발명의 수용성 레진은 PEG(polyethylene glycol)이 개질되어 있으며, 대량 생산이 가능하고 각 사이즈마다의 링커 제품화가 가능하다.

3) 루프형 펩티딜 레진의 생산

전 잔기가 보호된 1)에서 제작된 서열 1의 펩타이드를 2)에서 제작한 수용성레진기에 커플링시켰다. HoBt, HBTU 조건하에서 적절히 DIEA를 조절하여 반응하고 반응의 종료는 닌히드린 검사를 통해 확인하였다. 미반응 물질을 모두 제거하고 알릴기(Allyl Group)를 Pd(Ph3P)4/CHCl3/AcOH/NMN하에서 제거한 뒤 N-말단의 Fmoc을 탈보호하고 다시 한번 HoBt, HBTU 조건하에서 적절히 DIEA를 조절하여 반응하고 반응의 종료는 닌히드린 검사를 통해 확인 하여 루프형 펩타이드를 제조하였다. 동일한 반응으로 후술할 서열 목록의 펩타이드들을 합성할 수 있었다.

KWTLALKSDYISLLASGTYLATAYIE-Linker-Resin(1-26 Cyclized)

합성한 펩타이드는 도 3과 같이 HPLC와 Mass로 분석하여 정확하게 합성되었음을 확인할 수 있었다. 합성된 루프형 펩타이드들에 대한 서열정보는 다음 표 1과 같다.

합성한 서열 정보

서열	단백질명	서열	비고
1	CD-151-1	KWTLALKSDYISLLASGTYLATAYIELinker-Resin	펩타이드
2	CD151-2	C-GSNNSQDWR DSEWIRSQEA GGRVVPDSCC KTVVALCGQR DHASNIYKVE GG-C	단백질
3	Claudin 3	SANTIIRDFYNPVVPEAQKREMGAGELinker-Resin C-SANTIIRDFYNPVVPEAQKREMGAGEC	펩타이드/ 단백질
4	Claudin 4	TAHNIIQDFYNPLASGQKREMGASELinker-Resin C-TAHNIIQDFYNPLASGQKREMGASE-C	펩타이드/ 단백질
5	Claudin 5	FANIVVREFYDPSVPVSQKYELGAAELinker-Resin	펩타이드
6	Claudin 6	TAHAVIRDFYNPLVAEAQKRELGASELinker-Resin	펩타이드
7	Claudin 7	VANAIIRDFYNSIVNVAQKRELGEAELinker-Resin	펩타이드
8	Claudin 9	TAHAIIQDFYNPLVAEALKRELGASELinker-Resin	펩타이드
9	Claudin 17	TANIIIRDFYNPAIHIGQKRELGAAELinker-Resin	펩타이드
10	CPE Protein	KLVMKANSSYSGNYPYSILFQKELinker-Resin	펩타이드
11	CPE Protein	KANSSYSGNYPYSILFQKELinker-Resin	펩타이드
12	CD151-3	KGSNNSQDWRDSEWIRSQEAGGRVVPDSELinker-Resin	펩타이드
13	CD151-4	KKTVVALCGQRDHASNIYKVEGGELinker-Resin	펩타이드
14	CD151-5	WTLALJSDYUSLLASGTYLATAYIELinker-Resin	펩타이드
15	CD151-6	C-AYYQQLNTELKENLKDTMTKRYHQPGHEAVTSAVDQLQQE FH-C	펩타이드
16	CD9-1	KRFDSQTKSIFEQETNNNNSSFYTGVE-Linker-Resin	펩타이드
17	CD9-2	KDEVIKEVQEFYKDTYNKLKTKDEPQRETLE-Linker-Resin	펩타이드
18	CD9-3	C-GLAGGVEQFISDIC(S)PKKDVLETFTVKS-C	단백질
19	UP1b-1	KFVSDQHSLYPLLEATDNDDIYGAAWIGIFVE-Linker-Resin
20	UP1b-2	KQMLERYQNNSPPNNDDQWKNNGVTKE-Linker-Resin
21	UP1b-3	C-GVNGPSDWQKYTSFRTENNDADYPWPRQC(S)C(S)VMNNLKEPLNLEAC(S)KLGVPGFYHNQGC-C	단백질

실시예 2 : 루프형 단백질의 합성

도 4의 루프형 단백질을 생산하기 위하여 표 1의 서열목록 제3서열 및 제4서열의 클라우딘 단백질을 대상으로 클로닝을 수행하였다.

클라우딘 3의 막외 루프 서열인 SANTIIRDFYNPVVPEAQKREMGA에 대한 DNA 염기서열인 tcggccaacaccattatccgggacttctacaaccccgtggtgcccgaggcgcagaagcgcgagatgggc gcgggc와 클라우딘 4의 막외 루프 서열인 TAHNIIQDFYNPLASGQKREMGAS에 대한 DNA 염기서열인 acggcccacaacatcatccaagacttctacaatccgctggtggcctccgggcagaagcgggagatggg tgcctcg에 대하여 역전사 중합연쇄반응(RT-PCR) 또는 프라이머 중첩연장 중합연쇄반응(overlap extension PCR)을 통해 유전자를 확보하였다. 환형(cyclized) 재조합 펩타이드 제조를 위하여 말단에 시스테인 잔기를 코딩하는 유전자인 TGT나 TGC를 삽입하여 유전자를 확보하였다. 벡터와의 연결을 위하여 5’방향 및 3’방향에 각각 제한효소 NdeI 및 XhoI의 절단 부위인 CATATG및 CTCGAG를 삽입하였으며 XhoI 절단부위 앞쪽에 정지코돈(TAA)을 삽입하여 최종적으로 클라우딘 3는 CATATG-TGT(C)-tcggccaacaccattatccgggacttctacaaccccgtggtgcccgaggcgcagaagcgcgagatgggcg cgggc-TGT(C)-TAA-CTCGAG를 클라우딘 4는 CATATG-TGT(C)-acggcccacaacatcatccaaga cttctacaatccgctggtggcctccgggcagaagcgggagatgggtgcctcg-TGT(C)-TAA-CTCGAG 유전자를 확보하였다. 벡터는 pREP-HTX로서, T7 프로모터 및 암피실린 내성 선택 표지자(selective marker)를 사용하며 정제용 Hexa histidine tag과 트롬빈 절단 부위 유전자를 포함하고 있다.

확보된 벡터 및 클라우딘 펩타이드 유전자에 대하여 제한효소 NdeI 및 XhoI을 처리하여 각각 절단한 후 아가로스 젤 상에서 유전자의 크기를 확인한 후 정제과정을 통하여 벡터 및 펩타이드 유전자를 확보한 후 연결(ligation)을 진행하였다. T4 라이게이즈를 사용하여 벡터 : 유전자 = 1 : 3 분자비로 진행하였다.

15℃에서 4시간동안 연결반응을 진행하였다. 연결반응을 완료한 후 미리 준비된 화학적 수용세포(competent cell)화한 대장균 세포주(DH5α)에 형질전환을 유도하였다. 형질전환 유도를 완료한 후 50μg/ml의 농도의 암피실린을 포함한 한천 LB(Luria-Bertani) 배지 상에 도말한 후 37℃에서 18시간동안 배양하여 콜로니를 확인하였다. 확보된 콜로니들 중에서 유전자를 포함하고 있는지를 중합효소연쇄반응을 통한 확인시험을 통하여 정확하게 목적 유전자가 포함되어 있는 콜로니들을 선별하였다.

암피실린을 포함하고 있는 액상 LB상에서 37℃, 180rpm 조건으로 배양한 후 600nm 파장의 흡광도 수치가 약 0.7에 도달했을 때 1mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가한 후 30℃에서 4시간 이상 발현시켰다. 발현 완료 후 배양배지 전체를 원심분리(4℃, 5,000rpm, 15min)를 통해 발현 세포만을 회수하였다. 발현 세포는 고압을 이용하여 세포파쇄를 수행하였다. 이때 발현 세포는 pH 8.0 Tris 완충용액 5mM 이미다졸 및 0.5M 염화나트륨을 포함한 니켈 친화 크로마토그래피 완충용액으로 현탁한 후 파쇄하였다. 이렇게 파쇄한 파쇄액을 10,000rpm 이상의 고속 원심분리기를 활용하여 상등액만을 취하였다. 니켈 친화 크로마토그래피를 수행하여 미리 준비된 컬럼에 결합시킨 후 10mM의 DTT(Dithiothreitol)를 사용하여 단백질 말단의 시스테인 잔기를 환원시켰다. 그 후 상기의 니켈 친화 크로마토그래피 완충용액으로 바꿔주어 온칼럼 리폴딩(On-column refolding)을 수행하였다. 이후 준비했던 트롬빈 절단 용액을 사용하여 절단시켰다. 이때 절단조건은 상온에서 12시간 이상 트롬빈 절단용액에 방치하여 진행하되 단백질 1mg 당 1 유닛으로 절단시킨 후 니켈 친화 크로마토그래피 완충용액을 흘려주어 절단된 단백항원만 확보하였다.

확보된 정제 단백질 항원을 비변성 조건의 SDS-PAGE 젤 전기영동을 수행하여 단량체임을 확인한 후 젤 여과방법으로 단량체만을 순수분리하여 최종적으로 정제된 환형 정제 단백항원을 확보하였다. 서열목록 제2서열의 CD151-2에 대한 SDS-PAGE 결과는 도 5에 나타내었다.

실시예 3 : 루프형 펩타이드 및 단백질을 이용한 라이브러리 스크리닝

실시예 1과 같이 제작한 서열목록 제3서열의 클라우딘-3의 루프형 펩타이드 레진과 선형 펩타이드 레진을 비교하여 클라우딘 단백질과 클라우딘 단백질과 특이적 결합을 하는 항체를 스크리닝하고 입체적 항원의 유의성을 비교하기 위하여 파지 라이브러리 디스플레이법을 이용하였다. 도 6의 모식도에서 보는 바와 같이 LB 배지에 E.coli TG1 세포주를 접종 후 mid-log phase에 도달할 때까지 배양하였다. 비드(Bead)에 결합되어 있는 클라우딘 펩타이드와 인간화 항체 라이브러리 솔루션을 상온에서 1시간 반응시킨 후 비드 만을 회수하였다. TBS-T로 3회 세척한 후 막여과 튜브(membrane filter tube)로 비드를 옮겨 100mM TEA (Triethylamine)으로 상온에서 10분 반응하여 비드-클라우딘 펩타이드에 결합되어 있는 인간화 항체 라이브러리를 분리시켰다. 분리된 인간화 항체 라이브러리 솔루션을 Tris-HCl pH7.4로 중화한 후 앞서 배양한 E. coli TG1 세포에 접종하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 암피실린과 2% 글루코스가 함유된 한천배지에 배양액을 도말하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 한천배지에 5ml의 LB 배지를 첨가하여 콜로니를 스프레더로 긁어모아 50μl를 암피실린이 포함된 LB 배지에 접종, 37℃에서 배양하였다. Mid-log phase에 도달한 후 1×10¹¹/ml의 VCSM13 헬퍼파아지를 500μl 접종하여 1시간동안 배양하였다. 1시간 경과 후 70ng/ml 카나마이신을 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후 상층액을 회수하여 15% NaCl이 포함되어 있는 20% PEG8000을 첨가하여 냉장에서 30분 반응시켰다. 원심분리하여 상층액을 제거하고 500μl PBS로 펠릿을 잘 풀어준 후 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 상기에 기재된 과정을 3회 더 반복하였다. 도 6은 제작한 루프형 항원을 이용한 라이브러리 스크리닝의 모식도이며, 도 7은 클라우딘 단백질의 항원을 스크리닝한 패닝 결과이다. 패닝된 라이브러리 후보들의 역가를 측정하기 위해 다음과 같이 ELISA를 수행하였다: 마이크로타이터 플레이트에 바이오틴이 결합된 클라우딘 펩타이드를 각 웰 당 10㎍/㎖ 농도로 100㎕ 부피로 부착시키고, 충분히 세척한 후, 5% 탈지유를 이용하여 비특이적 결합을 방지하였다. TBS-Tween 20을 이용하여 세척한 후 E.coli에서 발현된 항체 단편을 1시간 동안 부착시켰다. 플레이트를 충분히 세척하고, 반응 후 동일한 방법으로 플레이트를 세척한 후, 항-HA-호스래디쉬 퍼옥시다제를 첨가하여 플레이트에 고착된 항체 단편과 실온에서 1시간 결합시켰다. 충분히 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 넣어 발색시켜 파장 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 통해 후보항체 단편을 1차 스크리닝하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 스크리닝 결과 선형의 항원에서보다 입체형 항원에서 보다 높은 반응성의 항체 단편이 스크리닝됨을 알 수 있었다. 한편 본 발명자들은 추가로 Fab 라이브러리와 다른 소스의 합성 scFv 1건 및 마우스를 이용한 전통적인 하이브리도마 스크리닝을 통해 같은 방식으로 항체단편 또는 항체를 스크리닝하였다.

실시예 4 : 선정된 scFv의 FACS 분석

선형 및 루프형 항원으로부터 1차 스크리닝된 항체 단편을 E-coli 에 서브클로닝하고 발현시킨 한 뒤 정제하고 이를 이용하여 FACS로 분석함으로써 입체성을 가진 루프형 항원의 유용성을 파악하였다. FACS 분석을 위해서 클라우딘이 과발현되는 위암세포주인 SNU-8 세포주(한국세포주은행, 한국)를 이 시험에서 표적 세포주로 사용하였다. 샘플당 1ml에서 세포를 밀도 2 ×10⁶/㎖로 조정하였다. 배양은 RPMI 1640 배지(Hyclone)+10% FBS로 수행하였다. 세포를 긁어 모아 PBS로 세척하고, 제조한 항체를 1시간 동안 부착시켰다. PBS로 다시한번 세척하고 HA-FITC Ig를 1시간 동안 부착한 후 FacsCalibur^TM 유량세포측정기(Becton Dickinson)를 사용하여 결합 결과를 평가하였다. 또한 대조군으로 OV-90 세포주를 상기에 기재된 동일한 방법을 통하여 결과를 확인하였다. 도 9에서 확인하는 바와 같이, 발현된 루프형 항원이 가장 좋은 효능을 보임을 알 수 있었다.

실시예 5 : 선정된 scFv의 SPR 분석

본 발명에서 제조한 항체단편의 항-클라우딘에 대한 특이성을 측정하기 위하여, 클라우딘 펩타이드를 ProteOn GLC 센서칩 표면에 붙이고, 제조한 선형 및 루프형 펩타이드로부터 스크리닝한 정제한 항체단편을 이용하여 SPR(surface plasmon resonance)를 통하여 결합력을 분석하였다. 일련의 실험방법은 Bio-Rad 사에서 제공하는 규칙에 따라 수행하였다. 도 10에서 보는 바와 같이, 선형 항원의 scFv보다 루프형 항원의 scFv가 1,000배 정도 높은 결합력을 보이는 것으로 알 수 있어 본 발명의 루프형 항원의 유용성을 확인 할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> REFERENCE BIOLABS <120> Antigen Derived from Extracellular Domain of Multi-transmembrane Protein and Uses Thereof <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Trp Thr Leu Ala Leu Lys Ser Asp Tyr Ile Ser Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 Gly Thr Tyr Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Glu 20 25 <210> 2 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Ser Asn Asn Ser Gln Asp Trp Arg Asp Ser Glu Trp Ile Arg Ser 1 5 10 15 Gln Glu Ala Gly Gly Arg Val Val Pro Asp Ser Cys Cys Lys Thr Val 20 25 30 Val Ala Leu Cys Gly Gln Arg Asp His Ala Ser Asn Ile Tyr Lys Val 35 40 45 Glu Gly Gly 50 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu 1 5 10 15 Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly Ala Gly Glu 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Ala His Asn Ile Ile Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Ala Ser Gly 1 5 10 15 Gln Lys Arg Glu Met Gly Ala Ser Glu 20 25 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Phe Ala Asn Ile Val Val Arg Glu Phe Tyr Asp Pro Ser Val Pro Val 1 5 10 15 Ser Gln Lys Tyr Glu Leu Gly Ala Ala Glu 20 25 <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Ala His Ala Val Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Gln Lys Arg Glu Leu Gly Ala Ser Glu 20 25 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Val Ala Asn Ala Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Ser Ile Val Asn Val 1 5 10 15 Ala Gln Lys Arg Glu Leu Gly Glu Ala Glu 20 25 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Thr Ala His Ala Ile Ile Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala Leu Lys Arg Glu Leu Gly Ala Ser Glu 20 25 <210> 9 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Thr Ala Asn Ile Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Ala Ile His Ile 1 5 10 15 Gly Gln Lys Arg Glu Leu Gly Ala Ala Glu 20 25 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Lys Leu Val Met Lys Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Gly Asn Tyr Pro Tyr 1 5 10 15 Ser Ile Leu Phe Gln Lys Glu 20 <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Lys Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Gly Asn Tyr Pro Tyr Ser Ile Leu Phe 1 5 10 15 Gln Lys Glu <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Gly Ser Asn Asn Ser Gln Asp Trp Arg Asp Ser Glu Trp Ile Arg 1 5 10 15 Ser Gln Glu Ala Gly Gly Arg Val Val Pro Asp Ser Glu 20 25 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Lys Lys Thr Val Val Ala Leu Cys Gly Gln Arg Asp His Ala Ser Asn 1 5 10 15 Ile Tyr Lys Val Glu Gly Gly Glu 20 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Trp Thr Leu Ala Leu Xaa Ser Asp Tyr Xaa Ser Leu Leu Ala Ser Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Glu 20 25 <210> 15 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Tyr Tyr Gln Gln Leu Asn Thr Glu Leu Lys Glu Asn Leu Lys Asp 1 5 10 15 Thr Met Thr Lys Arg Tyr His Gln Pro Gly His Glu Ala Val Thr Ser 20 25 30 Ala Val Asp Gln Leu Gln Gln Glu 35 40 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Lys Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr Asn 1 5 10 15 Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Glu 20 25 <210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr 1 5 10 15 Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Glu 20 25 30 <210> 18 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Xaa Pro 1 5 10 15 Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser 20 25 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Lys Phe Val Ser Asp Gln His Ser Leu Tyr Pro Leu Leu Glu Ala Thr 1 5 10 15 Asp Asn Asp Asp Ile Tyr Gly Ala Ala Trp Ile Gly Ile Phe Val Glu 20 25 30 <210> 20 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Lys Gln Met Leu Glu Arg Tyr Gln Asn Asn Ser Pro Pro Asn Asn Asp 1 5 10 15 Asp Gln Trp Lys Asn Asn Gly Val Thr Lys Glu 20 25 <210> 21 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Val Asn Gly Pro Ser Asp Trp Gln Lys Tyr Thr Ser Phe Arg Thr 1 5 10 15 Glu Asn Asn Asp Ala Asp Tyr Pro Trp Pro Arg Gln Xaa Xaa Val Met 20 25 30 Asn Asn Leu Lys Glu Pro Leu Asn Leu Glu Ala Xaa Lys Leu Gly Val 35 40 45 Pro Gly Phe Tyr His Asn Gln Gly Cys 50 55

Claims (7)

1. 서열목록 제 5 서열 내지 제 9 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 복합 막횡단 단백질(multi-transmembrane protein)의 세포외 루프(extracellular loop)의 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단이 고체 기질(solid sunstrate)에 부착되어 고정된 것을 특징으로 하는 복합 막횡단 단백질 항원.
   
2. 서열목록 제 5 서열 내지 제 9 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 복합 막횡단 단백질(multi-transmembrane protein)의 세포외 루프(extracellular loop)의 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단이 동일한 링커의 양 말단에 각각 부착되어 환형구조(cyclic structure)를 이루는 것을 특징으로 하는 복합 막횡단 단백질 항원.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 링커는 아미노헥사노익엑시드, 글라이신폴리머 및 알라닌폴리머로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합 막횡단 단백질 항원.
   
4. 제 2 항에 있어서, 상기 링커는 수용성 레진에 부착된 것을 특징으로 하는 복합 막횡단 단백질 항원.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 수용성 레진은 폴리에틸렌클라이콜(PEG)로 둘러싸인 레진인 것을 특징으로 하는 복합 막횡단 단백질 항원.
   
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 복합 막횡단 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
   
7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 복합 막횡단 단백질 항원을 인간화 항체 라이브러리에 접촉시키는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 의 막횡단 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법.

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