CN117050144A - 一种靶向cd137的探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种靶向CD137的探针及其应用。本发明基于新发现的CD137靶向多肽提供相应的分子探针，本发明所提供分子探针的制备方法简单易行、分子量小、特异性强、成本低廉、实用性强，且具有良好生物安全性和较好的应用价值，在动脉粥样硬化斑块诊断和肿瘤免疫治疗监测中具有重要意义和应用价值。

Description

一种靶向CD137的探针及其应用
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种靶向CD137的探针及其应用。
背景技术
CD137(又称4-1BB)是肿瘤坏死因子受体家族的一种表面糖蛋白，可诱导多种免疫细胞和非免疫细胞，包括内皮细胞和平滑肌细胞。人CD137是一种存在于细胞膜表面的II型膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体TNFR超家族成员，它不仅表达于活化的T淋巴细胞，亦可表达于单核细胞、粒细胞及树突状细胞(DC)等细胞上。CD137不仅在免疫细胞中表达，也在血管细胞中表达，主要由活化内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs)表达。CD137/CD137L是CD28/B7之外的另一重要的共刺激分子，可依赖或不依赖于CD28/B7途径而介导共刺激分子CD137与CD137L相互作用产生的协同刺激信号，在细胞间相互作用、细胞粘附、抗原递呈、T细胞共刺激以及信号传导中起不同的作用。CD137及其配体系统存在双向信号传导，既可以通过CD137受体向T细胞传导信号，又可将信号传向表达配体的细胞。CD137阳性血管已在动脉粥样硬化病变、肿瘤和血管炎中被发现。被认为是炎症反应的主要参与者和调节剂。激活CD137信号诱导的内皮功能障碍有效地诱导了炎症状态，这在多种病理状况中起着关键作用。
1、CD137与动脉粥样硬化
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是动脉壁的慢性炎性病变，可以长期隐匿存在，直到斑块破裂和血栓形成，进而可导致急性冠状动脉综合征和猝死。血管内皮功能障碍和形态学损伤导致白细胞粘附、血管收缩、血小板聚集、氧化应激、平滑肌增殖和血栓形成会促进内皮细胞损伤形成并诱导内皮细胞凋亡，导致局部内皮脱落，导致斑块侵蚀形成，导致急性冠脉综合征的发生。因此，内皮功能障碍通过多种途径参与动脉硬化。斑块内持续炎症与斑块的不稳定和破裂有关，因此检测斑块是否存在进行性炎症反应，有助于AS早期诊断和风险评估。在小鼠和人体内动脉粥样硬化斑块病变的动脉粥样硬化相关血管细胞中，CD137的表达普遍上调。在体外促炎环境刺激下，发现高脂饲喂敲低CD137的APOE小鼠的主动脉粥样硬化区域显著减少，这表明CD137促进动脉粥样硬化。因此，CD137可作为研究AS进展的有效标志物。Olofsson PS等人证实CD137是表达于高风险斑块活化的血管内皮细胞、斑块内活化的T细胞和单核细胞膜表面的共刺激分子，具有高特异性，当配体与其结合时促进斑块内白细胞进一步活化和增多、致炎因子分泌，有潜力作为高风险斑块示踪和治疗的靶点。如何有效利用影像方法监测AS发生发展已成为迫在眉睫的问题。
鉴于传统的临床策略受到的限制，迫切需要以一种更有效、无创的方法对动脉粥样硬化进行早期干预。而如何根据易损斑块的特征进行早期诊断及有效干预治疗，减少心血管病死亡率，成为当前亟待解决的问题。分子影像及纳米医学技术的迅猛发展正好能弥补这一短板，该成像方法能在分子和细胞水平对动脉粥样硬化斑块进行活体定性和定量研究,检测出坏死核心、炎症、斑块内出血、纤维帽厚度和微钙化等,实现AS的早期检测和监控疾病的发生发展。基于合理设计并成功开发的靶向CD137的纳米分子探针将会给AS等心血管疾病的早期诊断、预防和治疗带来新的希望。
2、CD137与肿瘤免疫治疗
近年来，以PD-1为代表的免疫疗法的出现已经彻底改变了癌症的治疗模式。CD137是肿瘤坏死因子受体超家族的一员，也是增强抗肿瘤免疫反应的一个有希望的靶点。CD137在免疫应答、肿瘤免疫中起重要作用，在多种肿瘤中呈高表达。CD137有助于调节许多免疫细胞的激活，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)、树突状细胞和自然杀伤细胞。在胃癌中，癌细胞的免疫状态与CD137/CD137L的表达状态有关，如果肿瘤细胞CD137L呈高表达，则机体对于肿瘤细胞的杀伤作用会更强，反之，如果CD137L呈低表达，则会导致肿瘤的免疫逃逸。在大肠癌患者血清中也发现CD137显著增高，后续ELISA法证实CD137在大肠癌的诊断中特异度为97％，敏感度为83％，有望成为新的早期大肠癌诊断标志物。
最近的研究表明靶向CD137的激动抗体可以增强免疫治疗的效果。CD137作为人单核/巨噬细胞的阳性免疫检查点在多个免疫细胞亚群中提供共刺激信号，因此通过CD137抗体与治疗性抗体共同刺激活化的T细胞、自然杀伤细胞细胞和其他免疫细胞已经成为一种很有前景的癌症免疫治疗方法。多种靶向CD137的药物也正在研发和临床试验中，未来将在肿瘤治疗中发挥重要的作用。然而，如何对敏感人群进行准确筛查和实时动态疗效监测是开展基于CD137精确治疗的前提条件。探索一种可以准确预测患者免疫治疗疗效的方法也是迫切需要解决的难题。目前最常用的预测方法是免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)，然而IHC检查存在根本的局限性：肿瘤异质性空间表达的特点导致其对标志物的检测不敏感，以及肿瘤取样不完全等因素可能导致检测出现假阳性或假阴性的结果。相比较而言，分子影像(molecular imaging)在免疫治疗和个性化医学中发挥越来越重要的作用。其中分子探针的制备是分子影像的关键，高灵敏度和特异性的分子探针进入体内后可与细胞内特定的靶点发生特异性结合并产生特异性信号，体外通过特定的影像设备进行信号捕捉，例如通过正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)、磁共振成像(MRI)以及荧光成像(FL)等进行采集成像，从而达到特异性诊断，实现高度特异性的诊断。
当前已报道的免疫检查点诊疗试剂主要以抗体为主，而抗体诊断试剂面临的问题有：体内半衰期过长、血液清除速度慢、多种靶标同时存在但抗体同时识别难度大、难于化学修饰和穿透能力差等。而多肽类靶向小分子药物及诊断探针以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性强、无免疫原性、并有较快的血液清除速率、制备简单等特点，在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面表现出很强的优越性。
发明内容
随着肿瘤免疫治疗的广泛应用，需要通过开发非侵入性分子影像工具实现对临床免疫检查点和免疫细胞的动态监测来评估疗效和筛选合适的病人。因此，需要开发一种针对CD137靶标的小分子探针，以实现快捷、简便、动态准确识别肿瘤组织中T细胞表面CD137蛋白表达水平，看是否有效激活免疫细胞，这对于免疫治疗及预后评估有着重要的临床意义。
在动脉粥样硬化斑块病变的相关血管细胞中CD137的表达普遍上调，具有高特异性，可作为高风险斑块示踪和治疗的靶点，用于AS的早期检测和监控疾病的发生发展。
本发明提供一种靶向CD137的探针及其应用，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供一种CD137靶向多肽，所述CD137靶向多肽包括SEQ ID NO.1-3任一所示的氨基酸序列。
本发明根据CD137/CD137L相互作用的这些热点氨基酸位点和分子识别理论进行肽库的设计和构建。采用氨基修饰的TentaGel树脂作为固相载体，利用Fmoc合成策略进行混合均分合成库容量为105的一珠一物肽库。利用荧光标记磁球和微流控芯片的方法进行高通量一珠一物肽库筛选，阳性肽珠经MALDI-TOF-MS鉴定，获得了一系列能特异性结合CD137的活性多肽。其中，WP1-3具备CD137亲和力。
SEQ ID NO.1：RKEEFYYWLWFC(WP1)；
SEQ ID NO.2：SVSTYLDASNRAC(WP2)；
SEQ ID NO.3：ACIEEGQYCPADPYMCA(WP3)。
本发明进一步提供所述CD137靶向多肽的制备方法，包括：
通过Fmoc固相肽合成方法合成所述CD137靶向多肽。
第二方面，本发明提供一种核酸，所述核酸用于编码如SEQ ID NO.1-3所述的CD137靶向多肽。
第三方面，本发明提供一种多价体，所述多价体包括至少2条多肽；所述多肽选自SEQ ID NO.1-3所述的CD137靶向多肽。所述多价体中以线性、D型化、环化或镜像结构形成。
本发明提供的多价体中，不同多肽间通过共价连接、非共价连接或多聚体混合的形式连接；
优选地，所述共价连接为通过连接分子进行连接，所述连接分子包括6-叔丁氧羰肼基烟酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种；和/或，
所述多聚体包括聚乙二醇、聚乙烯醇、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚乳酸或聚乳酸-乙醇胺中的一种或多种。
第四方面，本发明提供一种分子探针，所述分子探针由荧光标记和/或放射性同位素标记如下任一得到：
i)如上述CD137靶向多肽，
ii)如上述多价体。
本发明提供的分子探针中，所述荧光标记为IRDye800CW、Cy7、罗丹明或吲哚菁绿中的一种或多种，所述放射性同位素为131I、177Lu、64Cu、99mTc、18F或68Ga中的一种或多种；
优选地，所述荧光标记和所述放射性同位素通过螯合剂DOTA、NOTA、DTPA、HYNIC对所述CD137靶向多肽或多价体进行标记；也可通过NHS、EDC、MAL等点击化学方式进行标记；
更优选地，所述分子探针还包括氧化铁纳米颗粒Fe3O4。
本发明进一步提供所述CD137靶向多肽，或所述多价体，或所述分子探针在和CD137特异性结合中的应用。
第五方面，本发明还提供了上述的CD137靶向多肽，或上述核酸，或上述多价体，或上述分子探针在制备疾病检测试剂盒中的应用。
以及上述的CD137靶向多肽，或上述核酸，或上述多价体，或上述分子探针在制备药物中的应用；
优选地，所述药物用于CD137阳性血管内皮细胞、T细胞和单核细胞相关疾病的预防、诊断或治疗；
优选地，所述药物还包括显像制剂和能杀伤癌细胞的制剂；所述显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物、氧化铁磁共振造影剂或分子影像制剂中的一种或多种。进一步地，所述分子探针或所述多价体与所述显像制剂相缀合或混合。
进一步优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。例如PLGA聚合物、Dendrimer树状大分子、水凝胶、胶束、脂质体或无机纳米颗粒。
在本发明所提供的上述应用中，所述疾病包括肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、冠心病中的任意一种。所述肿瘤为多发性骨髓瘤、肿瘤为脑胶质瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌和/或乳腺癌。
在本发明所提供的应用中，所述药物用于CD137阳性的动脉粥样硬化斑块和肿瘤的预防、诊断或治疗。
第六方面，本发明提供一种药物或疾病检测试剂盒，所述药物包括上述CD137靶向多肽，或上述核酸，或上述多价体，或上述分子探针。
本发明的有益效果至少为：
(1)本发明发现了一种具有靶向CD137阳性T细胞或血管内皮细胞的特性的多肽，其可以作为分子探针用于监测接受免疫治疗的病人，同时进行疗效评估；还可以作为靶向多肽，与免疫制剂相缀合或混合，用于多种肿瘤的靶向治疗和成像；还可以优化该多肽将其本身作为多肽药物，激活CD137-CD137L信号通路，激活T细胞促进免疫治疗。
(2)本发明进一步基于发现的CD137靶向多肽提供了一种分子探针，其可以在保持良好靶向性的基础上，克服基于单抗的分子探针的分子量大、易失活、组织渗透慢、血液清除慢等缺陷。本发明提供的分子探针可以用于临床常用的PET检测，有利于后期临床转化，可以全面显示肿瘤区域内T细胞上CD137表达水平，同时在整个治疗过程中监测CD137水平的动态变化，具有较好的研究前景和临床指导意义。
(3)本发明提供的分子探针的制备方法简单易行，成本低廉，实用性强，且具有良好生物安全性和较高的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的表面等离子共振(SPRi)方法检测WP1、WP2和WP3多肽分别与人CD137蛋白的亲合力结果示意图；其中(a)为WP1的检测结果，(b)为WP2的检测结果,(c)为WP3的检测结果。
图2为本发明实施例3提供的罗丹明B标记WP1、WP2和WP3多肽与CD137阳性细胞系HUVEC的细胞水平共聚焦成像检测结果示意图。
图3为本发明实施例4提供的68Ga-DOTA-WP1用于小鼠肿瘤的PET成像。
图4为本发明实施例5提供的WP3@Fe3O4/ICG双模态探针的表征图，图中，WP3@Fe3O4/ICG显示为CD137@Fe3O4/ICG。
图5为CD137在人体组织表达量分析，其中，a为易损斑块、b为稳定斑块、c为正常动脉组织。
图6为WP3@Fe3O4/ICG探针在易损性动脉粥样硬化斑块ApoE-/-小鼠模型中对斑块的近红外荧光成像后的定量分析。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中涉及的N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，CD137重组蛋白，MB-Streptavidin(链霉亲和素磁珠)，Streptavidin-HRP(链霉亲和素标记辣根过物氧化酶)，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪和激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM710)，均从商业途径获得。
以下实施例中，没有特别提及的仪器和试剂均可以市售购得。
实施例1
本实施例提供CD137靶向多肽筛选系统的构建和筛选流程，具体如下：
1、“一珠一物”多肽文库的设计与合成
用DOCK 4.0模拟CD137-CD137L作用位点，筛选位点进行部分替换设计肽库。
多肽库的合成采取Fmoc固相合成策略，通过混合裂分的方式将氨基酸随机的逐个偶联到固相TentaGel树脂上(负载量0.35mmol/g)，在偶联过程中HBTU和Fmoc保护的氨基酸被溶解在含有0.4mol/LNMM的DMF中，每次偶联时间>2h。
随后进行脱保护流程：使用含20％六氢吡啶的DMF溶液去除Fmoc基团，每次脱保护时间为>1h。
最后，在强酸(92.5％ TFA、2.5％ H2O、2.5％TIS以及2.5％ EDT)的作用下脱去侧链保护基团，即室温反应2h脱去侧链保护基团，过滤除去裂解液，用甲醇多次洗涤收缩，真空抽干备用。
2、多肽库高通量微阵列芯片筛选和质谱原位鉴定
将CD137蛋白标记上生物素，经过Zeba旋转柱纯化。多肽库非特异性位点封闭2h后，将生物素化蛋白按照1：1000稀释，加入到多肽库中，37℃孵育2h。
PB轻轻清洗三次，向多肽库中加入1mL链霉亲和素标记的磁珠，37℃孵育2h。将多肽树脂转入到一个直径为1mm的聚四氟乙烯管中，设置流速为600μL/min。
最终收集阳性多肽树脂至高通量微阵列芯片上，向通道内注入裂解液(30mg/mL溴化氰)裂解过夜，轻轻撕掉盖片，将微点阵芯片导入质谱仪逐点进行二级质谱测序，最后利用Mascot软件解谱得到多肽序列。
3、CD137靶向多肽的合成
采用Fmoc固相肽合成方法合成多肽：称取200mg的Wang树脂，依次加入200mg的氨基酸依次进行如下反应：将被保护的氨基酸逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸作用下将肽链从树脂上裂解同时去除侧链保护基团；待反应完成后，加入FITC与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，在强酸的作用下脱去侧链保护基团(92.5％ TFA、2.5％ H2O、2.5％TIS及2.5％ EDT)室温反应2h脱去侧链保护基团，过滤除去裂解液，用甲醇多次洗涤收缩，得到产物WP1，WP2和WP3多肽，粗品经过ESI质谱鉴定和HPLC纯化用于后续试验。
WP1，WP2和WP3的质谱和液相色谱检测结果，表明该多肽探针具有较高的纯度，并且合成正确可以进行后续研究。
实施例2
本实施例通过表面等离子共振(SPRi)方法检测WP1，WP2和WP3与CD137蛋白的亲和作用力，具体流程如下：
将1mg/mL的WP1，WP2和WP3多肽及1×PBS缓冲液点到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜；然后用10×PBS清洗10min；再用1×PBS清洗10min；最后用去离子水清洗2次，每次10min；
将芯片浸入含5％牛奶的1×PBS中，4℃条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min；1×PBS清洗10min；最后用去离子水清洗2次，每次10min，用氮气吹干，装芯片上机(PlexeraHT表面等离子共振成像系统)。
流动相依次通过1×PBS、2×PBS、0.78μg/mL、1.56μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL的人CD137纯化蛋白，记录分析SPRi信号。
由图1中的结果可以看出，WP1，WP2和WP3的SPRi信号随着蛋白浓度的增加逐渐增强，说明本发明实施例1制备得到的WP1，WP2和WP3多肽对CD137都有较强的结合能力，亲和常数KD分别为4.31×10-7M，8.09×10-7M和8.16×10-8M，接近抗体的亲和力，比已报道的靶向CD137的多肽(GGACIEEGQYCF)的亲和力更强，已报道多肽的亲和常数为1.37×10-7M，表明本发明所提供的多肽可以更好地作为探针靶向表达CD137阳性的血管内皮细胞和T细胞，用于相关疾病的应用研究。
实施例3
本实施例检测WP1，WP2和WP3多肽分别与CD137高表达细胞HUVEC靶向结合成像，具体流程如下：
采用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养人脐静脉内皮细胞HUVEC，以1×105/mL的细胞浓度圆形玻底培养皿(35mm)，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，三种细胞中分别加入含1μmol/L Hoechst 33342和50μmol/L罗丹明B标记的WP1、WP2和WP3三种荧光多肽，4℃避光孵育15min后，用预冷1×PBS洗涤3次。用激光扫描共聚焦显微镜(ZEISSLSM 710)检测细胞中的荧光分布。
结果如图2所示，加入荧光标记WP1，WP2和WP3多肽的HUVEC细胞膜上观测到很强红色荧光，结果表明多肽结合在阳性细胞的细胞膜上，而且特异性与靶标蛋白的表达量呈正相关，可以作为靶向分子用于CD137相关的诊断和检测。也进一步验证了图1中的SPRi数据的可靠性。
实施例4
本实施例提供68Ga-DOTA-WP1多肽的制备方法和用于活体肿瘤PET成像，具体包括如下步骤：
1、将实施例2制备的WP1溶于去离子水中，用5mL 0.1mol/L高纯度盐酸溶液淋洗锗镓(68Ge/68Ga)发生器(JSC Isotope)至EP管中，收集1mL放射性含量最高的溶液，加入1.25mol/L醋酸钠100μL将混合液pH值调至3.5-4.5；
2、将30μg前体WP1加入至混合液中并充分混匀，加热至100℃保持10min；反应结束后将反应液冷却至室温，并加入无菌注射用水4mL后，通过无菌滤膜(0.22μm,13mm)过滤至无菌产品瓶中。
3、放射性检测应用HPLC专用放射性探测器。使用高效液相色谱进行检测(美国Waters公司，515型泵)、紫外检测器(486型，)和放射性检测器(美国EG&G BERTHOLD公司)对68Ga-DOTA-WP1的放射性检测其放化纯度(purity)>99％，可以作为PET探针进行活体肿瘤成像。
4、在6-8周龄的雄性小鼠后腿皮下接种H929细胞，当肿瘤体积长至100mm3左右时，进行PD-1抗体治疗1周后。分别尾静脉注射10MBq的68Ga-DOTA-WP1多肽探针。注射后30min、40min、50min、60min、80min使用Inveon micro-PET/CT扫描仪(Siemens，Germany)进行PET显像。如图3的结果显示，上述制备得到的多肽显像制剂WP1经尾静脉注射入CD137高表达的荷瘤小鼠体内，PET显像结果显示，在多肽探针注射后30min，肿瘤即可见明显的放射性浓聚，且从30分钟到80分钟均有较高的摄取。而在非治疗组肿瘤模型中，肿瘤均未见明显放射性浓聚。证明了本发明的分子探针具有CD137靶向性，可以实现肿瘤免疫治疗过程中免疫细胞的激活增殖的高灵敏度成像。
实施例5
本实施例提供WP3@Fe3O4/ICG双模态分子影像探针的制备方法和用于动脉粥样硬化斑块小鼠的活体成像检测，具体包括如下步骤：
1、先通过高温热分解发合成30nm左右油相Fe3O4纳米颗粒，将其溶解于四氢呋喃稀释至1mg/mL。称取150mg DP-PEG-Mal加入10mL溶液中，通过金属浴加热至60℃，振荡12h。随后用环己烷沉淀纳米颗粒，用环己烷洗涤3次，室温下真空干燥，去除正己烷。将干燥后的纳米颗粒溶解在去离子水中。用分子量为100kDa的超滤管进行超滤。然后，用去离子水洗涤三次，以去除未修饰的PEG。将DP-PEG-Mal修饰的Fe3O4纳米颗粒以3mg/mL溶解在Tris-HCl缓冲液(1mM,pH 7.4)中。然后加入CD137靶向肽(WP3),37℃搅拌混合20分钟。加入ICG-SH染料，4℃搅拌48h，最后在分子量为100kDa的截流超滤管中离心，PBS缓冲液(0.01M,pH 7.4)洗涤3次，去除未偶联的CD137肽和ICG-SH，得到双模态分子探针WP3@Fe3O4/ICG，图中显示为CD137@Fe3O4/ICG。随后进行投射电镜TEM和动态光散射DLS表征其形貌和粒径大小。如图4所示获得模态分子探针WP3@Fe3O4/ICG呈球形颗粒具有很好的分散性和均一性，粒径在50nm左右。
2、验证CD137在人体易损动脉粥样硬化斑块中的表达情况分析。CD137在人和小鼠动脉粥样硬化组织中的表达。将颈动脉内膜切除术后人内膜样本进行石蜡包埋切片，然后用CD137抗体进行免疫组化染色分析。如图5所示，易损斑块中CD137的表达明显高于稳定斑块和正常动脉组织，本发明还观察到小鼠主动脉和分支易损斑块中CD137的表达增加。
3、WP3@Fe3O4/ICG双模态分子影像探针用于小鼠颈部动脉斑块的高灵敏成像。8周雄性(约20g)C57BL/6J ApoE-/-小鼠购自北京HFK生物科技有限公司(北京，中国)。小鼠用含15％脂肪和1.25％胆固醇的高脂饲料饲喂6个月后进行实验，对照组饲喂标准实验室饲料。每只小鼠尾静脉注射200μL(2μM)WP3@Fe3O4/ICG探针，注射30min后用异氟烷麻醉小鼠。放入多光谱小动物活体成像系统IVIS Spectrum(PerkinElmer)中；设定激发波长为805±10nm；发射波长835±17.5nm，曝光时间为50ms，进行荧光检测并做定量分析。如图6所示，高脂喂养组位于主动脉和颈动脉弓处斑块的荧光信号强度明显高于对照组，特别是在注射后1h后。高脂喂养组有斑块组的信号强度为1.1×108p/sec/cm2/sr，之后随时间的延长信号逐渐降低24h后信号基本消失。证明了本发明的分子探针可以靶向斑块炎症组织中的CD137实现动脉斑块的高灵敏度活体成像。本发明的方法可以通过靶向CD137无创地识别高危动脉粥样硬化易损斑块。
综上所述，本发明提供一种多肽探针具有靶向表达CD137阳性细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的靶向多肽探针用于肿瘤免疫治疗成像，实现免疫治疗反应标志物CD137的无创可视化检测。此外，开发这种多模态磁性纳米探针CD137@Fe3O4/ICG可用于检测易损的动脉粥样硬化斑块。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种CD137靶向多肽，其特征在于，所述CD137靶向多肽包括SEQ ID NO.1-3任一所示的氨基酸序列。
2.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码如权利要求1所述的CD137靶向多肽。
3.一种多价体，其特征在于，所述多价体包括至少2条多肽；所述多肽选自权利要求1所述的CD137靶向多肽。
4.根据权利要求3所述的多价体，其特征在于，不同多肽间通过共价连接、非共价连接或多聚体混合的形式连接；
优选地，所述共价连接为通过连接分子进行连接，所述连接分子包括6-叔丁氧羰肼基烟酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或多种；和/或，
所述多聚体包括聚乙二醇、聚乙烯醇、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚乳酸或聚乳酸-乙醇胺中的一种或多种。
5.一种分子探针，其特征在于，所述分子探针由荧光标记和/或放射性同位素标记如下任一得到：
i)如权利要求1所述CD137靶向多肽，
ii)如权利要求4所述多价体。
6.根据权利要求5所述的分子探针，其特征在于，所述荧光标记为IRDye800CW、Cy7、罗丹明或吲哚菁绿中的一种或多种，所述放射性同位素为131I、177Lu、64Cu、99mTc、18F或68Ga中的一种或多种；
优选地，所述荧光标记和所述放射性同位素通过螯合剂DOTA、NOTA、DTPA、HYNIC对所述CD137靶向多肽或多价体进行标记；
更优选地，所述分子探针还包括氧化铁纳米颗粒Fe3O4。
7.权利要求1所述CD137靶向多肽，或权利要求2所述核酸，或权利要求3-4任一项所述多价体，或权利要求5-6任一项所述分子探针在制备药物中的应用；所述药物用于CD137阳性血管内皮细胞、T细胞和单核细胞相关疾病的预防、诊断或治疗；
优选地，所述药物还包括显像制剂和能杀伤癌细胞的制剂；
进一步优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。
8.权利要求1所述CD137靶向多肽，或权利要求2所述核酸，或权利要求3-4任一项所述多价体，或权利要求5-6任一项所述分子探针在制备疾病检测试剂盒中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述疾病包括肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和冠心病中的任意一种；
优选地，所述肿瘤为多发性骨髓瘤、肿瘤为脑胶质瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌和/或乳腺癌。
10.一种药物或疾病检测试剂盒，其特征在于，所述药物或所述疾病检测试剂盒包括权利要求1所述CD137靶向多肽，或权利要求2所述核酸，或权利要求3或4所述多价体，或权利要求5或6所述分子探针。
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