CN109897113A - Y型多功能靶向多肽及其在构建肿瘤靶向递药系统中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属药学领域，涉及Y型多功能靶向多肽及其在构建递药系统中的应用，本发明设计并制备了多功能靶向多肽AG及AG修饰的药物及高分子载体材料的制备，以及其在肿瘤影像和靶向治疗用递药系统构建中的应用。结果显示：AG可靶向肿瘤新生血管和跨血‑肿瘤屏障，靶向肿瘤拟态血管、肿瘤细胞及肿瘤干细胞；AG修饰的高分子载体材料所构建的纳米递药系统，如脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等，可有效地将所包载药物递送至肿瘤组织，如肿瘤新生血管、拟态血管、肿瘤细胞、肿瘤干细胞，显著提高抗肿瘤药效，所述的AG可介导药物或纳米递药系统跨血‑肿瘤屏障，主动靶向肿瘤，对肿瘤靶向效果优势显著。

Description

Y型多功能靶向多肽及其在构建肿瘤靶向递药系统中的应用

技术领域

本发明属药学领域，涉及Y型多功能靶向多肽及其在构建递药系统中的应用，具体涉及具有跨血-肿瘤屏障，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的多功能靶向多肽分子，及其药物复合物和修饰的纳米递药系统。本发明还涉及多功能靶向多肽AG及其修饰的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统。

背景技术

现有技术公开了肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病，死亡率高居所有疾病死亡率首位。传统的化疗作为肿瘤药物治疗的主要手段，存在对肿瘤组织选择性差、毒性大、治疗窗窄、易产生多药耐药等缺陷，因此，为克服传统治疗手段的局限性，近年来，主动靶向成为提高肿瘤组织靶向效率的重要策略。研究公开了主动靶向策略主要针对肿瘤组织中高表达的受体或转运体，利用与特异性受体或转运体具有识别、结合能力的对应配体，将药物或纳米递药系统递送至肿瘤组织或细胞中；配体修饰后的药物或纳米递药系统可通过细胞表面受体或转运体与配体的特异性识别、结合、内化，将药物递送至肿瘤组织和细胞内，从而实现对肿瘤的主动靶向。目前的配体大多数只是针对某一受体或某一细胞的靶向，然而肿瘤组织不只有肿瘤细胞，还有肿瘤干细胞、肿瘤拟态血管、肿瘤新生血管和血-肿瘤屏障(BTB)等，并且，肿瘤靶向递药需要首先跨过BTB之后，才能针对肿瘤干细胞、肿瘤拟态血管、肿瘤新生血管以及普通肿瘤细胞起效，因此，研发能够跨过BTB，且对肿瘤相关细胞均具有靶向功能的配体具有重要意义。

A7R(^LA7R(L型氨基酸序列为ATWLPPR)及其稳定优化多肽^DA7R(D型氨基酸序列^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA)是本申请的发明人前期研究验证的与血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)以及神经纤毛蛋白-1(NRP-1)具有高度结合活性的7肽，其能靶向肿瘤新生血管内皮细胞和跨越BTB、靶向肿瘤细胞，在体内具有良好的寻靶能力。

GICP(^LGICP(L型氨基酸序列为SSQPFWS)的及其稳定优化多肽^DGICP(D型氨基酸序列^DS^DW^DF^DP^DQ^DS^DS))也是前期研究验证的与VAV3受体具有高度结合活性的7肽，其能够靶向靶向肿瘤细胞、肿瘤新生血管内皮细胞以及肿瘤干细胞，但其受体较多分布于肿瘤细胞以及肿瘤干细胞，在肿瘤新生血管中的表达则少于VEGFR2和NRP-1。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种Y型多功能靶向多肽及其在构建递药系统中的应用，尤其是具有跨越血-肿瘤屏障，并靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的多功能靶向多肽分子AG其在构建递药系统中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种Y型多功能靶向多肽及其在构建递药系统中的应用，尤其是具有跨越血-肿瘤屏障，并靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的多功能靶向多肽分子AG及其在构建递药系统中的应用。

本发明将已有靶向多肽分子进行优化，利用融合蛋白原理，将A7R与GICP通过合适的桥联结构(linker)拼接成AG(^LAG：ATWLPPR-linker-SSQPFWS(^LAG1)、SSQPFWS-linker-ATWLPPR(^LAG2)；^DAG：^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA-linker-^DS^DW^DF^DP^DQ^DS^DS(^DAG1)、^DS^DW^DF^DP^DQ^DS^DS-linker-^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA(^DAG2)；^LDAG：ATWLPPR-linker-^DS^DW^DF^DP^DQ^DS^DS(^LDAG1)、^DS^DW^DF^DP^DQ^DS^DS-linker-ATWLPPR(^LDAG2)、^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA-linker-SSQPFWS(^LDAG3)和SSQPFWS-linker-^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA(^LDAG4))，使其成为多受体识别靶向分子，且拥有对肿瘤生长发展全过程靶向功能；同时，构建AG修饰的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的递药系统，以提高药物对肿瘤的靶向诊疗效果。

具体的，本发明利用融合蛋白原理，设计并制备了多肽分子AG，使其同时具有A7R和GICP的靶向能力，发挥跨血-肿瘤屏障，并靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞的肿瘤生长发展全过程靶向作用。

本发明中，A7R和GICP的拼接通过适合的桥联结构共价连接，使用的桥联结构为氨基脂肪酸及其衍生物，如半胱氨酸、氨基己酸等；氨基芳香酸及其衍生物，如对氨基苯甲酸等；或寡肽，如GG、GSSG等。

本发明所设计的AG可进一步在分子中引入活性官能团，构建其修饰的药物复合物、高分子载体材料，引入官能团的位点为AG的氮端、碳端或桥联结构，优选桥联结构，使该分子形成Y形结构，有利于靶向功能的发挥。

本发明所设计的AG引入半胱氨酸后，可利用其分子中巯基与马来酰亚胺功能化影像物质(如Fluorescein、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、磁共振影像剂Gd-DTPA、放射影像剂^99mTc-DTPA等)反应而形成复合物。

本发明所设计的AG修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成pH敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱、长春瑞滨和小白菊内酯衍生物等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成pH敏感硼酸脂(涉及硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及p53激活肽等多肽药物)的AG-药物复合物。

本发明所设计的AG引入半胱氨酸后，可修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)等高分子载体材料上，可用于AG修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统的构建。

本发明所设计的AG修饰的纳米递药系统可包载阿霉素和表阿霉素等蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇和卡巴他赛等紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱和9-硝基喜树碱和伊立替康等喜树碱类药物、长春新碱和长春瑞滨等长春碱类药物、硼替佐米和卡非佐米等蛋白酶体抑制剂、小白菊内酯等内酯类药物、p53激活肽、蜂毒肽和蝎毒肽等多肽毒素、抗菌肽等抗肿瘤药物；也可包载影像物质，如香豆素6、FAM，近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、DiD，磁共振影像剂Gd-DTPA等。

本发明所设计的AG可介导药物或纳米递药系统跨越血-肿瘤屏障(BTB)，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞，用于肿瘤的靶向诊断和治疗。

本发明中，进行了下述实验：

1、AG、AG-Cys及其荧光标记物(AG-Fluorescein)的合成

采用固相合成方法制备AG和AG-Cys；通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了AG-Fluorescein；MS表征了结构。

2、AG-DTPA-Gd与AG-DTPA-^99mTc的合成

通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了AG-DTPA，螯合Gd或^99mTc得AG-DTPA-Gd或AG-DTPA-^99mTc。

3、AG稳定性评价

考察AG在血清中的稳定性；将AG与小鼠血清在37℃进行孵育，在不同时间点检测多肽的浓度评价其稳定性。

4、AG体内外靶向能力评价

考察AG-Fluorescein对脐静脉内皮细胞(HUVEC)和模型肿瘤细胞(如：脑胶质瘤细胞U87)的体外靶向性；考察体外3D肿瘤球模型对AG-Fluorescein的摄取能力。

通过荷U87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉注射荧光标记的AG分子，考察其在各时间点的肿瘤内分布。

5、AG-药物复合物的制备

引入半胱氨酸后的AG与药物的马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含pH敏感腙键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物。

引入半胱氨酸后的AG与药物的3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱、长春瑞滨等含羟基或氨基的药物。

AG通过修饰上多巴胺进而与药物的硼酸基团反应，形成含pH敏感硼酸脂的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物。

AG通过固相合成直接与多肽药物缩合，其中所涉及药物包括p53激活肽等多肽药物。

6、AG修饰的纳米递药系统的构建与表征

首先合成AG修饰的高分子材料AG-PEG-DSPE、AG-PEG-PLA、AG-PEG-PLGA、AG-PEG-PCL等。通过引入半胱氨酸的AG上游离巯基与Mal-PEG-DSPE、Mal-PEG-PLA、Mal-PEG-PLGA、Mal-PEG-PCL等所含马来酰亚胺的反应实现材料的合成，即：将Mal-PEG-DSPE、Mal-PEG-PLA、Mal-PEG-PLGA、Mal-PEG-PCL等分别溶解在乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入含巯基AG的PBS(pH 8.0)反应制备得到AG修饰的高分子材料。

然后制备AG修饰的纳米递药系统。一定量的AG-PEG-DSPE和mPEG-DSPE和磷脂和胆固醇、或AG-PEG-DSPE和mPEG-DSPE、或AG-PEG-PLA和mPEG-PLA、或AG-PEG-PLGA和mPEG-PLGA、或AG-PEG-PCL和mPEG-PCL，以及一定量上述药物，采用成膜水化等方法分别制备相应的AG修饰脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、聚合物纳米粒等纳米递要系统；激光散射粒度仪表征纳米递药系统粒径和粒径分布。

7、AG修饰的纳米递药系统的体内外肿瘤靶向性评价

考察U87细胞、HUVEC细胞和U87肿瘤球体外模型对包载荧光物质的AG修饰纳米递药系统的摄取情况。

通过荷U87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉注射包载荧光物质的AG修饰纳米递药系统，考察其在各时间点的肿瘤内分布。

8、AG修饰的纳米递药系统的体内外抗肿瘤效果评价

以MTT法考察包载肿瘤治疗药物的AG修饰纳米递药系统对U87细胞和HUVEC细胞的体外生长抑制效果；通过荷U87皮下瘤模型裸鼠尾静脉注射包载肿瘤治疗药物的AG修饰纳米递药系统，以肿瘤体积增长曲线、肿瘤组织细胞凋亡、新生血管、拟态血管和干细胞数量为指标评价体内抗肿瘤效果。

本发明提供了AG制备和性质考察以及上述所修饰的药物复合物和纳米递药系统用于肿瘤诊疗的物质基础，本发明的试验结果表明：AG同时具备A7R和GICP的靶向能力，在模型动物体内具有良好的肿瘤组织靶向能力和影像效果，并表现出更优肿瘤靶向能力；AG修饰的纳米递药系统显示出了良好的肿瘤靶向性能和更强的抗肿瘤效果。

附图说明

图1、^LDAG3-Cys的ESI-MS图谱，其中显示ESI-MS：2105.3，与理论分子量相符合。

图2、^LDAG3-Fluorescein的ESI-MS图谱，其中显示ESI-MS：2532.6，与理论分子量相符合。

图3、^LDAG3-Cy7的ESI-MS图谱，其中显示ESI-MS：2796.3，与理论分子量相符合。

图4、^LDAG3的血清稳定性，其中，

图纵坐标为完整多肽的残留百分比，显示^LDAG3多肽在50％大鼠血清中具有较高的稳定性，孵育12h后才降解完全。

图5、^DA7R、GICP与^LDAG3间的竞争性抑制，

其中显示，^LDAG3既可通过^DA7R的受体VEGFR2、NRP-1入胞，也可通过GICP的受体VAV3入胞。

图6、人脑胶质瘤细胞U87及人脐静脉内皮细胞HUVEC对Fluorescein标记多肽的摄取，其中，

图A为Fluorescein标记的^LDAG3、^DA7R、GICP和游离荧光素与U87细胞作用2h后的激光共聚焦照片；图B为Fluorescein标记的^LDAG3、^DA7R、GICP和游离荧光素与HUVEC细胞作用4h后的激光共聚焦照片；图C和图D分别为以上样品与U87细胞和HUVEC细胞作用后流式细胞仪测定的细胞摄取结果，显示U87细胞和HUVEC细胞对^LDAG3的摄取明显高于游离荧光素、GICP和^DA7R。

图7、^LDAG3、GICP、^DA7R多肽与溶酶体的共定位，其中，

图A为三条多肽与U87细胞中溶酶体的共定位，图B为三条多肽与HUVEC细胞中溶酶体的共定位，显示三条多肽在两种种细胞中与溶酶体有良好的共定位。

图8、^LDAG3、GICP与^DA7R多肽在U87肿瘤球模型中的摄取，其中，

图A为FAM与肿瘤球孵育4h后的共聚焦Z轴扫描图；图B为荧光标记的GICP与肿瘤球孵育4h后的共聚焦Z轴扫描图；图C为荧光标记的^DA7R与肿瘤球孵育4h后的共聚焦Z轴扫描图；图D为荧光标记的^LDAG3与肿瘤球孵育4h后的共聚焦Z轴扫描图；图E为以上四组图片的半定量结果，结果表明AG在肿瘤球模型中有很强的渗透能力。

图9、体外肿瘤新生血管模型对^LDAG3、GICP与^DA7R多肽的摄取，其中，

图A为FAM、GICP-Fluorescein、^DA7R-Fluorescein和^LDAG3-Fluorescein与体外构建的肿瘤新生血管模型共孵育1h后，倒置荧光显微镜拍下的结果；图B为各组的半定量结果，表明体外肿瘤新生血管模型对^LDAG3多肽有很好的摄取能力。

图10、^LDAG3、GICP与^DA7R多肽体外跨血-肿瘤屏障能力的考察，其中，

图A为三条多肽跨体外HUVEC/U87共培养构建的BTB模型定量结果；图C、D、E和F分别为FAM、GICP-Fluorescein、^DA7R-Fluorescein和^LDAG3-Fluorescein跨BTB模型后肿瘤球对其的摄取；图B为图C、D、E、F的半定量结果，表明复合^LDAG3多肽具有比单条多肽更强的跨越血－肿瘤屏障能力，且跨屏障之后能够很好的渗透入肿瘤组织。

图11、^LDAG3、GICP与^DA7R多肽体内分布，其中，

图A为荷U87皮下瘤裸鼠尾静脉注射Cy7标记多肽1.5h后的荧光分布图像；图B为给药后各个时间点肿瘤组织荧光半定量结果；图C为给药2h后，动物离体脏器中的荧光定量结果，表明：Cy7标记的^LDAG3、^DA7R和GICP在肿瘤内的蓄积均显著高于游离荧光素Cy7，且肿瘤靶向效果^LDAG3-Cy7>^DA7R-Cy7>GICP-Cy7。

图12、^LDAG3、GICP、^DA7R修饰纳米圆盘包载卡非佐米U87细胞水平药效

其中显示了^LDAG3、GICP、^DA7R修饰纳米圆盘包载卡非佐米(^LDAG3-ND/CFZ、GICP-ND/CFZ、^DA7R-ND/CFZ)与mPEG-ND/CFZ以及游离CFZ对照的MTT实验结果，其中^LDAG3-ND/CFZ的IC₅₀为3.7×10^-9M，GICP-ND/CFZ的IC₅₀为6.5×10^-9M，^DA7R-ND/CFZ的IC₅₀为1.1×10^-8M，mPEG-ND/CFZ的IC₅₀为1.7×10^-8M，游离CFZ的IC₅₀为2.0×10^-9M，表明^LDAG3修饰的纳米圆盘包载CFZ后仍保留其抗肿瘤药效，且较非靶向的纳米圆盘具有更好的效果。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。

实施例1

^LDAG3-Cys、^LDAG3-Fluorescein、^LDAG3-Cy7、^LDAG3-药物、^LDAG3-PEG-DSPE的合成与表征

1)^LDAG3-Cys的合成与表征

采用固相多肽合成法，合成^LDAG3-Cys(序列为^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA-GGGCGGG-SSQPFWS)，具体方法：在PAM树脂上按序列依次接入氨基酸，以HBTU/DIEA为缩合剂、TFA为脱保护剂进行反应。反应完成后，将树脂用含P-cresol的氟化氢进行切割，冰浴搅拌反应1h。反应结束后减压抽去管中氟化氢，冰乙醚沉淀并洗涤沉淀3次，沉淀以20％乙腈重新溶解，收集滤液后旋蒸，得到多肽粗品溶液。多肽粗品用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。ESI-MS表征分子量(Mw)，质谱图如图1所示。

2)^LDAG3-Fluorescein与^LDAG3-Cy7的合成与表征

将上述步骤得到的^LDAG3-Cys溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，取Fluorescein-5-maleimide或Cy7-maleimide溶于DMF，加至^LDAG3-Cys溶液混合，磁力搅拌反应，HPLC监测，待^LDAG3-Cys反应完全后停止反应，制备液相纯化，用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。冷冻干燥得^LDAG3-Fluorescein或^LDAG3-Cy7纯品，质谱图如图2、3所示。

3)制备^LDAG3-DTPA-Gd与^LDAG3-DTPA-^99mTc

将^LDAG3-Cys溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，maleimide-DTPA溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待反应完全后经制备液相，用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。冷冻干燥得^LDAG3-DTPA纯品，螯合Gd或^99mTc即得^LDAG3-DTPA-Gd或^LDAG3-DTPA-^99mTc。

4)制备^LDAG3-药物复合物

以^LDAG3-阿霉素复合物制备作为^LDAG3连接含酮或醛基药物的实施例：9.4mg^LDAG3-Cys多肽溶于磷酸盐3mL缓冲液(0.1mM，pH 7.0)，加入10倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，于4℃搅拌20min，然后加入4倍摩尔量的阿霉素-6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h，反应液用制备液相纯化，冷冻干燥得^LDAG3-阿霉素复合物；

以^LDAG3-紫杉醇复合物作为^LDAG3通过二硫键连接含羟基或氨基药物的实施例。200mg紫杉醇溶于10mL氯仿中，冷却至0-5℃，先后加入40mg DCC及60.4mg 3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜。反应液过滤，经柱层析纯化(CHCl₃/MeOH＝50:1-15:1，V/V洗脱)得紫杉醇-3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物，紫杉醇-3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在5mL DMF中，1.5倍摩尔量的^LDAG3-Cys溶解在PBS/DMF中，溶液pH值保持4～5，将紫杉醇-3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至多肽溶液中，于室温反应6h，经制备液相纯化冻干得^LDAG3-紫杉醇复合物；

以^LDAG3-硼替佐咪复合物作为^LDAG3多肽连接含硼酸基团药物的实施例。依照^LDAG3的合成在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，三氟乙酸脱去氮端的Boc保护。加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与DIEA的DMF溶液，于室温反应30min。洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以HBTU/DIEA为缩合剂，于室温反应1h。树脂用HF切割，并经制备型HPLC纯化得^LDAG3-多巴胺衍生物，在pH7.4的缓冲液中，^LDAG3-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1:1混合即得^LDAG3-硼替佐咪复合物；

以^LDAG3-PMI(一种p53激活肽)作为^LDAG3连接多肽药物的实施例。直接通过固相多肽合成法制得，具体方法为：确定^LDAG3-PMI多肽序列后，按与制备^LDAG3相同的方法依次接入氨基酸，经HF切割并纯化后得^LDAG3-PMI复合物。

5)^LDAG3-高分子材料复合物的合成与表征

通过^LDAG3上游离巯基与Mal-PEG-DSPE所含马来酰亚胺反应作为制备^LDAG3-高分子材料复合物：将16.8mg Mal-PEG-DSPE和10mg含巯基的^LDAG3溶解在3mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入30μL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，反应2h，HPLC检测反应，过量的^LDAG3-Cys通过透析除去，冻干。

实施例2^LDAG3的血清稳定性考察

将^LDAG3、GICP、^DA7R三种多肽分别配成1mg/mL水溶液，取0.1mL加入0.9mL的50％大鼠血清中，37℃孵育，分别于一定时间点取出100μL反应液，加入20μL三氯乙酸(TCA)沉淀血清中蛋白，4℃静置20min，12000rpm离心10min，取上清液20μL进行HPLC分析，血清稳定性结果(如图4所示)表明，^LDAG3比单独L肽GICP稳定性有显著提高。

实施例3^LDAG3、GICP与^DA7R间竞争性抑制实验

利用U87细胞株验证^LDAG3是否通过GICP与^DA7R对应的受体入胞。U87细胞消化后分散在PBS中，分别于三种未标记荧光素的多肽预处理的U87细胞(4℃预先孵育2h，使受体饱和)中加入各荧光素标记的多肽，4℃孵育12h，随后流式细胞仪检测荧光标记多肽入胞情况(如图5所示)。

实施例4^LDAG3的体外细胞靶向性验证

1)^LDAG3对人脑胶质瘤细胞U87的体外靶向性

取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(U87细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的FAM、^LDAG3-Fluorescein、^DA7R-Fluorescein和GICP-Fluorescein溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育2h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片见附图6A。另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图6C所示；

2)^LDAG3对人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外靶向性

取对数生长期的单层培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)，同上试验，细胞内化照片如图6B所示，流式细胞仪分析结果如图6D所示。

实施例5^LDAG3多肽溶酶体共定位

将U87细胞与HUVEC细胞以5000个每孔的密度铺板，24h后待细胞完全贴壁，加入5μM的FAM、^LDAG3-Fluorescein、^DA7R-Fluorescein和GICP-Fluorescein溶液，37℃孵育2h后，用Lysotracker染料标记溶酶体。U87细胞中多肽与溶酶体共定位结果如图7A所示，HUVEC细胞中多肽与溶酶体共定位结果如图7B所示。

实施例6^LDAG3多肽体外靶向性验证

1)^LDAG3多肽肿瘤球摄取考察

U87细胞消化分散后，以4000个细胞每孔的密度铺入预先铺有Agarose胶的48孔板，顺时针摇晃使细胞聚集，37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养7天得到肿瘤球模型。20μM的FAM、^LDAG3-Fluorescein、^DA7R-Fluorescein和GICP-Fluorescein溶液与肿瘤球共孵育4h,之后用PBS洗涤，4％多聚甲醛固定15分钟，将肿瘤球吸出置于激光共聚焦显微镜下Z轴扫描，并用Image J软件进行半定量，定性结果如图8A-D所示，半定量结果如图8E所示；

2)^LDAG3多肽肿瘤新生血管摄取能力考察

HUVEC细胞消化分散后，以3×10⁵个细胞每孔的密度铺入预先铺有Matrigel胶的24孔板，37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养12h后，待肿瘤新生血管模型形成后，加入10μM的FAM、^LDAG3-Fluorescein、^DA7R-Fluorescein和GICP-Fluorescein溶液共孵育1h,随后在荧光倒置显微镜下观察，并用Image J软件进行半定量，定性结果如图9A所示，半定量结果如图9B所示。

3)^LDAG3多肽跨体外血-肿瘤屏障能力考察

将脐静脉内皮细胞HUVEC和U87按照1:5的比例分别铺于transwell的上、下室，培养72h得体外血-肿瘤屏障(BTB)模型，用含10％FBS的DMEM培养液配制荧光浓度为30μM的FAM、^LDAG3-Fluorescein、^DA7R-Fluorescein和GICP-Fluorescein溶液，将transwell上室中的培养液吸出，分别加入上述溶液，分别于30min，1、1.5、2、3和4h取下室培养液测其荧光浓度，各多肽转运结果容图10A所示。

4)^LDAG3多肽体外跨血-肿瘤屏障靶向肿瘤验证

U87细胞构建肿瘤球后，将其转移至BTB模型的transwell下室培养即得BTB/U87肿瘤球共培养模型；

30μM的FAM、^LDAG3-Fluorescein、^DA7R-Fluorescein和GICP-Fluorescein溶液给药4h后，取下室的肿瘤球置于荧光显微镜下观察，并用Image J软件进行半定量。定性结果如图10C-F所示，半定量结果如图10B所示。

实施例7^LDAG3多肽体内靶向性验证

将5×10⁶U87细胞接种至裸鼠腋下，待3周后肿瘤体积达到500mm³开始实验。U87皮下瘤模型鼠分别尾静脉注射100μL的游离Cy7、GICP-Cy7、^DA7R-Cy7以及^LDAG3-Cy7，在注射后30、60、90和120min后麻醉裸鼠，用活体成像仪记录Cy7荧光在裸鼠体内的分布情况并进行荧光半定量计算，随后剖出肿瘤以及各脏器拍照并进行荧光半定量(如图11所示)。

实施例8载卡非佐米纳米圆盘的体外药效学试验

1)载卡非佐米纳米圆盘的制备及表征

称取1.25mg ^LDAG3-PEG-DSPE、6.325mg mPEG-DSPE 2.625mg POPC、1.544mg胆固醇和1mg CFZ(卡非佐米)，溶解在4mL氯仿中，37℃水浴，减压(～0.085MPa)蒸干，成膜，室温真空干燥过夜，加入1mL PBS水化，探头超声45min(50w,超声2s，间隔1s)，0.22μm微孔滤膜过滤除去游离药物，制得包载卡非佐米的^LDAG3修饰的纳米圆盘(^LDAG3-ND/CFZ)；

2)^LDAG3-ND/CFZ体外药效试验

以4.0×10³个/孔将U87细胞接种于96孔板，24h后将培养液吸出，加200μL一系列浓度的^LDAG3-ND/CFZ、^DA7R-ND/CFZ、GICP-ND/CFZ和mPEG-ND/CFZ和游离CFZ，培养72h后，加入MTT溶液继续培养4h，弃去培养液，加入150μLDMSO，振荡至紫色颗粒溶解，用酶标仪在590nm处测定吸光度值。采用MTT法测定细胞存活率，计算细胞生长抑制率和半数致死剂量(如图12)。

Claims (16)

1.Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的Y型多功能靶向多肽为多肽AG，其由桥联结构将A7R与GICP共价连接形成(^LAG：ATWLPPR-linker-SSQPFWS(^LAG1)、SSQPFWS-linker-ATWLPPR(^LAG2)；^DAG：^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA-linker-^DS^DW^DF^DP^DQ^DS^DS(^DAG1)、^DS^DW^DF^DP^DQ^DS^DS-linker-^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA(^DAG2)；^LDAG：ATWLPPR-linker-^DS^DW^DF^DP^DQ^DS^DS(^LDAG1)、^DS^DW^DF^DP^DQ^DS^DS-linker-ATWLPPR(^LDAG2)、^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA-linker-SSQPFWS(^LDAG3)和SSQPFWS-linker-^DR^DP^DP^DL^DW^DT^DA(^LDAG4)),用于药物分子或纳米载药系统的靶向递送。

2.按权利要求1所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的桥联结构是氨基脂肪酸及其衍生物、氨基芳香酸及其衍生物或寡肽。

3.按按权利要求1所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的多肽AG介导药物分子或纳米递药系统的跨越血-肿瘤屏障，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞和肿瘤干细胞，实现药物分子或纳米载药系统对肿瘤的靶向递送。

4.按权利要求1所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的多肽AG在分子中通过引入活性官能团构建其修饰的药物复合物、高分子载体材料，引入官能团的位点为AG的氮端、碳端或桥联结构。

5.按权利要求1所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的多肽AG引入巯基后与含有马来酰亚胺基团的影像物质反应获得AG-X复合物。

6.按权利要求5所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的AG-X复合物中，X是荧光物质Fluorescein，近红外染料Cy7、IR820、DiR，磁共振影像剂Gd-DTPA，放射影像剂^99mTc-DTPA，用于肿瘤的影像诊断和示踪。

7.按权利要求1所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的多肽AG通过pH敏感的腙键、pH敏感的硼酸脂键、二硫键与治疗药物连接，或直接与多肽药物缩合，获得AG-Y复合物。

8.按权利要求7所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的AG-Y复合物中，Y是抗肿瘤药物中的阿霉素和表阿霉素蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇和卡巴他赛紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱和伊立替康喜树碱类药物、长春新碱和长春瑞滨长春花碱类药物、硼替佐米佐米类药物、小白菊内酯衍生物内酯类药物，p53激活肽多肽类药物。

9.按权利要求1所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的多肽AG引入巯基后与马来酰亚胺化的聚乙二醇-Z复合物连接，得到AG-聚乙二醇-Z复合物。

10.按权利要求9所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的AG-聚乙二醇-Z复合物中，Z是磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)或聚己内酯(PCL)。

11.按权利要求10所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的AG-聚乙二醇-磷脂复合物用于脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统或聚合物圆盘递药系统。

12.按权利要求10所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的AG-聚乙二醇-聚乳酸复合物、AG-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物、AG-聚乙二醇-聚己内酯复合物用于制备聚合物胶束递药系统或纳米粒递药系统。

13.按权利要求11或12所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统包载诊断药物。

14.按权利要求13所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的递药系统所包载的诊断药物是荧光物质香豆素6、FAM，近红外染料Cy7、IR820、DiR、DiD或磁共振影像剂Gd-DTPA，用于肿瘤的影像诊断和示踪。

15.按权利要求11或12所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统包载肿瘤治疗药物。

16.按权利要求15所述的Y型多功能靶向多肽，其特征在于，所述的肿瘤治疗药物，是阿霉素和表阿霉素蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇和卡巴他赛紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱和伊立替康喜树碱类药物、长春新碱和长春瑞滨长春花碱类药物、硼替佐米和卡非佐米蛋白酶体抑制剂、小白菊内酯内酯类药物、p53激活肽和蜂毒肽、蝎毒肽或抗菌肽多肽类药物。