CN111004307B - 一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物及其制备方法和应用，该化合物具有式(Ⅰ)所示分子结构：
Figure DDA0002334363880000011
首先合成了带有羧基的近红外荧光分子吲哚菁绿(ICG)的衍生物，然后将Gd‑DTPA连接到ICG上，最后连上靶向环肽iRGD，得到该化合物，iRGD的加入使其针同时靶向血管内皮细胞和肿瘤细胞的能力；并且尺寸极小，效率高；在脑胶质瘤早期的时候就能高效地穿过血脑屏障，靶向肿瘤组织，进行MR/荧光双模态成像，并且ICG片段还能实现光热和光动力疗法。

Description

一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及治疗脑胶质瘤技术领域，更具体地，涉及一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
脑胶质瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是一种非常致命的中枢神经系统疾病，由于血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)的存在阻碍了100％的大分子药物和超过98％的小分子药物从血液进入大脑。当前，手术切除依然是治疗脑胶质瘤的主流手段，但是切除肿瘤不完整以及手术本身所带来的创伤使得手术切除伴随着较高的风险。
此外，核磁共振成像(MRI)一直被视为诊断各种疾病最有效的手段之一，而最常用的MRI造影剂马根维显(Magnevist)早已商业化并且在临床上应用多年，但是由于它不能有效地穿过BBB，它在脑胶质瘤的诊断方面几乎不起作用。
倪文娟等报道了一种具有靶向脑胶质瘤、促BBB渗透的双功能的靶向递药系统构建方法，以树状大分子为载体材料并修饰血脑屏障靶向短肽TGN和肿瘤靶向短肽iRGD构建脑胶质瘤靶向递药系统(iRGD/TGN-PEG-PAMAM/ATO)，使其具有更好抗脑胶质瘤作用(倪文娟，马瑞，陆燕平，陈晓劼，程瀛，李范珠.载三氧化二砷脑胶质瘤靶向纳米递药系统iRGD/TGN-PEG-PAMAM/ATO的构建及体外研究[J].中草药，2019，50(9):2049-2056.)。但是这种靶向递药系统效率不高，并且不能诊疗一体，对脑胶质瘤的治疗效果不佳。
近年来，有研究成功地使纳米尺寸的体系(50～200nm)穿越了血脑屏障，进入了大脑内部。然而，由于纳米尺寸的限制，他们在脑部聚集的数量往往不会超过总量的1％，如此低的效率显然不能满足临床的需求。此外，纳米体系结构的复杂性以及生物安全性依然存疑，这影响了他们的临床应用前景。
因此，如果能够发展一种能够穿过血脑屏障的药物，具有良好的生物相容性，聚集的数量能够满足临床的需求，提高治疗效率，能够对脑胶质瘤成像和早期治疗，即实现诊疗一体化，那么在临床上将具有十分重大的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有穿过血脑屏障的药物效率不高以及不能实现诊疗一体化的缺陷和不足，提供一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物，具有良好的生物相容性，效率高，能够满足临床的需求，并能实现诊疗一体化。
本发明的目的是提供一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物的制备方法。
本发明的目的是提供一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物，具有式(Ⅰ)所示分子结构：
Figure BDA0002334363860000021
本发明所述具有诊疗一体化功能的吲哚菁绿类化合物，尺寸极小，该化合物首先靶向BBB的组分之一(血管内皮细胞)，分子中的iRGD靶向肽能够介导脑血管表面的αvβ3整合素受体的转胞吞作用，然后经过酶的水解作用，iRGD靶向肽暴露出一个RGDK的序列，它能够特异性地靶向在内皮细胞和胶质瘤细胞都高表达的神经纤毛蛋白-1(NRP-1)，从能大大增强分子在肿瘤组织渗透并在肿瘤细胞中聚集的能力，因此这个化合物在脑胶质瘤早期的时候就能高效地穿过血脑屏障(BBB)，靶向肿瘤组织，进行MR/荧光双模态成像。同时，在能够穿透颅骨的近红外光照(808nm)的作用下，分子中的吲哚菁绿片段能够产生热量和ROS活性氧自由基(即进行光热和光动力疗法)，杀死肿瘤细胞。而Gd-DTPA连接到吲哚菁绿上，能够清楚地使肿瘤组织显影，对术前诊断和术中导航都有重要的指导意义。此外，吲哚菁绿(ICG)和DTPA-Gd体内应用时生物安全性和生物相容性较好。
本发明保护上述吲哚菁绿类化合物的制备方法，包括如下步骤：
将二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿(ICG-lys-DTPA)溶于缓冲溶液，加入GdCl3，25～30℃反应24～30h，制得吲哚菁绿衍生物(ICG-lys-DTPA@Gd)；再将制得的吲哚菁绿衍生物溶解于缓冲溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，25～30℃反应2～4h，再加入iRGD环肽，25～30℃反应12～24h，制得吲哚菁绿类化合物(iRGD-ILD)；所述iRGD环肽序列为CRGDKGPDC。
优选地，二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿与GdCl3的摩尔比为1：0.027～0.1。
优选地，吲哚菁绿衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和iRGD环肽的摩尔比为0.0096～0.2：0.021～0.05：0.021～0.05：0.0192～0.05。
优选地，所述吲哚菁绿类化合物的制备方法还包括如下步骤：
反应后，将反应液在水中透析48～72小时，截流分子量为500～1000，得CG-lys-DTPA@Gd；加入iRGD环肽反应后，将反应液在水中透析48～72小时，截流分子量为500～1000，干燥制得吲哚菁绿类化合物(iRGD-ILD)。
其中反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000031
优选地，所述二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿的制备方法包括如下步骤：
所述将L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿与二乙烯三胺五醋酸的活化酯，在25～30℃反应6～10h，制得二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿。
优选地，所述二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿的制备方法还包括如下步骤：
反应后，将反应液在水中透析48～72小时，截流分子量为500～1000，干燥制得二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿(ICG-lys-DTPA)；
其中反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000041
优选地，二乙烯三胺五醋酸的活化酯与L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿的摩尔比为0.11～0.2：0.049～0.01。
优选地，所述L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿的制备方法包括如下步骤：
将吲哚菁绿活性酯和N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸溶于溶剂，在无氧环境中，在25～30℃反应5～10h，制得N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿；将上述制得的N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿溶于溶剂，加入哌啶，25～30℃反应25～30min，制得L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿。
优选地，吲哚菁绿活性酯和N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸的摩尔比为0.35～0.5：0.74～1。
优选地，L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿的制备方法还包括：
反应后，在反应液中加入冷丙酮进行沉淀，过滤得沉淀，并用冷丙酮洗涤，干燥得N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿(ICG-lys-FMOC)；将ICG-lys-FMOC溶于无水二甲基亚砜，加入哌啶，使哌啶的浓度在整个溶液中保持在体积分数20％左右，25～30℃反应20～30min，将反应液在甲醇中透析2～4h，每隔1h更换一次甲醇透析液，加入乙醚进行沉淀，过滤得沉淀，干燥得L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿(ICG-lys)；
其中反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000051
优选地，所述二乙烯三胺五醋酸的活化酯的制备方法包括如下步骤：
二乙烯三胺五醋酸酐的活化酯在碱性溶液中发生水解反应制得二乙烯三胺五醋酸的活化酯(DTPA-NHS)。
优选地，所述碱性溶液为碳酸氢钠溶液。
优选地，所述吲哚菁绿活性酯的制备方法包括如下步骤：
将羧基化吲哚菁绿、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于溶剂，在无氧环境中，25～30℃反应24～30h，制得吲哚菁绿活性酯。
优选地，所述羧基化吲哚菁绿、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为0.39～0.5：1.0～1.2：1.0～1.2。
优选地，吲哚菁绿活性酯的制备方法还包括：
反应后，在反应液中加入冷丙酮进行沉淀，过滤得沉淀，再用冷丙酮洗涤沉淀，干燥得吲哚菁绿活性酯(ICG-NHS)。
其中反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000061
优选地，所述羧基化吲哚菁绿的制备方法包括如下步骤：
将4-肼基苯甲酸、甲基异丙基酮、醋酸钠溶于酸溶液中，溶液pH值为5.0～6.0，120～130℃反应12～24h，加入甲醇后产生沉淀；取上述沉淀和1,4-丁烷磺酸内酯溶于溶剂中，180～190℃反应12～24h，过滤得沉淀；取上述沉淀和戊二烯醛缩二苯胺溶于溶剂中，溶液pH值为5.0～6.0，再加入醋酸钠，120～130℃反应45～60min，制得羧基化吲哚菁绿。
更优选地，所述羧基化吲哚菁绿的制备方法包括如下步骤：
将摩尔比为30～35:35～42:50～60的4-肼基苯甲酸、甲基异丙基酮、醋酸钠溶于冰醋酸中，溶液pH值为5.0～6.0，120～130℃反应12～24h，加入甲醇产生沉淀，过滤得到沉淀；取摩尔比为9.84～12：57～62的沉淀和1,4-丁烷磺酸内酯溶于溶剂中，180～190℃反应12～24h，过滤得沉淀；取摩尔比为5.8～7:2.8～4的沉淀和戊二烯醛缩二苯胺溶于溶剂中，溶液pH值为5.0～6.0，再加入醋酸钠，120～130℃反应45～60min，制得羧基化吲哚菁绿。
进一步优选地，所述羧基化吲哚菁绿的具体操作为：
将摩尔比为30～35:35～42:50～60的4-肼基苯甲酸、甲基异丙基酮、醋酸钠溶于冰醋酸中，溶液pH值为5.0～6.0，120～130℃反应12～24h，真空除去乙酸后加入体积分数10％甲醇沉淀，过滤并干燥得沉淀；取摩尔比为9.84～12：57.36～62的上述沉淀和1,4-丁烷磺酸内酯溶于1,2-二氯苯中，180～190℃反应12～24h，过滤，用丙酮洗涤，得沉淀；取摩尔比为5.8～7:2.8～4的上述沉淀和戊二烯醛缩二苯胺溶于体积比为1.2～1.6：0.8～1的乙酸酐和冰醋酸中，pH值为5.0～6.0，再加入醋酸酐，120～130℃反应45～60min，冷却至25～30℃，真空抽滤，用冷丙醇洗涤，冷冻干燥制得羧基化吲哚菁绿(ICG-COOH)。
其中反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000071
优选地，所述二乙烯三胺五醋酸酐的活化酯的制备方法包括如下步骤：
将二乙烯三胺五醋酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于溶剂，在无氧环境中，25～30℃反应24～30h，制得二乙烯三胺五醋酸酐的活化酯。
更优选地，所述二乙烯三胺五醋酸酐的活化酯的具体操作为：
将二乙烯三胺五醋酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于无水DMSO中，在氮气环境中，25～30℃反应24～30h后，沉淀在冷丙酮中，过滤得沉淀，用冷丙酮洗涤，干燥制得二乙烯三胺五醋酸酐的活化酯(DTPAA-NHS)。
优选地，所述二乙烯三胺五醋酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2.8～4：4.18～6：4.18～6。
优选地，所述溶剂为无水二甲基亚砜(DMSO)。
优选地，所述缓冲溶液为pH值为7.0～7.4磷酸盐缓冲溶液(PBS 7.0～7.4)。
本发明还保护上述吲哚菁绿类化合物在制备用于诊断和/或治疗脑胶质瘤的药物中的应用。
进一步地，所述吲哚菁绿类化合物在制备用于光热治疗和/或光动力治疗药物中的应用。
所述的吲哚菁绿类化合物可以作为一种能早期治疗脑胶质瘤的分子探针。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首先合成了带有羧基的近红外荧光分子吲哚菁绿的衍生物(ICG-COOH)，然后将Gd-DTPA连接到ICG上，最后连上靶向环肽iRGD，得到吲哚菁绿类化合物。靶向肽iRGD的加入赋予了该化合物靶向血管内皮细胞和肿瘤细胞的能力，并且同时作为肿瘤归巢肽，具有穿膜特性，能使药物更加有效地进入肿瘤细胞内部而发挥治疗作用。所制得的iRGD-ILD，尺寸极小，效率高，满足临床药物在脑部聚集数量的要求，而且iRGD靶向肽能够介导脑血管表面的αvβ3整合素受体的转胞吞作用，因而这个分子在脑胶质瘤早期就能高效地穿过血脑屏障，靶向肿瘤组织，进行MR/荧光双模态成像。同时，在能够穿透颅骨的近红外光照(808nm)的作用下，iRGD-ILD中的ICG片段能够产生热量和ROS活性氧自由基(即进行光热和光动力疗法)，杀死肿瘤细胞，实现诊疗一体化。并且ICG和DTPA–Gd具有良好的生物相容性。
附图说明
图1为本发明实施例1ICG-lys-DTPA的1HNMR谱图。
图2为本发明实施例1ICG-lys-DTPA的ESI质谱。
图3为本发明实施例1穿过bEnd3细胞层的靶向探针iRGD-ILD或者非靶探针ILD与C6细胞孵育4小时后的荧光图片。
图4为本发明实施例1在实时共聚焦显微镜下连续拍摄的非靶探针ILD穿越健康小鼠血脑屏障的图片。
图5为图4中4个矩形区域内的平均荧光强度的变化情况。
图6为本发明实施例1在实时共聚焦显微镜下连续拍摄的靶向探针iRGD-IL穿越健康小鼠血脑屏障的图片。
图7为本发明实施例1图6中4个矩形区域内的平均荧光强度的变化情况。
图8为本发明实施例1小鼠颅内种植肿瘤5天后尾静脉注射iRGD-ILD和非靶探针ILD所得到的荧光图像。
图9为本发明实施例1制得的小鼠注射探针3小时后活体解剖得到的脑组织的荧光成像。
图10为本发明实施例1在共聚焦显微镜下观察到的脑组织切片到的荧光图像。
图11为本发明实施例1小鼠颅内种植肿瘤5天后尾静脉注射iRGD-ILD和ILD探针所得到的脑部的冠状面(上)和横断面(下)的T1加权的MR成像。
图12为本发明实施例1裸鼠颅内种植肿瘤4、5、6、7、8、10、12天后尾静脉注射iRGD-ILD探针所得到的肿瘤细胞生物发光成像和探针的荧光成像图。
图13为本发明实施例1图12中的裸鼠处死后其主要器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)的荧光成像图。
图14为本发明实施例1图13中各个器官荧光分布的定量分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
本发明提供了一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物及其制备方法和应用，以下实施例具体举例说明。
实施例1
一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物，命名为iRGD-ILD，具有式(Ⅰ)所示分子结构：
Figure BDA0002334363860000091
上述吲哚菁绿类化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1.羧基化吲哚菁绿(ICG-COOH)的制备：
将摩尔比为30:42:60的4-肼基苯甲酸、甲基异丙基酮、醋酸钠在50mL冰醋酸中搅拌1小时，然后加热回流12h。真空除去乙酸后，在残渣中80mL 10％甲醇，过滤并干燥得到褐色固体产物(27.12mmol,产率90％)；
将摩尔比为9.84：57.36的上述产物和1,4-丁烷磺酸内酯在40mL 1,2-二氯苯中加热回流12h，形成红色沉淀，过滤，用丙酮洗涤，干燥得到红色固体(9.37mmol,产率95％)；
将摩尔比为5.8：2.8的上述产物和戊二烯醛缩二苯胺加入到30mL乙酸酐和18mL冰醋酸混合溶剂中，在剧烈搅拌下加入0.83g醋酸钠(10mmol)，加热回流45min后冷却至25℃，混合物沉淀在无水乙醚中，抽滤，用乙醚洗涤。在水：丙醇＝1：4的混合溶剂中重结晶，真空抽滤，用冷丙醇洗涤，干燥得到绿色固体，为羧基化吲哚菁绿(2.47mmol,产率88％)。
Figure BDA0002334363860000101
DTPAA-NHS的制备：
将摩尔比为2.8:4.18:4.18的二乙烯三胺五醋酸酐、NHS和EDC·HCl在氮气的保护下溶解在10mL的无水DMSO中，在室温条件下搅拌反应30小时后沉淀在过量的冷丙酮中，过滤得到固体，用冷丙酮洗涤三遍，真空干燥得到DTPAA-NHS(1.40mmol,产率50％)；
将制得的DTPAA-NHS溶解在0.1mol/L的NaHCO3溶液，斡旋2小时，使二乙烯三胺五醋酸酐上的两个酸酐充分水解变成羧酸，制得DTPA-NHS。
S2.将步骤S1制得的羧基化吲哚菁绿、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于10mL无水DMSO，在氮气中，25℃搅拌反应30h后，沉淀在过量的冷丙酮中，过滤得到固体，用冷丙酮洗涤三遍，真空干燥制得ICG-NHS；羧基化吲哚菁绿、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为0.39:1.2：1.2；
其反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000102
S3.将步骤S2制得的吲哚菁绿活性酯和N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸溶于无水DMSO，在氮气中，在25℃反应5h后，将反应液沉淀在冷丙酮中，过滤得到固体并用冷丙酮洗涤三次，真空干燥制得ICG-lys-FMOC；吲哚菁绿活性酯和N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸的摩尔比为0.35：0.74；
其反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000111
S4.步骤S3制得的N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿溶于无水DMSO，加入2mL哌啶，使哌啶的浓度在整个溶液中保持在20％，25℃反应30min，溶液用1000分子截流量的透析袋在甲醇中透析2小时(每隔一小时换一次甲醇透析液)。将溶液沉淀在乙醚中，过滤并洗涤，真空干燥制得ICG-lys；
其反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000112
S5.ICG-lys与步骤S1制得的DTPA-NHS，在25℃反应6h，用500分子截流量的透析袋在纯水中透析72小时，然后冷冻干燥制得ICG-lys-DTPA；DTPA-NHS与ICG-lys的摩尔比为0.11：0.049；
其反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000121
S6.将步骤S5制得的二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿溶于10mL PBS溶液(pH值为7.4)，加入GdCl3，25℃反应24h后，用500分子截留量的透析袋在纯水中透析72小时，冷冻干燥制得ICG-lys-DTPA@Gd，简称为ILD，作为非靶探针；二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿与GdCl3的摩尔比为1：5～10；
其反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000122
S7.将步骤S6制得的ILD溶解于PBS溶液(pH值为7.4)，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，25℃反应2h，再加入iRGD环肽，25℃反应12h后，溶液用500分子截留量的透析袋在纯水中透析72小时后，冷冻干燥制得iRGD-ILD，作为分子探针；ICG-lys-DTPA@Gd、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和iRGD环肽的摩尔比为0.0096：0.021：0.021：0.0192；所述iRGD环肽序列为CRGDKGPDC；其中iRGD由武汉昊德生物科技有限公司提供，纯度95％。
其反应方程式为：
Figure BDA0002334363860000131
结构分析与性能测试
1、(1)1H NMR分析
步骤S5制得的产物的1H NMR如图1所示，核磁图解析如下1H NMR(400MHz,MeOD,298K.):δ(ppm)＝1.38ppm(-NH-CH2CH2CH2CH2-of lys,q),1.42-1.86ppm(-C(CH3)2-,a；-CH2CH2CH2CH2SO3 -,b),1.88-2.10ppm(-NH-CH2CH2CH2CH2-of lys,p,r),2.90ppm(-CH2CH2CH2CH2SO3 -,c),3.16ppm(-NH-CH2CH2CH2CH2-of lys,n),3.26ppm(-N-(CH2CH2-N-(CH2COOH)2)2,x),3.39ppm(-N-(CH2CH2-N-(CH2COOH)2)2,v),3.70ppm(-N-(CH2CH2-N-(CH2COOH)2)2,w),3.94ppm(-CH2-N-(CH2CH2-N-(CH2COOH)2)2,u),4.16ppm(-CH2CH2CH2CH2SO3 -,d),6.43ppm(-C＝CH-CH＝CH-CH＝CH-CH＝CH-C-,e),6.68ppm(-C＝CH-CH＝CH-CH＝CH-CH＝CH-C-,f),7.38ppm(-CH-of benzyl group,g),7.44-8.18ppm(-C＝CH-CH＝CH-CH＝CH-CH＝CH-C-,h；-C＝CH-CH＝CH-CH＝CH-CH＝CH-C-,i；-CH-of benzylgroup,k；-CO-NH-(CH2)4-,m；-NH-DTPA,t)。
由核磁分析结果可知，所得产物为ICG-lys-DTPA。
(2)ESI质谱
步骤S5制得的产物的ESI质谱如图2所示，{[M–Na+H]-/2}–1＝873，与最高峰结果吻合。
核磁和质谱的结果共同证明了iRGD-ILD的成功合成。
根据DTPA络合钆离子的原理，每个DTPA分子上剩下的四个羧基会与钆剂络合。然后检测探针的钆元素含量，得到的结果显示钆元素的络合率高达89.2％。因此，实施例1成功合成了具有式(Ⅰ)所示分子结构的iRGD-ILD化合物。
2、体外模拟探针穿越BBB
(1)实验方法
首先建立体外模拟BBB的模型：bEnd3内皮细胞以每孔5×104个细胞的密度种到孔径为0.4μm的聚碳酸酯的24孔板上。每天按时更换培养介质并使用伏特计监测内皮细胞电阻。当电阻值达到稳定值时，可认为此时的体外BBB模型已经建成。
将探针加入到模拟BBB模型中，等探针穿越模拟的BBB后，与C6细胞共孵育4个小时，用倒置荧光显微镜观察细胞荧光分布情况。
(2)结果分析
由图3可见，有更多的靶向探针iRGD-ILD穿过了BBB模型并被C6细胞所摄取，显示出的荧光强度比非靶探针ILD强很多。其中DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。
3、体内实时共聚焦观察探针跨越BBB的情况
(1)实验方法
用实时的倒置荧光显微镜观察靶向和非靶探针穿越健康小鼠BBB的能力。为了满足仪器对荧光分子的波长的要求，我们首先合成了跟ICG具有相同分子结构却比ICG只少一个共轭单元的分子来代替ICG进行上述实验，新的探针的合成方法与上述ICG的完全相同。
(2)结果分析
由图4和5可见，在30分钟的检测时间里在小鼠脑部的血管外部几乎检测不到荧光的存在，这说明非靶探针无法有效地穿过血脑屏障，这是因为前面已经叙述过血脑屏障能够阻止98％的小分子药物进入脑部。不过靶向探针却能够有效地穿过血脑屏障。由图6可见，靶向探针的荧光在10分钟的时候即可在血管外围观察到，到了20分钟的时候穿越血脑屏障进入脑组织的靶向探针越来越多，以至于血管的轮廓都变得模糊不清。对血管外部的4个区域的荧光强度进行监测，如图7所示，最开始时荧光强度几乎为0，到了10分钟的时候开始迅速上升并最终维持着一个较高的水平。
4、体内荧光和MR成像
(1)实验方法
在颅内肿瘤种植4天、5天、6天、7天、8天、10天和12天的时候，尾静脉注射iRGD-ILD探针溶液(500μg/kg ICG)及伊文思蓝溶液(1.5mg/只)。1小时后，老鼠腹腔注射荧光素酶底物(1.5mg/只)。5分钟后，用小动物活体荧光成像仪拍摄荧光图片。然后将老鼠杀死，取其主要器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)进行荧光拍摄。
当颅内肿瘤种植5天的时候，同样用上述仪器检测靶向探针(iRGD-ILD)和非靶探针(ILD)在老鼠体内的分布情况。在实验结束后，取其脑部组织做成切片置于倒置荧光显微镜下观察。
此外，由于探针连接了钆剂，其在老鼠体内的分布情况也可通过MR成像进行验证。在种植肿瘤5天的老鼠尾静脉注射探针后，腹腔注射10％水合氯醛溶液(5mL/kg体重)进行麻醉。然后在不同的时间点将其置于3.0T的MR机器上进行扫描，所用的参数如下：TR＝400ms；TE＝11ms；FOV,60mm×60mm；matrix,248mm×246mm；voxel,0.24mm×0.24mm；slicethickness,1mm；flip angle,90°；NSA,2.
(2)结果分析
图8的体内荧光成像显示，尾静脉注射探针后，相对于非靶探针ILD，靶向探针iRGD-ILD更明显地集中在脑部区域。在3小时后，肿瘤区域能更清楚地看到靶向探针的ICG荧光，而非靶探针则完全看不到。体外的脑组织的荧光成像显示出相同的实验结果(图9)。图10展示的组织切片可以看到，非靶探针注射的老鼠的脑部切片只能检测到非常微弱的荧光，而靶向探针则能在肿瘤区域看到很强的荧光，在肿瘤区域和非肿瘤区域形成了非常明显的界限。这些结果表明靶向探针iRGD-ILD不但能穿过血脑屏障，还能有效地靶向肿瘤区域。
此外，图11的体内MR成像显示，无论是冠状面还是横断面，肿瘤处检测到的靶向探针的MR信号都要明显强于非靶探针的MR信号。用Image J进行定量分析得出，注射探针1h后，靶向探针是的脑部肿瘤区域的MR信号增强了80.6％，而非靶探针则只有3.2％。同时，这赋予了探针临床成像的功能，可以通过临床适用的MRI来监测探针的体内递送过程，以优化治疗方案。
5、裸鼠颅内种植肿瘤不同的天数后其体内肿瘤细胞的生物发光成像和荧光成像研究
(1)实验方法
通过接种C6-Luc细胞，可以通过体内荧光和生物荧光成像方便地监测颅内肿瘤生长和探针的分布情况。首先将老鼠用10％水合氯醛溶液(5mL/kg体重)麻醉后，将其头部固定。然后，将5μL包含5.0×105C6-Luc细胞的溶液以每分钟0.5μL的速度注射到老鼠的右脑实质中(深度3.5mm)，然后用消毒针缝合其伤口，在SPF级的环境中饲养。
(2)结果分析
如图12所示，C6-Luc胶质瘤细胞移植后第4天检测到微弱的生物发光信号，而后随着时间的推移逐渐增强。如图13所示，当肿瘤还比较小的时候，探针的荧光在脑实质中基本上是平均分布的。然而，随着时间的延长，探针逐渐向肿瘤组织处聚集。到了移植肿瘤第七天的时候，已经可以从荧光图像上看到比较明显的轮廓。移植肿瘤第十天后肿瘤细胞进入一个疯狂生长的阶段，到了第12天几乎占据了整个大脑。这些结果说明iRGD-ILD作为分子探针，能够高效率地穿过血脑屏障，并在肿瘤部位聚集，进而实现对原位脑胶质瘤的早期诊断和治疗。
此外，图13中的主要器官的荧光强度也被定量计算出来，各个器官所占的百分比如图14所示。可以看到在种植肿瘤4～6天的时候，就有6％～8％的荧光分布在裸鼠大脑，比那些聚集效率不及1％的纳米体系要高很多，完全能够满足临床数量的要求。由图统计的数据也可以看出，随着时间的延长脑中探针的含量逐渐增加，到第12天时探针含量可以达到20％左右。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种治疗早期脑胶质瘤的吲哚菁绿类化合物，其特征在于，具有式(Ⅰ)所示分子结构：
Figure FDA0002334363850000011
2.权利要求1所述的吲哚菁绿类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿溶于缓冲溶液，加入GdCl3，25～30℃反应24～30h，制得吲哚菁绿衍生物；再将制得的吲哚菁绿衍生物溶解于缓冲溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，25～30℃反应2～4h，再加入iRGD环肽，25～30℃反应12～24h，制得吲哚菁绿类化合物；所述iRGD环肽序列为CRGDKGPDC。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿的制备方法包括如下步骤：
将L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿与二乙烯三胺五醋酸的活化酯，在25～30℃反应6～10h，制得二乙烯三胺五醋酸接枝的吲哚菁绿。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿的制备方法包括如下步骤：
将吲哚菁绿活性酯和N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸溶于溶剂，在无氧环境中，在25～30℃反应5～10h，制得N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿；将所述制得的N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿溶于溶剂，加入哌啶，25～30℃反应25～30min，制得L-赖氨酸接枝的吲哚菁绿。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述二乙烯三胺五醋酸的活化酯的制备方法包括如下步骤：
二乙烯三胺五醋酸酐的活化酯在碱性溶液中发生水解反应制得二乙烯三胺五醋酸的活化酯。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述吲哚菁绿活性酯的制备方法包括如下步骤：
将羧基化吲哚菁绿、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于溶剂，在无氧环境中，25～30℃反应24～30h，制得吲哚菁绿活性酯。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述羧基化吲哚菁绿的制备方法包括如下步骤：
将4-肼基苯甲酸、甲基异丙基酮、醋酸钠溶于酸溶液中，溶液pH值为5.0～6.0，120～130℃反应12～24h，加入甲醇后产生沉淀；取上述沉淀和1,4-丁烷磺酸内酯溶于溶剂中，180～190℃反应12～24h，过滤得沉淀；取上述沉淀和戊二烯醛缩二苯胺溶于溶剂中，溶液pH值为5.0～6.0，再加入醋酸钠，120～130℃反应45～60min，制得羧基化吲哚菁绿。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述二乙烯三胺五醋酸酐的活化酯的制备方法包括如下步骤：
将二乙烯三胺五醋酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于溶剂，在无氧环境中，25～30℃反应24～30h，制得二乙烯三胺五醋酸酐的活化酯。
9.权利要求1所述吲哚菁绿类化合物在制备用于诊断和/或治疗脑胶质瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述吲哚菁绿类化合物在制备用于光热治疗和/或光动力治疗药物中的应用。
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