CN104311641B

CN104311641B - 一种抗术后疤痕的可降解多支化糖肽水凝胶及其制备方法

Info

Publication number: CN104311641B
Application number: CN201410365194.5A
Authority: CN
Inventors: 张先正; 陈巍海; 曾旋; 冯俊
Original assignee: WUHAN BAIERMO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2034-07-29
Also published as: CN104311641A

Abstract

本发明涉及一种抗术后疤痕的可降解多支化糖肽水凝胶及其制备方法。它是由修饰了疏水胆固醇的多支化糖肽在生理条件下通过疏水、π‑π堆叠和氢键等作用力自组装形成的水凝胶。由于该多支化糖肽结构中含有的氨基葡萄糖单元能够有效抑制由成纤维细胞增殖导致的组织纤维化，防止术后疤痕的形成，因此本发明可用作抗术后疤痕的凝胶态制剂。引入疏水胆固醇不仅可以提高凝胶的生物相容性，降低其毒副作用和炎症风险，而且可以提高水凝胶的自组装能力以及稳定性。本发明具有生物安全性高，操作简便等优点。

Description

一种抗术后疤痕的可降解多支化糖肽水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗术后疤痕的可降解多支化糖肽水凝胶及其制备方法，属于生物医药领域。

技术背景

青光眼是全球范围内的主要致盲眼病，约占眼科疾病的14.36%。在我国，随着计算机技术的普及与应用，以及新媒体模式的流行，人们用眼压力随着阅读、工作和娱乐方式的改变不断增大，青光眼发病率呈爆发式增长，已成为我国第二大眼病。近几年，随着人们对青光眼发病机制的进一步了解，激光滤过手术更受青光眼患者的青睐，目前市场占有率近70%。但滤过手术后创口极易疤痕化从而导致滤过道闭合，手术失败，青光眼复发。为了抑制青光眼滤过手术后疤痕组织的形成（结膜下组织纤维化），临床上常采用多次注射抗增生药物的方法，如5-氟尿嘧啶和丝裂霉素水剂等。此类药物会引起严重的毒副作用，如低眼压性黄斑病变、滤过泡渗漏、滤过泡感染、眼内炎等，使患者痛苦不堪。此外，目前市场上可用的青光眼眼阀都依赖进口（如硅管），我国大部分青光眼患者常因无法承担昂贵的费用退而选择治疗效果差副作用大的廉价国产药物，但其复发率很高，患者必须长期用药，更可怕的后果在于直接导致患者视神经受损和视力严重下降。因此，针对青光眼的高发生率，为了应对目前治疗的困境，研究开发更高效、更安全的抑制滤过道疤痕化的制剂或青光眼滤过手术辅助器械势在必行。

研究表明，核心蛋白多糖（Decorin）是一种小分子的硫酸软骨素类蛋白多糖, 包含一个核心蛋白和一条氨基葡萄糖多聚糖链。它能降低转化生长因子TGF-β的活性，阻断TGF-β与其受体之间的相互作用，从而起到抑制成纤维细胞增生，防止组织纤维化的作用。但Decorin用于临床上抑制青光眼术后瘢痕有以下缺点：蛋白多糖人工合成非常困难、价格昂贵，使用的水剂注射法需要反复注射增加病人痛苦等。从Decorin的组成结构受到启发，科学研究证实氨基葡萄糖同样具有抑制纤维化的作用。因此，研究设计具有良好的生物相容性、在体内可持续高效释放氨基葡萄糖的制剂或手术辅助器械是生物医学领域的热点。

在过去几十年里，由于具有良好的生物相容性、生物活性以及种类多样性，多肽及其衍生物广泛吸引着研究者的兴趣。目前多肽产品已广泛用于医药、保健品、化妆品、生物材料等众多领域。其中，在医药领域已开发的多肽药物分为治疗药物、诊断药物和预防药物。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，是介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。研究人员发现，利用分子间氢键作用、疏水性作用和π-π堆积作用等，多肽及其衍生物可以在水溶液自组装形成具有纳米纤维微观结构的超分子水凝胶。由于在制备过程无需加入化学交联剂，高含水量的多肽凝胶可以被直接注射到靶向位点，因此广泛应用于生物医用等领域。

在多肽分子结构中引入生命体内大量含有的疏水功能团胆固醇和氨基葡萄糖，得到与核心蛋白多糖结构类似的多支化糖肽。该糖肽在生理条件下通过自组装形成水凝胶，该凝胶不仅生物相容性好，安全性高，而且在生理环境下可以通过降解的方式持续释放氨基葡萄糖，起到抑制成纤维细胞生长的作用，有望用于抑制青光眼滤过手术后的疤痕化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种生物相容性好、安全无毒的多支化糖肽水凝胶的制备方法。

制备方法如下：

（1）利用固相合成方法制备含有胆固醇作为疏水端的三肽或四肽，三肽的氨基酸序列为天冬氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸、苯丙氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸或苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，四肽的氨基酸序列为苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸；

（2）通过使用不同的切落剂将合成的三肽或四肽从固相切落，得到含有一个、两个或三个羧基的三肽或四肽；

（3）纯化的三肽或四肽与氨基葡萄糖进行缩合反应得到多支化糖肽；

（4）通过高效液相色谱法分离纯化所制得的多支化多肽；

（5）将多支化糖肽分散在磷酸盐缓冲溶液中，通过加热溶解-冷却法制备得到多支化糖肽水凝胶。

上述方案中，所用多肽全部通过固相有机合成技术制备，固相合成技术所采用的树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂、Rink Amide树脂或MBHA树脂中的一种，肽链的延长为碳端到氮端。

上述方案中，步骤（2）中得到含有一个、两个或三个羧基的三肽或四肽，具体如下：所用切落剂是体积比为1：2：7的醋酸、三氟乙醇和二氯甲烷时，天冬氨酸的侧基保护基OtBu不会被切除，切下的肽链只含有碳端一个羧基；当所用切落剂是体积比为5：5的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液时，天冬氨酸的侧基保护基OtBu被切除，切下的肽链中的羧基包括碳端的羧基和侧链的羧基，肽链含有一个天冬氨酸就有两个羧基，肽链含有两个天冬氨酸就有三个羧基。

上述方案中，合成多支化糖肽的缩合剂是N,N-二环己基碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种。

上述方案中，高效液相色谱法分离纯化多支化多肽的条件是：HPLC分离柱为C₁₈柱，用含0.1% （v/v）NH₄OH的乙腈和含0.1% （v/v）NH₄OH的去离子水做梯度淋洗，紫外检测波长为254 nm。

上述方案中，磷酸缓冲溶液的浓度为10 mM，pH为7.4。

上述方案中，通过加热溶解-冷却法制备糖肽水凝胶时，可以先把多支化糖肽加热到60-80℃使糖肽完全溶解，随后静置冷却到室温形成水凝胶。

本发明所制备的多支化糖肽水凝胶在组织蛋白酶的作用下能够缓慢降解，降解的产物安全无毒，且降解的过程中可以缓慢释放氨基葡萄糖用于抑制组织纤维化。本发明所制备的糖肽水凝胶制剂由胆固醇、氨基葡萄糖和多肽构成，生物相容性好，安全无毒。支化糖肽中有效成份氨基葡萄糖的含量高，可以减少水凝胶制剂用量，降低生产和使用成本。糖肽凝胶的缓慢降解有利于在体内持续释放氨基葡萄糖，使凝胶制剂长期有效。

附图说明

图1. 糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine（胆固醇-苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-氨基葡萄糖）的化学结构式。

图2. HPLC表征糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine的纯度。

图3. 糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine自组装形成水凝胶照片。

图4. 不同浓度的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine水凝胶在HeLa和3T3细胞培养48小时的细胞毒性。

图5. 糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine降解前的ESI-MS图。

图6. 糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine降解168小时后的ESI-MS图。

图7. 支化糖肽Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-glucosamine的化学结构式。

图8. 多支化糖肽Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-Asp(glucosamine)-glucosamine（胆固醇-苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸(氨基葡萄糖)-天冬氨酸(氨基葡萄糖)-氨基葡萄糖）的化学结构式。

图9. α-SMA(α-肌动蛋白)免疫组织化学研究在滤过泡周围组织上成纤维细胞的增殖表达程度。

具体实施方式

实施例1

（1）含有良好生物相容性的疏水功能团胆固醇（cholesterol，Chol）修饰的三肽Chol-Phe-Phe-Asp(OtBu)-OH的制备

采用2-氯-三苯甲基氯树脂（树脂的有效氯取代度为1.08mmol/g）为固相载体，使用多肽固相自动合成仪制备胆固醇键接的短肽Chol-Phe-Phe-Asp(OtBu)-OH。肽链在树脂上由碳端向氮端延长。具体的制备步骤如下：称取2.0g 2-氯-三苯甲基氯树脂（共有有效氯的量为2.0g × 1.08mmol/g= 2.16mmol，然后用15mL DMF浸泡树脂1小时。抽去DMF，加入溶有FMOC-Asp(OtBu)-OH(2 × 2.16mmol)和二异丙基乙胺（DIEA, 6 × 2.16mmol）的15 mLDMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，用15 mL DMF洗涤树脂三次，然后加入15 mL 20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。抽去反应液，用15mL DMF洗涤树脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 × 2.16mmol)、DIEA（6 ×2.16mmol）、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU， 2.4 × 2.16mmol）和1-羟基苯并三氮唑（HOBt，2.4 × 2.16mmol）的15 mL DMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，之后用DMF洗涤树脂3次。取少量树脂做茚三酮显色测试（颜色应为无色或浅黄色），若变色则重复此步反应至显色测试为无色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。之后用15 mL DMF洗涤树脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 × 2.16mmol)、DIEA（6 × 2.16mmol）、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU， 2.4 × 2.16mmol）和1-羟基苯并三氮唑（HOBt，2.4 × 2.16mmol）的15 mL DMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，之后用DMF洗涤树脂3次。取少量树脂做茚三酮显色测试（颜色应为无色或浅黄色），若变色则重复此步反应至显色测试为无色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。之后用15mL DMF洗涤树脂三次后加入溶有Cholesteryl chloroformate (2× 2.16mmol)和DIEA（6 × 2.16mmol）的15 mL THF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应过夜。整个肽链合成结束后，分别用15mL THF、15mL DMF、15mL CH₃OH和15mL CH₂Cl₂各洗涤树脂3次，真空干燥树脂过夜。加入20mL切落剂（体积比1：2：7的醋酸、三氟乙醇和CH₂Cl₂将多肽从树脂上切落，收集滤液并浓缩。然后加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并多次洗涤，室温下将产品真空干燥过夜。

（2）含有氨基葡萄糖单元的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine制备

将上述制备的Chol-Phe-Phe-Asp(OtBu)-OH （1.5mmol）、N,N-二环己基碳酰亚胺（DCC, 1.8mmol）以及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS, 1.8mmol）溶于25mL重蒸的无水THF中，并在冰浴下搅拌6小时。然后抽滤除去沉淀，加入6mL溶有氨基葡萄糖盐酸（6mmol）和NaHCO₃（12mmol）的水溶液到滤液中并在室温下搅拌24小时。旋蒸浓缩除去溶剂，加入20mL体积比为5：5的三氟乙酸和CH₂Cl₂的混合溶液，在室温下搅拌1小时除去侧基OtBu。之后加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并用乙醚多次洗涤，室温下真空干燥产品。用高效液相色谱（HPLC）分离纯化产品（HPLC分离柱为C₁₈型，含有0.1%氨水的乙腈和0.1%氨水的二次水做梯度淋洗，紫外检测波长为254nm），结构式见附图1，其HPLC图谱如附图2。

（3）可注射生物降解凝胶的制备

将糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine分散在磷酸缓冲溶液（PBS，pH=7.4）中，加热至80℃使其充分溶解形成澄清溶液（浓度20-30mg/mL）。缓慢降低温度至室温时，糖肽可以自组装形成稳定的超分子水凝胶，如附图3。

（4）糖肽水凝胶的生物相容性以及生物安全性评价

糖肽水凝胶的生物相容性通过和细胞共培养的细胞毒性及细胞存活率测定，分别采用HeLa和3T3两种细胞用MTT法检测。首先将在高温溶解的不同浓度的糖肽溶液加入到96孔细胞培养板中，每孔20μL，室温冷却形成凝胶，照射紫外灭菌。然后将HeLa和3T3细胞以6000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL含有10% FBS的DMEM培养基，然后在5% CO₂培养箱中于37度培养48 h。待培养结束后，小心移除培养板中的溶液，加入200μL新鲜DMEM培养基。再在每个孔中各加入20μL MTT的磷酸盐缓冲液溶液（5 mg/mL），在37 度湿润环境中培育4 h，弃去孔中的培养基和MTT，各加入150μLDMSO并在室温下振荡1 min混合均匀，之后用酶标仪（Bio-Rad，Model 550）记录570 nm处的吸光值。用第1列未接种细胞所测得吸光值的平均值对其它各孔调零，用第2列只接种细胞未加入药物所测得的吸光值为参照，第3列到第11列各孔中得出的平均吸光值作为测试结果。细胞的相对存活率由公式算出：细胞相对存活率(%)=(OD_570(sample)/OD_570(control))×100，其中OD_570(control)是未加入药物时测定的吸光值，OD_570(sample)是加入药物后测得的吸光值。OD值的测定基于4个独立平行样取平均值，结果表示为平均值±标准偏差(SD)。如附图4所示，在各个浓度下糖肽凝胶对HeLa和3T3两种细胞均未表现出细胞毒性。

（5）糖肽水凝胶的生物降解性能评估

称0.8g糖肽水凝胶放在样品瓶中，然后加入1.0 mL的20U的组织蛋白酶B和凝胶在37 度共孵育。之后每隔24小时取100μL混合液体同时补加100μL新鲜20U的组织蛋白酶B溶液，连续检测168小时。然后使用ESI-MS检测糖肽凝胶的降解情况评估其在生物体内的降解性能。通过对比图5和图6可知，在水凝胶降解前，ESI-MS质谱（图5）主要显示是多肽凝胶的分子离子峰；而与组织蛋白酶B共孵育以后，出现大量分子量较小的分子离子峰且多肽凝胶的分子离子峰消失（图6），说明多肽凝胶能够在组织蛋白酶B的作用下发生降解。

（6）兔眼滤过手术以及成纤维细胞的分布情况检测

滤过手术前首先对小分子肽的凝胶做消毒处理。具体方法如下：使用孔径为250nm的滤膜将小分子肽的水溶液过滤除菌，然后再将凝胶置于紫外光下照射30分钟。滤过手术在兔子的右眼进行，左眼作为参照。12只成年白兔平均分为四组：第一组兔眼只进行滤过手术、第二组兔眼在滤过手术中注射Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine多肽凝胶、第三组兔眼在滤过手术中使用Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-glucosamine支化糖肽凝胶、第四组兔眼在滤过手术中注射Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-Asp(glucosamine)-glucosamine多支化糖肽凝胶。在滤过手术中，向深层肌肉注射氯胺酮（50 mg/kg）和甲苯噻嗪（15 mg/kg）对兔子做全身麻醉，使用1-wt%地卡因对兔子右眼做局部麻醉。在滤过手术后的14天内，向心脏注射致死剂量的戊巴比妥处死手术兔。摘除眼球并保存在4-wt%多聚甲醛溶液中进行组织固定。随后用石蜡包埋眼组织手术滤过泡区，做成4 μm的病理切片。将切片进行α-肌动蛋白（α-SMA）免疫组化染色用于观察肌成纤维细胞的分布情况。由于成纤维细胞在增殖时其表面会分泌α-肌动蛋白（α-SMA），我们使用免疫组织化学研究α-SMA在滤过泡周围组织上的表达程度。如图9所示，由于glucosamine可以有效抑制成纤维细胞的增殖，在glucosamine凝胶剂组（图9B是：Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine多肽凝胶；图9C是：Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-glucosamine支化糖肽凝胶；图9D是：Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-Asp(glucosamine)-glucosamine多支化糖肽凝胶；）中，兔眼的滤过泡周围组织在术后14天内只有极少量的α-SMA表达，说明注射糖肽凝胶的兔眼内滤过泡无明显的组织纤维化现象。而在只进行滤过手术组（图9A）中，兔眼的滤过泡周围组织在术后第14天表达出大量的α-SMA。

实施例2

（1）含有良好生物相容性的疏水胆固醇（cholesterol，Chol）修饰的三肽 Chol-Phe-Phe-Asp-OH的制备

采用2-氯-三苯甲基氯树脂（树脂的有效氯取代度为1.08mmol/g）为固相载体，使用多肽固相自动合成仪制备胆固醇键接的短肽Chol-Phe-Phe-Asp(OtBu)-OH。肽链在树脂上由碳端向氮端延长。具体的制备步骤如下：称取2.0g 2-氯-三苯甲基氯树脂（共有有效氯的量为2.0g × 1.08mmol/g= 2.16mmol，然后用15mL DMF浸泡树脂1小时。抽去DMF，加入溶有FMOC-Asp(OtBu)-OH(2 × 2.16mmol)和二异丙基乙胺（DIEA, 6 × 2.16mmol）的15 mLDMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，用15 mL DMF洗涤树脂三次，然后加入15 mL 20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。抽去反应液，用15mL DMF洗涤树脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 × 2.16mmol)、DIEA（6 ×2.16mmol）、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU， 2.4 × 2.16mmol）和1-羟基苯并三氮唑（HOBt，2.4 × 2.16mmol）的15 mL DMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，之后用DMF洗涤树脂3次。取少量树脂做茚三酮显色测试（颜色应为无色或浅黄色），若变色则重复此步反应至显色测试为无色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。之后用15 mL DMF洗涤树脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 × 2.16mmol)、DIEA（6 × 2.16mmol）、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU， 2.4 × 2.16mmol）和1-羟基苯并三氮唑（HOBt，2.4 × 2.16mmol）的15 mL DMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，之后用DMF洗涤树脂3次。取少量树脂做茚三酮显色测试（颜色应为无色或浅黄色），若变色则重复此步反应至显色测试为无色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。之后用15mL DMF洗涤树脂三次后加入溶有Cholesteryl chloroformate (2× 2.16mmol)和DIEA（6 × 2.16mmol）的15 mL THF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应过夜。整个肽链合成结束后，分别用15mL THF、15mL DMF、15mL CH₃OH和15mL CH₂Cl₂各洗涤树脂3次，真空干燥树脂过夜。加入20mL切落剂（体积比5：5三氟乙酸和CH₂Cl₂将多肽从树脂上切落，收集滤液并浓缩。然后加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并多次洗涤，室温下将产品真空干燥过夜。此时Asp的侧基OtBu已经被切除，Chol-Phe-Phe-Asp-OH含有两个羧基能够和两分子的氨基葡萄糖反应，可用于制备支化的多肽功能糖肽。

（2）多功能支化糖肽Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-glucosamine的合成

将上述制备的Chol-Phe-Phe-Asp-OH （0.5mmol）、N,N-二环己基碳酰亚胺（DCC,1.2mmol）以及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS, 1.2mmol）溶于15mL重蒸的无水THF中，并在冰浴下搅拌6小时。然后抽滤除去沉淀，加入6mL溶有氨基葡萄糖盐酸（4mmol）和NaHCO₃（8mmol）的水溶液到滤液中并在室温下搅拌24小时。旋蒸浓缩除去溶剂，然后将产品溶于少量的三氟乙酸中，并加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并用乙醚多次洗涤，室温下真空干燥产品。用高效液相色谱（HPLC）分离纯化产品（HPLC分离柱为C₁₈型，含有0.1%氨水的乙腈和0.1%氨水的二次水做梯度淋洗，紫外检测波长为254nm），结构式见附图7。

（3）支化糖肽水凝胶的制备

将糖肽Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-glucosamine分散在磷酸缓冲溶液（PBS，pH=7.4）中，加热至80℃使其充分溶解形成澄清溶液（浓度20mg/mL）。缓慢降低温度至室温时，糖肽可以自组装形成稳定的超分子水凝胶。

与实例1中的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine相比，实例2中的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-glucosamine中天冬氨酸的侧基上的羧基也被修饰上氨基葡萄糖，形成了支化的糖肽。此支化糖肽含有两分子的氨基葡萄糖，增加了氨基葡萄糖的含量不仅有利于形成凝胶（增加氢键作用）而且提高了单位质量内有效氨基葡萄糖的含量。

实施例3

（1）含有良好生物相容性的疏水胆固醇（cholesterol，Chol）修饰的四肽 Chol-Phe-Phe-Asp-Asp-OH的制备

采用2-氯-三苯甲基氯树脂（树脂的有效氯取代度为1.08mmol/g）为固相载体，使用多肽固相自动合成仪制备胆固醇键接的短肽Chol-Phe-Phe-Asp(OtBu)-OH。肽链在树脂上由碳端向氮端延长。具体的制备步骤如下：称取2.0g 2-氯-三苯甲基氯树脂（共有有效氯的量为2.0g × 1.08mmol/g= 2.16mmol，然后用15mL DMF浸泡树脂1小时。抽去DMF，加入溶有FMOC-Asp(OtBu)-OH(2 × 2.16mmol)和二异丙基乙胺（DIEA, 6 × 2.16mmol）的15 mLDMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，用15 mL DMF洗涤树脂三次，然后加入15 mL 20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。抽去反应液，用15mL DMF洗涤树脂三次后加入溶有FMOC-Asp(OtBu)-OH(2 × 2.16mmol)、DIEA（6 × 2.16mmol）、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU， 2.4 ×2.16mmol）和1-羟基苯并三氮唑（HOBt，2.4 × 2.16mmol）的15 mL DMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，之后用DMF洗涤树脂3次。取少量树脂做茚三酮显色测试（颜色应为无色或浅黄色），若变色则重复此步反应至显色测试为无色。然后加入15 mL20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。抽去反应液，用15mLDMF洗涤树脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 × 2.16mmol)、DIEA（6 × 2.16mmol）、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU， 2.4 × 2.16mmol）和1-羟基苯并三氮唑（HOBt，2.4 × 2.16mmol）的15 mL DMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，之后用DMF洗涤树脂3次。取少量树脂做茚三酮显色测试（颜色应为无色或浅黄色），若变色则重复此步反应至显色测试为无色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。之后用15 mL DMF洗涤树脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 × 2.16mmol)、DIEA（6 × 2.16mmol）、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU， 2.4 × 2.16mmol）和1-羟基苯并三氮唑（HOBt，2.4 × 2.16mmol）的15 mLDMF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应1.5小时。抽去反应液，之后用DMF洗涤树脂3次。取少量树脂做茚三酮显色测试（颜色应为无色或浅黄色），若变色则重复此步反应至显色测试为无色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF（v/v）溶液到上一步的树脂中，充分反应脱去FMOC保护基。之后用15mL DMF洗涤树脂三次后加入溶有Cholesteryl chloroformate (2 ×2.16mmol)和DIEA（6 × 2.16mmol）的15 mL THF溶液到树脂中，并在室温下搅拌反应过夜。整个肽链合成结束后，分别用15mL THF、15mL DMF、15mL CH₃OH和15mL CH₂Cl₂各洗涤树脂3次，真空干燥树脂过夜。加入20mL切落剂（体积比5：5的三氟乙酸和CH₂Cl₂将多肽从树脂上切落，收集滤液并浓缩。然后加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并多次洗涤，室温下将产品真空干燥过夜。此时Asp的侧基OtBu已经被切除，Chol-Phe-Phe-Asp-Asp-OH含有三分子羧基能够和三分子的氨基葡萄糖反应，可用于制备多支化的功能糖肽。

（2）多功能支化糖肽Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-Asp(glucosamine)-glucosam-

ine的合成

将上述制备的Chol-Phe-Phe-Asp-Asp-OH（0.5mmol）、N,N-二环己基碳酰亚胺（DCC, 1.8mmol）以及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS, 1.8mmol）溶于15mL重蒸的无水THF中，并在冰浴下搅拌6小时。然后抽滤除去沉淀，加入6mL溶有氨基葡萄糖盐酸（6mmol）和NaHCO₃（12mmol）的水溶液到滤液中并在室温下搅拌24小时。旋蒸浓缩除去溶剂，然后将产品溶于少量的三氟乙酸中，并加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并用乙醚多次洗涤，室温下真空干燥产品。用高效液相色谱（HPLC）分离纯化产品（HPLC分离柱为C₁₈型，含有0.1%氨水的乙腈和0.1%氨水的二次水做梯度淋洗，紫外检测波长为254nm），结构式见附图8。

（3）多支化糖肽水凝胶的制备

将糖肽Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-Asp(glucosamine)-glucosamine分散在磷酸缓冲溶液（PBS，pH=7.4）中，加热至60℃使其充分溶解形成澄清溶液（浓度15mg/mL）。缓慢降低温度至室温时，糖肽可以自组装形成稳定的超分子水凝胶。与实例1中的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine相比，实例3中的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp(glucosamine)-Asp(glucosamine)-glucosamine两个天冬氨酸的侧基上的羧基也被修饰上氨基葡萄糖，形成了多支化的糖肽。此支化糖肽含有三分子的氨基葡萄糖，增加了氨基葡萄糖的含量不仅有利于形成凝胶（增加氢键作用）而且提高了单位质量内有效氨基葡萄糖的量。

Claims

1.一种抗术后疤痕的多支化糖肽水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（4）通过高效液相色谱法分离纯化所制得的多支化多肽；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，固相合成技术所采用的树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂、Rink Amide树脂或MBHA树脂中的一种，肽链的延长为碳端到氮端。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所用切落剂是体积比为1：2：7的醋酸、三氟乙醇和二氯甲烷时，天冬氨酸的侧基保护基OtBu不会被切除，切下的肽链只含有碳端一个羧基；当所用切落剂是体积比为5：5的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液时，天冬氨酸的侧基保护基OtBu被切除，切下的肽链中的羧基包括碳端的羧基和侧链的羧基，肽链含有一个天冬氨酸就有两个羧基，肽链含有两个天冬氨酸就有三个羧基。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中高效液相色谱法分离纯化多支化多肽的条件是：HPLC分离柱为C₁₈柱，用含0.1% （v/v）NH₄OH的乙腈和含0.1% （v/v）NH₄OH的去离子水做梯度淋洗，紫外检测波长为254 nm。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中合成多支化糖肽的缩合剂是N,N-二环己基碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中磷酸缓冲溶液的浓度为10mM，pH为7.4。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，通过加热溶解-冷却法制备糖肽水凝胶时，先把多支化糖肽加热到60-80℃使糖肽完全溶解，随后静置冷却到室温形成水凝胶。

8.权利要求1~7中任一种方法所制备的多支化糖肽水凝胶。

9.权利要求8所述的多支化糖肽水凝胶在制备术后疤痕抑制剂上的应用。