CN113149967B - Nir/mri双模态造影剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种近红外成像和核磁共振成像NIR/MRI双模态造影剂及其制备方法与应用。本申请以优化后的吲哚氰绿衍生物作为载体，连接MRI信号分子，获得了NIR/MRI双模态造影剂。该造影剂既可以近红外成像，又具备MRI显像能力；同时水溶性好、毒性低，近红外与MRI影像相互印证，丰富诊断信息，具备成为新型肿瘤造影剂的潜力。
Description
技术领域
本申请属于造影剂技术，具体涉及一种近红外成像和核磁共振成像NIR/MRI双模态造影剂及其制备方法与应用。
背景技术
肝癌是死亡率极高的恶性肿瘤之一，肝癌早期发病颇隐匿，无明显的症状和体征。患者被确诊肝癌时，往往分期较晚，预后差，5年生存率不高。因此发展一种有效可靠的诊断手段可以使得肝癌能够被早期发现，早期治疗以提高病患的存活率，在临床上具有较高的应用价值。
作为非侵入性的检测方式，各种分子影像技术迅速发展，在肝癌诊断和治疗中发挥了非常重要的作用。但是，它们各有优缺点，单一使用时不能完全满足临床诊疗的需要。核磁共振成像(Magnetic Resonance Image,MRI)可以获得肿瘤及周围组织多方面的分子信息，早期诊断有优势，却因为存在强磁场不能用于术中实时监测。近红外(NearInfrared,NIR)造影灵敏度高，可以诊断出微小病灶，但是穿透深度仅仅有10mm，不能发现深部的肝癌。现代医学要求肿瘤检测具有高灵敏度和实时成像的特性，单一模态的造影剂难以满足要求。多模态造影剂组合多种影像技术的优点，显著提高了肿瘤组织成像的特异性和图像分辨率，成为分子影像的研究热点。
绝大多数造影剂缺乏靶向肿瘤的能力，在肿瘤诊断中灵敏度不高。肿瘤靶向性造影剂能够在肿瘤组织进行蓄积，减少正常器官组织对造影剂的摄取，能够减少用药量并且增加安全性，更重要的是增强肿瘤与正常组织的对比度，更为直观的显示肿瘤病灶区域。因此，开发一种新型具有肿瘤靶向能力的造影剂对于肝癌早期的精准诊断具有重要意义。目前，临床上使用的肝癌造影剂仅有钆塞酸二钠。钆塞酸二钠在正常肝细胞中摄取，而在肝癌细胞中不摄取，组织对比时在肝癌部位暗成像。钆塞酸二钠并非靶向肿瘤细胞，仅有的一个专一性造影剂不能满足目前临床对肝癌诊断的需求，能够靶向肝癌部位的造影剂是急需解决的难题。
本世纪以来，近红外造影剂吲哚箐绿(Indocyanine Green,ICG)成为临床研究热点，在术前病灶确定、前哨淋巴结探测、心脑血管和肝胆外科手术中广泛使用。ICG近红外显像检测的小肝癌，直径甚至可达到1.5mm，有效增强了微小癌灶的发现和肝癌切除的完整性。但是，ICG在肝癌检测中存在的最大挑战，就是组织穿透性差，只能检测位于10mm深度以上的肝癌，深部的肿瘤无法发现。MRI穿透力强能够检测组织内部的肿瘤，但是，目前临床上使用的MRI肝癌造影剂仅有钆塞酸二钠，成像效果不能满足目前临床对肝癌诊断的需求。
临床实践发现，吲哚箐绿进入血液后与血浆蛋白形成复合物，被动靶向至内皮网状细胞丰富的肝脏区域。随后，在有机阴离子转运多肽(OATPs)以及牛磺胆酸转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)介导下被细胞摄取。肝癌细胞膜上过度表达OATP与NTCP受体，且肝癌细胞胆管堵塞并缺乏有效的淋巴回流。最终，导致ICG在正常肝细胞排出，而在肿瘤部位蓄积。患者在手术前注射ICG，大约24小时后，肝脏表面的肿瘤借助近红外成像可以直观地呈现在外科医生面前，增加手术切除的准确性。但是，ICG只能观察肝脏表面的肿瘤。探索MRI/NIR双模态探针分子策略，将肝癌靶向性、组织穿透力两方面的优势相结合，寻找敏感而高效的双模态造影剂候选化合物以期实现肝癌的精准定位，是早期发现肝癌患者，解决患者长期生存率低，满足临床诊疗需求的关键。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术中存在的技术问题，本申请提供了一种全新结构的NIR/MRI双模态造影剂及其制备方法与应用。
技术方案：本申请所述的一种如式(I)所示的金属络合物：
其中，W1和W2相同或不同，各自独立地为顺磁性金属离子；
Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand为配体；
条件是：当Y1为-COO-或-SO3 -时，则Halo-不存在。
进一步的，上述顺磁性金属离子选自Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Cr(3+)、Gd(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、La(3+)、Yb(3+)或Mn(2+)。优选的，W1和W2相同，为Gd(3+)。
本申请中，Ra1、Ra2、Ra3和Ra4中，所述C1-4烷基优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
本申请中，
中，N1优选为-CO-。
本申请中，
中，Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf和Rg相同或不同，彼此独立地优选为-COOH、-CH(OH)CH3或-CONHCH3。
本申请中，
中，M1和M2优选为-NH-。
本申请中，
中，X优选为-O-。
本申请中，
中，m优选为0、1、2或3；m’优选为2、3或4。
本申请中，
中，R1、R3、R4和R6优选为H。
本申请中，
中，R2和R5优选为-CO-。
本申请中，
中，Y1优选为SO3 -或CH3。
本申请中，
中，Y2优选为SO3H或CH3。
本申请中，
中，Halo-优选为Cl-。
本申请中，
中，Rx、Ry和Rz优选为H；或者，Rx优选为F、Cl、Br或I，优选地，Ry和Rz与其相连的碳一起形成
本申请中，
中，优选地，Ry和Rz与其相连的碳一起形成
本申请中，配体Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand中，
优选为
本申请中，配体Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand中，
优选为
本申请中，配体Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand中，
优选为
作为一种优选的技术方案，配体Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand中，
为
N1为-CO-，Ra、Rb、Rc相同，为-COOH；
为
M1和M2为-NH-，X为-CH2-，m为0、1、2、3、4、5或6，m’为2、3、4、5或6；
为
R1、R3、R4和R6相同为H，R2和R5为-CO-，Y1为-SO3 -，Y2为-SO3H，Rx、Ry和Rz为H，n为1、2、3或4。
进一步优选的，
为
为
为
本申请中，配体Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand优选为如下任一化合物：
化合物1
具体如下：
备注：“/”表示无。
化合物2
具体如下：
备注：“/”表示无。
进一步优选的，本申请中，所述的如式(I)所示的金属络合物优选为如下任一化合物：
化合物I-1
具体如下：
备注：“/”表示无。
化合物I-2
具体如下：
备注：“/”表示无。
本申请还提供了一种所述的如式(I)所示的金属络合物制备方法，其包括下列步骤：在pH值为6-7条件下，将配体与金属卤化物进行如下所示的反应，制得如式(I)所示的金属络合物：
其中，所述配体为Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand；所述金属卤化物为(W1)x1(Halo)x2和/或(W2)x3(Halo)x4；其中，各字母和基团的定义均同前所述。
所述的如式(I)所示的金属络合物制备方法中，所述反应优选在溶剂存在下进行，所述溶剂优选为水；
和/或，所述配体与所述金属卤化物的摩尔比可为1:1-1:2；
和/或，所述反应的温度优选室温；
和/或，反应的进程优选以检测所述配体消失时作为反应的终点；所述反应的时间例如为48h。
所述的如式(I)所示的金属络合物制备方法优选包括下列步骤：将配体和水的混合液与金属卤化物和水的混合液混合，进行所述的反应。
所述的如式(I)所示的金属络合物制备方法中，所述反应结束后，所得的反应液优选采用0.22μm微孔滤膜滤除不溶物，收集滤液并冻干，得到金属配合物。
本申请中，所述的如式(I)所示的金属络合物制备方法，还可进一步包括配体Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand的制备方法，其包括下列步骤：在碱和缩合剂的作用下，将如式(1-a)所示的化合物与Ligand进行缩合反应制得所述的配体，
Linker-NIR-Linker+Ligand→Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand (1-a)
其中，
的定义均如前述所定义；
Ligand为
N1a为-COOH或-NH2；Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf和Rg同前所述；
优选地，所述碱为无机碱和/或有机碱；所述的无机碱优选为碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐，例如为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或多种；所述的有机碱优选为三乙胺、二异丙基乙胺和吡啶中的一种或多种。条件是：当所述碱仅为有机碱时，所述缩合反应结束后，所得的反应液需要在碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾)的存在下，进行成盐反应，得到目标化合物。
优选地，所述缩合剂为环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。
优选地，所述缩合反应在溶剂存在下进行，所述溶剂优选为酰胺类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂和亚砜类溶剂中的一种或多种；更优选地，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或多种。
优选地，所述如式(1-a)所示的化合物与Ligand的摩尔比为1：(1-10)；优选为1:(2.3-2.5)。
优选地，所述如式(1-a)所示的化合物与碱的摩尔比为1：(1-10)；优选为1:(3-3.5)。
优选地，所述如式(1-a)所示的化合物与缩合剂的摩尔比为1：(1-10)；优选为1:(3-3.5)。
优选地，所述缩合反应的温度为-10-40℃，例如室温。
优选地，所述的制备方法中，反应的时间可不作具体限定，一般以TLC或HPLC检测Linker-NIR-Linker消失或不再进行反应时作为反应的终点。
具体制备过程如下：
将对肼基苯甲酸与3-甲基-2-丁酮经Fisher吲哚合成反应得到化合物2。
化合物2与1,3-丙磺酸内酯或1,4-丁磺酸内酯反应得到3系列化合物。
3系列化合物与戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐发生亲核加成消除反应得到5系列化合物。
三氯氧磷，N,N-二甲基甲酰胺，环己酮，苯胺反应得到4b。
3系列化合物与4b发生亲核加成消除反应得到6系列化合物。
Linker系列化合物与二碳酸二叔丁酯反应生成单边Boc保护化合物。
5系列化合物和6系列化合物分别与单Boc保护的Linker系列化合物反应生成7系列化合物和8系列化合物。
7系列化合物和8系列化合物通过三氟醋酸脱去Boc得到9系列化合物和10系列化合物。
DOTA与溴乙酸叔丁酯反应生成DO3A。
DO3A与溴乙酸苄酯反应生成Bn-DO3A。
Bn-DO3A与钯碳和氢气反应生成DO3A-COOH。
DO3A-COOH和9系列化合物或10系列化合物经缩合得到T-NPMC系列化合物。
T-NPMC系列化合物脱去叔丁酯生成NPMC系列化合物。
NPMC系列化合物与GdCl3.6H2O反应得到终产物Gd-NMC系列化合物
上述化合物中，L-表示
-L-表示
其定义如本申请中所定义。
优选地，上述9系列化合物或10系列化合物的合成方法包括下列步骤：7系列化合物或8系列化合物在碱的存在下与Linker系列化合物反应。所述碱优选为无机碱和/或有机碱。所述的无机碱优选碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐，例如为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或多种。所述的有机碱优选三乙胺、二异丙基乙胺和吡啶中的一种或多种。当所述碱仅为有机碱时，反应结束后，需要在碱金属氢氧化物的存在下，进行成盐反应，得到目标化合物。7系列化合物或8系列化合物与Linker系列化合物的摩尔比优选为1:(1.3-1.5)。反应温度优选为室温。
优选地，T-NPMC系列化合物的合成方法包括下列步骤：DO3A-COOH化合物在碱和缩合剂的存在下与9系列化合物反应。终产物的合成方法中，溶剂优选为酰胺类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂和亚砜类溶剂中的一种或多种，更优选N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或多种。所述碱优选为无机碱和/或有机碱。所述的无机碱优选碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐，例如为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或多种。所述的有机碱优选三乙胺、二异丙基乙胺和吡啶中的一种或多种。当所述碱仅为有机碱时，反应结束后，需要在碱金属氢氧化物的存在下，进行成盐反应，得到目标化合物。所述缩合剂优选为环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。9系列化合物与DO3A-COOH化合物的摩尔比优选为1：(1-10)，更优选为1:(2.3-2.5)。9系列化合物与碱的摩尔比优选为1：(1-10)，更优选为1:(3-3.5)。9系列化合物与缩合剂的摩尔比优选为1：(1-10)，更优选为1:(3-3.5)。9系列化合物与DO3A-COOH化合物反应的温度优选为-10-40℃，例如室温。
优选地，终产物的合成方法包括下列步骤：10系列化合物在碱和缩合剂的存在下与DO3A-COOH化合物反应。终产物的合成方法中，溶剂优选为酰胺类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂和亚砜类溶剂中的一种或多种，更优选N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或多种。所述碱优选为无机碱和/或有机碱。所述的无机碱优选碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐，例如为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或多种。所述的有机碱优选三乙胺、二异丙基乙胺和吡啶中的一种或多种。当所述碱仅为有机碱时，反应结束后，需要在碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾)的存在下，进行成盐反应，得到目标化合物。所述缩合剂优选为环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。10系列化合物与DO3A-COOH化合物的摩尔比优选为1：(1-10)，更优选为1:(2.3-2.5)。10系列化合物与碱的摩尔比优选为1：(1-10)，更优选为1:(3-3.5)。10系列化合物与缩合剂的摩尔比优选为1：(1-10)，更优选为1:(3-3.5)。10系列化合物与DO3A-COOH系列化合物反应的温度优选为-10-40℃，例如室温。
优选地，终产物的合成方法优选包括下列步骤：将DO3A-COOH化合物与缩合剂在冰浴下混合(活化)，然后加入9系列化合物或10系列化合物的溶液，其中溶剂优选与反应溶剂相同，进行所述反应。
优选地，终产物的合成方法结束后，若碱选用的是有机碱，还包括后处理的操作。所述后处理的操作包括成盐与重结晶。所述成盐过程使用氢氧化钠与9系列化合物或10系列化合物的摩尔比优选为1:(1.05-1.15)。所述重结晶的溶剂为摩尔比为1:(15-25)的水与异丙醇混合溶液，甲醇与二氯甲烷混合溶液，甲醇与氯仿混合溶液或甲醇与乙酸乙酯混合溶液。
优选地，上述的Gd(3+)还可以替换成Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Cr(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(2+)。
优选地，上述的DOTA还可以替换成DTPA
本申请还提供了一种药物组合物，其包含所述如式(I)所示的金属络合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本申请还提供了上述如式(I)所示的金属络合物或所述的药物组合物在制备造影剂中的应用。所述的造影剂可用于诊断肿瘤，所述的肿瘤优选肝癌。所述的造影剂用于近红外成像(NIR)和核磁共振成像(MRI)中。因此，本申请的造影剂优选是一种NIR和MRI双模态造影剂。
本申请所述如式(I)所示的金属络合物，可配制静脉注射剂使用。
所述顺磁性金属是指有些金属的离子是填满的电子结构，但它们的自由电子所产生的顺磁性大于离子部分的抗磁性。例如Gd(3+)、Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Cr(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(2+)。
本申请中，MRI是指核磁共振成像，根据不同结构环境中释放能量的衰减不一样，可以通过检测施加的梯度磁场发射的电磁波来确定物体核的位置和类型，并能够绘制物体的结构图像。
本申请中，室温是指0-35℃。
有益效果：相比较于现有技术，本申请具有以下优势：(1)利用具有靶向性富集于肿瘤(肝癌)区域的分子载体吲哚氰绿衍生物，与DOTA、DTPA等官能团相连接，螯合顺磁性金属离子时，得到如式(I)所示的金属络合物，得到NIR/MRI双模态造影剂。(2)本申请络合物能够实现多种造影模态相互印证，丰富诊断信息，提高诊断精度，为临床上肿瘤的早期诊断提供可行的新型造影剂。(3)本申请的络合物可被肿瘤(肝癌)组织特异性吸收，可选择性富集于肿瘤(例如肝癌)区域，与周围正常组织形成较强对比，使得该造影剂具有显著的肿瘤(肝癌)靶向性；同时，该造影剂具有水溶性好(在水中溶解度可达到100mg/mL，可通过静脉注射给药)、毒性低的特点，具有潜在的应用前景。
附图说明
图1是实施例1制备的化合物Gd-NMC-1、实施例2制备的化合物Gd-NMC-2、实施例3制备的化合物Gd-NMC-3与普美显的体外MRI强度图；
图2是实施例1制备的化合物Gd-NMC-1、实施例2制备的化合物Gd-NMC-2、实施例3制备的化合物Gd-NMC-3与普美显的体外MRI强度柱状图；
图3-4分别是实施例3制备的化合物Gd-NMC-3与普美显的不同浓度体外MRI强度图；
图5是实施例1制备的化合物Gd-NMC-1、实施例2制备的化合物Gd-NMC-2与实施例3制备的化合物Gd-NMC-3的MTT细胞活力测试图；
图6-7分别实施例3制备的化合物Gd-NMC-3和ICG的活体小动物近红外成像图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请内容作进一步地说明。
实施例1化合物Gd-NMC-1的制备
反应路线如下：
步骤1：将4g 4-肼基苯甲酸、3.96mL 3-甲基-2-丁酮、4.32g醋酸钠、60mL醋酸投入250mL三颈瓶中，氮气保护；25℃搅拌3h，随后120℃反应6h；反应结束后，用水转移反应液，二氯甲烷(DCM)萃取，合并浓缩有机相；采用柱层析分离(DCM:甲醇＝50:1)，浓缩得到黄色固体化合物2，收率61％。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):8.17(d,J＝8.19Hz,1H),8.08(s,1H),7.67(d,J＝8.19Hz,1H),2.41(s,3H,),1.40(s,6H)。
步骤2：向250mL三颈瓶中依次投入4g化合物2、11.93mL1,4-丁磺酸内酯、50mL邻二氯苯、氮气保护，180℃回流9h；反应结束后大量固体析出，抽滤，丙酮洗涤三次，得到粉红色固体化合物3，收率93％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm)：8.40(s,1H),8.17(dd,2H),4.52(t,2H),2.90(s,3H),2.51(t,2H),1.97(m,2H),1.77(m,2H),1.58(s,6H)。
步骤3：依次向250mL三颈瓶中加入2g化合物3、784mg戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐、30mL醋酸酐、18mL冰醋酸，最后加入808.8mg醋酸钠，氮气保护，120℃回流45min；反应结束后，加入50mL无水乙醚，将析出的固体抽滤得到粗品，随后进行重结晶，溶剂选用摩尔比为4:1的异丙醇与水混合溶液，得到绿色化合物5a，收率76％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):8.08(d,2H,J＝1.2Hz),7.98(dd,2H,J＝1.1,8.2Hz),7.95(m,5H),7.51(d,2H,J＝8.7Hz),6.65(t,2H,J＝12.4Hz),6.54(d,2H,J＝13.6Hz),4.11(m,4H),3.09(m,4H),1.75(m,8H),1.67(m,12H)。
步骤4：在250mL三颈瓶中，将5.8mL乙二胺溶于15mL干燥的DCM中。冰浴，氮气保护，无水反应，开始搅拌。将3.2mL二碳酸二叔丁酯溶于65mL干燥的DCM中，缓慢滴加至反应体系。滴加完毕，撤除冰浴，换成25℃油浴反应18h。反应结束后，过滤除去副产物，向残留物中加入饱和碳酸氢钠溶液。用DCM萃取，合并浓缩有机相，得淡黄色油状物单Boc-乙二胺，收率71％。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):3.15(t,J＝6.5Hz,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,2H),1.47(s,9H)。
步骤5：冰浴下，在250mL三颈瓶中，依次加入1.8g化合物5a、2.7g 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、80mL无水DMF、1.26mL N,N-二异丙基乙胺。在冰浴下搅拌1h活化。1h后，加入单Boc-乙二胺，加料完毕，撤出冰浴，在室温下搅拌12h。反应完毕后，用无水甲醇转移反应液，柱层析分离(DCM:甲醇＝10:1；8:1；6:1；5:1；4:1)。浓缩至微量，加入大量DCM除杂，抽滤，得到绿色固体1.3g化合物7-1。收率52.8％。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.48(m,2H),8.09-7.84(m,7H,4Ar-H,3–CH＝CH),7.46(d,J＝7.65Hz,2H,2ArH),6.94(m,2H),6.63-6.44(m,4H,4–CH＝CH),4.09(br,4H,2N-CH 2),3.11(m,8H),2.51(m,4H,2-CH2SO3),1.86-1.76(m,8H,2N-CH2-CH2CH2-CH2-SO3),1.66(12H,4-CH3),1.38(s,18H,9-CH3)。
步骤6：在50mL单颈瓶中，依次加入1g化合物7-1、3mL三氟醋酸、4mL无水DCM，氮气保护，室温下反应。反应结束后，用无水甲醇转移反应液，60℃下浓缩干燥，随后加入乙醚打浆。抽滤得到红色固体0.762mg化合物9-1。收率97.6％。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.53(m,2H),7.94-7.72(m,11H),7.47(m,2H,2ArH),6.94(m,2H),6.63-6.44(m,4H,4–CH＝CH),4.09(br,4H,2N-CH2),3.41(m,4H),2.88(m,4H),2.51(m,4H,2-CH 2SO3),1.86-1.76(m,8H,2N-CH2-CH2CH2-CH2-SO3),1.64(s,12H,4-CH3)。
步骤7：在无水条件，冰浴下，在250mL三颈瓶中，将8.61g化合物DOTA、13.02g减压干燥的碳酸氢钠、100mL重蒸乙腈依次加入，最后缓慢滴加溴乙酸叔丁酯。反应完毕后，甲醇转移反应液，抽滤，将滤液在旋转蒸发仪上旋干，溶解于氯仿，用水萃取，合并有机相，用甲苯120℃重结晶，得到白色固体11.3g化合物DO3A。收率44％。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):10.14(br,s,1H,NH),3.39(br,s,4H),3.30(br,s2H,CH2),3.12(m,4H,CH2),3.09-2.89(m,12H,CH2),1.46(27H,9-CH3)。
步骤8：在无水条件下，在500mL三颈瓶中，将6.17g化合物DO3A、4.98g干燥碳酸钾、300mL乙腈依次投入，氮气保护，室温下反应1h。1h后，将2.75mL溴乙酸苄酯缓慢滴加至反应体系内，30min内加完。反应24h。反应结束后，用DCM转移反应液，抽滤，将滤液旋干，得到黄色油状物。加入DCM溶解油状物，依次用水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，合并有机相，旋干的到红棕色油状物7g化合物Bn-DO3A。收率88％。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):7.34-7.29(m,5H),5.12(s,2H),3.5-2.39(m,24H),1.46(27H,9-CH3)。
步骤9：氢气体系下，向500mL单颈瓶中依次加入8.2g化合物Bn-DO3A、1g钯碳、150mL乙醇，室温下反应12h，体系有气泡产生。反应结束后，在滤纸表面上铺上硅藻土防止漏碳，抽滤，将滤液浓缩得到油状物，加入DCM溶解，水洗2次，饱和碳酸氢钠洗两次，饱和食盐水洗两次，旋干溶剂，减压干燥得到4.5g白色固体化合物DO3A-COOH。收率64.3％。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):4.01-1.92(br,24H),1.48(27H,9-CH3)。
步骤10：冰浴条件下，向50mL三颈瓶中加入90mg化合物9-1、136mg化合物DO3A-COOH、123.4mg 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、12mL DMF。搅拌1h。1h后，加入90mg化合物9-1、0.08mL N,N-二异丙基乙胺，撤除冰浴，室温下搅拌。反应完全后，旋干溶剂，加入乙醚析晶，抽滤得到固体，溶解制砂，柱层析分离(DCM:甲醇：千分之一TEA ＝8:1-4:1)，浓缩得72mg深绿色固体化合物。不进一步纯化，直接进行下一步反应。
步骤11：在250mL单颈瓶中，将步骤10所得粗品(1.64g,0.85mmol)溶于H2O:TFA＝1:3(v/v)的混合溶液(60mL)，加入三异丙基硅烷(0.7mL,3.4mmol)，室温反应18h。TLC(DCM:甲醇＝3:1)监测反应进程。反应完成后，旋除溶剂，乙醚逼出固体。制备型高效液相色谱分离，得到132mg蓝绿色粉末状固体，两步总收收率共计7.6％。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.66(m,4H),8.15–7.82(m,7H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),4.16(br,4H),3.97(br,8H),3.80(br,8H),3.66(br,12H),3.45(br,12H),3.11(br,16H),2.53(m,4H),1.68(m,20H).
步骤12：室温下，向10mL单颈瓶中加入20mg化合物NMC-1、1.5mL水，调节pH在中性范围。加入6.3mg六水合氯化钆，溶于1mL水中加入单颈瓶中，调节pH至7，37℃下反应12h。反应结束后，将反应液进行抽滤，滤除不溶物(氢氧化钆)，过0.22μm微孔滤膜，得到滤液。旋至微量，进行冻干。得到18.7mg固体化合物Gd-NMC-1。
HRMS(ESI-TOF)[(M+3H)3+]m/z:636.5096(Calcd for[M+3H]3+:636.5150relative Error＝0.85ppm).
实施例2化合物Gd-NMC-2(结构如下)
制备方法同实施例1，除了步骤4中用1,3-丙二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物Gd-NMC-2，收率39％。
HRMS(ESI-TOF)[(M+3H)3+]m/z:655.2003(Calcd for[M+3H]3+:655.2027relative Error＝0.37ppm).
实施例3化合物Gd-NMC-3(结构如下)
制备方法同实施例1，除了步骤4中用1,4-丁二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物Gd-NMC-3，收率30％。
HRMS(ESI-TOF)[(M+3H)3+]m/z:655.2003(Calcd for[M+3H]3+:655.2027relative Error＝0.37ppm).
实施例4化合物Gd-NMC-4(结构如下)
制备方法同实施例1，除了步骤4中用1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物Gd-NMC-4，收率30.2％。
HRMS(ESI-TOF)[M+2NH 4+Na]3+m/z:713.9029(Calcd for[M+2NH 4+Na]3+:713.8959relative Error＝0.98ppm).
实施例5化合物Gd-NMC-6的制备
反应路线：
制备的前两个步骤同实施例1，得到化合物3。
然后再制备NIR，具体步骤如下：
步骤A：在250mL单颈瓶中，加入26mL DMF，磁力搅拌，冰浴下滴加22mL POCl3。滴加完毕后，继续冰浴搅拌30min，撤除冰浴，加入11mL环己酮，氮气保护，加热回流1h。降至室温，改用机械搅拌，滴加36mL摩尔比1:1的苯胺与乙醇混合溶液。滴加完毕后，继续搅拌1h。加入220mL摩尔比10:1的为水和HCl的混合溶液，冰浴搅拌2h。抽滤，冰水、丙酮、乙醚洗涤滤饼。将固体打浆洗涤(PE:EA＝2:1)，得紫色固体4，收率32％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):8.40(s,2H),7.50-7.38(m,8H),7.21-7.16(m,2H),2.71(t,4H),1.80(m,2H)。
步骤B：在25mL单颈瓶中，依次加入173mg化合物3，87mg化合物4，68mg醋酸钠，1mL醋酸和2mL醋酸酐，氮气保护，120℃回流搅拌45min。溶液变为绿色，采用柱层析分离(PE:EA＝2:1)监测至反应完全，停止加热，降至室温，将反应液倒入10mL乙醚中，绿色固体析出。抽滤，乙醚洗涤固体，柱层析分离(DCM:甲醇＝3:1)，得绿色固体6，收率46％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):8.27(d,J＝14.2,2H),8.07(d,J＝1.5,2H),7.97(d,J＝1.6,2H),7.51(d,J＝8.4,2H),6.60(d,J＝13.8,2H),4.44–4.34(m,4H),2.58(d,J＝6.7,4H),2.04(dt,4H),1.70(s,12H)。
得到绿色固体6后，继续按照实施例1中的方法，除了将化合物6代替化合物5a进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物Gd-NMC-6，收率15.3％。
HRMS(ESI-TOF)[M+2NH 4+Na]3+m/z:680.5066(Calcd for[M+2NH 4+Na]3+:680.5059relative Error＝0.98ppm).
实施例6化合物Gd-NMC-14(结构如下)
制备方法同实施例4，除了用1,3-丙磺酸内置代替1,4-丁磺酸内酯进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物Gd-NMC-14，收率46.8％。
HRMS(ESI-TOF)[(M+2H)+Na]3+m/z:1039.2937(Calcd for[(M+2H)+Na]3+:1039.2967relative Error＝0.29ppm).
实施例7化合物Gd-NMC-16(结构如下)
制备方法同实施例5，除了用1,3-丙磺酸内酯代替1,4-丁磺酸内酯与化合物2进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物Gd-NMC-16，收率20.7％。
HRMS(ESI-TOF)[(M+3H)3+]m/z:671.1633(Calcd for[M+3H]3+:671.5152relative Error＝0.20ppm).
实施例8化合物Gd-NMC-19(结构如下)
制备方法同实施例7，除了用1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物Gd-NMC-19，收率19.2％。
HRMS(ESI-TOF)[(M+3H)3+]m/z:729.9966(Calcd for[M+3H]3+:729.5152relative Error＝0.20ppm).
应用例
选用HepG2(人肝癌细胞)、L02(人正常肝细胞)与LM3(人肝癌细胞)细胞进行体外培养，其中，HepG2细胞购自中国科学院上海细胞所，L02细胞购自上海复生生物科技有限公司，LM3细胞购自中国科学院上海细胞所。HepG2细胞在含有10％FBS，100IU/mL青霉素和100mg/mL链霉素的HyClone DMEM培养基中培养。L02细胞在含有10％FBS，100IU/mL青霉素和100mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养。LM3细胞在含有10％FBS，100IU/mL青霉素和100mg/mL链霉素的HyClone DMEM培养基中培养。
动物实验模型鼠为普通裸鼠经腋下接种HepG2细胞，饲养裸鼠1周，得到肿瘤模型。
图1是实施例1-3中的化合物Gd-NMC-1、Gd-NMC-2、Gd-NMC-3和普美显的体外MRI强度图。将化合物Gd-NMC-1、Gd-NMC-2、Gd-NMC-3和普美显配置成相同钆浓度的溶液(2mM)至于BRUKER PharmaScan 7T仪器下成像，分析成像结果，化合物Gd-NMC-1、Gd-NMC-2、Gd-NMC-3和普美显具有近似的MRI信号强度。其中，化合物Gd-NMC-1和Gd-NMC-3的MRI信号明显强于普美显。
图2是实施例1-3中的化合物Gd-NMC-1、Gd-NMC-2、Gd-NMC-3和普美显的体外MRI强度柱状图。将化合物Gd-NMC-1、Gd-NMC-2、Gd-NMC-3和普美显配置成相同钆浓度(1mM)的溶液至于BRUKER PharmaScan 7T仪器下成像，分析成像结果。
图3-4是实施例3中的化合物Gd-NMC-3和普美显的体外MRI振动弛豫特性评价。将化合物Gd-NMC-3和普美显配置成等体积的浓度梯度溶液(化合物1mM-0，普美显2mM-0)，将MRI信号强度绘制成回归曲线，横坐标为造影剂的浓度(mM)，纵坐标为1/T1值，四条曲线的R2均大于0.99，说明这种造影剂在图示浓度梯度具有良好的线性关系。
图5是实施例1-3中的化合物Gd-NMC-1、Gd-NMC-2和Gd-NMC-3的MTT细胞活力测试图。测试化合物Gd-NMC-1、Gd-NMC-2和Gd-NMC-3对HepG2细胞的细胞毒性，于37℃将细胞接种到96孔板(6×103细胞/孔)上，5％CO2条件下共孵育24小时。随后，在新鲜培养基中加入化合物Gd-NMC-1、Gd-NMC-2或Gd-NMC-3(0-100μM)加入至孵育体系。48小时后，进行标准MTT测定检测细胞活力。其中横坐标指化合物用量，纵坐标指化合物对细胞的抑制率。图中表明，化合物Gd-NMC-1、Gd-NMC-2和Gd-NMC-3的浓度小于100μM时，HepG2的细胞均存活率在80％以上，说明该造影剂具有良好的细胞相容性且毒性较低。
图6-7是实施例3中的化合物Gd-NMC-3的活体小动物近红外成像图。荧光信号由带有Semrock 700±12nm常通滤光片的CCD相机(美国普林斯顿仪器公司)采集。实验选取两组HepG2腋下接种裸鼠，分别经尾静脉注射浓度为20mg/kg的化合物Gd-NMC-3与ICG的2％PBS0.2mL，在不同时间段对实验鼠进行近红外成像，记录不同时间段的活体模型鼠近红外成像结果。图中圆圈部位指示肿瘤位置，肿瘤区域成像亮度远高于周围组织。因此，在近红外成像下均能显示化合物Gd-NMC-3与ICG在肿瘤区域的富集，且化合物Gd-NMC-3具有更好的对比度。
Claims (8)
1.一种NIR/MRI双模态造影剂，其结构如式(I)所示：
其中，W1和W2相同或不同，各自独立地为顺磁性金属离子；
Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand为配体；
其中，
为
N1为-CO-或-NH-；Ra、Rb和Rc相同或不同，彼此独立地为-COOH、-CH(Ra3)(Ra4)或-CONRa1Ra2；Ra1和Ra2独立地为H或C1-4烷基；Ra3和Ra4一个为-OH，另一个为C1-4烷基；
所述顺磁性金属离子选自Fe2+、Fe3+、Cu2+、Cr3+、Gd3+、Eu3+、Dy3+、La3+、Yb3+或Mn2+。
2.根据权利要求1所述的NIR/MRI双模态造影剂，其特征在于：
W1和W2相同，为Gd3+；
和/或，
中，N1为-CO-；
和/或，
中，Ra、Rb和Rc相同或不同，彼此独立地为-COOH、-CH(OH)CH3或-CONHCH3；
和/或，
中，M1和M2为-NH-；
和/或，
中，X为-O-；
和/或，
中，m为0、1、2或3；m’为2、3或4；
和/或，
中，R1、R3、R4和R6为H；
和/或，
中，R2和R5为-CO-；
和/或，
中，Y1为SO3 -或CH3；
和/或，
中，Y2为SO3H或CH3；
和/或，
中，Halo-为Cl-；
和/或，
中，Rx、Ry和Rz为H；或者，Rx为F、Cl、Br或I，Ry和Rz与其相连的碳一起形成
3.根据权利要求1所述的NIR/MRI双模态造影剂，其特征在于：
所述
为
所述
为
所述
为
4.根据权利要求1所述的NIR/MRI双模态造影剂，其特征在于，所述配体Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand选自如下结构的化合物中的任一种：
具体如下：
具体如下：
备注：“/”表示无。
5.根据权利要求4所述的NIR/MRI双模态造影剂，其特征在于，选自：
其中，所述配体Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand选自1-1至1-10、或者2-1至2-10。
6.权利要求1-5中任一项所述的NIR/MRI双模态造影剂的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：在pH值为6-7条件下，将配体与金属卤化物进行如下所示的反应，制得如式I所示的金属络合物：
其中，所述配体为Ligand-Linker-NIR-Linker-Ligand，所述金属卤化物为(W1)x1(Halo)x2和/或(W2)x3(Halo)x4，其中，X1-4根据W1和W2价态推算而得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述反应溶剂为水；所述配体与所述金属卤化物的摩尔比为1∶1-1∶2；所述反应温度为室温。
8.权利要求1所述的NIR/MRI双模态造影剂在制备NIR/MRI双模态造影剂中的应用。
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