CN112315909A - 一种功能化聚合物胶束pm-tlk及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种功能化聚合物胶束PM‑TLK及其制备方法和应用，属于纳米生物医药材料领域。该胶束由可降解的聚己内酯‑b‑聚乙二醇嵌段共聚物(PCL‑b‑PEG)胶束与表面功能化多肽(D)‑TLKIVW构成。(D)‑TLKIVW能与Tau蛋白相互作用，但本身疏水性较强容易聚集在生理条件下作用效果较差。PCL‑b‑PEG是一种高生物相容性和可降解性的聚合物，还具有较好的抗蛋白吸附与血液长循环性能。该功能化聚合物胶束能够高效结合Tau蛋白聚集体，在体外抑制Tau蛋白聚集，还能阻止Tau蛋白聚集体种子向神经细胞传播，并且聚合物胶束‑Tau复合物还能促进Tau聚集体的降解。这种聚合物胶束提高了多肽的溶解性与稳定性，增强了作用能力，并且制备工艺简单，在阿尔兹海默症治疗方面具有广阔的应用前景。

Description

一种功能化聚合物胶束PM-TLK及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种用于抑制Tau蛋白聚集并阻止Tau聚集体向神经细胞传播的功能化聚合物胶束的制备和应用。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)，又称老年痴呆症，是大脑半球的语言、记忆和推理等智能处于受损状态而产生的一种神经退行性疾病，是老龄人口中发病率最高的疾病之一，严重危害人类健康，但目前仍旧缺乏有效的药物和治疗方法。AD最重要的病理特征是胞外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的淀粉样斑块和神经细胞内的Tau蛋白形成的神经纤维缠结。最近，以Aβ为靶点的部分药物在三期临床试验中以失败告终，预示着Aβ可能不是最根本的治病因素，而越来越多的研究发现Tau蛋白病变与AD发病之间具有比Aβ有更好的相关性。因此开发以Tau蛋白为靶点治疗AD的方法具有更大的意义和紧迫性。
Tau蛋白聚集会使Tau蛋白丧失其正常的生理功能，并且导致细胞轴突受损损害细胞内物质传输，而且Tau蛋白聚集体还会向正常的神经细胞传播，造成大量神经细胞死亡。因此在疾病早期通过抑制Tau蛋白聚集来治疗AD是一种可行的手段，能够阻止或者延迟AD的发病。目前研究人员已经发现一些有机小分子、多肽具有在体外抑制Tau蛋白的作用，但是在它们的生物相容性、稳定性存在一定的问题。多肽药物具有无免疫原性、易于合成、特异性强等特点，目前经过分子对接和高通量筛选已经得到一些Tau蛋白多肽抑制剂，但这些抑制剂也存在疏水性强易聚集、细胞毒性、难以跨越细胞膜屏障等问题。
随着纳米技术的发展，纳米粒子在药物递送方面发挥着越来越重要的作用。聚合物纳米粒子如聚己内酯-聚乙二醇(PCL-b-PEG)具有很高的生物相容性和生物稳定性，并且在生物体内可降解，还具有很好的长循环性能，常用于药物递送，而且表面易于修饰。
发明内容
本发明目的是克服现有技术与不足，将小分子多肽抑制剂与聚合物纳米粒子的优势相结合，得到表面修饰多肽的功能化聚合物胶束，改善了多肽抑制剂的溶解性低、稳定性差等缺陷，而且引入纳米效应，增强对Tau蛋白聚集的抑制作用并阻止Tau聚集体向神经细胞传播，聚合物胶束-Tau复合物还能促进Tau聚集体的降解，并且制备工艺简单，对于以Tau蛋白为靶点的AD治疗具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案
一种功能化聚合物胶束PM-TLK，所采用的多肽是D构型多肽苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-色氨酸((D)-Thr-Leu-Lys-Ile-Val-Trp,(D)-TLKIVW，简写为TLK)，聚合物是聚己内酯-聚乙二醇PCL-b-PEG，最终合成得到PCL5k-b-PEG5k-TLKIVW聚合物，在水溶液中自组装形成平均粒径38nm的聚合物胶束，该聚合物胶束表面有TLKIVW多肽。
一种功能化聚合物胶束PM-TLK及其制备方法，制备过程如下：
1)PCL-b-PEG与PCL-b-PEG-NHBOC的合成；
聚乙二醇(PEG5k-OH)与ε-己内酯(ε-caprolactone，以下简称ε-CL)以1:1的质量之比溶解在适量重蒸甲苯中，在Schlenk瓶中经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，循环三次；在110℃氩气保护条件下反应12h，通过冰乙醚沉淀和真空干燥得到PCL-b-PEG5k白色粉末；同理用BOC氨基聚乙二醇(HO-PEG5k-NHBOC)与ε-CL反应得到淡黄色粉末PCL-b-PEG-NHBOC；
2)PCL-b-PEG-NHBOC脱保护；
将PCL-b-PEG-NHBOC溶解在适量三氟乙酸(TFA)：二氯甲烷(DCM)＝1:1混合溶液中，室温搅拌4h。悬蒸后加入DCM洗涤浓缩三次后，加入适量三乙胺(TEA)：二氯甲烷(DCM)＝1:1混合溶液中，室温搅拌4h，悬蒸浓缩，用冰乙醚沉淀和真空干燥得到PCL-b-PEG-NH2淡黄色粉末；
3)PCL-b-PEG-MAL的合成；
将PCL-b-PEG-NH2：3-马来酰亚胺基丙酸：EDCL：HOBT：DIPEA物质的量之比1:5:5:5:10用适量干燥DCM溶解，室温反应24h后，依次用稀盐酸、饱和碳酸钠水溶液和蒸馏水洗涤，分离得到的有机相用无水硫酸镁干燥，有机相过滤之后将滤液旋蒸浓缩，并在冰乙醚中沉淀，真空干燥后得到PCL-b-PEG-MAL粉色粉末；
4)PCL-b-PEG-TLKIVW的合成；
将PCL-b-PEG-MAL与CGGG-(D)-TLKIVW按物质的量比1:1.5溶于适量干燥的DMF中，加入催化量TEA，氩气保护下室温反应24h，经过DMF透析三次、水透析三次后冷冻干燥，得到淡黄色粉末PCL-b-PEG-TLKIVW；
5)PM-TLK胶束的制备：
将PCL-b-PEG-TLKIVW溶于适量干燥的DMF(浓度5mg/ml)中，超声下滴入水中，20分钟后用去离子水透析三天(截留分子量为5000)；胶束使用前浓缩定容。
一种本发明聚合物胶束PM-TLK作为制备阿尔兹海默症药物的应用，用于抑制Tau蛋白聚集和阻止Tau蛋白聚集体向神经细胞传播。
本发明的优点和有益效果：
本发明将Tau蛋白作用多肽(D)-TLKIVW修饰在聚合物胶束PCL-b-PEG表面，结合了二者的优势，改善多肽抑制剂的溶解性低、稳定性差等缺陷，降低多肽的细胞毒性，而且还有纳米效应，增强了抑制Tau蛋白聚集的效果并阻止Tau聚集体向神经细胞传播，聚合物胶束-Tau复合物还能促进Tau聚集体的降解，并且制备工艺简单。实验结果表明，PM-TLK聚合物胶束具有良好的稳定性，能够抑制Tau蛋白的聚集，有效减少Tau蛋白纤维的形成，而且具有很低的细胞毒性，能够抑制Tau蛋白聚集体种子向神经细胞传播，聚合物胶束-Tau复合物还能促进Tau蛋白聚集体的降解，作为治疗AD的药物有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明中功能化胶束抑制Tau蛋白聚集、阻止Tau蛋白聚集体向神经细胞中传播、促进Tau聚集体降解的示意图。
图2为TLK多肽与功能化胶束PM-TLK的结构、稳定性与形貌；其中(a)多肽TLK结构，(b)功能化胶束PM-TLK的制备，(c)TLK多肽的光强变化，(d)TLK多肽的粒径变化，(e)TLK多肽孵育后的形貌，(f)功能化胶束PM-TLK的光强变化，(g)功能化胶束PM-TLK的粒径变化，(h)功能化胶束PM-TLK孵育后的形貌。
图3为PM-TLK功能化胶束抑制Tau蛋白聚集；(a)硫黄素T检测功能化胶束抑制Tau蛋白聚集，(b)1-苯胺基-8-萘磺酸ANS检测功能化胶束抑制Tau蛋白聚集,(c)圆二色光谱检测功能化胶束抑制Tau蛋白聚集二级结构转变，(d)功能化胶束抑制Tau蛋白聚集产物TEM形貌表征。
图4为PM-TLK胶束抑制Tau蛋白聚集体向神经细胞传播；(a)功能化胶束PM-TLK降低多肽TLK细胞毒性，(b)功能化胶束PM-TLK降低Tau蛋白聚集体向神经细胞传播的细胞毒性，(c)功能化胶束PM-TLK阻止Tau蛋白聚集体向神经细胞传播荧光共聚焦图片。
图5为PM-TLK功能化胶束促进Tau聚集体降解；(a)PM-TLK功能化胶束促进Tau聚集体降解ThT荧光变化，(b)PM-TLK功能化胶束促进Tau聚集体降解产物TEM图片。
具体实施方式
以下通过非限定性实例进一步详细说明本发明。
实施例1：一种用于抑制Tau蛋白聚集并阻止Tau蛋白聚集体向神经细胞传播的功能化聚合物胶束的制备。
1)PCL-b-PEG与PCL-b-PEG-NHBOC的合成；
将0.2mmol干燥的聚乙二醇(PEG5k-OH)与10mmol减压蒸馏过的ε-己内酯(ε-caprolactone，以下简称ε-CL)加入到干燥的Schlenk瓶中，加入5ml重蒸过的无水甲苯溶解，加入一滴辛酸亚锡(Sn(Oct)2)。经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，循环三次后，在氩气保护条件下于110℃的油浴中反应12h。反应后加入3ml二氯甲烷稀释，然后用20倍体积的冰乙醚沉淀，冰箱4℃过夜，经过抽滤，洗涤和真空干燥12h后得到PCL-b-PEG白色粉末；同理用0.2mmol BOC氨基聚乙二醇(HO-PEG5k-NHBOC)与10mmolε-CL通过相同的步骤反应得到淡黄色粉末PCL-b-PEG-NHBOC；
2)PCL-b-PEG-NHBOC脱保护；
将0.1mmol PCL-b-PEG-NHBOC加入25ml圆底烧瓶中，用3ml三氟乙酸(TFA)与3ml二氯甲烷(DCM)混合溶液溶解，水浴室温搅拌4h。将反应混合物用悬蒸悬干后加入5ml DCM溶解，再悬干加入5ml DCM溶解，重复三次后，加入3ml三乙胺(TEA)与3ml二氯甲烷(DCM)，再水浴室温搅拌4h。用悬蒸悬干后加入5ml DCM溶解，用20倍体积冰乙醚沉淀，沉淀过夜完全后，抽滤，洗涤和真空干燥得到PCL-b-PEG-NH2淡黄色粉末；
3)PCL-b-PEG-MAL的合成；
将0.05mmol PCL-b-PEG-NH2、0.25mmol 3-马来酰亚胺基丙酸、0.25mmol EDCL：0.25mmol HOBT：0.5mmol DIPEA加入到25ml圆底烧瓶中，加入5ml干燥的DCM溶解，水浴室温搅拌24h后，用5ml DCM稀释，再依次用稀盐酸、饱和碳酸钠水溶液和蒸馏水洗涤，分离得到的有机相用无水硫酸镁干燥过夜，有机相过滤之后将滤液旋蒸浓缩，并在20倍体积冰乙醚中沉淀，将沉淀抽滤，洗涤，真空干燥后得到PCL-b-PEG-MAL粉色粉末；
4)PCL-b-PEG-TLKIVW的合成；
将0.04mmol PCL-b-PEG-MAL与0.06mmol CGGG-(D)-TLKIVW加入25ml圆底烧瓶中，用10ml干燥的二甲基甲酰胺(DMF)DMF溶解，加入5μl三乙胺(TEA)，氩气保护下室温反应24h。反应完后将混合液加入到截留分子量5000的透析袋中，用DMF透析三次、去离子水透析三次后冷冻干燥，得到淡黄色粉末PCL-b-PEG-TLKIVW；
5)PM-TLK功能化胶束的制备：
将9mg PCL-b-PEG-TLKIVW溶于1.5ml干燥的DMF中，超声下缓慢滴入15ml水中，20分钟后将胶束溶液转移到截留分子量为5000的透析袋中，用去离子水透析三天(截留分子量为5000)，定容到18ml，得到0.5mg/ml的胶束溶液，再悬蒸浓缩定容后得到1mg/ml胶束。
实施例2：用于抑制Tau蛋白聚集并阻止Tau蛋白聚集体向神经细胞传播的功能化聚合物胶束的应用。
1)PM-TLK胶束的形貌与稳定性：
将TLK多肽溶解于DMSO(10mM)中，用纯水在超声作用下稀释至500mM(5％DMSO)。然后用10mM Tris-HCl、140mM NaCl缓冲液(TBS缓冲液，pH7.4)透析4h，去除DMSO。得到TLK原液，并将其稀释为40μM、100μM、400μM。PM-TLK在TBS缓冲液中稀释至0.4mg/ml。所有样品在37℃孵育，在不同时间点用动态光散射(DLS)对光强和粒径进行测量，用透射电镜(TEM，醋酸双氧铀负染)对孵育后的多肽和胶束形貌进行表征。
结果如图2所示。多肽TLK的光强和粒径随时间逐渐增大，形成了大的聚集体。功能化胶束PM-TLK的光强和粒径比较稳定，其形貌呈球形，平均粒径为38nm，具有较窄的粒径分布。
2)PM-TLK功能化胶束抑制Tau蛋白聚集方面的应用
将20μM Tau蛋白(K18)溶液与1mg/ml PM-TLK功能化胶束混合，加入500μM肝素(Heparin，平均分子量约15kd)溶液，使最终Tau蛋白浓度为10μM，胶束浓度为0.33mg/ml(等效(D)-TLKIVW约为20μM)，Heparin浓度为2.5uM。混合液在37℃，600rpm震荡12h使Tau蛋白聚集，按设定的时间间隔每次取20μL混合液加入到780μL的20μM硫黄素T(ThT)检测液(10mMPB,pH＝7.4)中，充分混合1min。用荧光分光光度计检测混合后的溶液在440nm激发波长下485nm处的荧光发射强度(激发狭缝宽5nm，发射狭缝宽度10nm)。该操作过程重复3次取平均值。用单纯Tau蛋白组、Tau蛋白加多肽(D)-TLKIVW(20μM)组、Tau蛋白加纯胶束(PM)组通过同样的步骤使Tau蛋白聚集，实验结果作为对照，结果如图3a。将20μM硫黄素T(ThT)检测液换成20μM的1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)检测液，在不同时间点与Tau蛋白聚集样品充分混合1min，用荧光分光光度计检测混合后的溶液在390nm激发波长下475nm处的荧光发射强度(激发狭缝宽5nm，发射狭缝宽度10nm)，结果如图3b。新鲜的Tau蛋白与最终聚集后的产物用圆二色光谱仪检测产物的二级结构，结果如图3c。聚集后的产物醋酸双氧铀负染拍摄TEM照片，结果如图3d。
如图3所示，多种表征手段证明，功能化胶束PM-TLK相比对照组蛋白聚集荧光的增加量、β折叠的生成量、纤维的形成量明显减少，表现出更高的抑制Tau蛋白聚集的效率，大约是实验浓度下多肽效果的3.5倍。
3)PM-TLK胶束阻止Tau蛋白聚集体向细胞传播方面的应用
先通过CCK-8实验检测PM-TLK功能化胶束、多肽、纯胶束的细胞毒性，配置了不同浓度的胶束溶液与多肽溶液(25、100、400μg/mL)，选用小鼠神经瘤细胞N2a进行细胞毒性实验(CCK-8)，结果如图4a。然后进行Tau蛋白聚集体播种实验，步骤如下。将Tau蛋白单独聚集形成的纤维用超声探头超声2分钟得到Tau聚集体种子。收集N2a细胞，在共聚焦培养皿中以6x104细胞密度用MEM培养基(含10％胎牛血清)培养24h，然后每孔转染0.25ug pEGFP-TauP301S质粒。使用Lipofectamine 3000进行转染，转染4h后将转染培养基换为新鲜培养基，转染12h后用与缓冲液PBS、纯胶束PM、多肽TLK和功能化胶束PM-TLK混合的Tau聚集体种子转染细胞。将细胞培养基换成每孔150uL新鲜培养基。通过[50μL Opti-MEM+2μLLipofectamine 3000]和[50μL Opti-MEM+2μg tau种子混合物]制备转染复合物，每孔总体积为100μL。将转染复合物在室温下孵育20分钟后加入细胞，将细胞与转染复合物孵育48小时，多肽TLK和功能化胶束PM-TLK最终的等效多肽浓度为4μM，纯胶束PM浓度与功能化胶束PM-TLK一致。孵育后用缓冲液PBS洗涤3次，4％多聚甲醛固定，细胞核用DAPI染色后，用共聚焦荧光显微镜观察，并计数视野中含有Tau蛋白聚集体的细胞的比例，结果如图4c。
Tau纤维播种后的细胞存活率测试，以每孔8000个细胞的密度将N2a细胞铺在96孔板中。如上所述进行质粒转染与Tau纤维播种，所有试剂用量为共聚焦培养皿中所用试剂的1/5。多肽TLK和功能化胶束PM-TLK的终浓度相等，分别为1μM、2μM、4μM，并在播种后24小时进行CCK-8试验，结果如图4b。
结果表明，功能化胶束PM-TLK相比多肽TLK表现出更低的细胞毒性，并且在Tau聚集体种子向神经细胞传播实验中，表现出更强的抑制能力，大概是实验浓度下多肽TLK的1.8倍，并且大大降低了Tau聚集体种子的毒性。
4)PM-TLK胶束促进Tau蛋白聚集体降解方面的应用。
按照之前所述的方法制备Tau蛋白纤维，浓度为10μM。将1mg/ml功能化胶束PM-TLK与Tau蛋白20μM混合，最终Tau蛋白浓度为10μM，功能化胶束PM-TLK胶束为0.5mg/ml。然后往Tau蛋白纤维与Tau蛋白-功能化胶束PM-TLK样品中加入5μg/ml的蛋白酶K，在37℃下孵育，在不同时间点取20μL混合液加入到780μL的20μM硫黄素T(ThT)检测液(10mM PB,pH＝7.4)中进行荧光检测。降解产物用透射电镜(TEM，醋酸双氧铀负染)进行观察。
结果如图5所示，单纯的Tau蛋白纤维很难被降解，PM-TLK功能化胶束与Tau蛋白混合物很容易被降解，表明PM-TLK功能化胶束促进了Tau蛋白聚集体的降解。

Claims (9)

1.一种功能化聚合物胶束PM-TLK，其特征在于：所述功能化胶束为PCL-b-PEG表面修饰多肽(D)-TLKIVW，表面多肽可以与Tau蛋白结合，主体PCL-b-PEG具有高度稳定性、生物相容性与生物可降解性。
2.一种如权利要求1所述的功能化聚合物胶束PM-TLK的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)PCL-b-PEG与PCL-b-PEG-NHBOC的合成；
聚乙二醇(PEG5k-OH)与ε-己内酯ε-CL溶解在适量重蒸甲苯中，经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，反应后得到PCL-b-PEG5k白色粉末；同理用BOC氨基聚乙二醇(HO-PEG5k-NHBOC)与ε-CL反应得到淡黄色粉末PCL-b-PEG-NHBOC；
2)PCL-b-PEG-NHBOC脱保护；
将PCL-b-PEG-NHBOC溶解在三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷(DCM)的混合溶液中，悬蒸后加入DCM洗涤浓缩，加入三乙胺(TEA)和二氯甲烷(DCM)混合溶液中，经悬蒸浓缩得到PCL-b-PEG-NH2淡黄色粉末；
3)PCL-b-PEG-MAL的合成；
将PCL-b-PEG-NH2、3-马来酰亚胺基丙酸、EDCL、HOBT、DIPEA用DCM溶解，室温反应后，经洗涤、分离、过滤、旋蒸浓缩、干燥后得到PCL-b-PEG-MAL粉色粉末；
4)PCL-b-PEG-TLKIVW的合成；
将PCL-b-PEG-MAL与CGGG-(D)-TLKIVW溶于DMF中，加入催化量TEA，经反应、透析、冷冻干燥，得到淡黄色粉末PCL-b-PEG-TLKIVW；
5)PM-TLK胶束的制备：
将PCL-b-PEG-TLKIVW溶于DMF中，超声下滴入水中，用去离子水透析三天，截留分子量为5000，得到PM-TLK胶束。
3.根据如权利要求2所述的功能化聚合物胶束PM-TLK的制备方法，其特征在于：1)PCL-b-PEG与PCL-b-PEG-NHBOC的合成步骤为：
聚乙二醇(PEG5k-OH)与ε-己内酯ε-CL以1:1的质量之比溶解在适量重蒸甲苯中，在Schlenk瓶中经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，循环三次；在110℃氩气保护条件下反应12h，通过冰乙醚沉淀和真空干燥得到PCL-b-PEG5k白色粉末；同理用BOC氨基聚乙二醇(HO-PEG5k-NHBOC)与ε-CL反应得到淡黄色粉末PCL-b-PEG-NHBOC。
4.根据如权利要求2所述的功能化聚合物胶束PM-TLK的制备方法，其特征在于：2)PCL-b-PEG-NHBOC脱保护步骤为：
将PCL-b-PEG-NHBOC溶解在适量三氟乙酸(TFA)：二氯甲烷(DCM)＝1:1混合溶液中，室温搅拌4h；悬蒸后加入DCM洗涤浓缩三次后，加入适量三乙胺(TEA)：二氯甲烷(DCM)＝1:1混合溶液中，室温搅拌4h，悬蒸浓缩，用冰乙醚沉淀和真空干燥得到PCL-b-PEG-NH2淡黄色粉末。
5.根据如权利要求2所述的功能化聚合物胶束PM-TLK的制备方法，其特征在于：3)PCL-b-PEG-MAL的合成步骤为：
将PCL-b-PEG-NH2：3-马来酰亚胺基丙酸：EDCL：HOBT：DIPEA物质的量之比1:5:5:5:10用适量干燥DCM溶解，室温反应24h后，依次用稀盐酸、饱和碳酸钠水溶液和蒸馏水洗涤，分离得到的有机相用无水硫酸镁干燥，有机相过滤之后将滤液旋蒸浓缩，并在冰乙醚中沉淀，真空干燥后得到PCL-b-PEG-MAL粉色粉末。
6.根据如权利要求2所述的功能化聚合物胶束PM-TLK的制备方法，其特征在于：4)PCL-b-PEG-TLKIVW的合成步骤为：
将PCL-b-PEG-MAL与CGGG-(D)-TLKIVW按物质的量比1:1.5溶于适量干燥的DMF中，加入催化量TEA，氩气保护下室温反应24h，经过DMF透析一天、水透析两天后冷冻干燥，得到淡黄色粉末PCL-b-PEG-TLKIVW。
7.根据如权利要求2所述的功能化聚合物胶束PM-TLK的制备方法，其特征在于：5)PM-TLK胶束的制备步骤为：
将PCL-b-PEG-TLKIVW溶于适量干燥的DMF(浓度5mg/ml)中，超声下滴入水中，20分钟后用去离子水透析三天，截留分子量为5000，得到PM-TLK胶束；胶束使用前浓缩定容。
8.一种如权利要求1所述的聚合物胶束PM-TLK作为制备阿尔兹海默症药物的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是用于抑制Tau蛋白聚集和阻止Tau蛋白聚集体向神经细胞传播。
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