CN109350598B - 糖-聚乙二醇-dspe偶联化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类糖‑聚乙二醇‑DSPE偶联化合物及其制备方法和应用。其中，所述糖‑聚乙二醇‑DSPE偶联化合物是将糖与磷脂酰乙醇胺(DSPE)‑聚乙二醇(PEG)偶联后得到。所述糖为单糖、双糖、多糖或乙酰化的上述糖，其中单糖包括甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖，双糖包括麦芽二糖，多糖包括麦芽三糖。DPSE是人工合成磷脂，具有亲脂性作用，PEG为亲水性物质，糖配体为靶向材料的靶标。本发明的化合物可用于设计靶向性载体，特别是脂质体与胶束，也可用作表面活性剂。此外，本发明还提出了所述化合物的制备方法，该制备方法的原料易得、反应条件温和易于控制，操作简单，产物易提纯，收率高。产物可以应用到生物研究中，对药物载体制备和疾病治疗有重要意义。

Description

糖-聚乙二醇-DSPE偶联化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种修饰纳米载体的靶向药物材料，特别涉及一种糖与聚乙二醇-DSPE偶联后得到糖-聚乙二醇-DSPE偶联化合物及其制备方法和应用。本发明属于医药(药物材料)技术领域。
背景技术
脂质体最初是由英国学者Bangham将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层，后来将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。1971年英国莱门等人开始将脂质体用于药物载体。从此脂质体作为一种靶向给药系统新剂型，开始引起全世界的关注。脂质体载药系统被认为是目前最有前途的靶向给药载体之一，从而得到广泛研究应用。脂质体的原料是脂类化合物，如磷脂，胆固醇等。磷脂具有双亲性，可以自发的形成磷脂双分子层的封闭囊泡，药物可包封在囊泡里面，在脂质体表面经不同材料的化合物修饰后，可以特异性的把药物输送到病变组织并且靶向性释放药物，从而提高靶向治疗效果。
葡萄糖转运体是一类镶嵌在细胞膜上转运葡萄糖的载体蛋白质，以易化扩散的方式顺浓度梯度转运葡萄糖，可被葡萄糖特异性识别并结合。葡萄糖转运体特异性转运底物有葡萄糖、半乳糖、甘露糖及其衍生物等，葡萄糖转运体与这些底物修饰的相应配体结合，形成的配体复合物发生微观簇集，随后内陷，被细胞内吞进入溶酶体，释放出药物。
磷脂类化合物其应用相对较早的是在食品加工及保健品研究等领域，随着研究的不断进步，特别是功能化磷脂的应用和制备逐渐地被人们应用到药物制剂领域，在如今最活跃的脂质体技术领域，不同糖分子修饰的聚乙二醇磷脂酰乙醇胺功能化磷脂不仅是脂质体技术的車要原料之一，而且其衍生物也正在显现出越来越大的学术价值和应用价值。
为了克服上述现有技术的缺陷拓展脂质体制备领域，本发明发明人设计并合成了几种可被葡萄糖转运体的转运介导的新型糖配体偶联化合物，并对脂质体表面进行修饰，其脂溶性的1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE)分子嵌入脂质体双分子层中，水溶性的葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、麦芽二糖、麦芽三糖部分暴露在脂质体表面，被细胞膜表面的葡萄糖转运体高效识别，从而实现了靶向性给药。
不同类型糖-PEG-DSPE偶联化合物具有很高的经济价值，主要用于制备靶向性脂质体，但是这些化合物合成过程复杂，后处理困难，目前国内外还没有成熟的合成工艺报道。本发明工艺操作简单，收率高，反应过程不使用剧毒、危险等试剂，反应监控不需要价格高昂的设备，只需要TLC点板监测即可，生产成本低，适合大规模工业化生产，操作简单，适用性强，绿色环保，适合工业化生产等优点。
发明内容
本发明的目的是为了提供一类纳米载体修饰的靶向分子，该类分子可用于设计靶向性药物纳米载体，特别是纳米脂质体与胶束。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种糖-PEG-DSPE偶联化合物，是将糖与磷脂酰乙醇胺(DSPE)-聚乙二醇(PEG)偶联后得到。
其中，优选的，所述的糖为单糖、双糖或多糖，其中所述的单糖包括甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖，所述的双糖为麦芽二糖，所述的多糖为麦芽三糖。
其中，优选的，所述的糖为乙酰化修饰的单糖、双糖或多糖，其中所述的单糖包括甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖，所述的双糖为麦芽二糖，所述的多糖为麦芽三糖。
其中，优选的，所述的糖通过连接臂I或连接臂II与PEG连接，连接臂I结构为“-CH2CH2-三氮唑-”，连接臂II结构为“-C6H4-NHCO-CH2-(CH2)m-CH2CONH-”，其中m＝0～2，优选为，m＝0、1。
其中，优选的，所述的化合物具有式I或式II所示的结构：
Figure BDA0001797481550000021
Figure BDA0001797481550000031
其中，式I结构中，X基团为糖或乙酰化修饰糖；式II结构中，Y基团为糖或乙酰化修饰糖；
其中，式I、式II结构中，n＝5～230，优选的，PEG平均分子量为200～10000，更优选的，所述PEG平均分子量为600、1000、2000或5000；
其中，在式II结构中，m＝0～2，优选为m＝0或1。
其中，优选的，式I中所示X基团具有式III，式IV，式V所示的结构：
Figure BDA0001797481550000032
其中，式III、式IV、式V中，R为H或乙酰基；
式II中所示Y基团具有式III所示的结构。
其中，优选的，式III中所示糖部分为甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖或乙酰化修饰的甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖；式IV中所示糖部分为麦芽二糖或乙酰化修饰的麦芽二糖；式V中所示糖部分为麦芽三糖或乙酰化修饰的麦芽三糖。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的糖-聚乙二醇-DSPE偶联化合物的方法，包括以下步骤：
(1)糖结构修饰合成过程；
(2)糖-聚乙二醇-DSPE连接合成过程；
其中，糖结构修饰合成过程，按照以下方法中的任一种进行：
方法一：
1)乙酰化反应
将单糖、双糖或多糖和醋酸酐在催化剂以及碱存在下，在0℃条件下进行乙酰化反应得到中间体I，即乙酰化糖，其中单糖、双糖或多糖与醋酸酐的摩尔比为1:17～20；其中，优选的，所述的催化剂为碘粒；所述的碱为吡啶；
2)成苷反应
将中间体I和3-丁炔-1-醇在酸性条件下，在有机溶剂中，于室温进行取代反应得到中间体II，即3-丁炔-1-基-乙酰化糖苷；
3)去乙酰基反应
将中间体II和甲醇钠，在甲醇溶剂中，于室温进行脱保护基得到中间体III，即3-丁炔-1-基-糖苷；
Figure BDA0001797481550000041
方法二：
1)乙酰化反应
将单糖和醋酸酐在催化剂以及碱，在0℃条件下进行乙酰化反应得到中间体I’，即乙酰化吡喃糖，其中单糖与醋酸酐的摩尔比为1:17～18；其中，优选的，所述的催化剂为碘粒；所述的碱为吡啶；
2)成苷反应
将中间体I’和对硝基苯酚在酸性催化剂存在下，在有机溶剂中，于室温进行取代反应得到中间体II’，即对硝基苯基乙酰化吡喃糖苷；其中，优选的，所述的述的酸性催化剂为三氟化硼的乙醚溶液，所述的有机溶剂为二氯甲烷；
3)硝基还原反应
将中间体II’在氢气和催化剂存在的条件下在有机溶剂中进行还原反应得到中间体III’，即对氨基苯基乙酰化吡喃糖苷；其中，优选的，所述的催化剂为钯碳，所述的有机溶剂为甲醇；
4)酸酐开环反应
将中间体III’和酸酐在碱性催化剂存在的条件下，在有机溶剂中，室温进行反应得到中间体IV’；其中，优选的，所述的碱性催化剂为三乙胺，所述的有机溶剂为二氯甲烷；
5)羧酸活化反应
将中间体IV’和N-羟基丁二酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在有机溶剂中，室温进行反应得到中间体V’；其中，优选的，所述的有机溶剂为二氯甲烷；
6)脱保护反应
将中间体V’和甲醇钠，在甲醇溶剂中，于室温进行脱保护基得到中间体VI’；
Figure BDA0001797481550000051
其中，糖-PEG-DSPE连接合成过程为步骤(2)，按照以下方法中的任一种进行：
方法一：
将DSPE-PEG-N3与步骤(1)方法一得到的修饰后的糖产物与五水硫酸铜和抗坏血酸钠，在有机溶剂中，室温反应得到式I所示的化合物；其中，所述有机溶剂为二氯甲烷，乙醚，三氯甲烷，甲苯，1,4-二氧六环，四氢呋喃以及EDCI，DCM中的至少一种，更优选为EDCI和DCM；
Figure BDA0001797481550000052
方法二：
将DSPE-PEG-NH2与步骤(1)方法二得到的不同糖产物在碱存在下，在有机溶剂中，室温反应得到式II所示的化合物；
其中，优选的，所述的碱为三乙胺，所述的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷，更优选为二氯甲烷；
Figure BDA0001797481550000061
该制备方法的原料易得、反应条件温和易于控制，操作简单，产物易提纯，收率高。产物可以应用到生物研究中，对药物载体制备和疾病治疗有重要意义。
更进一步的，本发明还提出了所述的糖-PEG-DSPE偶联化合物在制备药物载体中的应用。其中，优选的，所述的药物载体为脂质体或胶束。
附图说明
图1为糖结构修饰合成过程中方法一的反应流程图；
图2为糖结构修饰合成过程中方法二的反应流程图；
图3为糖-PEG-DSPE连接合成过程中方法一的反应流程图；
图4为糖-PEG-DSPE连接合成过程中方法二的反应流程图；
图5A为Ac4M胶束修饰ATO脂质体(以PEG1000为例)的示意图；
图5B为在Ni(OAC)2溶液中加入ATO溶液时可明显观察到绿色沉积，表明了ATO和Ni(OAC)2在Ac4MAN修饰的脂质体中的存在状态；
图6为脂质体的表征；
用Zetasizer Nano ZS 90测定Ac4M-ATO-LIP(以PEG1000为例)的平均粒径(A)和Zeta电位(B)；用透射电镜观察ATO-LIP(C)、Ac4M胶束(D)、Ac4M-ATO-LIP(E)脂质体的外观形态；
图7为在pH为7.4的PBS中，测定了脂质体在37℃下ATO和Ni(OAC)2的体外累积释放率曲线；
(A)ATO在ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP(以PEG1000为例)中的释放曲线；(B)Ni(OAC)2在Ni-LIP和Ac4M-Ni-LIP中的释放曲线；数据以平均值±标准差(n＝3)来表示；
图8为不同脂质体对胶质瘤细胞生长抑制作用的研究；
分别用MTT法和细胞成像法检测不同浓度的ATO、ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP(以PEG1000为例)加药48h(A，a)、72h(B，b)和96h(C，c)后U87细胞的存活率；ATO浓度分别为40.6、81.5、162.5、325、650和1300μM，数据为平均值±标准差(n＝3)；(标尺，300nm)；
图9为采用流式细胞术检测药物在体外的摄取情况；
其中，图6A为摄取试验：直方图峰向右侧移动，表明U87对Ac4M-ATO-LIP(以PEG1000为例)的摄取率增加；
图9B为统计分析：各制剂的荧光强度用柱形图表示；数据需经归一化处理，并用平均值±标准差(n＝3，***p<0.001，与Rho-LIP的细胞摄取进行比较)表示；
图10A为U87胶质瘤细胞与Rho标记的Ac4MAN-PEG1000-LIP孵育0～20min的过程中拍摄的活细胞图；(红色部分为被Rho标记的脂质体；绿色为被DIO染色的细胞膜；蓝色为被Hoechst 33258染色的细胞核)(标尺，30μm)；
图10B为U87胶质瘤细胞与Rho标记的Ac4MAN-PEG1000-LIP孵育0～20min的过程中延时活细胞成像实验的统计学分析；各制剂的荧光强度用归一化数值做成曲线图；数据显示为平均值±标准差(n＝3)；
图11A为U87胶质瘤细胞与Rho标记的Ac4MAN-PEG600-LIP孵育0～20min的过程中拍摄的活细胞图；(红色部分为被Rho标记的脂质体；绿色为被DIO染色的细胞膜；蓝色为被Hoechst 33258染色的细胞核)(标尺，30μm)；
图11B为U87胶质瘤细胞与Rho标记的Ac4MAN-PEG600-LIP孵育0～20min的过程中延时活细胞成像实验的统计学分析；各制剂的荧光强度用归一化数值做成曲线图；数据显示为平均值±标准差(n＝3)；
图12A为U87胶质瘤细胞与Rho标记的Ac4MAN-PEG2000-LIP孵育0～20min的过程中拍摄的活细胞图；(红色部分为被Rho标记的脂质体；绿色为被DIO染色的细胞膜；蓝色为被Hoechst 33258染色的细胞核)(标尺，30μm)；
图12B为U87胶质瘤细胞与Rho标记的Ac4MAN-PEG2000-LIP孵育0～20min的过程中延时活细胞成像实验的统计学分析；各制剂的荧光强度用归一化数值做成曲线图；数据显示为平均值±标准差(n＝3)；
图13为Ac4MAN-PEG-LIP对胶质瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤作用；
其中，图13A为注射Ac4MAN-PEG1000-LIP的脑胶质瘤冰冻切片的H.E染色；(标尺，50μm)；
图13B为注射Ac4MAN-PEG-LIP的小鼠的Kaplan Meier生存曲线；
其中，1)注射Ac4MAN-PEG1000-LIP的小鼠的Kaplan Meier生存曲线(n＝7)；2)注射Ac4MAN-PEG600-LIP的小鼠的Kaplan Meier生存曲线(n＝7)；3)注射Ac4MAN-PEG2000-LIP的小鼠的Kaplan Meier生存曲线(n＝7)；
图14A-C分别为Ac4MAN，MAN和Ac4MAN+猪肝酯酶(PLE)的HPLC-MS图像；
图14D为流式细胞术统计图；数据显示为平均值±标准差(n＝3，*p<0.05，*p<0.01，与Rho-LIP的细胞摄取比较)。
图15为活细胞工作站检测细胞对脂质体/胶束的摄取情况。
其中，甘露糖-PEG600-DSPE脂质体(A)、半乳糖-PEG1000-DSPE脂质体(B)、麦芽二糖-PEG2000-DSPE脂质体(C)、甘露糖-PEG600-DSPE胶束(D)、葡萄糖-PEG1000-DSPE胶束(E)与麦芽三糖-PEG2000-DSPE(F)，以未修饰的脂质体缓冲液为空白对照组(Ctl)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
糖-PEG-DSPE化合物合成流程图参见图1-4所示。
实施例1化合物2a或2b或2c或2d或2e的合成
Figure BDA0001797481550000091
操作过程：将葡萄糖(半乳糖、甘露糖、麦芽二糖、麦芽三糖)1g、乙酸酐5ml，吡啶7ml，碘粒10mg依次加入三口瓶中，在0℃条件下进行乙酰化反应，25℃反应过夜(刚加入时反应体系有散热现象)。第二天，加入8.4g NaHCO3水溶液(10ml H2O)于30ml EA中，搅拌2h，有气泡生成，用NaHCO3水溶液洗1次，再用2M HCl洗2次，旋干即可，得到化合物2a。结果：得无色透明油状产品4.1g收率94.7％。2b，2c，2d，2e合成条件与2a相同。
化合物2a的核磁共振解析：
H NMR(500MHz；Chloroform-d):δ6.29(d,J＝3.2Hz,1H),5.67(d,J＝7.7Hz,0.4H),5.44-5.35(dd,J＝10.2and 10.0Hz,1H),5.29-5.21(m,0.4H),5.17-5.04(m,2.8H),4.30-4.26(m,1.4H),4.12-4.01(m,2.4H),3.84-3.79(0.4H),2.19(s,4.2H),2.12(s,1.2H),2.09(s,4.2H),2.03(s,8.4H)。
实施例2化合物3a或3b或3c或3d或3e的合成
Figure BDA0001797481550000101
操作过程：将化合物2a(2g,5.1mmol)，3-丁炔-1-醇(718mg,10.2mmol)，二氯甲烷(20ml)依次加入100ml三口瓶，氮气保护，冰浴降温至4℃，滴入三氟化硼的乙醚溶液(1.25ml,10.2mmol)，室温反应过夜。第二日加入饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)淬灭反应，加入二氯甲烷(50ml)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得黄色半油半固体产品2.01g，即化合物2c，收率98.0％。3b，3c，3d，3e合成条件与3a相同。
实施例3化合物4a或4b或4c或4d或4e的合成
Figure BDA0001797481550000111
操作过程：将化合物3a(2.01g，5mmol)，甲醇(20ml)依次加入100ml三口瓶，氮气保护，然后加入甲醇钠(1.35g，25mmol)，室温搅拌过夜。第二日加入冰乙酸(1.8ml，30mmol)搅拌10分钟，旋干，加入去离子水(5ml)溶解，用离子交换树脂纯化，旋干得类白色半油半固产品1.1g，即化合物4a，收率94.3％。4b，4c，4d，4e合成条件与4a相同。
化合物4a核磁解析：1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ4.30(d,J＝7.8Hz,1H),3.99-3.92(m,1H),3.86(dd,J＝11.9,1.7Hz,1H),3.72–3.63(m,2H),3.35–3.24(m,3H),3.17(dd,J＝9.1,7.8Hz,1H),2.54-2.48(m,2H),2.27(t,J＝2.7Hz,1H)。
化合物4b核磁解析：1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ4.25(d,J＝7.5Hz,1H),3.95(m,1H),3.86–3.80(m,1H),3.80–3.65(m,3H),3.57–3.42(m,3H),2.51(m,2H),2.26(t,J＝2.7Hz,1H)。
化合物4c核磁解析：1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ4.81-4.78(m,1H),3.86–3.76(m,3H),3.74–3.66(m,2H),3.64–3.53(m,3H),3.31(p,J＝1.6Hz,1H),2.44-2.41(m,2H),2.25(t,J＝2.7Hz,1H)。
化合物4d核磁解析：1H NMR(500MHz,Deuterium Oxide)δ5.37-5.26(m,1H),4.46-4.38(m,1H),4.15–3.43(m,12H),3.42–3.12(m,2H),2.51–2.41(m,2H),1.83-1.79(m,1H)。
化合物4e核磁解析：1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ5.15(dd,J＝7.8,3.8Hz,2H),4.32(d,J＝7.7Hz,1H),3.95(m,1H),3.90–3.73(m,7H),3.73–3.58(m,5H),3.56–3.47(m,3H),3.44(dd,J＝9.7,3.8Hz,1H),3.38(m,1H),3.29–3.20(m,2H),2.51(m,2H),2.26(t,J＝2.7Hz,1H)。
实施例4化合物2a’或2b’或2c’或2d’的合成
Figure BDA0001797481550000121
操作过程：将葡萄糖(甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖)1g、乙酸酐5ml，吡啶7ml，碘粒10mg依次加入三口瓶中，在0℃条件下进行乙酰化反应，25℃反应过夜(刚加入时反应体系有散热现象)。第二天，加入8.4g NaHCO3水溶液(10mlH2O)于30ml EA中，搅拌2h，有气泡生成，用NaHCO3水溶液洗1次，再用2M HCl洗2次，旋干即可，得到化合物2a’。结果：得无色透明油状产品4.1g收率94.7％。2b’，2c’，2d’合成条件与2a’相同。
实施例5化合物3a’或3b’或3c’或3d’的合成
Figure BDA0001797481550000122
操作过程：在装有二氯甲烷30ml的反应瓶中，加入化合物2a’(11.28g，28.9mmol)，氩气条件下室温搅拌，再加入对硝基苯酚(12.1g，86.7mmol)和4A分子筛搅拌，1小时后，缓慢加入三氟化硼的乙醚溶液(14ml)，用TLC跟踪反应进程，反应过夜。向反应混合物中加入二氯甲烷(20ml)和水(20ml)搅拌20min，抽滤除去固体，用氢氧化钠水溶液(1mol)萃取(20ml×3)，水萃取(20ml×3)，重结晶得白色晶体10g，即化合物3a’，产率69％。3b’、3c’、3d’的合成条件与3a’相同。
化合物3a’的核磁共振解析：
1H NMR化学位移(500MHz,Chloroform-d)δ8.23(d,J＝8.8Hz,2H),7.33–7.13(m,2H),5.63(s,1H),5.54(dd,J＝10.1,3.5Hz,1H),5.50–5.41(m,1H),5.38(t,J＝10.2Hz,1H),4.27(dd,J＝12.4,5.6Hz,1H),4.15–3.92(m,2H),2.34–1.85(m,12H).
实施例6 4a’或4b’或4c’或4d’的合成
Figure BDA0001797481550000131
操作过程：在装有甲醇10ml的反应瓶中，加入化合物3a’(5.0g，10.02mmol)，再加入Pb/C(0.04g，5％)，氢气条件下室温搅拌，用TLC跟踪反应进程，3-5小时停止反应。悬干得油状物3.5g，即化合物4a’，产率74％。4b’、4c’、4d’的合成条件与4a’相同。
实施例7化合物5a或5b或5c或5d的合成
Figure BDA0001797481550000132
操作过程：在装有二氯甲烷150ml的反应瓶中，分别加入化合物4a’(3.5g，10.02mmol)、戊二酸酐(2.19g，17mmol)和三乙胺(2.7ml，17mmol)，在室温下搅拌，用TLC跟踪反应进程，反应过夜。悬干用硅胶柱层析提纯，流动相二氯甲烷：甲醇(20:1)，得黄色油状物4.6g，即化合物5a，产率82％。5b、5c、5d的合成条件与5a相同，化合物5a的核磁共振数据如下。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.44(d,J＝8.5Hz,2H),7.04(d,J＝8.5Hz,2H),5.54(dd,J＝10.1,3.4Hz,1H),5.52–5.38(m,2H),5.36(t,J＝10.2Hz,1H),4.27(dd,J＝12.4,5.5Hz,1H),4.15–3.99(m,2H),2.47(dt,J＝21.4,7.2Hz,4H),2.23–1.81(m,14H).
实施例8化合物6a或6b或6c或6d的合成
Figure BDA0001797481550000141
操作过程：在装有二氯甲烷50mL的反应瓶中，加入化合物5a(2g,2.76mmol)，搅拌溶解，再分别加入N-羟基丁二酸亚胺(0.65g,5.25mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1g,5.25mmol)，在室温下搅拌，用TLC跟踪反应进程，反应过夜。饱和氯化钠萃取(20mL×2)，悬干用硅胶柱层析提纯，流动相二氯甲烷：甲醇(20:1)，得黄色油状物2.2g，即化合物6a，产率96％。6b、6c、6d合成条件与6a相同，化合物6a的核磁共振数据如下：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.93(s,1H),7.47(d,J＝8.9Hz,2H),7.03(d,J＝8.9Hz,2H),5.55(dd,J＝10.0,3.5Hz,1H),5.47(s,1H),5.43(dd,J＝3.1,1.5Hz,1H),5.36(t,J＝10.0Hz,1H),4.28(dd,J＝12.3,5.3Hz,1H),4.13–4.03(m,2H),2.87–2.80(m,4H),2.72(q,J＝7.1,6.4Hz,2H),2.47(q,J＝7.3Hz,2H),2.21(d,J＝6.8Hz,3H),2.13–1.98(m,11H).
实施例9化合物7a或7b或7c或7d的合成
Figure BDA0001797481550000142
操作过程：将化合物6a(2.2g，5mmol)，甲醇(20ml)依次加入100ml三口瓶，氮气保护，然后加入甲醇钠(1.43g，25mmol)，室温搅拌过夜。第二日加入冰乙酸(1.9ml，30mmol)搅拌10分钟，旋干，加入去离子水(6ml)溶解，用离子交换树脂纯化，旋干得类白色半油半固产品1.1g，即化合物7a，收率94.3％。7b，7c，7d的合成条件与7a相同。
实施例10化合物9a、9b、9c、9d、9e的合成
Figure BDA0001797481550000151
操作过程：将化合物8(250mg，0.18mmol)溶于叔丁醇(4ml)，加入到50ml单口瓶，然后加入化合物4a(166mg，0.72mmol)的水(2ml)溶液，0.3mol/L的五水硫酸铜(180μl，0.05mmol)，抗坏血酸钠(36mg，0.02mmol)，50℃反应过夜。旋干，加入二氯甲烷(10ml)冰箱冷藏5h，过滤，滤液用葡聚糖凝胶色谱纯化，冷冻干燥得白色固体140mg，即为化合物9a，收率为48.1％。9b，9c，9d，9e的合成条件与9a相同。
葡萄糖-PEG600-DSPE的核磁解析：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.00-7.55(m,1H),6.02(s,1H),5.18(s,1H),4.50(s,2H),4.45–4.03(m,3H),4.25-3.10(m,66H),3.00(s,4H),2.34-2.18(m,4H),1.62-1.46(m,4H),1.32-1.14(m,47H),0.89-0.79(m,5H)。
甘露糖-PEG600-DSPE的核磁解析：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.81–7.45(m,1H),5.99(s,2H),5.20(s,2H),4.83(s,1H),4.51(s,2H),4.35-2.75(m,68H),2.35-2.20(m,4H),1.65-1.45(m,4H),1.33-1.15(m,54H),0.90-0.80(m,5H)。
半乳糖-PEG600-DSPE的核磁解析：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.16–7.59(m,1H),6.01(s,1H),5.26(s,1H),4.78-2.85(m,77H),2.40–2.18(m,3H),1.68-1.50(m,4H),1.35-1.10(m,56H),0.91-0.83(m,6H)。
麦芽二糖-PEG600-DSPE的核磁解析：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.73(s,1H),5.99(s,3H),5.18(s,1H),4.61–4.24(m,3H),4.22-2.83(m,66H),2.35-2.15(m,4H),1.63-1.45(m,5H),1.35-1.10(m,53H),0.90-0.80(m,6H)。
麦芽三糖-PEG600-DSPE的核磁解析：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.92–7.59(m,1H),5.91(s,3H),5.21(s,1H),4.76–4.11(m,2H),4.02-3.28(m,95H),2.42–2.14(m,3H),1.65-1.46(m,3H),1.35-1.15(m,48H),0.91-0.83(m,5H)。
实施例11化合物11a或11b或11c或11d的合成
Figure BDA0001797481550000161
操作过程：将化合物10(250mg，0.13mmol)溶于三氯甲烷(8ml)，加入到25ml单口瓶，然后加入6a(166mg，0.72mmol)，TEA(70μl，0.50mmol)，室温反应过夜。旋干，加入二氯甲烷(10ml)冰箱冷藏5h，过滤，滤液用葡聚糖凝胶色谱纯化，冷冻干燥得白色固体156mg，即为化合物11a，收率为52.4％。11b，11c，11d的合成条件与11a相同，化合物11a的核磁共振数据如下：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.57(s,2H),7.02(d,J＝9.9Hz,2H),5.54(dd,J＝9.8,3.4Hz,1H),5.45(s,1H),5.45–5.41(m,1H),5.36(t,J＝10.0Hz,1H),5.21(s,1H),4.36(d,J＝9.5Hz,1H),4.29(dd,J＝12.2,5.2Hz,1H),4.20–3.87(m,7H),3.65(q,J＝7.7,6.0Hz,79H),3.53–3.34(m,4H),2.54–2.21(m,12H),2.19(s,3H),2.11–1.91(m,11H),1.58(s,4H),1.25(s,48H),0.88(t,J＝6.9Hz,6H).
实施例12化合物12a或12b或12c或12d的合成
Figure BDA0001797481550000171
操作过程：将化合物10(250mg，0.13mmol)溶于三氯甲烷(8ml)，加入到25ml单口瓶，然后加入7a(142mg，0.72mmol)，TEA(70μl，0.50mmol)，室温反应过夜。旋干，加入二氯甲烷(10ml)冰箱冷藏5h，过滤，滤液用葡聚糖凝胶色谱纯化，冷冻干燥得白色固体140mg，即化合物12a，收率为51.6％。12b，12c，12d的合成条件与12a相同，化合物12a的核磁共振数据如下：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.51(m,2H),7.00(m,2H),5.54(m,1H),5.45-5.31(m,2H),5.36(m,1H),5.21(s,1H),4.36(d,J＝9.5Hz,1H),4.29(dd,J＝12.2,5.2Hz,1H),4.20–3.87(m,7H),3.65(q,J＝7.7,6.0Hz,79H),3.53–3.34(m,4H),2.11–1.91(m,11H),1.58(s,4H),1.25(s,48H),0.88(t,J＝6.9Hz,6H).
实施例13载药(ATO)脑靶向脂质体的制备与表征
(1)ATO-LIP的制备
采用薄膜水化法制备空白脂质体：将二棕榈酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰甘油，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000按摩尔比49.4：3.2：43.3：4.1称取，溶于乙醇中，通过旋转蒸发蒸干，可在圆底烧瓶中获得脂质膜。干燥的脂质膜用醋酸镍(Ni(OAC)2)溶液(600mm，pH＝6.8)经超声水化，之后用探针超声(200W)超声5min进一步分散，再通过220nm的聚碳酸酯膜(220nm)挤出3次。挤压过的脂质体过SephadexG-50柱，除去脂质体双分子层外的Ni(OAC)2溶液，将缓冲液1(300mM NaCl+200mM HEPEs，pH 6.8)加入到脂质体胶体溶液中，在脂质体内、外水相之间形成一个梯度，即形成Ni(OAC)2脂质体(Ni-LIP)。然后，在2mL Ni-LIP(8.73mg脂质/mL)中加入1mL ATO溶液(33.4mM)，调pH为7.2，在震荡摇床(50℃，110rpm)中孵育10～15h，之后，脂质体悬液过SephadexG-50柱，用缓冲液2(300mM NaCl+200mM HEPEs，pH4)除去过量的H3AsO3。最后将脂质体pH值调回7.2，从而得到了ATO-LIP。
图5A是脂质体制备的示意图。将Ni(OAC)2包封于脂质体内部，然后将ATO主动载入脂质体中，再与Ni(OAC)2进行络合。最后将Ac4M胶束插入到脂质体表面。图5B表明，在室温下，Ni(OAC)2溶液与ATO溶液可形成绿色沉淀，显示出ATO和Ni(OAC)2在脂质体中的存在状态。当它们结合在一起时，ATO从囊泡中的快速释放得到了改善。
(2)Ac4MAN-PEG 1000-DSPE修饰ATO-LIP
用合成的乙酰化甘露糖-PEG1000-DSPE对ATO-LIP进行修饰。首先制备Ac4MAN-PEG1000-DSPE胶束，其中含有Ac4MAN-PEG1000-DSPE和DSPE-PEG2000，摩尔比为8.32：3.75。1ml ATO-LIP(5.82mg脂/mL)与0.5mlAc4MAN-PEG1000-DSPE胶束(8mg脂质/mL)在室温下孵育2h，可获得Ac4MAN-ATO-LIP(PEG1000)。Ac4MAN-ATO-LIP(PEG600)和Ac4MAN-ATO-LIP(PEG2000)按照相同摩尔比加入，制备方法相同。
(3)脂质体的形态、大小和Zeta电位
用Malvem Zetasizer Nano ZS 90仪器测定脂质体Ac4M-ATO-LIP的Zeta电位和粒径大小的分布情况。用透射电镜(TEM，H7650，日本，日立)观察Ac4M-ATO-LIP的形态和大小。将脂质体悬液滴在覆盖支撑膜的铜网格上，几分钟后，用滤纸在铜网格上吸收多余的液体，将0.5～3％磷钨酸溶液作为负染液覆盖在铜网格表面，持续1～2分钟，然后除去染液，于室温下干燥，即得到透射电镜待测样品。
图6A和6B分别为Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)的粒径和Zeta电位图。图6C-E分别为ATO-LIP、Ac4M胶束和Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)的TEM图。如表1所示，Ac4MAN-ATO-LIP的平均粒径约为160nm，多分散指数约为0.161，且所有的脂质体均为电中性，带有较少的负电荷。Ac4MAN-ATO-LIP(PEG1000)的粒径略大于ATO-LIP。从TEM的结果中可看出，Ac4MAN-ATO-LIP表面为光滑的圆形结构，并附着一些较小的球体，这些均匀一致的小球为Ac4MAN-PEG1000-DSPE胶束。
表1.脂质体的平均粒径、多分散性指数(PDI)和Zeta电位的表征。数据用平均值±标准差(n＝3)表示。
Figure BDA0001797481550000191
(4)包封率与药物的体外释放
采用原子吸收分光光度法(AAS)分析ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)的药物含量。采用透析法测定ATO或Ni(OAC)2的体外释放率。透析袋两端用线系紧，将1mL ATO-LIP或Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)置于透析袋(Cutoff8000～14400Da)中。然后将透析袋放入含300mL PBS的500mL离心管中，使离心管在37℃，100rpm的摇床中不断振摇。在特定的时间点(0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h和96h)采集样品，每次收集后加入相同体积的PBS。
用以下公式计算包封率(％)：包封率(％)＝(过G-50柱后的药物浓度/过G-50柱前的药物浓度)×100％。计算释放率(％)的公式为：释放率(％)＝(Mn/M)×100％。Mn是ATO或Ni(OAC)2在某个时间点的累积释放量。M是脂质体中载入的ATO或Ni(OAC)2的总量。
结果：ATO在ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)中的包封率分别为22.48％±3.95和25.85％±2.64。由于经过修饰和未经过修饰的脂质体之间的包封率无明显差异，可知修饰配体DSPE-PEG 1000-Ac4MAN胶束不影响脂质体的包封性能。图7A和7B显示的是ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)中ATO和Ni(OAc)2的体外释放率。运用透析法后，ATO和Ni(OAc)2的释放率用元素分析仪进行检测。实验结果显示，在开始的2小时，ATO和Ni(OAc)2在透析液中的释放率分别小于28.18％±6.23和27.76％±2.56。48个小时后，ATO和Ni(OAc)2的释放率分别约为84.82％±2.78和47.44％±3.51。ATO和Ni(OAc)2在ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)中的体外释放率是相似的。
实施例14体外疗效研究实验
(1)细胞培养
人胶质瘤细胞U87来源于中国科学院细胞库(上海)。在含1％青霉素-链霉素和20％胎牛血清的DMEM中培养U87胶质瘤细胞。该细胞在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
(2)细胞毒性对脑胶质瘤细胞的影响
采用细胞成像实验和MTT法检测脂质体的细胞毒性作用。在96孔培养板中，以2.0×104个/孔的密度接种U87细胞，培养过夜，然后分别用不同浓度的空白脂质体、游离ATO、ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)孵育细胞，分别孵育48h、72h和96h。ATO浓度分别为40.6、81.5、162.5、325、325、650和1300μM。之后，将含药物的原培养基换为100μL新培养基和10μL MTT(5mg/mL)，在37℃下继续孵育4h后，除去MTT，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)。我们用酶联免疫测定仪(Tecan，奥地利)测量了490nm处的光密度(OD)值。
将U87细胞接种，培养过夜，然后用各种不同脂质体孵育，孵育48h、72h或96h后将原培养液换为新培养液，然后用Hoechst 33258(0.2mg/mL)进行染色，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，立即开始细胞成像实验。我们使用Cytation 5进行图像拍摄并对数据进行分析。
图8显示的是脂质体对U87胶质瘤细胞的细胞毒作用。为探讨ATO对U87胶质瘤细胞的生长是否具有有效的抑制作用，我们对U87胶质瘤细胞给予不同浓度的游离ATO、ATO-LIP或Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)，并用MTT法和细胞成像法进行观察。我们观察到不同脂质体对U87胶质瘤细胞的生长均有明显的抑制作用，并以剂量依赖性的方式诱导细胞死亡。随着时间的延长，细胞毒性增强。各制剂对U87细胞的抑制强度顺序为：游离ATO>Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)>ATO-LIP。与脂质体相比，游离ATO对细胞的生长抑制作用最强，其原因是小分子与细胞直接接触，细胞摄取速度快，并且这是一种具有杀伤性的自然物质。Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)对U87细胞的抑制作用强于ATO-LIP，说明存在于脂质体表面的Ac4M胶束，增强了ATO-LIP对U87细胞生长的抑制作用。
(3)U87胶质瘤细胞摄取
1)流式细胞术
用流式细胞术检测不同脂质体的细胞摄取情况。我们将U87胶质瘤细胞接种到六孔板中，并使细胞培养过夜，然后用DMEM/低糖替代DMEM/高糖，继续培养12小时，之后分别加游离Rho、Rho-LIP和Ac4M-Rho-LIP(PEG1000)在37℃、5％CO2下孵育细胞(脂质体用Rho标记)。空白对照组为DMEM/低糖培养基。孵育4小时后，对细胞进行胰酶消化，离心，再用PBS重悬，收集细胞，进行检测。流式细胞仪检测细胞内Rho的荧光强度。Rho的发射波长为560nm，用FL2-A滤光片检测荧光强度，并利用FlowJo 7.6软件对数据进行分析。
图9A和9B显示脂质体在U87胶质瘤细胞中的定量分析，揭示了肿瘤细胞对囊泡的摄取速度。应用流式细胞术检测U87细胞中的荧光信号，监测细胞对游离Rho、Rho-LIP和Ac4M-Rho-LIP(PEG1000)的摄取情况。实验结果表明，游离Rho的平均荧光强度为6162，Rho-LIP的平均荧光强度为7125，Ac4M-Rho的平均荧光强度为10827。实验数据显示，在体外，U87细胞对Ac4M-Rho-LIP的摄取比对Rho-LIP更显著(P<0.05)。根据细胞摄取结果，由于DSPE-PEG-1000-Ac4MAN的存在，DSPE-PEG-1000-Ac4MAN胶束修饰的脂质体具有脑靶向性和胶质瘤靶向性。
2)活细胞成像
使用DeltaVision显微镜系统观察脂质体随时间推移的细胞摄取能力和摄取率。我们将U87胶质瘤细胞接种于玻璃底小皿中，细胞在37℃，5％CO2条件下培养过夜。细胞的细胞核和膜分别用Hoechst33258(0.2mg/mL)和DIO(0.2mg/mL)染色，然后用PBS洗三次，加1mL新培养液，将Rho-LIP或Ac4M-Rho-LIP(分别为PEG1000、PEG600和PEG2000做linker)加入到小皿中，然后开始拍摄，并每隔5分钟采集一次图像直到20分钟。最后使用DeltaVisionSoftwx软件分析结果。
图10-12为延时活细胞成像图，显示不同制剂被U87胶质瘤细胞内化的过程。图片显示的是Rho-LIP和Ac4M-Rho-LIP(分别为PEG1000、PEG600和PEG2000做linker)在0～20min被细胞摄取的过程。在与Rho-LIP或Ac4M-Rho-LIP作用的20min中，U87细胞中出现了红色荧光信号。图像显示，两种制剂均能被U87细胞摄取。而与Rho-LIP孵育的U87细胞中，发现的荧光信号较弱，与此同时，Ac4M-Rho-LIP在各时间点的荧光信号比Rho-LIP强。图像和数据分析表明，Rho-LIP进入胶质瘤细胞的速度比Ac4M-Rho-LIP慢。Ac4M-Rho-LIP的荧光信号在细胞质和细胞核中都有显示，说明囊泡在各个细胞器中的分布无明显差异。
实施例15体内抗肿瘤作用
(1)胶质瘤荷瘤小鼠模型的构建
5～6周龄雄性Balb/c裸鼠(18～20g)来源于北京生命河实验动物技术有限公司(中国，北京)。用5％水合氯醛(15mL/20g)麻醉，固定在立体定向仪上，先在头皮上切一个开口，在头盖骨上找到前囟，在前囟的前方0.5mm，侧方2mm处钻一个孔，以0.75μL/min的速度，将U87细胞(2×106细胞/15μL PBS)缓慢注入脑内，深度为2.5mm。切口用组织胶封闭，手术完成，之后每天给模型鼠称重。
(2)脑胶质瘤荷瘤小鼠的治疗
手术完3周后，将小鼠分为四组，每2天通过尾静脉给药一次，分别给予生理盐水、游离ATO、ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP，给药剂量为每克体重给予2μgATO。每天观察和记录小鼠的身体状况和体重。
(3)存活时间
每组有7只小鼠用于监测存活时间，在给药后第1天开始计算到小鼠死亡当天，并绘制各组的KaplaneMeier生存曲线。
KaplaneMeier生存曲线(图13B)显示，给予生理盐水、游离ATO、ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)的胶质瘤模型鼠的平均存活时间为23、25、30和32天。Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)组小鼠的存活时间明显长于生理盐水组、游离ATO组和ATO-LIP组。这证明了Ac4MAN PEG-1000-DSPE修饰的ATO-LIP对治疗胶质瘤具有巨大的潜力。而Ac4MAN-ATO-LIP(PEG600)和Ac4MAN-ATO-LIP(PEG2000)生存时间分别为33天和35天。
(4)H.E.染色
监测不同制剂对荷瘤小鼠的疗效，在小鼠死亡前，用4％多聚甲醛溶液进行心脏灌注10分钟，之后，取出脑用来制备冷冻切片(每片切片5μm)。切片用苏木精和伊红进行染色，然后在荧光显微镜下观察。
以荷瘤裸鼠为模型，研究了不同ATO制剂的抗肿瘤作用。从H.E.染色结果(图13A)中可直接观察到肿瘤组织切片与正常脑组织切片有所不同，在给予模型鼠ATO-LIP和Ac4M-ATO-LIP治疗后，荷瘤鼠脑中的肿瘤细胞减少。ATO-LIP杀死的胶质瘤细胞高于游离ATO，而Ac4M-ATO-LIP(PEG1000)与ATO-LIP相比可使更多的胶质瘤细胞死亡。这些结果表明，脂质体在胶质瘤部位的累积多于小分子，是由于高通透性和滞留效应(EPR)所致。此外，Ac4M胶束还能促进更多的脂质体在胶质瘤部位积累。
实施例16“类前药”脂质体的逻辑关系研究
(1)对羧基苯基乙酰甘露糖胺的脱乙酰化
运用液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)测定p-对羧基苯基-α-D-乙酰甘露糖胺(Ac4MAN)的脱乙酰化反应。0.1mL的甲醇溶解的Ac4MAN(4mg/mL)，加入到1.9mL的双蒸水溶解的猪肝酯酶(PLE)(3mg/mL)中，37℃下在磁力搅拌器上孵育15h。用HPLC-MS对Ac4MAN、Ac4MAN+PLE和对氨基苯基-α-D-甘露糖苷(MAN)进行分析。
图14A-C分别是Ac4MAN、Ac4MAN+PLE和MAN的HPLC-MS图像。在图14A中，我们可以看到在2.49min处，相对分子质量为440.18的峰为Ac4MAN。在图14A、B中，MAN的峰在0.72min时出现，分子量为272.11。图14C为Ac4MAN+PLE的峰，出峰时间为0.84min，分子量为272.11，与MAN的分子量相同。HPLC-MS实验结果表明，Ac4MAN可以被脱乙酰并暴露靶分子MAN，它可以引导纳米粒穿越BBB靶向到脑肿瘤部位。
(2)与PLE孵育后的类前药脂质体被U87细胞的摄取情况
用流式细胞术检测类前药脂质体的U87摄取情况。U87细胞的培养和接种的操作过程与实施例23相同。细胞分别给予Rho-LIP、Ac4M-Rho-LIP(PEG1000)和Ac4M-Rho-LIP(PEG1000)+PLE，孵育4h后将细胞用胰酶消化、离心、再用PBS重悬，用流式细胞仪检测细胞内Rho的荧光强度。
图14D表示脂质体被U87细胞摄取。结果表明，Rho-LIP的平均荧光强度为11007，Ac4M-Rho-LIP(PEG1000)的平均荧光强度为15995，Ac4M-Rho-LIP(PEG1000)的平均荧光强度为18967。与Rho-LIP相比，U87胶质瘤细胞对Ac4M-Rho-LIP(PEG1000)+PLE的摄取最为明显(P<0.05)。从细胞摄取的结果中可以看出，在Ac4M-Rho-LIP(PEG1000)中加入一些PLE，可能由于Ac4MAN的去乙酰化而增强了脂质体的脑靶向性和对胶质瘤的靶向性。
实施例17糖修饰脂质体以及胶束的构建
1、糖修饰脂质体的构建
称取适量糖-PEG-DSPE偶联化合物、蛋黄卵磷脂、胆固醇分别溶于三氯甲烷。均配制成1mg/ml溶液。取适量蛋黄卵磷脂、胆固醇与糖-PEG-DSPE偶联化合物溶液(摩尔比：9.0:3:1)移入旋瓶，适量加入DiO染料，超声数秒均匀混合。安装旋瓶，调试水浴锅温度为37℃，两次旋转成膜后取下旋瓶，加入1ml生理盐水溶液。超声水化至薄膜全部溶解。移入摇箱，孵育1-2小时。取出后过220nm滤膜三次，挤出机1次，于4℃条件下保存，制备得到的糖修饰脂质体如表2所示。
2、糖修饰胶束的构建
称取适量糖-PEG-DSPE偶联化合物及对应链长DSPE-PEG，分别溶于三氯甲烷，配制成1mg/ml溶液。取适量DSPE-PEG和糖-PEG-DSPE偶联化合物(摩尔比2:0.2)移入旋瓶，适量加入DiO染料，超声至溶液均匀混合。调试水浴锅温度，安装旋瓶，旋转成膜后取下旋瓶，加入1ml生理盐水摇匀，超声水化2分钟，取出移入EP管，探头超声20次，过100nm滤膜三次，于4℃条件保存，制备得到的糖修饰胶束如表2所示。
3、脂质体与胶束的表征
取1ml制备的脂质体，1:100磷酸盐缓冲溶液稀释，加入微量池中，上机检测，检测温度25摄氏度，激光动态分析仪分别检测脂质体粒度分布与Zeta电位。结果如表2所示：
表2
Figure BDA0001797481550000241
Figure BDA0001797481550000251
4、活细胞工作站检测细胞摄取情况
将细胞接种于活细胞工作站专用小皿中，培养48小时，更换新的培养液，细胞拍摄前一天，吸弃培养液，用PBS洗3次，清洗时不要直接吹打到皿的底部，应加到壁上，使其沿着壁流到皿中，清洗完毕，加入培养液，置于镜下，固定好。采取气体培养装置维持细胞培养环境，找到所要拍摄的细胞，调整清晰，设置好t轴和z轴，然后加入DiO标记的脂质体或胶束，具体分别为甘露糖-PEG600-DSPE脂质体(A)、半乳糖-PEG1000-DSPE脂质体(B)、麦芽二糖-PEG2000-DSPE脂质体(C)、甘露糖-PEG600-DSPE胶束(D)、葡萄糖-PEG1000-DSPE胶束(E)与麦芽三糖-PEG2000-DSPE(F)(表2)，以未修饰的脂质体缓冲液为空白对照组(Ctl)，观察4h后细胞对药物的摄取情况。
结果如图15所示，从该结果可以看出糖-PEG-DSPE修饰的脂质体以及胶束相较于未修饰的脂质体具有更强的运载药物的作用。

Claims (11)

1.一种糖-PEG-DSPE偶联化合物，其特征在于，所述的糖-PEG-DSPE偶联化合物是将糖与磷脂酰乙醇胺(DSPE)-聚乙二醇(PEG)偶联后得到；
所述的化合物具有式I所示的结构：
Figure FDA0003009970940000011
其中，式I结构中，X基团为糖或乙酰化修饰糖；
其中，所述的糖为双糖或多糖，其中，所述的乙酰化修饰糖为乙酰化修饰的单糖、双糖或多糖；
其中，式I结构中，n＝5～230。
2.如权利要求1所述的糖-PEG-DSPE偶联化合物，其特征在于，所述的双糖为麦芽二糖，所述的多糖为麦芽三糖。
3.如权利要求1所述的糖-PEG-DSPE偶联化合物，其特征在于，所述的乙酰化修饰糖为乙酰化修饰的单糖、双糖或多糖，其中所述的单糖包括甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖，所述的双糖为麦芽二糖，所述的多糖为麦芽三糖。
4.如权利要求1所述的糖-PEG-DSPE偶联化合物，其特征在于，式I中所示X基团具有式III，式IV，式V所示的结构：
X：
Figure FDA0003009970940000012
其中，式III中，R为乙酰基，式IV、式V中，R为H或乙酰基。
5.如权利要求4所述的糖-PEG-DSPE偶联化合物，其特征在于，式III中所示糖部分为乙酰化修饰的甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖；式IV中所示糖部分为麦芽二糖或乙酰化修饰的麦芽二糖；式V中所示糖部分为麦芽三糖或乙酰化修饰的麦芽三糖。
6.如权利要求1所述的糖-PEG-DSPE偶联化合物，其特征在于，PEG平均分子量为200～10000。
7.如权利要求1所述的糖-PEG-DSPE偶联化合物，其特征在于，所述PEG平均分子量为600、1000、2000或5000。
8.一种制备权利要求1-7任一项所述的糖-聚乙二醇-DSPE偶联化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)糖结构修饰合成过程；
(2)糖-聚乙二醇-DSPE连接合成过程；
其中，糖结构修饰合成过程，按照以下方法进行：
方法一：
1)乙酰化反应
将单糖、双糖或多糖和醋酸酐在催化剂以及碱存在下，在0℃条件下进行乙酰化反应得到中间体I，即乙酰化糖，其中单糖、双糖或多糖与醋酸酐的摩尔比为1:17～20；其中，所述的催化剂为碘粒；所述的碱为吡啶；
2)成苷反应
将中间体I和3-丁炔-1-醇在酸性条件下，在有机溶剂中，于室温进行取代反应得到中间体II，即3-丁炔-1-基-乙酰化糖苷；
3)去乙酰基反应
将中间体II和甲醇钠，在甲醇溶剂中，于室温进行脱保护基得到中间体III，即3-丁炔-1-基-糖苷；
Figure FDA0003009970940000021
其中，糖-PEG-DSPE连接合成过程为步骤(2)，按照以下方法进行：
将DSPE-PEG-N3与步骤(1)方法一得到的修饰后的糖产物与五水硫酸铜和抗坏血酸钠，在有机溶剂中，室温反应得到式I所示的化合物；其中，所述有机溶剂为二氯甲烷，乙醚，三氯甲烷，甲苯，1,4-二氧六环，四氢呋喃以及EDCI，DCM中的至少一种；
Figure FDA0003009970940000031
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，其中，将DSPE-PEG-N3与步骤(1)方法一得到的修饰后的糖产物与五水硫酸铜和抗坏血酸钠，在有机溶剂中，室温反应得到式I所示的化合物，其中所述有机溶剂为EDCI和DCM。
10.权利要求1-7任一项所述的糖-聚乙二醇-DSPE在制备药物载体中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的药物载体为脂质体或胶束。
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