CN112494458A - 类甘油三酯前药静注自组装纳米粒的构建 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，包括脂酶还原环境程序化触发的类甘油三酯前药的合成，以及前药静注自组装纳米粒的构建，以及其在药物传递中的应用。本发明所述的二硫键桥连的类甘油三酯前药，选择多西他赛为模型药物，通过二硫代二乙酸连接到类甘油三酯结构骨架上，1，3位的脂肪酸为(a)硬脂酸，(b)油酸，(c)亚油酸。本发明设计合成了二硫键桥连的类甘油三酯前药，合成方法简单易行；同时制备了均匀的小分子前药自组装纳米粒，制备方法简单易行，稳定性好，实现了多西他赛的高效包载；所述的类甘油三酯前药的小分子前药自组装纳米粒可以应用于注射给药，克服了现有技术中多西他赛注射液存在的问题，从而提高了疗效。

Description

类甘油三酯前药静注自组装纳米粒的构建

技术领域

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，包括脂酶还原环境程序化触发的类甘油三酯前药的合成，以及前药静注自组装纳米粒的构建，以及其在药物传递中的应用。

背景技术

癌症严重威胁着人类的生命安全，全世界患癌人数逐年增加，死亡率居高不下。化疗仍是癌症临床治疗的主要方式，尤其是不易手术切除和易扩散的肿瘤。但是大部分的化疗药物属于BCSⅣ类药物，具有溶解性低，渗透性差的特性，并且化疗药物还有体内稳定性差，毒性大，治疗窗窄等缺点。目前临床上广泛使用的化疗药物递送手段依然是静脉注射，这种途径能够使药物高效地进入血液系统，吸收不被生理屏障所抑制，然而，市场上的传统静注化疗制剂多为药物的溶液剂，选择性低，靶向能力差，导致临床效果不佳且副作用大。例如多西他赛广泛用于多种肿瘤的一线治疗，包括乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌等，但是目前所用的市售制剂是利用吐温80和乙醇助溶的溶液剂，助溶剂的使用导致了严重的辅料相关副反应，如超敏反应等，极大地限制了临床的应用，因此，开发安全高效的静注化疗药物递送系统是亟需解决的问题。

近年来，多种药物递送手段蓬勃发展，其中前药技术和纳米技术在抗肿瘤方向发展迅速，应用广泛，已有多个制剂投入了临床应用，如SN-38的前药伊利替康，紫杉醇白蛋白纳米粒，阿霉素脂质体等。前药策略通过对药物进行结构修饰，改善其理化性质，降低毒性，并能够通过一定的机制在特定部位释放出母药发挥药效。此外，纳米技术在药物递送方向具有独特的优势，药物纳米制剂可以改善药物不佳的药动学行为，延长药物在体内的循环时间，通过主动或被动的方式蓄积到肿瘤部位，发挥药效作用。在此基础上，前药自组装纳米粒综合了前药和纳米技术二者的优势，同时前药分子也是药物的载体，具有载药量高，稳定性好，高效低毒的特点，这些优势使前药自组装纳米成为了近年来研究的热点。

前药的肿瘤部位的特异性释放对于安全高效递送化疗药物非常重要。与正常细胞相比，肿瘤细胞的异质性为递送系统的刺激响应释药提供了机会，如肿瘤部位的酸性pH,肿瘤细胞内高表达的酶和高氧化还原环境等。与正常细胞相比，肿瘤细胞中高表达的谷胱甘肽(GSH)使二硫键成为设计刺激响应性前药的典型途径。但是，血液循环中含有少量的还原性物质，因此有可能提前释放母药，导致副反应。此外，肿瘤的侵袭性生长需要大量的脂肪酸作为能量，因此肿瘤细胞的脂解作用很强。甘油三脂脂肪酶(ATGL)，激素敏感性脂肪酶(HSL)和单酰甘油脂肪酶(MAGL)是参与脂质代谢的主要脂肪酶。MAGL在许多侵袭性肿瘤细胞系中过表达，在一些报道中已被证明在药物递送设计中具有潜力。据报道，ATGL作为将脂肪酶水解甘油三酸酯(TG)转化为二酰基甘油(DG)的载体，在某些肿瘤细胞系中表达也很高。然而，目前还未见基于ATGL的刺激响应性药物递送系统的报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种二硫键桥连的类甘油三酯前药，该前药能够在肿瘤高表达的脂酶和还原环境下程序化触发释药，将该前药制备成自组装纳米粒，从而实现高载药量，稳定性好、毒副作用低和肿瘤部位特异性快速释药的效果，通过静脉注射给药后，提高抗肿瘤活性。同时，类甘油三酯前药的1，3位脂肪酸选自不同饱和度的长链脂肪酸，不同脂肪酸饱和度对前药程序化触发响应释放，细胞毒性，药动学以及药效学的影响也不同。

本发明的目的是设计和合成二硫键桥连的类甘油三酯前药，类甘油三酯前药的1，3位脂肪酸选自不同饱和度的长链脂肪酸，包括全饱和的硬脂酸，含有一个不饱和度的油酸以及俩个不饱和度的亚油酸，制备前药静注自组装纳米药物传递系统，探讨不同不饱和度连对前药自组装纳米粒药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布以及药效学产生的影响，综合筛选出效果最佳的脂肪酸链，为开发肿瘤微环境智能响应型药物递送系统提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效化疗制剂的迫切需求。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明所述的二硫键桥连的类甘油三酯前药，选择多西他赛为模型药物，通过二硫代二乙酸连接到类甘油三酯结构骨架上，1，3位的脂肪酸为(a)硬脂酸，(b)油酸，(c)亚油酸，其结构式为：

本发明提供二硫键桥连的类甘油三酯前药的合成方法，包括如下步骤：首先合成1，3-二脂肪酸甘油酯，将二硫代二乙酸制备成酸酐后与1，3-二脂肪酸甘油酯成酯得到中间产物，最后与多西他赛相连得到终产物。

具体地，本发明提供了系列多西他赛类甘油三酯前药的合成方法：

将硬脂酸，油酸或亚油酸溶于二氯甲烷中，加入催化剂EDCI和DMAP，冰浴下活化0.5h-1h，向反应中加入1，3-二羟基丙酮，室温反应24h，通过柱层析后得到的产物经硼氢化钠氢化得到1，3-二脂肪酸甘油酯；将二硫代二乙酸溶解于乙酸酐中，反应2h-3h，将所得产物溶于二氯甲烷中，并加入1，3-二脂肪酸甘油酯和DMAP，室温条件下搅拌1-2小时，通过柱层析分离得到中间产物；将中间产物、EDCI、HOBt和DMAP溶于无水二氯甲烷中，冰浴1-2小时，然后加入多西他赛，室温条件下搅拌24-48小时，所得产物经制备液相分离纯化，上述反应全程都在N₂保护下进行。

本发明中所述的多西他赛可以用其他含有活性羟基或氨基的抗癌药物，如紫杉烷类化合物、核苷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物所代替。

长链脂肪酸可以用其他含有不饱和键和活性羟基的碳链替代，如棕榈酸、亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳六烯酸等。

本发明还提供了所述的系列多西他赛类甘油三酯前药静注自组装纳米粒的制备方法，所述的静注前药纳米粒可以是PEG修饰的小分子前药纳米粒、包载荧光前药的纳米粒和主动靶向的小分子前药纳米粒。

所述的多西他赛类甘油三酯前药静注自组装纳米粒通过如下方法制备：

将一定量的多西他赛类甘油三酯前药或小分子前药与PEG修饰剂的混合物溶解到适量的丙酮中，搅拌下，将该丙酮溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒。最后，采用透析法除去制剂中的丙酮，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。所述的PEG修饰剂为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG和PE-PEG等，优选的PEG修饰剂为DSPE-PEG。所述PEG的分子量为1000、2000和5000，优选的PEG分子量为2000。多西他赛类甘油三酯前药与PEG修饰剂的重量比为：90:10-70:30，在此范围条件下，多西他赛可以发挥最好的抗肿瘤效果。

本发明设计了二硫键桥连的类甘油三酯前药递送系统，在血液循环中，类甘油三酯的高亲脂性结构阻碍了还原剂的攻击，从而保证了前药在运输过程中的完整性，而肿瘤高表达的谷胱甘肽和脂酶作为程序化触发释药的条件，可以在肿瘤部位特异性程序化释药，即脂酶水解掉甘油三酯结构中1位的脂肪酸，生成的类甘油二酯前药的亲水性增加，高表达的谷胱甘肽继而进攻，母药得以释放。

本发明具有以下有益效果：(1)设计合成了二硫键桥连的类甘油三酯前药，合成方法简单易行；(2)制备了均匀的小分子前药自组装纳米粒，制备方法简单易行，稳定性好，实现多西他赛的高效包载；(3)考察了不同脂肪酸不饱和度对前药程序化响应释药能力以及静注给药后，抗肿瘤活性等方面的差异，以及对前药自组装纳米粒药物释放、细胞毒性、药动学、以及药效学产生的影响。综合筛选出效果最佳的脂肪酸，为开发肿瘤微环境智能响应型药物递送系统提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效化疗制剂的迫切需求。

附图说明

图1为本发明实施例1的多西他赛-类甘油三酯前药(DSSTG(0))的¹HNMR谱图和质谱图。

图2为本发明实施例2的多西他赛-类甘油三酯前药(DSSTG(1))的¹HNMR谱图和质谱图。

图3为本发明实施例3的多西他赛-类甘油三酯前药(DSSTG(2))的¹HNMR谱图和质谱图。

图4为本发明实施例4的PEG修饰的多西他赛-类甘油三酯前药自组装纳米粒的透射电子显微镜图。

图5为本发明实施例5的多西他赛-类甘油三酯前药自组装纳米粒的粒径-存储时间图。

图6为本发明实施例6的多西他赛-类甘油三酯前药自组装纳米粒的体外释放试验图

图7为本发明实施例7的多西他赛-类甘油三酯前药自组装纳米粒的细胞毒性图。

图8为本发明实施例7的多西他赛-类甘油三酯前药自组装纳米粒的肿瘤细胞内药物释放图。

图9为本发明实施例8的多西他赛-类甘油三酯前药自组装纳米粒的血药浓度-时间曲线图。

图10为本发明实施例9的多西他赛-类甘油三酯前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1：多西他赛-类甘油三酯前药(DSSTG(0))的合成

称取适量硬脂酸，EDCI，DMAP于100ml茄型瓶中，加入60ml无水二氯甲烷溶解并于冰浴下活化半个小时，称取适量1，3-二羟基丙酮加入到上述反应液中，氮气保护下，于室温反应48h。反应液旋干后粗产物经硅胶柱层析分离得到中间产物。称取适量中间产物溶解于四氢呋喃和苯的混合溶剂中，搅拌下注射器缓慢滴加2ml去离子水，冰浴条件缓慢加入适量硼氢化钠并继续反应30min，缓慢滴加0.5ml乙酸终止反应。上述反应液加入60ml氯仿充分混合，经5％碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，滤除无水硫酸钠后，旋干得到1.3-二硬脂酰甘油。将适量二硫代二丙酸加入到50mL圆底烧瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，室温下搅拌2个小时，通过薄层色谱监测反应过程，之后将20mL的甲苯分三次加入体系中，并进行减压蒸馏干燥。将所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入适量1，3-二硬脂酰甘油酯和DMAP，室温条件下搅拌1小时，通过薄层色谱监测反应过程，用硅胶柱色谱法纯化得到中间产物。最后将中间产物、EDCI和DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴0.5小时，然后加入适量多西他赛，在室温下再搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化既得。上述反应全程都在N₂保护下进行。

采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示。核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝8.0Hz,2H),7.61(t,J＝7.2Hz,1H),7.51(t,J＝7.4Hz,2H),7.42–7.31(m,5H),6.23(t,J＝8.5Hz,1H),5.69(d,J＝7.3Hz,1H),5.65(d,J＝8.4Hz,1H),5.48(m,1H),5.29(m,1H),5.22(m,1H),4.96(d,J＝9.4Hz,1H),4.33(d,J＝8.5Hz,1H),4.29–4.15(m,2H),4.22-4.13(m,5H),3.93(d,J＝6.6Hz,1H),3.62-3.48(dd,J＝27.3,12.2Hz,4H),2.57(ddd,J＝15.8,9.5,6.6Hz,1H),2.43(s,3H),2.32(t,J＝7.4Hz,4H),2.27-2.25(m,2H),1.95(s,3H),1.91–1.82(m,2H),1.76(s,3H),1.69(s,1H),1.60(m,4H),1.34(s,9H),1.25(m,56H),1.22(s,3H),1.13(s,3H),0.88(t,J＝6.3Hz,6H).ESI-MS(m/z):calcd for[C₈₆H₁₃₂NO₂₁S₂][M+H]⁺1578.863733；found:1578.872779.

实施例2：多西他赛-类甘油三酯前药(DSSTG(1))的合成

称取适量油酸，EDCI，DMAP于100ml茄型瓶中，加入60ml无水二氯甲烷溶解并于冰浴下活化半个小时，称取适量1，3-二羟基丙酮加入到上述反应液中，氮气保护下，于室温反应48h。反应液旋干后粗产物经硅胶柱层析分离得到中间产物。称取适量中间产物溶解于四氢呋喃和苯的混合溶剂中，搅拌下注射器缓慢滴加2ml去离子水，冰浴条件缓慢加入适量硼氢化钠并继续反应30min，缓慢滴加0.5ml乙酸终止反应。上述反应液加入60ml氯仿充分混合，经5％碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，滤除无水硫酸钠后，旋干得到1.3-二油酰甘油。将适量二硫代二丙酸加入到50mL圆底烧瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，室温下搅拌2个小时，通过薄层色谱监测反应过程，之后将20mL的甲苯分三次加入体系中，并进行减压蒸馏干燥。将所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入适量1，3-二油酰甘油酯和DMAP，室温条件下搅拌1小时，通过薄层色谱监测反应过程，用硅胶柱色谱法纯化得到中间产物。最后将中间产物、EDCI和DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴0.5小时，然后加入适量多西他赛，在室温下再搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化既得。上述反应全程都在N₂保护下进行。

采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例2中前药的结构，结果如图2所示。核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝7.8Hz,2H),7.61(d,J＝7.4Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,2H),7.36(m,5H),6.23(t,J＝8.5Hz,1H),5.69(d,J＝7.3Hz,1H),5.65(d,J＝8.4Hz,1H),5.48(m,1H),5.34(m,4H),5.30(d,J＝4.8Hz,1H),5.22(s,1H),4.97(d,J＝8.7Hz,1H),4.33(d,J＝8.5Hz,1H),,4.22-4.13(m,5H),4.20–4.15(m,2H)，3.93(d,J＝7.0Hz,1H),3.57(dd,J＝27.3,12.2Hz,4H),2.66–2.51(m,1H),2.43(s,3H),2.31(t,J＝7.5Hz,4H),2.26(m,2H),2.01(d,J＝5.9Hz,8H),1.95(s,3H),1.92–1.80(m,2H),1.76(s,3H),1.66(s,1H),1.60(m,4H),1.34(s,9H),1.28(m,40H),1.23(s,3H),1.13(s,3H),0.88(t,J＝6.6Hz,6H).ESI-MS(m/z):calcd for[C₈₆H₁₂₈NO₂₁S₂][M+H]⁺1574.832987；found:1574.841479.

实施例3：多西他赛-类甘油三酯前药(DSSTG(2))的合成

称取适量亚油酸，EDCI，DMAP于100ml茄型瓶中，加入60ml无水二氯甲烷溶解并于冰浴下活化半个小时，称取适量1，3-二羟基丙酮加入到上述反应液中，氮气保护下，于室温反应48h。反应液旋干后粗产物经硅胶柱层析分离得到中间产物。称取适量中间产物溶解于四氢呋喃和苯的混合溶剂中，搅拌下注射器缓慢滴加2ml去离子水，冰浴条件缓慢加入适量硼氢化钠并继续反应30min，缓慢滴加0.5ml乙酸终止反应。上述反应液加入60ml氯仿充分混合，经5％碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，滤除无水硫酸钠后，旋干得到1.3-二亚油酰甘油。将适量二硫代二丙酸加入到50mL圆底烧瓶中，并用3mL乙酸酐溶解，室温下搅拌2个小时，通过薄层色谱监测反应过程，之后将20mL的甲苯分三次加入体系中，并进行减压蒸馏干燥。将所得产物溶于30mL二氯甲烷中，并加入适量1，3-二亚油酰甘油酯和DMAP，室温条件下搅拌1小时，通过薄层色谱监测反应过程，用硅胶柱色谱法纯化得到中间产物。最后将中间产物、EDCI和DMAP溶于50mL无水二氯甲烷中，冰浴0.5小时，然后加入适量多西他赛，在室温下再搅拌24小时，通过薄层色谱监测反应过程，目标产物通过制备液相色谱分离纯化既得。上述反应全程都在N₂保护下进行。

采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例3中前药的结构，结果如图3所示。核磁共振选用的溶剂为CDCl3，波谱解析结果如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝7.2Hz,2H),7.61(d,J＝7.4Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,2H),7.43–7.28(m,5H),6.23(t,J＝8.5Hz,1H),5.69(d,J＝7.0Hz,1H),5.63(d,J＝8.4Hz,1H),5.48(m,1H),5.43–5.31(m,8H),5.29(d,J＝3.9Hz,1H),5.22(s,1H),4.97(d,J＝7.8Hz,1H),4.33(d,J＝8.5Hz,1H),4.22-4.13(m,5H),4.21–4.13(m,2H),3.93(d,J＝6.9Hz,1H),3.65–3.45(dd,J＝25.5,14.2Hz,4H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.58(m,1H),2.43(s,3H),2.31(t,J＝7.6Hz,4H),2.05(q,J＝6.7Hz,8H),2.26(m,2H),1.95(s,3H),1.92–1.79(m,2H),1.76(s,3H),1.65(s,1H),1.64–1.57(m,4H),1.56(s,9H),1.29(m,32H),1.23(s,3H),1.13(s,3H),0.89(t,J＝6.9Hz,6H).ESI-MS(m/z):calcd for[C₈₆H₁₂₄NO₂₁S₂][M+H]⁺1570.819444；found:1570.810178.

实施例4：PEG修饰的前药自组装纳米粒的制备

精密称取DSPE-PEG_2k0.8mg和前药4mg溶解于1ml丙酮中，再搅拌下，将该丙酮溶液缓缓滴加到4mL去离子水中，自发形成均匀的纳米粒DSSTG(0)纳米粒，DSSTG(1)纳米粒和DSSTG(2)纳米粒，在25℃的条件下用去离子水透析除去纳米制剂中的有机溶剂。

如表1所示，纳米粒的粒径都在120nm左右，PDI小于0.2，表面电荷在-20mV左右，载药量都在45％以上。通过透射电子显微镜测定实施例4中制备的前药自组装纳米粒的粒径和形态，结果如图4，透射电镜图表明载药纳米粒为均一的球形，粒径在100nm左右。

表1.PEG修饰的小分子前药自组装纳米粒的表征

实施例5：前药自组装纳米粒稳定性考察

将实施例4中制备的PEG修饰的前药自组装纳米粒取出1mL，加入到20mL含有10％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)中，在37℃的条件下孵育24小时，并且在预定的时间点(0,2,4,6,8,12小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图5所示，前药纳米粒胶体稳定性良好，在12小时内粒径没有发生明显的变化。

实施例6：前药自组装纳米粒的释放行为考察

以含30％乙醇的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)为释放介质，考察小分子前药自组装纳米粒的体外释放情况。将1mL实施例4中制备的前药自组装纳米粒加入到20mL释放介质中，在37℃条件下，于设定的时间点取样，通过高效液相色谱测定释放出的紫杉醇浓度。向释放介质中加入一定浓度的脂酶(lipase,1000IU/ml)或二硫苏糖醇(DTT,50μM)，以分别考察纳米粒在脂酶和还原条件下的释放情况。

如图6所示，前药纳米粒在单一脂酶条件下，8h内释放低于40％，在单一DTT条件下，8h释放低于80％，说明单一条件不足以使多西他赛高效释放，保证了纳米粒在血液循环中和其他高脂酶组织的稳定性，避免了前药纳米粒的脱靶释放；而在脂酶和DTT双重条件下，前药纳米粒可以在2h内释放完全，证实了其肿瘤细胞内高脂酶高还原环境双触发的特性。另外，DSSTG(2)的双触发释放效率最高，原因在于脂酶水解类甘油三酯结构中1位的脂肪酸，所得到的类甘油二酯结构中，3位脂肪酸的双键越多，类甘油二酯前药的亲水性越好，越有利于还原物质的攻击。

实施例7：前药自组装纳米粒的细胞毒性

采用MTT法考察前药自组装纳米粒对小鼠前列腺癌(RM-1)细胞的细胞毒性。将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至2000cells/mL细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100μL，置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加多西他赛溶液剂或实施例4中制备的前药纳米粒。本实验中药物溶液与纳米粒制剂的配制和稀释均用RPMI1640培养液，并用0.22μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入100μL，每个浓度3个平行孔。对照组，即不加待测药液，单一补加100μL培养液，置培养箱中和细胞共同孵育。于加药后48和72h，将96孔板取出，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，置培养箱中孵育4h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μL DMSO)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。

为了确定与RM-1细胞孵育后前药纳米粒释放的多西他赛的量，在固定的时间点(48和72小时)收集细胞和培养基(紫杉醇初始当量浓度：500ng/mL)。超声处理和离心后，通过液相色谱-质谱联用仪测量上清液中游离多西他赛的浓度。为了考察脂酶在前药纳米粒细胞释放过程中的作用，设置了脂酶抑制组，即在细胞培养基中加入脂肪组织甘油三酯脂酶抑制剂，其他操作同上。

细胞毒性结果如图7所示。与多西他赛溶液剂相比，前药纳米粒的细胞毒性降低。这是因为多西他赛需要一定时间从前药纳米粒中释放出来，限制了其药效的发挥。1，3位脂肪酸的不饱和度对前药纳米粒的细胞毒性具有显著影响。DSSTG(2)纳米粒相对其他两个前药纳米粒表现出了最强的细胞毒性，可能的原因在于不同的纳米粒释放多西他赛效率的不同，前药纳米粒细胞毒性与多西他赛从纳米粒中的释放速度相关，药物释放效率越高，细胞毒性越强。因此考察了前药纳米粒在RM-1细胞中的释放情况。如图8所示，DSSTG(2)在48h和72h释放的多西他赛量均高于其他两个前药纳米粒，结果与体外释放结果相符合，也解释了细胞DSSTG(2)的高细胞毒性；另外，抑制了脂肪组织甘油三酯脂酶后，3个前药纳米粒的释放均显著性降低，证明了单一的高还原条件不足以使前药纳米粒高效释放，高亲脂性和二硫键的双重保险保证了前药对正常组织和肿瘤细胞的高效区分。

实施例8：前药自组装纳米粒的药代动力学研究

取体重在200-250g之间的SD大鼠，随机分组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射多西他赛溶液剂以及实施例4中制备的前药自组装纳米粒。多西他赛的剂量为5mg/kg。于规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。通过液相色谱-质谱联用仪测定血浆中的药物浓度。

实验结果如图9所示，多西他赛溶液剂组药物迅速从血液中清除。相比之下，前药自组装纳米粒的循环时间明显延长，原因在于亲脂性和二硫键的双重保险，使得前药能够在血液循环中保持稳定；此外，DSSTG(2)前药的AUC显著高于其他两组前药，结果与体外释放结果相符，在弱还原环境下，DSSTG(2)能够保持稳定。

实施例9：前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤实验

将RM-1细胞悬液(5x 10⁶cells/100μL)接种于雌性C57小鼠腹侧皮下。待肿瘤体积生长至80mm³时，将荷瘤小鼠随机分组，每组五只,分别给与生理盐水、多西他赛溶液剂和实施例4中制备的前药自组装纳米粒。每隔1天给药1次，连续给药5次，按多西他赛计算，给药剂量为5mg/kg。给药后，每天观察小鼠的存活状态，称体重，测量肿瘤体积。最后一次给药后一天将小鼠处死，获取器官和肿瘤，进行进一步分析评价。收集主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾脏)和肿瘤组织并用福尔马林固定用于H&E染色。

实验结果如图10所示，与生理盐水相比，多西他赛表现出一定的肿瘤抑制活性。前药自组装纳米粒显示出比多西他赛溶液剂更强的抗肿瘤活性，肿瘤体积几乎没有增长。其中，DSSTG(2)纳米粒由于高效的肿瘤药物释放，良好的药物动力学行为，抗肿瘤效果最好。各组小鼠体重没有明显变化。这些结果说明前药自组装纳米粒在具有明显的抗肿瘤效果的同时，没有对机体造成显著的非特异性毒性，是安全有效的抗癌药物传递系统。

Claims (10)

1.如下结构的化合物、几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药：

2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，

将硬脂酸、油酸或亚油酸溶于二氯甲烷中，加入催化剂EDCI和DMAP，加入1，3-二羟基丙酮，室温反应，通过柱层析后得到的产物经硼氢化钠氢化得到1，3-二脂肪酸甘油酯；将二硫代二乙酸溶解于乙酸酐中，反应2-3h，将所得产物溶于二氯甲烷中，并加入1，3-二脂肪酸甘油酯和DMAP，室温条件下搅拌1-2小时，通过柱层析分离得到中间产物；将中间产物、EDCI、HOBt和DMAP溶于无水二氯甲烷中，冰浴1-2小时，然后加入多西他赛，室温条件下搅拌24-48小时，所得产物经制备液相分离纯化。

3.如权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述的硬脂酸、油酸或亚油酸用含有不饱和键和活性羟基的碳链替代，优选棕榈酸、亚麻酸，花生四烯酸，二十二碳六烯酸；所述的多西他赛用含有活性羟基或氨基的抗癌药物替代，优选紫杉烷类化合物、核苷类化合物、蒽环类化合物或喜树碱类化合物。

4.权利要求1所述的化合物、几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药的自组装纳米粒，其特征在于，所述的自组纳米粒是PEG修饰的小分子前药纳米粒、包载荧光前药的纳米粒和主动靶向的小分子前药纳米粒。

5.如权利要求4所述自组装纳米粒，其特征在于，所述的PEG修饰的小分子前药纳米粒通过如下方法制备：

将一定量的小分子前药与PEG修饰剂溶解到适量的丙酮中，搅拌下，将该丙酮溶液缓缓滴加到水中，前药自发形成均匀的纳米粒，最后，采用透析法除去制剂中的丙酮，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。

6.根据权利要求4所述的自组装纳米粒，其特征在于，所述的PEG修饰剂为TPGS、DSPE-PEG、PLGA-PEG、PE-PEG和DSPE-PEG-AA，小分子前药与PEG修饰剂的比例为90:10～70:30。

7.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的化合物，几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药和药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的化合物、几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药或权利要求7所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.权利要求1所述的化合物、几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药或权利要求7所述的药物组合物在制备靶向治疗药物中的应用。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的权利要求1的化合物、几何异构体、及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药或权利要求7所述的药物组合物制备成静脉注射用药物。

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