CN109481400A - 一种肝靶向阿霉素/Bcl-2 siRNA共载纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

一种肝靶向阿霉素/Bcl-2 siRNA共载纳米胶束及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种载药纳米胶束及其制备方法和应用，该载药纳米胶束其包含药物和/或基因、DPP聚合物和甘草次酸修饰的透明质酸聚合物，所述DPP聚合物具有式(I)所示结构：其中，n为≥13的自然数。本发明的载药纳米胶束采用了新的聚合物载体DPP，并引入了GH聚合物，提高了药物递送的靶向性，尤其肝靶向性、降低了摄取速率、提高了抗癌效果。本发明的聚合物及载药纳米胶束也可用于制备其他基因与疏水性药物联用的肝靶向递送体系。

Description

一种肝靶向阿霉素/Bcl-2 siRNA共载纳米胶束及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种肝靶向阿霉素/Bcl-2 siRNA共载纳米胶束及其制备方法和应用。
背景技术
肝癌是世界范围内死亡率较高的常见癌症之一，传统化疗是一种有效的抗癌治疗方法。然而，许多化疗药物，如阿霉素，由于系统毒性大，靶向性不强，多药耐药的发展，存在许多临床局限性。
为了提高对肝癌细胞的选择性，有效的策略是设计纳米载体实现肝靶向递送。近年来，纳米颗粒已被证明具有低系统毒性的药物递送优势。基于磷酸乙醇胺-聚乙二醇聚合物(PEG-PE)的纳米载体是一种有前途的纳米颗粒传递系统，它具有生物相容性，通过增强的渗透性和保留效应(EPR)在肿瘤中延长循环和积累。在过去的十年中，人们已经做了很多工作来制备肝靶向纳米载体，这些纳米载体被糖、抗体等配体修饰。
此外，肿瘤细胞中MDR(multidrug resistance，多药耐药性)的发展是导致临床化疗失败的主要原因。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，分布于内质网，即细胞核和线粒体的外膜。上调Bcl-2表达是MDR的机制之一，导致抗凋亡通路的激活。Bcl-2的反义寡核苷酸序列siRNA可以抑制Bcl-2基因的表达，导致肝癌细胞凋亡。
为克服传统化疗在临床抗肿瘤治疗中的局限性，联合用药策略作为一种新的抗肿瘤治疗方法被应用。它是基于协同递送纳米颗粒系统，将化疗药物与RNAi等其他治疗方法相结合。纳米颗粒可以同时将两种或两种以上的药物共同递送到肿瘤区域，从而通过协同/联合治疗效应提高肿瘤治疗效果，逆转多药耐药。
发明内容
本发明提供了一种DPP聚合物以及由该聚合物组成的载药纳米胶束，并且该纳米胶束中引入了甘草次酸修饰的透明质酸(GH聚合物)，可实现对药物尤其是疏水性药物较好的递送效果和靶向效应。尤其是，本发明提供了一种阿霉素(DOX)和Bcl-2siRNA共载的肝靶向纳米胶束，其组成包括：阿霉素、Bcl-2 siRNA、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-聚乙烯亚胺(DPP聚合物)、甘草次酸修饰的透明质酸(GH聚合物)。DPP聚合物是新合成的药物载体，GH聚合物的引入实现了纳米胶束的靶向递送，并且降低了摄取速率，提高了抗癌尤其是对肝癌的治疗效果。其中，GH聚合物与载药DPP聚合物的质量比是1:5～1:10；盐酸阿霉素与纳米载体(DPP)质量比为1:5～1:20；纳米载体(DPP)与bcl-2 siRNA的质量比为100:2～100:16；阿霉素包封率在72％～91％。本发明同时涉及新型共载材料合成和肝靶向共载纳米胶束的制备及实施，该方法也可用于制备其他基因与疏水性药物联用的肝靶向递送体系。
具体地，本发明通过如下所述的技术方案实现：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种载药纳米胶束，其包含药物和/或基因、DPP聚合物和甘草次酸修饰的透明质酸聚合物(GH聚合物)，GH聚合物包裹在载药纳米胶束的最外层，所述DPP聚合物具有式(I)所示结构：
其中，n为≥13的自然数。PEG分子量为600-1800，n值为13-41的自然数。
其中，所述DPP聚合物为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-聚乙烯亚胺(DSPE-PEG-PEI)聚合物，其由二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯(DSPE-PEG-NHS)与支链聚(乙烯亚胺)的支链氨基聚合得到。
优选地，所述支链聚(乙烯亚胺)的Mw为0.6～1.8kDa，优选为1.8kDa。
相较于支链PEI，本发明选择支链PEI并与其支链氨基聚合制备得到的聚合物制备的纳米胶束粒径更小，压缩基因的效率更高。并且当支链PEI的Mw在0.6～1.8kDa，优选为1.8kDa时，更容易获得更高的基因压缩效率。
优选地，所述二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯为1,2-二芳基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[琥珀酰亚胺(聚乙二醇)-2000]。
优选地，所述DPP聚合物通过如下反应路线制备：
其中，n为≥13的自然数，优选n为13-41。
优选地，所述DPP聚合物通过如下方法制备：将支链(聚乙烯亚胺)溶解于DMSO中，搅拌后加入碳化二亚胺(EDC)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯(DSPE-PEG-NHS)，反应过程中加入三乙胺(TEA)调节反应液pH值呈弱碱性(优选pH 8-9)，在氮气保护下，反应溶液在室温下搅拌24小时，产品经蒸馏水透析(MWCO 3000Da)纯化，冻干得到。
优选地，所述碳化二亚胺和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯的摩尔比大于1:1，优选为1.2:1-1.5:1，优选为1.3:1。
碳化二亚胺的加入，尤其当其加入量与二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯相比处于1.2:1-1.5:1，尤其是1.3:1时，可以较好的提高二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯的稳定性。
在本发明中，所述甘草次酸修饰的透明质酸聚合物GH具有式(II)所示结构：
其中，n为≥20的自然数，优选n为25-65。透明质酸的分子量为2-5万。
当n为≥20，尤其当n为25-65时，GH聚合物具有较好的靶向功能。
优选地，GH聚合物通过如下方法制备：
用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(DMT-MM)活化甲醇中的甘草次酸(GA)以形成活性酯(GA-ES)，在旋转蒸发甲醇后，将活性酯缓慢加入到乙二胺溶液中，并将混合物在室温下搅拌过夜，通过柱色谱法纯化二胺改性的GA(GA-N)，通过在DMT-MM存在下将GA-N修饰至HA(比如70kDa)的骨架来合成GH聚合物。
GH聚合物的合成路线如下所示。
在一个较为优选的实施方式中，GH聚合物通过如下方法制备：1.5g甘草次酸(GA)溶于30mL甲醇茄形瓶中，加入缩合剂2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(DMT-MM，其与GA摩尔比为1.2-1.5)，室温下搅拌1h，得到GA的活性酯GA-ES。旋蒸甲醇后，将GA-ES缓慢加入到30mL乙二胺溶液中，室温搅拌过夜，经葡聚糖柱层析纯化后得中间体乙二胺。取100mg透明质酸(HA)溶于双蒸水中，加入1.2摩尔量的缩合剂DMT-MM，室温搅拌24h，透析过滤(截流分子量3000-5000Dr)，冻干获得最终产物。
甘草次酸(glycyrrtinic acid,GA)是甘草酸苷的代谢产物，GA修饰的纳米载体可以显著提高肝靶向效率，抑制肝癌的发生发展。在此基础上，本发明将GA用于修饰透明质酸(HA)胶束，透明质酸是一种带负电荷的多糖，存在于细胞外基质和滑膜液中，本发明将甘草次酸修饰透明质酸得到GH聚合物，并将其引入到本发明的载药纳米胶束中，该聚合物与本发明DPP聚合物的结合使用，能够极大地提高载药胶束的靶向性，并有效降低摄取速率，提高药物的抗肿瘤活性。
在本发明中，所述药物为疏水性药物，比如抗肿瘤药物，选自紫杉烷类药物、蒽环类药物、喜树碱类药物、长春新碱类药物、佐米类药物、铂类药物、伊利替康、小白菊内酯类药物。
优选地，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、蛇床子素、紫杉醇、去氢骆驼蓬、喜树碱、奥沙利铂、依托泊苷、顺铂和西妥昔单抗中的一种或多种；优选为阿霉素；
优选地，所述纳米胶束中，所述药物与DPP的质量比为1:5-1:20，优选为1:8-1:12，更优选为1:10；
优选地，所述基因选自Bcl-2 siRNA、Toll样4受体基因、多药耐药基因、程序性死亡配体基因、Mcl-1抗凋亡基因中的一种或多种；优选为Bcl-2 siRNA；Bcl-2 siRNA为商品化产品，可通过常规购买渠道获取。
siRNA序列(正义链：5’-GGATGACTGAGTACCTGAA-3’；反义链:5’-TTCAGGTACTCAGTCATCC-3’)
阿霉素会引发的多药耐药性与Bcl-2蛋白的表达有密切关系，优选药物与基因的组合为阿霉素和Bcl-2 siRNA。
优选地，所述纳米胶束中，所述DPP与基因的质量比为100:2-100:16，优选为100:8-100:16，更优选为100:8或100:16。
优选地，所述纳米胶束中GH与载药物的DPP的质量比是1:5-1:10，优选为1:4-1:6，更优选为1:5。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述载药纳米胶束的方法，所述方法依次包括步骤(1)(2)(3)，或者只包括步骤(1)和(3)，其中，各步骤如下所示：
(1)透析法制备载药物的DPP纳米胶束；
(2)载药物的DPP纳米胶束与基因溶液混合制备共载基因和药物的DPP纳米胶束；
(3)GH聚合物缓慢滴入共载基因和药物的DPP纳米胶束中，或者滴入载药物的DPP纳米胶束中，制备最终的载药纳米胶束药物。
优选地，步骤(1)中，药物与DPP的质量比为1:5-1:20，优选为1:8-1:12，更优选为1:10；
优选地，步骤(1)包括将药物溶液缓慢加入DPP溶液中，搅拌过夜，然后对混合体系在去离子水中透析，透析袋内溶液冻干得到载药物的DPP纳米胶束；
优选地，步骤(2)中，DPP与基因的质量比为100:2-100:16，优选为100:8-100:16，更优选为100:8或100:16。
优选地，步骤(2)包括将步骤(1)制备得到的载药物的DPP纳米胶束与基因溶液混合，轻微搅拌0.5-1.2h，优选1h得到共载基因和药物的DPP纳米胶束。
优选地，步骤(3)中，GH与共载基因和药物的DPP的质量比是1:5-1:10，优选为1:4-1:6，更优选为1:5；
优选地，步骤(3)包括将GH聚合物缓慢滴入共载基因和药物的DPP纳米胶束中，或者滴入载药物的DPP纳米胶束中，室温搅拌0.5-1.2h，优选1h，冻干得共载基因和药物的GH-DPP纳米胶束或者载药物的GH-DPP纳米胶束。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种共载药纳米胶束，其包括阿霉素、Bcl-2siRNA、DPP聚合物和甘草次酸修饰的透明质酸聚合物；该共载药纳米胶束通过如下方法制备得到：
(1)透析法制备载DOX的DPP纳米胶束DOX/DPP；
(2)DOX/DPP纳米胶束与Bcl-2 siRNA溶液混合制备siRNA/DOX/DPP纳米胶束；
(3)GH聚合物缓慢滴入siRNA/DOX/DPP体系中制备siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束。
优选地，步骤(1)中，DOX与DPP的质量比为1:5-1:20，优选为1:8-1:12，更优选为1:10。
优选地，步骤(1)包括将DPP聚合物分散在甲酰胺中得到DPP溶液，盐酸阿霉素(DOX·HCL)溶于含有三乙胺的二甲基甲酰胺中得到DOX溶液，然后将DOX溶液缓慢加入DPP溶液中，搅拌过夜，然后对混合体系在去离子水中透析，透析袋内溶液冻干得到DOX的DPP纳米胶束(DOX/DPP)。
优选地，所述透析带的截留分子量为3000Da。
优选地，步骤(1)中，三乙胺与DOX的摩尔比为1.2-1.5:1，优选为1.3:1。
优选地，步骤(2)中，DPP与Bcl-2 siRNA的质量比为100:2-100:16，优选为100:8-100:16，更优选为100:8或100:16。
优选地，步骤(2)包括将步骤(1)制备得到的DOX/DPP纳米胶束与Bcl-2 siRNA的去离子水溶液混合，轻微搅拌0.5-1.2h，优选1h得到共载Bcl-2 siRNA和DOX的/DPP纳米胶束，记为siRNA/DOX/DPP纳米胶束。
优选地，步骤(3)中，GH与siRNA/DOX/DPP的质量比是1:5-1:10，优选为1:4-1:6，更优选为1:5。
优选地，步骤(3)包括将GH聚合物缓慢滴入步骤(2)的siRNA/DOX/DPP纳米胶束中，室温搅拌0.5-1.2h，优选1h，冻干得共载基因和药物的GH-DPP纳米胶束，记为siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束。
在本发明的第四方面，本发明提供了式(I)所示的DPP聚合物及其制备方法，其中，DPP聚合物如式(I)所示。
其中，n为≥13的自然数，优选为13-41。DPP的制备方法如上所述。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种GH-DPP纳米载体，其由DPP聚合物与GH聚合物混合制备得到，其中，DPP聚合物与GH聚合物如上文中所定义。
优选地，所述GH-DPP纳米载体通过将GH聚合物缓慢滴加到DPP聚合物的去离子水溶液(所述DPP聚合物的去离子水溶液在使用前经超声波分散处理，优选处理2-5min，比如处理3min)中，室温下搅拌、冻干制得。
在本发明的第六方面，本发明还提供了式(I)所示DPP聚合物或GH-DPP纳米载体在制备载药纳米胶束或药物递送系统中的应用。
优选地，所述载药纳米胶束如上所述。
优选地，所述药物递送体系为肝靶向药物递送系统，优选递送的药物为疏水性药物。
在本发明的第七方面，本发明还提供了上述载药纳米胶束或上述共载药纳米胶束或上述DPP聚合物或上述DPP-GH纳米载体在制备抗癌或抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述癌症或肿瘤依据所载药物，比如所述癌症或肿瘤可以选自急性白血病、淋巴细胞性白血病、粒细胞性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、未分化小细胞性支气管肺癌、非小细胞性支气管肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌；优选地，所述癌症或肿瘤为肝癌。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明的载药纳米胶束的制备与其作用示意图：其中，①siRNA/DOX/GH-DPP纳米粒的制备，②血液循环的靶向药物递送，③细胞摄取和④pH触发的Bcl-2 siRNA和DOX释放的示意图。
图2为GH聚合物的合成路线。
图3为HA、GA、GH的1H-NMR谱；a:HA在3.3-3.7ppm有特征吸收峰；b:GA在0.5-2.0ppm的特征吸收峰。
图4为DSPE-PEG-PEI(DPP)聚合物的合成路线。
图5为PEI、DSPE-PEG-NHS和DSPE-PEG-PEI的1H-NMR谱；a：PEI的峰；b&c：DSPE-PEG-NHS的峰。
图6为共载GH-DPP纳米胶束的特征。(A)以DPP与Bcl-2 siRNA的质量比为100:128至100:4的GH-DPP的siRNA电泳分析：其中，1-7分别依次对应比值100:128、100:64、100:32、100:16、100:8、100:4、100:2。(B)siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的粒度分布。(C)siRNA/DOX/DPP的TEM图像，和(D)siRNA/DOX/GH-DPP的TEM图像。
图7为siRNA和DOX体外释放曲线：(A)分别在pH 7.4或5.0下从GH-DPP或DPP纳米胶束释放Bcl-2 siRNA；(B)分别在pH 7.4或5.0下从GH-DPP或DPP纳米胶束中释放DOX。
图8为空白纳米胶束对(A)A549细胞和(B)HepG2细胞的细胞毒性(48h)。各种药物组对(C)A549细胞和(D)HepG2细胞的细胞毒性分析(48h)。
图9为细胞摄入分析：HepG2细胞分别与DOX/FITC-siRNA混合组、siRNA/DOX/DPP、siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束共育4h。FITC-siRNA(绿色)，DOX(红色)和DAPI(蓝色)。
图10为(A)活体NIRF成像：尾静脉注射游离DiR，DiR/DPP和DiR/GH-DPP纳米胶束至H22荷瘤小鼠(2-24h)；(B)离体NIRF成像：器官和肿瘤(24h)。
图11为分别通过注射生理盐水(对照)，空白GH-DPP纳米胶束，游离DOX，siRNA/DPP，DOX/DPP，siRNA/DOX/DPP，siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束抑制肿瘤生长。(A)肿瘤生长曲线；(B)体重变化；(C)肿瘤生长抑制率；(D)肿瘤；(E)心脏的组织学观察；(F)肿瘤组织H&E和BCL-2免疫组织化学分析。数据代表来自5只小鼠的肿瘤体积或体重的平均值±SD；*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
材料：透明质酸(Mw：50kDa)购自山东福瑞达生物有限公司。甘草次酸(HPLC纯度>98％)购自富捷制药有限公司。支链聚(乙烯亚胺)(PEI,Mw 1.8kDa)购自Sigma Aldrich(美国)。DOX购自大连美伦生物科技有限公司。(中国大连)。4-(4,6-二甲氧基1,3,5-三嗪-2-酰基)-4-甲基吗啉氯化铵(DMT-MM)购自上海美德普有限公司，(中国上海)；1,2-二芳基sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[琥珀酰亚胺(聚乙二醇)-2000](dsp-peg-nhs)购自西安瑞禧科技有限公司。(西安,中国)。Bcl-2 siRNA和FITC标记siRNA购自广州锐博生物股份有限公司(中国广州)。3-(4,5-二甲基噻唑-2-酰基)-2,5-二苯四唑溴化铵(MTT)购自Sigma Aldrich。(美国)。胎牛血清及RPMI-1640培养基购自北京索莱宝有限公司。其他试剂均为商用特级试剂，无需进一步纯化。
人肝细胞系(HepG2)、人肺腺癌细胞系(A549)和小鼠肝癌细胞(H22)均来自中国武汉型培养中心。雌性BALB/c小鼠(重量:18±2g)由潍坊医学院实验动物中心(中国潍坊)和WFMU动物研究伦理委员会批准。
本实施例及附图中出现的siRNA和Bcl-2 siRNA均表示Bcl-2 siRNA。
1、GH聚合物的合成
其合成过程按如下反应进行：
1.5g甘草次酸(GA)溶于30mL甲醇茄形瓶中，加入缩合剂2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(DMT-MM，与GA摩尔为1.3)，室温下搅拌1h，得到GA的活性酯(GA-ES)。旋蒸甲醇后，将GA-ES缓慢加入到30mL乙二胺溶液中，室温搅拌过夜，经葡聚糖柱层析纯化后得中间体乙二胺。取100mg透明质酸(HA)溶于双蒸水中，加入1.2摩尔量的缩合剂DMT-MM，室温搅拌24h，透析过滤(截流分子量3000-5000Dr)，冻干获得最终产物，1HNMR检测结构。HA在3.3-3.7有特征吸收峰，GA的特征峰位于0.5-2ppm，终产物的核磁氢谱中位移值为0.5-2.0处有明显的GA特征峰，表明GA分子已经成功修饰到HA上。其氢谱如图2所示。
2、DPP聚合物的合成
合成DSPE-PEG-PEI(DPP)的步骤按如下反应进行：
其制备方法包括：将PEI在DMSO(10-15mL)中溶解于25mL的玻璃瓶中，搅拌后加入碳化二亚胺(EDC)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯(DSPE-PEG-NHS)，其中EDC和DSPE-PEG-NHS的摩尔比为1.2:1-1.5:1。反应过程中加入20μl三乙胺调节反应液pH值呈弱碱性(pH 8-9)，在氮气保护下，反应溶液在室温下搅拌24小时。产品经蒸馏水透析(MWCO 3000Da)纯化，冻干即得。
制备例1：将PEI在DMSO(10mL)中溶解于25mL的玻璃瓶中，搅拌后加入碳化二亚胺(EDC)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯(DSPE-PEG-NHS)，其中两者摩尔比为1.3:1。反应过程中加入20μl三乙胺调节反应液pH值呈弱碱性(pH 8-9)，在氮气保护下，反应溶液在室温下搅拌24小时。产品经蒸馏水透析(MWCO 3000Da)纯化，冻干，1H NMR(D2O,300mhz)确认其化学结构。
在弱碱条件下，DSPE-PEG-NHS的NHS酯部分与PEI发生酰胺反应，生成DSPE-PEG-PEI。通过1H NMR验证了DSPE-PEG-NHS，PEI和DSPE-PEG-PEI聚合物的结构(如图3B所示)，确认了三种物质的特征峰，即：PEG：3.6ppm(-CH2O-)；DSPE：1.0-1.5ppm(-CH2-)；PEI：2.5-3.0ppm(CH2-N)。DSPE-PEG-PEI中在2.5-3.0ppm(PEI峰)，3.6ppm(PEG峰)和1.0-1.5ppm(DSPE峰)出现了特征峰，表明PEI成功修饰到DSPE-PEG-NHS分子上。
制备例2：将PEI在DMSO(15mL)中溶解于25mL的玻璃瓶中，搅拌后加入碳化二亚胺(EDC)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯(DSPE-PEG-NHS)，其中两者摩尔比为1.5:1。反应溶液在室温下搅拌24小时。产品经蒸馏水透析(MWCO 3000Da)纯化，冻干。经验证，PEI成功修饰到DSPE-PEG-NHS分子上。
制备例3：将PEI在DMSO(15mL)中溶解于25mL的玻璃瓶中，搅拌后加入碳化二亚胺(EDC)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯(DSPE-PEG-NHS)，其中两者摩尔比为1.2:1。反应溶液在室温下搅拌24小时。产品经蒸馏水透析(MWCO 3000Da)纯化，冻干。经验证，PEI成功修饰到DSPE-PEG-NHS分子上。
3、siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的制备
siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的制备过程如图1中的过程①所示。其制备方法包括：
步骤(1)：100mg DPP聚合物分散在10mL甲酰胺中，5mg、10mg、20mg的DOX·HCL分别溶于2mL含有三乙胺的二甲基甲酰胺中(三乙胺与阿霉素的摩尔比为1.2-1.5:1)。然后将DOX溶液缓慢加入DPP溶液中，搅拌过夜。混合体系对去离子水进行了透析(MWCO 3000Da)。将透析袋中溶液冻干，得到载DOX的DPP纳米胶束(即DOX/DPP纳米胶束)。
步骤(2)：DOX/DPP纳米胶束与Bcl-2 siRNA的去离子水溶液(下称siRNA溶液)混合，轻微搅拌1h，DPP与Bcl-2 siRNA的质量比100:2-100:16，分别制备siRNA/DOX/DPP纳米胶束。
步骤(3)将GH聚合物缓慢滴入步骤(2)的siRNA/DOX/DPP体系(GH聚合物与siRNA/DOX/DPP纳米胶束的质量比为1:5-1:10)中，室温搅拌1h。然后载药纳米胶束冻干，即得siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束。
制备例4：步骤(1)100mg DPP聚合物分散在10mL甲酰胺中，10mg的DOX·HCL溶于2mL含有三乙胺的二甲基甲酰胺中(三乙胺与阿霉素的摩尔比为1.3)(盐酸阿霉素在三乙胺存在下可脱去盐酸)。然后将DOX溶液缓慢加入DPP溶液中，搅拌过夜。混合体系对去离子水进行了透析(MWCO 3000Da)。将透析袋中溶液冻干，得到载DOX的DPP纳米胶束(即DOX/DPP纳米胶束)。步骤(2)DOX/DPP纳米胶束与Bcl-2 siRNA的去离子水溶液(下称siRNA溶液)混合，轻微搅拌1h，DPP与Bcl-2 siRNA的质量比为100:8，制备得到siRNA/DOX/DPP纳米胶束。步骤(3)将GH聚合物缓慢滴入步骤(2)的siRNA/DOX/DPP体系(GH聚合物与siRNA/DOX/DPP聚合物的质量比为1:5)中，室温搅拌1h。然后载药纳米胶束冻干，即得siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束。
针对siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的制备对其用量进行了筛选，以下筛选过程中涉及的制备过程均构成本发明的载药纳米胶束的制备例。
(1)DPP聚合物与DOX的用量筛选
以步骤(1)中的DPP聚合物与DOX的质量比为变量，按照制备例4的方法制备载药纳米胶束。
透析法制备载DOX的DPP纳米胶束。100mg DPP聚合物分散在10mL甲酰胺中，5mg(制备例4)、10mg(制备例5)和20mg(制备例6)的DOX·HCL分别溶于2mL含有三乙胺的二甲基甲酰胺中(三乙胺与阿霉素的摩尔比为1.3)。然后将DOX溶液缓慢加入DPP溶液中，搅拌过夜。混合体系对去离子水进行了透析(MWCO 3000Da)。将透析袋中溶液冻干，得到载DOX的DPP纳米胶束(DOX/DPP)，马尔文粒度仪检测粒径和分布，紫外分光光度计检测DOX载药量和包封率。得到的DOX/DPP按照制备例4的方法继续进行步骤(2)和步骤(3)，制备siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束。
(2)DPP聚合物与Bcl-2 siRNA的用量筛选
以步骤(2)中的DPP聚合物与siRNA溶液的质量比为变量，按照制备例4的过程制备载药纳米胶束。
为了得到合适的DPP与Bcl-2 siRNA的质量比，将制备例4中的DOX/DPP纳米胶束与Bcl-2 siRNA的去离子水溶液混合，轻微搅拌1h，分别设置DPP与Bcl-2 siRNA的质量比为100:128(制备例7)、100:64(制备例8)、100:32(制备例9)、100:16(制备例10)、100:8(制备例4)、100:4(制备例11)和100:2(制备例12)。琼脂糖凝胶实验研究了DOX/DPP与siRNA的结合能力(如图6中的A图所示)。制备siRNA/DOX/DPP纳米胶束。将其按照制备例4的步骤(3)分别制备siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束。
(3)GH聚合物与siRNA/DOX/DPP的用量筛选
以步骤(3)中的GH聚合物与siRNA/DOX/DPP的质量比为变量，按照制备例4的过程制备载药纳米胶束。
步骤(1)和步骤(2)同制备例4，不同量的GH聚合物缓慢滴入siRNA/DOX/DPP体系，GH聚合物与siRNA/DOX/DPP的质量比分别为1:1(制备例13)、1:2(制备例14)、1:5(制备例4)、1:10(制备例15)、1:20(制备例16)中，室温搅拌1h。制备siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束，然后载药纳米胶束冻干，并检测理化性质。
马尔文粒度仪测量共载纳米胶束的粒径和ζ电位，透射电镜检测siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的形态特征。
为了评价纳米胶束中DOX的载药效率(LE)和包封效率(EE)，将载DOX纳米胶束在甲酰胺中微热溶解，在480nm处用紫外可见分光光度计进行测定。利用标准曲线得到了载药纳米胶束中DOX的浓度。然后用式(1)和(2)计算LE和EE:
LE(％)＝Ws/Wt×100％ (1)
EE(％)＝Ws/Wa×100％ (2)
Ws＝纳米胶束中的DOX量；Wt＝载药纳米胶束总重量；Wa＝加入的DOX的初始量。
载药纳米粒的理化性质分析
将盐酸阿霉素和Bcl-2 siRNA分别加入到DPP聚合物中，制备的单药纳米胶束命名为DOX/GH-DPP和siRNA/GH-DPP，共载纳米胶束为siRNA/DOX/DPP和siRNA/DOX/GH-DPP。
其中，单药纳米胶束DOX/GH-DPP的制备方法：
制备例17：100mg DPP聚合物分散在10mL甲酰胺中，10mg的DOX·HCL分别溶于2mL含有三乙胺的二甲基甲酰胺中(三乙胺与阿霉素的摩尔比为1.3)。然后将DOX溶液缓慢加入DPP溶液中，搅拌过夜。混合体系对去离子水进行了透析(MWCO 3000Da)。将透析袋中溶液冻干，得到载DOX的DPP纳米胶束(DOX/DPP)。将GH聚合物缓慢滴入步骤DOX/DPP体系(GH聚合物与DOX/DPP的质量比为1:5)中，室温搅拌1h。然后载药纳米胶束冻干，即得DOX/GH-DPP纳米胶束。
单药纳米胶束siRNA/GH-DPP的制备方法：
制备例18：100mg DPP聚合物分散在10mL去离子水中，加入Bcl-2siRNA的去离子水溶液(下称siRNA溶液)混合，轻微搅拌1h，DPP与Bcl-2 siRNA的质量比为100:8，制备siRNA/DPP纳米胶束。将GH聚合物缓慢滴入siRNA/DPP体系(GH聚合物与siRNA/DPP的质量比为1:5)中，室温搅拌1h。然后载药纳米胶束冻干，即得siRNA/GH-DPP纳米胶束。
表1显示，三种质量比下，DOX/DPP理化性质有较大差异，DOX/DPP(1:10)组有较高的载药量和包封率，进一步检测到DOX/DPP质量比在1:8-1:12范围内效果良好。药物体中的PEI可以压缩基因，不同siRNA/DPP质量比得到的载Bcl-2 siRNA理化性质有一定差异，结合凝胶成像实验(图6A)，DPP/Bcl-2 siRNA质量比在100:8～100:16范围内能较好压缩基因。为了提高药物载体的肝癌靶向性，在共载纳米胶束体系中引入GH聚合物，siRNA/DOX/DPP与GH的质量比为5:1时粒径较小，载体表面电荷反转，进一步检测两者质量比在4:1-6:1范围内效果良好。综述所述，共载脂质体优化的处方为：DOX/DPP质量比为1:8～1:12；DPP/Bcl-2siRNA质量比为100:8-100:16；siRNA/DOX/DPP与GH的质量比为4:1-6:1。
为了考察共载纳米胶束的抗肿瘤活性，我们选择DOX/DPP质量比为1:10，DPP/siRNA质量比为100:8，siRNA/DOX/DPP与GH的质量比为5:1，制备共载纳米胶束，检测理化性质。表4所示：siRNA/DOX/GH-DPP的平均粒径大于siRNA/DOX/DPP，siRNA/DOX/GH-DPP的ζ电位较低。DOX的EE和LE分别为86.1％和7.09％。如图6C-D所示，共同递送系统呈现球形。稳定性研究表明载药的GH-DPP纳米粒子在生理条件下比载药DPP纳米粒子更稳定。
表1：不同的DOX投入量对DOX/DPP纳米胶束理化性质的影响
注：PEI多分散性指数
表2：不同Bcl-2 siRNA投入量对siRNA/DOX/DPP纳米胶束的影响
表3：不同GH加入量对siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束理化性质的影响
表4：工艺优化后siRNA/DOX/DPP和siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的理化性质分析(制备例4)
粒径(nm) PDI ζ(mV) EE<sup>b</sup>(％) DL<sup>b</sup>(％)
siRNA/DOX/DPP 157.2±5.7 0.272±0.04 12.75±1.72 87.4±2.7 8.32±1.4
siRNA/DOX/GH-DPP 176.4±6.4<sup>a</sup> 0.229±0.04 -1.64±1.73<sup>a</sup> 86.1±3.1 7.09±1.6
ap＜0.05siRNA/DOX/DPP vs siRNA/DOX/GH-DPP.bDOX.
4、siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束体外释药
在PBS缓冲液(pH 7.4和5.0)中研究GH-DPP纳米胶束中DOX和Bcl-2 siRNA(下文及附图中将均以siRNA表示)的释放。1mg/mL siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束分散于5ml PBS中，溶液置于透析袋中(MWCO＝3000)。然后,透析袋放置在20毫升的PBS缓冲在37℃下100rpm的震动速度。在预定的时间间隔内，取出1mL的释放介质，加入1mL新鲜PBS缓冲液。分别在480nm和260nm的微板上测定DOX和siRNA的含量。采用标准曲线法计算了小鼠体内DOX和siRNA的释放量。试验一式三份。结果如图7所示。
结果与分析：siRNA/DOX/GH-DPP(制备例4)或siRNA/DOX/DPP(制备例4的步骤(2)制得)纳米胶束的DOX和siRNA的释放在pH 7.4和pH 5.0下进行。从GA-DPP或DPP释放的siRNA和DOX是时间依赖性的(图7)。GH-DPP和DPP纳米胶束均在pH 5.0下快速释放。相反，药物释放在pH 7.4下较慢。可能的解释是，在较低的pH值下，正电荷的PEI和负电荷的siRNA和GH之间的静电相互作用较弱，导致药物从纳米载体中快速释放。
5、siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的体外细胞毒性测定
空白GH-DPP纳米胶束的制备方法：
制备例19：将DPP聚合物分散在10mL去离子水中，超声波分散处理3min，将GH聚合物缓慢滴入DPP聚合物的去离子水溶液中，GH聚合物与DPP聚合物的质量比为1:5，室温搅拌1h，冻干，即得空白GH-DPP纳米胶束。
采用MTT法检测空白DPP(制备例1)和空白GH-DPP纳米胶束(制备例19)对HepG2和A549细胞的细胞毒性。肿瘤细胞被接种在96-孔板(1×104细胞/孔)，培养48h。然后加入不同浓度DPP或GH-DPP(1、10、20、50、100μg/ml)。48小时后，加入20μL MTT试剂(5mg/ml)，处理4h。溶液被200μL DMSO溶液替换。使用Bio-Rad微板阅读器(型号680,Richmond,USA)测量了490nm处的吸光度。
采用MTT法检测HepG2和A549细胞中游离DOX、DOX/GH-DPP(制备例17)、siRNA/GH-DPP(制备例18)、siRNA/DOX/DPP(制备例4的步骤(2)制得)和siRNA/DOX/GH-DPP(制备例4)纳米粒的细胞毒性。所有的实验都重复了三次。结果如图8所示。
结果与分析：使用MTT测定法测定空白纳米载体的细胞毒性。在10至100μg/mL的浓度下，两种空白纳米载体的细胞毒性低于15％(图8A)。结果表明，DPP和GH-DPP纳米粒子由于其可忽略的毒性而可用于药物递送材料。
在用游离DOX，DOX/GH-DPP(制备例17)，siRNA/GH-DPP(制备例18)，siRNA/DOX/DPP(制备例4的步骤(2))和siRNA/DOX/GH-DPP(制备例4)纳米胶束孵育48小时后评估A549和HepG2细胞的活力。图8B显示所有五种药物制剂表现出相似的剂量依赖性细胞毒性作用，并且与游离药物治疗组相比，共递送纳米胶束组显示出更高的细胞毒性。测定siRNA/DOX/DPP(制备例4的步骤(2))和siRNA/DOX/GH-DPP(制备例4)纳米胶束对HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50值)分别为1.02和0.76DoXμg/mL，低于游离DOX(1.86DOXμg/mL)。结果表明，DOX和Bcl-2 siRNA的共同递送纳米胶束siRNA/DOX/GH-DPP可以增强DOX的抑制作用。如图8C-D所示，siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束对HepG2细胞的毒性高于其他DOX制剂。
6、siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的细胞摄取分析
荧光显微镜检测细胞摄取DOX和FITC标记的siRNA(BX40,Olympus,Japan)。12孔板培养HepG2细胞。过夜后，分别加入DOX和siRNA混合物,siRNA/DOX/DPP(制备例4的步骤(2))，siRNA/DOX/GH-DPP(制备例4)。4h共育后用冷PBS洗涤3次，4％多聚甲醛溶液固定。荧光显微镜观察细胞内DOX和siRNA定位。结果如图9所示。图9左第一列为蓝色荧光，左第二列为红色荧光，左第三列为除第一图外，下两图为绿色荧光，左第四列呈现荧光叠加后的效果。
结果与分析：通过荧光显微镜检测siRNA/DOX/GH-DPP的细胞摄取特征。绿色和红色荧光信号分别表示siRNA和DOX的摄取，而蓝色荧光信号显示细胞核被DAPI染色。三个荧光图片的叠加揭示了DOX和siRNA在细胞质中的分布。如图9所示，用三种药物制剂孵育HepG2细胞的细胞质中有明显的红色荧光信号，表明DOX被肿瘤细胞摄取。通过游离DOX和siRNA的混合物处理的组中几乎没有绿色荧光信号，表明肿瘤细胞摄取的siRNA很少。与载药DPP纳米粒子相比，在用siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束孵育的HepG2细胞中发现了更强的绿色荧光信号。该结果归因于GH聚合物的覆盖，其通过GA-受体介导的胞吞作用增加药物的量。
7、体内近红外荧光成像(GH-DPP纳米胶束的体内生物分布)
利用近红外荧光成像系统对载药的GH-DPP纳米胶束的体内生物分布进行了监测。首先，在BALB/c雌性小鼠腹腔皮下接种H22细胞，建立荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积增长到约100mm3时，将小鼠随机分为三组。其次，用DiR作为荧光剂。分别制备了DiR/DPP(DPP取自制备例1)和DiR/GH-DPP(GH-DPP取自制备例19)纳米胶束。静脉注射游离DiR、DiR/DPP和DiR/GH-DPP纳米胶束。利用Caliper Life Sciences公司的Xenogen IVIS光谱(Ex为745nm,Em为835)，在预定时间(2,6,12和24h)进行体内近红外荧光成像。结果如图10所示。
结果与分析：制备负载DiR的纳米胶束以研究GH-DPP在体内的生物分布。在注射DiR制剂后，可以在肝脏和肿瘤中监测荧光信号。如图7所示，与游离DiR相比，载DiR纳米胶束在肿瘤中存在强荧光信号，表明纳米载体可以增强肿瘤区域中的药物积累。与DiR/DPP纳米胶束相比，DiR/GH-DPP纳米胶束在肿瘤组织的荧光强度更强，这说明靶向材料GH明显提升了肝靶向效果。
8、siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的抗肿瘤作用
以H22荷瘤小鼠为模型，评价载药GH-DPP纳米胶束的抗肿瘤作用，研究其治疗效果。当肿瘤体积达到100mm3左右时，将荷H22的小鼠随机分为7组(每组5只)。分别用生理盐水(对照)、空白GH-DPP纳米胶束(制备例19)、游离DOX·HCl、siRNA/GH-DPP(制备例18)、DOX/GH-DPP(制备例17)、siRNA/DOX/DPP(制备例4的步骤(2))和siRNA/DOX/GH-DPP(制备例4)纳米胶束给药。每隔一天给药剂量为5mg DOX/kg体重。每天测量体重和肿瘤体积。最后，所有小鼠被处死，肿瘤被摘取。肿瘤体积按下式计算:
Vt＝d2×L/2
L为肿瘤最长直径；d为肿瘤最短直径；Vt是肿瘤体积
结果与分析：结果如图11所示。在荷H22肿瘤的小鼠中评估siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束的抗肿瘤作用。如图11A所示，用生理盐水和空白GH-DPP纳米粒子处理的组显示肿瘤大小快速增长，并且在空白GH-DPP组和对照组之间未观察到显着差异，表明GH-DPP纳米粒子是生物相容的。相反，用药物制剂治疗组显示出明显的生长抑制效应。其中，DOX和Bcl-2siRNA共递送纳米胶束组的体内肿瘤抑制率(IR)高于用于单独递送DOX或siRNA的GH-PDD纳米胶束，表明DOX和Bcl-2 siRNA的联合治疗提高了抗肿瘤功效。与siRNA/DOX/DPP相比，siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束显示更强的抗肿瘤效果。
图11B显示用游离DOX处理的小鼠的体重低于用载药纳米胶束处理的小鼠的体重，表明GH-DPP纳米胶束降低了DOX的全身毒性。如图11C所示，siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束表现出更好的肿瘤生长抑制率，并且该抑制作用具有显著差异(**P<0.01)。如图11E所示，在游离DOX组中观察到明显的细胞间空泡化和心肌纤维溶解，表明注射游离DOX诱导显着的心脏毒性。相比之下，通过载药纳米胶束注射的组中没有明显的心肌纤维退化。这些结果表明，基于纳米载体的联合治疗改善了抗肿瘤作用，减轻了DOX的全身毒性。
提取肿瘤用于H&E染色以评估抗肿瘤效果。如图11F所示，与单一药物制剂相比，用共同递送系统处理的肿瘤细胞表现出明显的核溶解和核固缩，具有更多的细胞质空泡化，表明联合治疗表现出更高的抗肿瘤效果。与siRNA/DOX/DPP相比，siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束诱导更多的核缩小和更低的细胞密度，这表明GH的引入促进了肝脏靶向递送药物，从而导致更有效的治疗。通过免疫组织化学测定在肿瘤中评估BCL-2蛋白的表达。在游离DOX和DOX/GH-DPP纳米胶束组中观察到BCL-2蛋白的高表达。相比之下，用共同递送系统治疗的组显示出明显的BCL-2表达抑制。综上所述，siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束通过药物联用和肝靶向递送双重策略提高了抗肝癌效果。

Claims (10)

1.一种载药纳米胶束，其包含药物和/或基因、DPP聚合物和甘草次酸修饰的透明质酸聚合物GH，所述DPP聚合物具有式(I)所示结构：
其中，n为≥13的自然数。
2.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征在于，所述DPP聚合物为由二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯(DSPE-PEG-NHS)与支链聚(乙烯亚胺)的支链聚合得到；
优选地，所述支链聚(乙烯亚胺)的Mw为0.6-1.8kDa，优选为1.8kDa；
优选地，所述二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯为1,2-二芳基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[琥珀酰亚胺(聚乙二醇)-2000]；
优选地，所述DPP聚合物通过如下反应制备：
其中，n为≥13的自然数；优选n为13-41；
优选地，所述DPP聚合物通过如下方法制备：将支链(聚乙烯亚胺)溶解于DMSO中，搅拌后加入碳化二亚胺和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯，反应过程中加入三乙胺调节反应液pH值呈弱碱性，优选pH为8-9，在氮气保护下，反应溶液在室温下搅拌24小时，经蒸馏水透析纯化，冻干得到；
优选地，所述碳化二亚胺和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇活性酯的摩尔比为大于1:1，优选为1.2:1-1.5:1，更优选为1.3:1。
3.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征在于，所述甘草次酸修饰的透明质酸聚合物GH具有式(II)所示结构：
其中，n为≥20的自然数，优选n为25-65；
优选地，所述GH聚合物通过如下所示反应制备得到：
优选地，所述HA-GA聚合物的制备包括以下步骤：
用DMT-MM活化甲醇中的甘草次酸以形成活性酯GA-ES，在旋转蒸发甲醇后，将活性酯缓慢加入到乙二胺溶液中，并将混合物在室温下搅拌过夜，通过柱色谱法纯化二胺改性的GA表示为GA-N，通过在DMT-MM存在下将GA-N修饰至HA的骨架来合成GH聚合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米胶束，其特征在于，所述药物为抗肿瘤药物，优选疏水性药物，选自紫杉烷类药物、蒽环类药物、喜树碱类药物、长春新碱类药物、佐米类药物、铂类药物、伊利替康、小白菊内酯类药物；
优选地，所述抗肿瘤药物选自阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、蛇床子素、紫杉醇、去氢骆驼蓬、喜树碱、奥沙利铂、依托泊苷、顺铂和西妥昔单抗中的一种或多种；优选为阿霉素；
优选地，所述纳米胶束中，所述药物与DPP的质量比为1:5-1:20，优选为1:8-1:12，更优选为1:10；
优选地，所述基因选自Bcl-2siRNA、Toll样4受体基因、多药耐药基因、程序性死亡配体基因、Mcl-1抗凋亡基因中的一种或多种；优选为Bcl-2siRNA；
优选地，所述纳米胶束中，所述DPP与基因的质量比为100:2-100:16，优选为100:8-100:16，更优选为100:8或100:16；
优选地，所述纳米胶束中GH与载药物的DPP的质量比是1:5-1:10，优选为1:4-1:6，更优选为1:5。
5.一种制备权利要求1至4中任一项所述的载药纳米胶束的方法，所述方法包括步骤(1)(2)(3)，或者只包括步骤(1)和(3)，其中，各步骤如下所示：
(1)透析法制备载药物的DPP纳米胶束；
(2)载药物的DPP纳米胶束与基因溶液混合制备共载基因和药物的DPP纳米胶束；
(3)GH聚合物缓慢滴入共载基因和药物的DPP纳米胶束中，或者滴入载药物的DPP纳米胶束中，制备最终的载药纳米胶束；
优选地，步骤(1)中，药物与DPP的质量比为1:5-1:20，优选为1:8-1:12，更优选为1:10；
优选地，步骤(1)包括将药物溶液缓慢加入DPP溶液中，搅拌过夜，然后对混合体系在去离子水中透析，透析袋内溶液冻干得到载药物的DPP纳米胶束；
优选地，步骤(2)中，DPP与基因的质量比为100:2-100:16，优选为100:8-100:16，更优选为100:8或100:16；
优选地，步骤(2)包括将步骤(1)制备得到的载药物的纳米胶束与基因溶液混合，轻微搅拌0.5-1.2h，优选1h得到共载基因和药物的DPP纳米胶束；
优选地，步骤(3)中，GH与共载基因和药物的DPP的质量比是1:5-1:10，优选为1:4-1:6，更优选为1:5；
优选地，步骤(3)包括将GH聚合物缓慢滴入共载基因和药物的DPP纳米胶束中，或者滴入载药物的DPP纳米胶束中，室温搅拌0.5-1.2h，优选1h，冻干得共载基因和药物的GH-DPP纳米胶束或者载药物的GH-DPP纳米胶束。
6.一种共载药纳米胶束，其包括阿霉素、Bcl-2siRNA、DPP聚合物和甘草次酸修饰的透明质酸聚合物；
所述共载药纳米胶束通过如下方法制备得到：
(1)透析法制备载盐酸阿霉素的DPP纳米胶束DOX/DPP；
(2)DOX/DPP纳米胶束与Bcl-2siRNA溶液混合制备siRNA/DOX/DPP纳米胶束；
(3)GH聚合物缓慢滴入siRNA/DOX/DPP体系中制备siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束；
优选地，步骤(1)中，盐酸阿霉素与DPP的质量比为1:5-1:20，优选为1:8-1:12，更优选为1:10；
优选地，步骤(1)包括将DPP聚合物分散在甲酰胺中得到DPP溶液，盐酸阿霉素(DOX·HCL)溶于含有三乙胺的二甲基甲酰胺中得到DOX溶液，然后将DOX溶液缓慢加入DPP溶液中，搅拌过夜，然后对混合体系在去离子水中透析，透析袋内溶液冻干得到DOX的DPP纳米胶束(DOX/DPP)；
优选地，步骤(1)中，三乙胺与DOX的摩尔比为1.2-1.5:1，更优选为1.3:1；
优选地，步骤(2)中，DPP与Bcl-2siRNA与的质量比为100:2-100:16，优选为100:8-100:16，更优选为100:8或100:16；
优选地，步骤(2)包括将步骤(1)制备得到的DOX/DPP纳米胶束与Bcl-2siRNA的去离子水溶液混合，轻微搅拌0.5-1.2h，优选1h得到共载Bcl-2siRNA和DOX的/DPP纳米胶束，记为siRNA/DOX/DPP纳米胶束；
优选地，步骤(3)中，GH与siRNA/DOX/DPP的质量比是1:5-1:10，优选为1:4-1:6，更优选为1:5；
优选地，步骤(3)包括将GH聚合物缓慢滴入步骤(2)的siRNA/DOX/DPP纳米胶束中，室温搅拌0.5-1.2h，优选1h，冻干得共载基因和药物的GH-DPP纳米胶束，记为siRNA/DOX/GH-DPP纳米胶束。
7.式(I)所示的DPP聚合物：
其中，n为≥13的自然数，优选n为13-41。
8.一种GH-DPP纳米载体，其由DPP聚合物与GH聚合物混合制备得到，其中，DPP聚合物与GH聚合物如权利要求1至3中任一项中所定义；
优选地，所述GH-DPP纳米载体通过将GH聚合物缓慢滴加到DPP聚合物的去离子水溶液中，室温下搅拌、冻干制得；
优选地，所述DPP聚合物的去离子水溶液在使用前经超声波分散处理。
9.式(I)所示DPP聚合物或权利要求8所述的GH-DPP纳米载体在制备载药纳米胶束或药物递送系统中的应用；
优选地，所述载药纳米胶束如权利要求1至6中任一项中所定义；
优选地，所述药物递送体系为肝靶向药物递送系统，优选递送的药物为疏水性药物，比如疏水性抗肿瘤药物。
10.权利要求1至4中任一项所述的载药纳米胶束或权利要求7中所述的共载药纳米胶束或权利要求7所述的聚合物或权利要求8所述的纳米载体在制备抗癌或抗肿瘤药物中的应用；
优选地，所述癌症或肿瘤选自急性白血病、淋巴细胞性白血病、粒细胞性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、未分化小细胞性支气管肺癌、非小细胞性支气管肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌，优选为肝癌。
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