JP2023515708A - 中枢神経系送達のための結合剤及びその使用 - Google Patents

中枢神経系送達のための結合剤及びその使用 Download PDF

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Abstract

本明細書では、血液脳関門の貫通を促進する結合剤、コンジュゲート、及び細胞外小胞が開示される。中枢神経系への作用剤、例えば治療剤の送達のためのそれらの使用もまた提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年４月２７日出願の米国仮特許出願第６３／０１５，９３６号について優先権の利益を主張するものであり、その仮特許出願は、その全体が参照により本出願に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列リストを含み、その配列リストは、その全体が参照により本出願に援用される。２０２１年４月２０日に作成されたそのＡＳＣＩＩのコピーは、ファイル名がＡ１０６５２５＿１０５０ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが６２１，３３３バイトである。
巨大分子は、わずかな数の既知の経路を利用することにより、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる（例えば非特許文献１を参照）。細胞外小胞（ＥＶ）が受容体仲介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）を介して血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することは、固有のサイズ及び電荷の制限を考慮すると他の既知の経路は利用できないので、広く受け入れられている（非特許文献２）。しかしながら、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、及び低密度リポタンパク質受容体を含むＲＭＴ経路及び／又は受容体はわずかしか特定されておらず、いずれもＥＶ ＲＭＴに関与することが示されていない。これらのタンパク質が脳内で果たす重要な役割を考えると、薬物送達のためにこれらの経路を選ぶことは一般的にリスクが高いとみなされている。従って、ＢＢＢを通ってＥＶを送達する、改善された方法が必要である。ＥＶ ＲＭＴの分子レベルの基盤についてはほとんど知られていない。ＥＶ ＲＭＴに関与する分子及び経路を理解することは、例えばＣＮＳへの薬物送達の増大、有効用量の低減、製造需要の低減、及び標的外の影響の低減のために有益となり得る。
Abbott, N. J., et al., Astrocyte‐endothelial interactions at the blood‐brain barrier. Nature Reviews, Neurosicence, 7(l):41‐53, 2006 Morad, G., et al., Tumor‐Derived Extracellular Vesicles Breach the Intact Blood‐Brain Barrier via Transcytosis. ACS Nano, 2019
本発明は様々な態様において、関連分子による血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を促進する、新規の標的及び結合剤を提供する。例えば、対象の血液脳関門を通っての（例えば対象の脳又は中枢神経系への）細胞外小胞の送達を改善するために、本明細書では、脳内皮細胞によって発現される１つ以上のタンパク質（例えば受容体）に特異的に結合して、ＢＢＢを介した取り込みを増強することができる、１つ以上の結合剤を含む細胞外小胞（ＥＶ）が提供される。ある態様では、本明細書では、脳内皮細胞によって発現される受容体に結合する結合剤（例えばリガンド、抗体、アプタマー）を含む細胞外小胞組成物が提供される。別の態様では、本明細書では、対象の血液脳関門を通ってＥＶ（例えば治療剤を含むＥＶ）を送達する方法が提供され、その方法は、対象に本開示のＥＶを投与することを含む。いくつかの実施形態では、その細胞外小胞は神経細胞に由来する。
ある態様では、本明細書では、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する外因性結合剤を含む細胞外小胞（ＥＶ）が提供される。いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、血液脳関門を通っての上記ＥＶの輸送を増強する。特定の実施形態では、上記外因性結合剤は、表１に記載の標的タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、表１に記載の１つの結合剤の全体又は一部を含む。例えば上記外因性結合剤は、表１に記載のある結合剤、又は本明細書に記載の標的タンパク質に結合する能力を保持したそれらの断片若しくは部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、上記ＥＶは複数の外因性結合剤を含み、これらはそれぞれ、表１に記載の標的タンパク質に特異的に結合する。例えば上記ＥＶは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の外因性結合剤を含むことができる。
特定の実施形態では、上記外因性結合剤は、表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、上記ＥＶは複数の外因性結合剤を含み、これらはそれぞれ、表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合する。例えば上記ＥＶは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の外因性結合剤を含むことができる。
いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＣＤ７４、ＣＤ１６４、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＬＡ‐ＤＯＡ、ＨＯＸＤ４、ＩＦＮＬＲ１、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＨＴＲ６、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＣＨＲ２、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７、ＶＬＤＬＲ若しくはＺＰ２、Ｂ３ＧＡＴ１修飾タンパク質、ＳＴ８ＳＩＡ３修飾タンパク質、又はそれらの組み合わせから選択される内皮細胞タンパク質に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＣＤ７４、ＣＤ１６４、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＬＡ‐ＤＯＡ、ＨＯＸＤ４、ＩＦＮＬＲ１、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＨＴＲ６、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＣＨＲ２、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７、ＶＬＤＬＲ若しくはＺＰ２、Ｂ３ＧＡＴ１修飾タンパク質、又はＳＴ８ＳＩＡ３修飾タンパク質から選択される、１つ以上の内皮細胞タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＣＤ７４、ＣＤ１６４、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＬＡ‐ＤＯＡ、ＨＯＸＤ４、ＩＦＮＬＲ１、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＨＴＲ６、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＣＨＲ２、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７、ＶＬＤＬＲ若しくはＺＰ２、Ｂ３ＧＡＴ１修飾タンパク質、又はＳＴ８ＳＩＡ３修飾タンパク質から選択される、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又は更に多数の内皮細胞タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＯＸＤ４、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７、及びＶＬＤＬＲからなる群から選択される内皮細胞タンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態では、上記外因性結合剤は、ＫＣＮＴ２、ＯＲ４Ｘ２、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴ２Ｄ２、ＴＭＥＤ１０、及びＶＬＤＬＲからなる群から選択される内皮細胞タンパク質に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、ＣＤ７４、ＨＬＡ‐ＤＯＡ、ＶＬＤＬＲ、ＺＰ２、ＩＦＮＬＲ１、ＨＴＲ６、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＭＣＨＲ２、ＣＤ１６４、Ｂ３ＧＡＴ１修飾タンパク質、及びＳＴ８ＳＩＡ３修飾タンパク質からなる群から選択される内皮細胞タンパク質に特異的に結合する。
一実施形態では、上記外因性結合剤は、表１又は表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合部分である。例示の実施形態では、上記抗体又はその抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、及びシングルドメイン抗体からなる群から選択される抗体フラグメントである。特定の実施形態では、上記抗体又はその抗原結合部分は、ヒト化抗体又はその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、上記抗体又はその抗原結合部分は、完全ヒト抗体又はその抗原結合部分である。
一実施形態では、上記外因性結合剤は、表１又は表２に記載の標的タンパク質のポリペプチドリガンドである。
いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドリガンドは、表１に記載の結合剤、又は本明細書に記載の標的タンパク質に結合する能力を保持したそれらの断片若しくは部分のうちの、１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、上記ＥＶは、１つ以上の（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又は更に多数の）表１に記載の結合剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、上記ＥＶは、本明細書に記載のＡ２Ｂ５抗体（Ａｂｃａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）カタログ番号ａｂ５３５２１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニューヨーク州グランドアイランド）カタログ番号４３３１１０）、ＡＣＲ、ＡＤＡＭ２、ＡＤＲＢＫ１、ＡＰ２Ｍ１、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＲ、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ７４、ＣＬＵ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＦ、ＣＴＳＨ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームａ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｂ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｃ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｄ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｅ、ＤＱＢ１、ＤＲＢ３、ＥＲＢＢ４、Ｅ‐セレクチン、ＨＬＡ‐ＤＯＢ、ＨＬＡ‐ＤＰＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ２、ＨＬＡ‐ＤＱＢ１、ＨＬＡ‐ＤＱＢ２、ＨＬＡ‐ＤＲＡ、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１、ＨＬＡ‐ＤＲＢ３、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ラミニン（ラミニンサブユニットγ‐１）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐２）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐１）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐２）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐１）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐５）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐３）、ラミニン（ラミニンサブユニットγ‐３）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐４）、ラミニン（ラミニンサブユニットγ‐２）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐３）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐４）、ＬＧＭＮ、ＬＰＬ、ＬＲＰＡＰ１、ＭＩＦ、ＭＭＰ１、ＯＶＧＰ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＮＰ、ＰＰＡＲＡ、Ｐｒｏ‐ＭＣＨ、ＰＳＡＰ、Ｐ‐セレクチン、ＲＥＬＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＺＰ１、ＺＰ３、ＺＰ４、ＺＰＢＰ、又は本明細書に記載の標的タンパク質に結合する能力を保持したそれらの断片若しくは部分から選択される、１つ以上の（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又は更に多数の）タンパク質を含むことができる。
いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、表１又は表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合するアプタマーである。
様々な実施形態において、上記ＥＶのサイズは約２０ｎｍ～約２５０ｎｍである。特定の実施形態では、上記ＥＶはエクソソームである。いくつかの実施形態では、上記ＥＶは微小胞である。
他の実施形態では、上記ＥＶは、初代細胞、形質転換細胞、又は幹細胞／前駆細胞に由来する。いくつかの実施形態では、上記ＥＶは、神経細胞、筋細胞、免疫細胞、脂肪細胞、又は腫瘍細胞に由来する。いくつかの実施形態では、上記ＥＶは、神経細胞、例えば星状膠細胞、希突起膠細胞、ニューロン、又はグリア細胞に由来する。他の実施形態では、上記ＥＶは、免疫細胞、例えば小膠細胞又は樹状細胞に由来する。他の実施形態では、上記ＥＶは幹細胞／前駆細胞に由来する。様々な実施形態において、上記ＥＶは、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞に由来する。他の実施形態では、上記ＥＶは、神経前駆細胞、神経幹細胞、又は間葉系幹細胞に由来する。
更なる実施形態では、上記ＥＶは、培養された細胞株、例えばＣＨＯ細胞株、ＨＥＫ２９３細胞株、又はＶｅｒｏ細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、上記ＥＶは、上記外因性結合剤を組み換え発現する細胞に由来する。
いくつかの実施形態では、上記ＥＶは小分子を更に含む。
いくつかの実施形態では、上記ＥＶは外因性核酸を更に含む。例えば上記外因性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はそれらの組み合わせである。
特定の実施形態では、上記ＥＶは外因性ポリペプチドを更に含む。
別の態様では、本発明は、上記のいずれかのＥＶの治療有効量と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、対象の血液脳関門を通ってＥＶを送達する方法も提供し、その方法は、上記対象に、本明細書に記載のＥＶのいずれかを含む組成物、又は本明細書に記載のＥＶのいずれかを含む医薬組成物を投与することを含む。
特定の実施形態では、上記組成物は、静脈内、動脈内、又は鼻腔内に投与される。他の実施形態では、組成物は、経口で、筋肉内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、頭蓋内に、皮下に、又は吸入によって投与される。
いくつかの実施形態では、上記ＥＶは上記対象の脳に送達される。一実施形態では、上記ＥＶは、上記対象の中枢神経系に送達される。
ある態様では、本発明は、治療剤と結合した、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する結合剤を含むコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、上記外因性結合剤は、血液脳関門を通っての治療剤の輸送を増強する。
一実施形態では、上記結合剤はポリペプチドである。一実施形態では、上記結合剤は、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質のポリペプチドリガンドである。
他の実施形態では、上記結合剤は、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分である。特定の実施形態では、上記結合剤は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、及びシングルドメイン抗体からなる群から選択される抗体フラグメントである。
一実施形態では、上記結合剤は、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合するアプタマーである。
上述の態様のいくつかの実施形態では、上記結合剤は、表１に記載の標的タンパク質に特異的に結合する。他の実施形態では、上記結合剤は、表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、上記結合剤は、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＣＤ７４、ＣＤ１６４、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＬＡ‐ＤＯＡ、ＨＯＸＤ４、ＩＦＮＬＲ１、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＨＴＲ６、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＣＨＲ２、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７、ＶＬＤＬＲ若しくはＺＰ２、Ｂ３ＧＡＴ１修飾タンパク質、ＳＴ８ＳＩＡ３修飾タンパク質、又はそれらの組み合わせから選択される内皮細胞タンパク質に特異的に結合する。例示の実施形態では、上記結合剤は、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＯＸＤ４、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７、及びＶＬＤＬＲからなる群から選択される標的タンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態では、上記結合剤は、ＫＣＮＴ２、ＯＲ４Ｘ２、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴ２Ｄ２、ＴＭＥＤ１０、及びＶＬＤＬＲからなる群から選択される標的タンパク質に特異的に結合する。
一実施形態では、上記結合剤は、表１又は表２に記載の標的タンパク質のポリペプチドリガンドである。いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドリガンドは、表１に記載の結合剤、又は本明細書に記載の標的タンパク質に結合する能力を保持したそれらの断片若しくは部分のうちの、１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、上記結合剤は、本明細書に記載のＡ２Ｂ５抗体（Ａｂｃａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）カタログ番号ａｂ５３５２１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニューヨーク州グランドアイランド）カタログ番号４３３１１０）、ＡＣＲ、ＡＤＡＭ２、ＡＤＲＢＫ１、ＡＰ２Ｍ１、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＲ、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ７４、ＣＬＵ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＦ、ＣＴＳＨ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームａ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｂ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｃ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｄ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｅ、ＤＱＢ１、ＤＲＢ３、ＥＲＢＢ４、Ｅ‐セレクチン、ＨＬＡ‐ＤＯＢ、ＨＬＡ‐ＤＰＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ２、ＨＬＡ‐ＤＱＢ１、ＨＬＡ‐ＤＱＢ２、ＨＬＡ‐ＤＲＡ、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１、ＨＬＡ‐ＤＲＢ３、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ラミニン（ラミニンサブユニットγ‐１）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐２）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐１）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐２）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐１）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐５）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐３）、ラミニン（ラミニンサブユニットγ‐３）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐４）、ラミニン（ラミニンサブユニットγ‐２）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐３）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐４）、ＬＧＭＮ、ＬＰＬ、ＬＲＰＡＰ１、ＭＩＦ、ＭＭＰ１、ＯＶＧＰ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＮＰ、ＰＰＡＲＡ、Ｐｒｏ‐ＭＣＨ、ＰＳＡＰ、Ｐ‐セレクチン、ＲＥＬＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＺＰ１、ＺＰ３、ＺＰ４、ＺＰＢＰ、又は本明細書に記載の標的タンパク質に結合する能力を保持したそれらの断片若しくは部分から選択される、タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、上記結合剤は上記治療剤に直接結合される。いくつかの実施形態では、上記結合剤はリンカーによって上記治療剤と共有結合される。例えばリンカーは、ペプチドリンカー又は小分子リンカーであることができる。
特定の実施形態では、上記治療剤は小分子である。一実施形態では、上記治療剤はペプチドである。一実施形態では、上記治療剤はポリペプチドである。特定の実施形態では、上記治療剤は核酸である。例えば核酸は、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ分子、プラスミド、コスミド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｇＲＮＡであることができる。
特定の実施形態では、上記結合剤は、二重特異性抗体又はその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、上記二重特異性抗体又はその抗原結合部分は、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合部位と、神経疾患抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む。
他の態様では、本発明は、対象の血液脳関門を通って治療剤を送達する方法を提供し、その方法は、上記対象に、請求項４０～５８のいずれか１項に記載のコンジュゲートを投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記コンジュゲートは静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、上記コンジュゲートは鼻腔内に投与される。いくつかの実施形態では、上記コンジュゲートは動脈内に投与される。他の実施形態では、上記コンジュゲートは、経口で、筋肉内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、頭蓋内に、皮下に、又は吸入によって、投与される。
一実施形態では、上記コンジュゲートは上記対象の脳に送達される。いくつかの実施形態では、上記コンジュゲートは、上記対象の中枢神経系に送達される。
ＣＦＳＥ標識ＥＶで処置された付着ＨＣＭＥＣ／Ｄ３細胞の７．５時間及び２３．７５時間の時点での代表的な画像を示す。画像は２０倍の倍率で撮影されている。 細胞選別のためのゲーティング戦略を示す。イベントを３つの連続したゲートに基づいてゲーティングした。まず、ＦＳＣ面積対ＳＳＣ面積を用いて、デブリから細胞を分離した（Ｒｌ、左側）。次に、ＳＳＣ幅対ＳＳＣ高さを用いて、ダブレットから単一細胞を分離した（Ｒ２、中央）。最後に、細胞のうち４８８‐ＳＳＣ高さ値が最も低い３～４％（Ｒ４、右側）をシーケンシング用に保持した。 調整されたｐ値の負のｌｏｇ１０、及びｌｏｇ２倍率変化をプロットしている、ｇＲＮＡシーケンスアラインメントのボルケーノプロットである。ｐ値が０．０５未満の正の倍率変化を示すもの（赤色の丸）を、更なる分析のために選択した。 ノックダウンの減少が検証研究において約３４％～約８８％であったことを示す。細胞のみの場合及び対照の場合に対してスケーリングされた、８つのノックアウト細胞株の平均蛍光強度が示されている。連結された生物学的複製からの、対数変換された蛍光強度中央値を、細胞のみの場合（０％に設定）、及びＣＲＩＳＰＲ対照（１００％に設定）に対してスケーリングした。
Ａ．定義
本発明をより容易に理解できるように、初めに特定の用語を定義する。更に、あるパラメータの値又は値の範囲が記載されている場合は常に、記載されている値の間の値及び間の範囲も本発明の一部となることに留意されたい。
用語「約」又は「およそ」は通常、与えられている値又は範囲の５％以内、又はより好ましくは１％以内を意味する。
本明細書では、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、これらに限定するものではないが、所望の抗原結合活性を示すのであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ナノボディ、モノボディ、抗体ミメティック、及び抗体フラグメントなどの、標的抗原に結合する様々な構造を包含する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ジスルフィド結合で相互接続された４つのポリペプチド鎖、即ち２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えばＩｇＭ）を含む。各重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変領域（又はドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略す）、及び重鎖定常領域（又はドメイン）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、即ちＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略す）、及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、１‐Ｒ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスのものであってもよい。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へと更に細分化することができ、これらには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。
抗体の「抗体フラグメント」、「抗原結合断片」、又は「抗原結合部分」は、インタクト抗体の一部を含み、かつそのインタクト抗体が結合する抗体に結合する、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントは、通常は少なくとも１つ以上（即ち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。抗体フラグメントの例としては、これらに限定するものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’‐ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）や、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体などである。
用語「抗体ミメティック」又は「抗体模倣物」は、抗体とは構造的に関連していないものの、抗原に特異的に結合することができる分子を指す。抗体ミメティックの例としては、これらに限定するものではないが、アドネクチン（即ちフィブロネクチン系結合分子）、アフリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、ｎａｎｏＣＬＡＭＰ、ナノボディ、ユニボディ、バーサボディ、アプタマー、及びペプチド分子が挙げられ、これらは全て従来の抗体結合を模倣するものの、異なる機序から生成されて異なる機序によって機能する結合構造を用いる。用語「自家ＥＶ」は、ＥＶの投与対象である１人の対象又は患者由来の細胞から得られる、ＥＶの集団を記載するために使用される。
用語「アプタマー」は、特定の標的タンパク質に結合するオリゴ核酸又はペプチド分子を指す。これらの分子は一般的に、ランダム配列プールから選択される。選択されたアプタマーは、独自の三次構造が適合されて、高い親和性及び特異性で標的分子を認識することができる。核酸アプタマーは、その配座により標的タンパク質に結合するＤＮＡ又はＲＮＡオリゴ核酸である。核酸アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせによって構成されていてもよい。ペプチドアプタマーは、可変ペプチド配列が定常足場タンパク質に挿入された、コンビナトリアルタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの特定は、通常は、選択されたペプチドアプタマーが安定して発現され、細胞内において正しく折り畳まれる蓋然性を向上させる、ストリンジェントな酵母の二遺伝子雑種条件下で実施される。
「結合剤」は、関心のタンパク質標的に特異的に結合することができる作用剤を指す。例示の実施形態では、結合剤は、本明細書では「脳内皮細胞標的タンパク質」又は「血液脳関門標的タンパク質」とも呼ばれる、血液脳関門を含む脳又はＣＮＳの内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合することができる。例えば結合剤は、血液脳関門標的タンパク質に特異的に結合することができる、抗体又はその抗原結合部分、ポリペプチド（例えばリガンド）、アプタマーなどのうちのいずれか１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、細胞表面タンパク質、例えば受容体である。用語「外因性結合剤」は、小胞又は小胞が由来する細胞株の操作によってＥＶに導入される結合剤を指す。いくつかの実施形態では、外因性結合剤は、産生細胞から放出された後に小胞を操作することによって、ＥＶに導入されることができる。例えば外因性結合剤は、細胞ソースからのＥＶの単離後にＥＶに装填される又はＥＶに組み込まれる結合剤を指すことができる。外因性結合剤はまた、ＥＶが由来する細胞の外因性遺伝子から発現される場合もあり、例えばＥＶのソースとして役立つ細胞に組み換えによって導入された遺伝子から発現される場合もある。「外因性」は導入の方法を指し、ＥＶが由来する細胞内で自然に発現される作用剤と同一又は類似の配列を有する結合剤を排除するものではない（例えばいくつかの実施形態では、ＥＶは、結合剤の外因性及び天然の発現を含有し得る）。外因性結合剤は合成ＥＶにも組み込むことができる。用語「外因性結合剤」及び「結合剤」は相互交換可能なものとして使用される。
本明細書で使用される場合、用語「血液脳関門（ＢＢＢ）」は、循環血液中の分子がＣＮＳの細胞外液中に非選択的に入り込むのを防止する、内皮細胞の高度に選択的な半透性の境界を指す。血液脳関門は、毛細血管壁の内皮細胞、毛細血管を覆う星状膠細胞のエンドフィート、及び毛細血管基底膜に埋め込まれた周皮細胞を含む。血液脳関門は、末梢に投与された様々な外因性分子がＣＮＳに到達して、ＣＮＳ内で生理学的に有意な濃度となるのを防止する。
用語「脳内皮細胞」又は「血液脳関門（ＢＢＢ）内皮細胞」は、脳及び中枢神経系で形成される血管に存在する内皮細胞を指す。中枢神経系で形成される血管は、血管と脳及びＣＮＳの組織との間でのイオン、細胞、及び他の作用剤の通過を、厳密に調節する。本明細書では単に「標的タンパク質」とも呼ばれる「脳内皮細胞によって発現される標的タンパク質」は、脳内皮細胞の表面に局在するタンパク質である。このような細胞表面タンパク質は本明細書中に記載されており、更に本明細書に記載の方法及び当該技術分野で公知の方法を用いて特定されることができる。本明細書に記載の結合剤は、例えば野生型標的タンパク質又は天然の多様体、例えばスプライスアイソフォーム、一塩基多型、断片、糖タンパク質などに存在する、標的タンパク質のエピトープ又は領域に結合し得る。このようなエピトープは、アミノ酸及び／又はアミノ酸修飾、例えば炭水化物若しくは脂質修飾を含む標的タンパク質の領域を包含し得る。
本明細書で使用される場合、用語「積み荷」は、血液脳関門を通っての積み荷の送達を促進する、本明細書で開示される結合剤によって体内の標的位置（例えば神経系）へと送達されることができる１つ以上の分子を指す。積み荷としては例えば、これらに限定するものではないが、小分子（例えば小分子薬物）、核酸（例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、タンパク質若しくはペプチド（例えばホルモン、増殖因子、酵素、抗凝固剤、インターフェロン、インターロイキン、抗体、抗体フラグメント、抗体‐薬物コンジュゲートなど）、エクソソーム、又はリポソームなどである。いくつかの実施形態では、積み荷は治療用分子である。いくつかの実施形態では、積み荷は、結合剤に直接又は間接的に付着されることができる。他の実施形態では、積み荷は、本明細書で提供されるような、結合剤を含むＥＶを用いて送達される。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非隣接抗原結合部位を指す。これらの特定の領域については、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609‐6616 (1977)及びKabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991)によって、Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901‐917 (1987)によって、並びにMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732‐745 (1996)によって記載されており、ここで定義には、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。上述の各文献によって定義されているＣＤＲを包含するアミノ酸残基が、比較のために記載される。好ましくは、用語「ＣＤＲ」は、配列比較に基づいてＫａｂａｔによって定められたＣＤＲである。
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列がある種に由来し、かつ定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、かつ定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことが意図される。
用語「中枢神経系」（ＣＮＳ）は、有機体（例えば対象）の脳及び脊髄を含む神経系の一部を指す。
本明細書で使用される場合、薬剤を「ＣＮＳの遠位に」又は「末梢に」投与する、「末梢投与」などの文脈における用語「遠位」及び「末梢」は、血液脳関門によってＣＮＳから離れた部位において、薬剤を対象に投与することを指す。薬剤を末梢に又はＣＮＳの遠位の部位に投与する場合、薬剤はＣＮＳに到達するために血液脳関門を通過しなければならない。末梢投与又はＣＮＳの遠位の部位での投与は、これらに限定するものではないが、静脈内、鼻腔内、腹腔内、及び経口投与などの多数の投与経路によることができる。
本明細書で使用される場合、用語「有効量」又は「治療有効量」は、障害若しくはその１つ以上の症状の重篤度及び／又は期間を低減又は改善する、障害の進行を防止する、障害の軽減を引き起こす、障害に関連する１つ以上の症状の再発、発症、兆候、又は進行を防止する、あるいは別の療法の予防又は治療効果を増強又は改善するのに十分な薬剤、例えばＥＶ（例えばエクソソーム）を含む組成物の量を指す。
用語「胚性幹細胞」又は「ＥＳＣ」は、多能性細胞、好ましくはヒトを含む霊長類の胚盤胞期の胚から単離された多能性細胞を指す。
「輸送を増強する」という文脈における用語「増強する、増強する」、「増大させる」、「優れた」などは、上記外因性結合剤なしで血液脳関門を通ってのＥＶの輸送と比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、又はそれより多い血液脳関門のＥＶ輸送での増大を指す。
本明細書では、用語「細胞外小胞」及び「ＥＶ」は、脂質二重層、例えば細胞膜の一部によって取り囲まれた、約１０ｎｍ～１０μｍの小胞を指すために使用される。ＥＶは、例えば細胞からの流体、巨大分子、溶質、及び代謝物を含有することができる。用語「ＥＶ」は、外因性薬剤（例えば外因性ポリペプチド）を産生／発現するように操作又は修飾された組み換え細胞ソースから単離された小胞を包含し、その薬剤はＥＶに組み込まれる。用語「ＥＶ」は、外因性薬剤（例えば外因性ポリペプチド）を含有するように単離後に操作された（例えば装填された）小胞も包含する。用語「ＥＶ」はまた、神経ＥＶなどの細胞由来のＥＶに見られる生物活性分子を含有するように操作された人工脂質小胞も含む。用語ＥＶは、エクソソーム及びエクトソームの両方を包含する。ＥＶは、複数の単離技法、例えば遠心分離法、ろ過法、及び超遠心分離法の組み合わせを用いて、適切な生物学的ソースから得ることができる。エクソソームは、多小胞体（ＭＶＢ）のエキソサイトーシスにおいて放出される。エクトソームは、原形質膜において集合して原形質膜から放出される小胞である。場合によって、ＥＶのサイズは約２０ｎｍ～１０μｍ、２０ｎｍ～１μｍ、２０ｎｍ～５００ｎｍ、３０ｎｍ～１００ｎｍ、３０ｎｍ～１６０ｎｍ、又は８０ｎｍ～１６０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、サイズが約２０ｎｍ～２５０ｎｍのエクソソームである。実質的にいずれのソースに由来するＥＶであっても、本明細書で提供される組成物及び方法に使用されることができる。例示の実施形態では、ＥＶは、これらに限定されるものではないが、初代細胞、幹細胞／前駆細胞、形質転換細胞、及び樹立細胞株などの培養された哺乳類細胞から単離されることができる。いくつかの実施形態では、ＥＶは、神経細胞（例えば神経前駆細胞、神経幹細胞、グリア細胞、星状膠細胞、希突起膠細胞、ニューロンなど）から単離されることができる。ＥＶはまた、これらに限定されるものではないが、全血、血清、血漿、母乳、脳脊髄液、羊水、腹水、又は骨髄などのいずれの適した生物学的試料からも単離されることができる。
用語「Ｆｃドメイン」は、インタクト抗体のパパイン消化によって生成されることができる、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃドメインは、天然配列Ｆｃドメイン又は多様体Ｆｃドメインであってもよい。免疫グロブリンのＦｃドメインは、一般的に２つの定常ドメイン、即ちＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、また任意でＣＨ４ドメインを含むことができる。Ｆｃ部分でのアミノ酸残基を置換して抗体エフェクタ機能を改変することは、当該技術分野において公知である（Winter, et al.、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃドメインは、例えば抗体及び抗体－抗原複合体のサイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び半減期／クリアランス率などの、複数の重要なエフェクタ機能に介在する。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン含有結合タンパク質のＦｃドメイン内において少なくとも１つのアミノ酸残基が改変（例えば削除、挿入、又は置換）されることにより、その結合タンパク質のエフェクタ機能が改変される。
本明細書で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体を指す。更に、抗体が定常領域を含有する場合、その定常領域もヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来である。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダムな若しくは部位特異的な変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図されていない。
用語「ヒト化抗体」は、マウスなどの１つの哺乳類種の生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を指すことが意図される。更なるフレームワーク領域の修飾を、ヒトフレームワーク配列内で実施してもよい。例えば非ヒト抗体である抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化がなされた抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「インタクト」又は「全長」抗体は、４つのポリペプチド鎖、即ち２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む抗体を指す。一実施形態では、インタクト抗体はインタクトＩｇＧ抗体である。
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、その集団を構成する個々の抗体は、可能性のある多様体抗体、例えば自然に発生する変異を含有する又はモノクローナル抗体の生成中調製物の生成中に発生する可能性のある多様体抗体（このような多様体は一般的に微量だけ存在する）を除いて、同一であり及び／又は同一のエピトープに結合する。異なる複数の決定基（エピトープ）に対する異なる複数の抗体を一般的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１つの抗原での単一の決定基に向けられる。よって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、何らかの特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、これらに限定するものではないが、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む、多様な技法によって作製されることができ、モノクローナル抗体の作製のためのこれらの方法及び他の例示の方法が、本明細書で説明される。
「多重特異性抗原結合ポリペプチド」又は「多重特異性抗体」は、２つ以上の抗原又はエピトープを標的とするものである。「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、又は「二重機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」抗原結合ポリペプチド又は抗体はそれぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合ポリペプチド又は抗体である。二重特異性抗原結合ポリペプチド及び抗体は、多重特異性抗原結合ポリペプチド又は多重特異性抗体の例であり、これらに限定するものではないが、ハイブリドーマの融合、又はＦａｂ’断片の連結を含む、多様な方法で生産されることができる。例えばSongsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315‐321、Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547‐1553, Brinkmann and Kontermann. 2017. MABS. 9(2):182‐212を参照。二重特異性抗原結合ポリペプチド又は抗体の２つの結合部位は、例えば、２つの異なるエピトープに結合することになり、それらは同一のタンパク質標的にあっても、異なるタンパク質標的にあってもよい。
用語「神経細胞」は、神経系に関連する細胞を指す。用語「神経細胞」は、神経幹細胞、例えば神経前駆（ＮＰ）細胞及び分化した神経細胞を包含する。いくつかの実施形態では、分化した神経細胞は、神経幹細胞、ＮＰ細胞、又は多能性幹細胞から、インビトロで得ることができる。例示の神経細胞としては、ニューロン、グリア細胞、星状細胞、希突起膠細胞、ミクログリア細胞、シュワン細胞、又は神経膠細胞などである。他の実施形態では、神経細胞はＮＰ細胞又は神経幹細胞であることができる。用語「神経前駆細胞」及び「神経幹細胞」は、複数の神経細胞及びグリア細胞型のうちの限られたレパートリーに分化する能力を有する多分化能細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＮＰ細胞は、多能性幹細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から、インビトロで得ることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で言及される神経細胞はヒト神経細胞である。例示の実施形態では、本明細書で言及されるＮＰ細胞はヒトＮＰ細胞である。いくつかの実施形態では、ＮＰ細胞は形質転換されていないものであることができる。いくつかの実施形態では、ＮＰ細胞は増殖性である。いくつかの実施形態では、ＮＰ細胞は、分化することなく表現型を維持する。
用語「神経ＥＶ」は、神経細胞、例えば神経幹細胞、例えば神経前駆細胞に由来するＥＶを指すために使用される。この用語はまた、細胞由来のＥＶに見られる十分な数の生物活性分子を含有することによって、実質的に同一の生物学的活性を有するように操作された小胞を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」は、化合物の生物学的活性又は特性を無効化しない、毒性が比較的低い、担体又は希釈剤などの材料を指す。即ち、その材料は、望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、又はその材料が含有される組成物のいずれの成分とも有害な相互作用を起こすことなく、個体に投与されることができる。いくつかの例では、「薬学的に許容可能な」は、合理的な利益／リスク比で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は合併症を伴わずに、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物を指す。
用語「多能性幹細胞」（「胚性幹細胞」（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）はそのサブセットである）は、受精後のいずれかの時点での前胚性、胚性、胎児組織又は成体幹細胞（人工多能性幹細胞の場合）に由来し、適切な条件下において、神経幹細胞及び前駆細胞、神経堤細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、並びに関連する増殖性及び非増殖性神経細胞を特に含む、複数の異なる細胞型の子孫を産生することができるという特徴を有する。その用語は、様々な種類の幹細胞の樹立株と、本明細書に記載されているような多能性を有する、一次組織から得られた細胞との両方を含む。
本明細書で使用される場合、用語「試料」は、対象から採取された標本（例えば細胞（例えば神経細胞）、組織、血液、血液成分（例えば血清又は血漿）、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、膵液、絨毛膜絨毛試料、及び骨髄）を指す。
用語「特異的に結合する」は、公知の方法を用いて測定されることができる、タンパク質の混合物中のある標的タンパク質への選択的結合を指す。例えば抗体である結合剤の場合、特異的結合は、標的タンパク質のエピトープに対して生じる。通常は、抗体は、例えば標的タンパク質を分析物として及び抗体を結合剤として使用したＢＩＡＣＯＲＥ２０００装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した場合に、およそ１０－６Ｍ未満、例えばおよそ１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、若しくは１０－１０Ｍ未満の、又は更に低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、そして非特異的標的（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合の親和性の少なくとも２倍の親和性で、標的タンパク質に結合する。場合によっては、「特異的に結合する」は、非特異的標的への結合の親和性の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１００倍、１０００倍、又は更に高い親和性である標的タンパク質に対する結合剤の結合を指す。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、投与又は治療の標的であるいずれかの生物を指す。「対象」は、生物、例えば哺乳類（例えばヒト、非ヒト哺乳類、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、ネコ、又はイヌ）であることができる。一実施形態では、対象はヒト対象である。用語「患者」は、臨床医、例えば内科医の治療下にあるヒト対象を指す。対象はオスであってもメスであってもよい。
用語「治療する」及び「治療」は、疾患、病的状態、若しくは障害の改善、軽減、安定化（即ち悪化させないこと）、予防、又は治癒を目的とした、対象の医学的管理を指す。この用語は、能動的治療（疾患、病的状態、又は障害の軽減を目的とした治療）、原因治療（関連する疾患、病的状態、又は障害の原因に向けられた治療）、緩和治療（症状の緩和のために設計された治療）、予防治療（関連する疾患、病的状態、若しくは障害の発症を最小限に抑える、又は部分的に若しくは完全に阻害することを目的とした治療）、及び支持治療（別の療法を補足するために使用される治療）を含む。治療はまた、検出可能か検出不可能かにかかわらず、疾患又は状態の程度の減少、疾患又は状態の拡大の防止、疾患又は状態の進行の遅延若しくは低速化、疾患又は状態の改善若しくは緩和、及び寛解（部分的な又は完全な）を含む。疾患又は状態を「軽減する」又は「緩和する」とは、治療を行わない場合の程度又は時間経過と比較した場合に、疾患、障害、若しくは状態の程度及び／若しくは望ましくない臨床症状が減少する、並びに／又は進行の時間経過が遅く若しくは長くなることを意味する。治療は、症状又は疾患の完全な軽減を必要とせず、症状及び／又はその根底にあるリスク因子を低減する実施形態を包含する。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存が延長されることも意味することができる。治療を必要とする者としては、状態又は障害を既に有する者、及び状態若しくは障害を起こしやすい者、又は状態若しくは障害を予防すべき者などである。用語「予防する」は、事象の可能性を１００％排除することを要求するものではない。むしろこの用語は、事象の発生の可能性が、化合物又は方法の存在時に低下したことを示す。
本発明により、当該技術分野における従来の細胞培養方法、化学合成方法、並びに他の生物学的及び薬学的技法を用いてもよい。このような技法は公知であり、そうでない場合でも文献に十分に記載されている。細胞の増殖のための標準的な技法、細胞の分離のための標準的な技法、並びに関連する場合には、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどが関与する酵素反応のためのクローニング、ＤＮＡの単離、増幅及び精製のための標準的な技法、並びに様々な分離技法は、当業者によって知られておりかつ一般的に使用されているものである。多数の標準的な技法が、Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York、Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York、Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I、Wu (Ed.) 1979 Meth. Enzymol. 68、Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101、Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65、Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York、Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley、Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology、Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK、Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK;及びSetlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1‐4, Plenum Press, New Yorkに記載されている。略語及び命名法が使用されている場合、これらは当該技術分野において標準的な、本明細書で引用されているものなどの専門誌において一般的に使用されているものとみなされる。
ある値の範囲が提供されている場合、文脈からそうでないことが明らかでない（多数の炭素原子を含む基の場合など。この場合には、その範囲内にある各炭素原子数が提供される）限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１／１０までの各中間値、及び言及されている範囲内の他のいずれかの言及されている値又は中間値が、明示的に言及されているようにして、本発明に含まれることが理解される。その範囲に独立して含まれ得る、これらのより小さな範囲の上限及び下限もまた、言及されている範囲内の特に除外された限界を条件として、本発明に含まれる。
異なる定義がされていない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等であるいずれの方法及び物質も本発明の実施又は試験に使用されることができるが、ここでは好ましい方法及び物質について説明する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ある（ａ、ａｎ）」及び「上記、前記（ｔｈｅ）」は、文脈からそうでないことが明確でない限り、複数についての言及を含む。
Ｂ．血液脳関門の通過を促進する標的タンパク質及び結合剤を特定する方法
本開示は、結合剤と結び付けられた薬剤及び分子の血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を促進する、内皮細胞タンパク質標的及び結合剤を特定する方法を提供する。いくつかの態様では、このような方法は、（ｉ）ＢＢＢを通っての分子の輸送においてある役割を果たし、更に外因性作用剤のＢＢＢの通過を調節することができる内皮標的タンパク質を特定する方法と、（ｉｉ）その特定された内皮細胞標的タンパク質に特異的に結合し、更にＢＢＢを通って結合剤及び結び付けられた積み荷が脳及び／又はＣＮＳへと送達されることができるように、作用剤に結び付けられた薬剤及び分子の輸送を増強することができる作用剤を特定する方法とを含む。
（ｉ）内皮標的タンパク質を特定する方法
いくつかの態様では、本開示は、脳又はＣＮＳの血管又は微小血管内皮細胞で発現されるタンパク質をスクリーニングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、このスクリーニングは、ＢＢＢを通っての分子の輸送においてある役割を果たし、また外因性作用剤のＢＢＢの通過を調節することができる、内皮標的タンパク質を特定することができる。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）単一遺伝子ノックダウン（又はノックアウト）を脳内皮細胞の集団に導入するステップと、（ｂ）その内皮細胞の集団を、ＢＢＢを通過できる作用剤、例えば神経前駆ＥＶと接触させるステップと、（ｃ）その内皮細胞の集団によるＥＶの取り込みを測定するステップと、（ｄ）対照に比べてＥＶの取り込みが減少した／少ない細胞を選択するステップと、（ｅ）選択された細胞でノックダウンされたタンパク質を、候補標的タンパク質として特定するステップとを含む。任意で、いくつかの実施形態では、その方法は更に、アラインメント及び示差的発現アルゴリズム、遺伝子発現データ、並びに／又は細胞内局在性データを用いて、候補標的タンパク質のプールを絞り込むステップを含むことができる。
更にいくつかの実施形態では、上記方法は更に、候補標的タンパク質を機能的に確認するステップを含むことができる。例えば候補標的タンパク質は、脳内皮細胞の各候補標的タンパク質をノックダウンし、細胞を、ＢＢＢを通過できる作用剤、例えば神経前駆ＥＶと接触させ、内皮細胞による作用剤の取り込みの減少を示す標的タンパク質を選択することによって確認されることができる。更に又はあるいは、候補標的タンパク質は、脳内皮細胞を、候補標的タンパク質に特異的に結合する作用剤と接触させ、作用剤の取り込みの増大を示す標的タンパク質を選択することによって、確認されることができる。例示の結合剤としては、これらに限定するものではないが、本明細書に記載されているもの、例えば抗体又はその抗原結合部分、ポリペプチドリガンド、アプタマーなどである。いくつかの実施形態では、結合剤を積み荷と結合させることができる。例示の積み荷としては、例えば小分子（例えば小分子薬物）、核酸（例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、タンパク質若しくはペプチド（例えばホルモン、増殖因子、酵素、抗凝固剤、インターフェロン、インターロイキン、抗体、抗体フラグメント、抗体‐薬物コンジュゲートなど）、ＥＶ（例えばエクソソーム若しくは微小胞）、又はリポソームなどである。いくつかの実施形態では、結合剤はＥＶに結合されることができる。
いくつかの実施形態では、ＢＢＢを通っての分子の輸送においてある役割を果たす内皮標的タンパク質を特定する方法は、単一遺伝子ノックダウン（又はノックアウト）を脳又はＣＮＳの血管内皮細胞の集団に導入するステップを含む。いくつかの実施形態では、脳又はＣＮＳの内皮細胞は、対象、例えばヒトから得られた初代脳内皮細胞である。いくつかの実施形態では、脳又はＣＮＳの内皮細胞は、継代、非形質転換、又は形質転換脳内皮細胞、例えばｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞である。いくつかの実施形態では、脳又はＣＮＳの内皮細胞は、ヒト細胞である。形質転換されたヒト脳内皮細胞培養物は、インビトロでＢＢＢを模倣するために使用されており、ＨＣＭＥＣ／Ｄ３（Ｄ３）という名称で市販されている（例えばWeksler, B., I.A. Romero, and P.‐O. Couraud, The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and barriers of the CNS, 2013. 10(1): p. 16‐16を参照）。
いくつかの実施形態では、単一遺伝子ノックダウン又はノックアウトは、細胞の集団の単一の標的遺伝子をノックダウンすることによって生成されることができる。他の実施形態では、単一遺伝子ノックダウン又はノックアウトは、細胞の集団での複数の標的遺伝子をノックダウンすることによって生成されることができ、該集団の各細胞でほぼ１つのノックダウンされた遺伝子となる（例えば単一遺伝子ノックダウンを達成するように希釈されたライブラリ、例えばＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９ライブラリ、ｓｉＲＮＡライブラリなどを用いる）。脳又はＣＮＳの内皮細胞で発現される遺伝子をノックダウン（又はノックアウト）するために、各細胞が単一遺伝子ノックダウンを備えた細胞の集団の形成など、当該技術分野で公知のいずれの方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、細胞集団内の各細胞がノックアウトされた１つの遺伝子を有するように単一遺伝子ノックダウン（又はノックアウト）を脳又はＣＮＳの内皮細胞の集団に導入するために、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９システムが用いられる（例えばHorlbeck, M.A., et al., Compact and highly active next‐generation libraries for CRISPR‐mediated gene repression and activation. Elife, 2016. 5を参照）。
いくつかの実施形態では、作用剤がＢＢＢを通過できるように内皮細胞の機能を調節することができる内皮標的タンパク質を特定する方法は、単一遺伝子ノックダウンを含む脳又はＣＮＳの内皮細胞の集団を、関心の作用剤を取り込む能力に関してスクリーニングするステップを含む。理論によって束縛されることを望むものではないが、ポジティブ及びネガティブの一般的な２つの種類のスクリーニングが存在する。ポジティブスクリーニングでは、所望の細胞のコホートの選択が、蛍光表現形に基づくＦＡＣＳ、又は当該技術分野で利用可能な他のいずれかのシグナル発生方法によってなされることができる。ポジティブスクリーニングは、インフルエンザウイルス感染経路の特定に良好に使用された（Heaton, B.E., et al., A CRISPR Activation Screen Identifies a Pan‐avian Influenza Virus Inhibitory Host Factor. Cell Rep, 2017. 20(7): p. 1503‐1512、Han, J., et al., Genome‐wide CRISPR/Cas9 Screen Identifies Host Factors Essential for Influenza Virus Replication. Cell Rep, 2018. 23(2): p. 596‐607）。ネガティブスクリーニングでは、選択メカニズムで生き残らない細胞が特定されて、その遺伝子の配列が決定される。ネガティブスクリーニングは、特定の条件下での成長／生存に不可欠な遺伝子の特定に使用されることができる。いくつかの実施形態では、内皮標的タンパク質を特定する上記方法は、ポジティブスクリーニングを用いて細胞をスクリーニングするステップを含む。いくつかの実施形態では、内皮標的タンパク質を特定する上記方法は、ネガティブスクリーニングを用いて細胞をスクリーニングするステップを含む。
いくつかの実施形態では、作用剤がＢＢＢを通過できるように内皮細胞の機能を調節することができる標的タンパク質をスクリーニングする上記方法は、単一遺伝子ノックダウン（又はノックアウト）を含む細胞の集団を、ＢＢＢを通ってある程度まで輸送されることが知られている分子と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、ポジティブスクリーニングのために、上記分子は例えば蛍光タグ、例えばＦＩＴＣ、ＣＦＳＥによって標識される。神経幹細胞又は神経前駆細胞に由来するＥＶが、未知のメカニズムによってＢＢＢを通過できることが示されている。従っていくつかの実施形態では、神経前駆細胞株に由来するＥＶを、遺伝子ノックダウン（又はノックアウト）を含む内皮細胞の集団と接触させ、内皮細胞によるこれらの取り込みを試験するために使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞によるＥＶの取り込みをフローサイトメータで検出できるように、神経前駆ＥＶが蛍光標識される。いくつかの実施形態では、ＥＶの取り込みに関与するタンパク質の発現を（遺伝子ノックダウンによって）欠く細胞は、取り込みが障害されない細胞に比べて蛍光が減少し、これによりＢＢＢを通っての分子の輸送に関与する内皮タンパク質が示される。いくつかの実施形態では、上記スクリーニング方法は、対照より蛍光が弱い（これはＥＶの取り込みの減少を示す）細胞を選択するステップを含む。
いくつかの実施形態では、例えば脳又はＣＮＳの内皮細胞内での蛍光強度によって測定される、細胞の集団への標識分子の取り込みの生データを、当該技術分野で公知のアルゴリズム、例えば（ｉ）バッチ効果を除去したＭｏｄｅｌ‐ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ‐ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（「ＭＡｇｅＣＫ」）（Li, W., et al., Genome Biology, 2014;15(12):554）プロトコル、（ｉｉ）バッチ効果を除去していないＭＡｇｅＣＫ ｇＲＮＡアラインメント、（ｉｉｉ）ＤＥＳｅｑ２発現差異解析、及び（ｉｖ）ＤＥＳｅｑ２発現差異解析とペアリングされたＭＡｇｅＣＫアラインメント、を用いて分析することによって、標的タンパク質のヒットを提供することができる。いくつかの実施形態では、初期に特定された候補標的タンパク質（例えばｇＲＮＡの数、ｐ値によって特定）を、遺伝子発現データ及び細胞内局在性データを用いて更に分析して、候補標的タンパク質のプールを絞り込む。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質を特定する方法は更に、例えばＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９システムを用いて、例えば各遺伝子を標的化するＣＡＳ９及びｇＲＮＡレンチウイルス粒子を細胞に導入することで、脳又はＣＮＳ血管内皮細胞中の各候補標的タンパク質をノックダウンすることによって候補標的タンパク質を確認するステップと、ノックダウン細胞を、ＢＢＢを通って輸送されることが知られている分子、例えば神経前駆ＥＶと接触させるステップと、フローサイトメトリーを用いて、内皮細胞による蛍光標識分子、例えばＥＶの取り込みの減少に関するスクリーニングを行うステップとを含む。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質を特定する方法は更に、標的タンパク質に特異的に結合する作用剤を用いて、脳又はＣＮＳ血管内皮細胞を処理すること（これは標的タンパク質のノックダウン又はノックアウトを含まない）によって、候補標的タンパク質を確認するステップと、内皮細胞によるその作用剤の取り込みの増大に関するスクリーニングを行うステップとを含む。いくつかの実施形態では、結合剤は例えば蛍光標識であるレポータで標識され、スクリーニングは、例えばフローサイトメトリーを用いて、内皮細胞によるレポータの取り込みの増大を識別するために実施される。
上記スクリーニングに使用されることができる更なる標識は当該技術分野で公知であり、例えば放射性同位体標識などである。放射性同位体標識の有無は、公知の技法を用いて内皮細胞内において検出されることができる。
（ｉｉ）結合剤を特定する方法
いくつかの実施形態では、候補結合剤は、インタクトな内皮細胞を（インビトロ又はインビボで）候補結合剤と接触させ、内皮細胞によるこれらの取り込みを調べることによってスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、候補結合剤は、例えば蛍光標識又は放射性同位体標識であるレポータと結合されることができる。いくつかの実施形態では、上記候補結合剤は治療剤と結合されることができる。いくつかの実施形態では、候補結合剤を、例えば融合遺伝子構築物、リンカー、共有若しくは非共有結合、ウイルスベクター、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９システム、又は当該技術分野で利用可能ないずれかの方法を用いて、ＥＶにおいて外因的に発現させることができる。いくつかの実施形態では、ＥＶは、蛍光、例えばＣＦＳＥで標識されることができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合剤の取り込みは、例えば内皮細胞への取り込みを調査することによって、インビトロで調査される。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合剤の取り込みは、例えば１つ以上の結合剤を末梢に対象に投与した後の対象の脳への取り込みを調査することによって、インビボで調査される。いくつかの実施形態では、対象に対する放射性同位体標識ＥＶの末梢投与後に、脳及び全身単一光子放出分光法を用いて、脳内及び全身にわたる放射性同位体の相対強度を測定することによって、ＥＶの取り込みをインビボで評価する。
いくつかの態様では、本開示は、特定された内皮細胞標的タンパク質に特異的に結合し、ＢＢＢを通っての作用剤及びそれに結び付けられた分子の輸送を増強することができる、作用剤を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）ＢＢＢを通っての分子の輸送を調節することができることが特定された内皮標的タンパク質に対するリガンドを、候補結合剤として特定するステップと、（ｂ）各候補結合剤を神経前駆ＥＶで発現させるステップと、（ｃ）脳内皮細胞を、候補結合剤を発現するように修飾されたＥＶと接触させるステップと、（ｄ）内皮細胞によるそのＥＶの取り込みを測定するステップと、（ｅ）内皮細胞によるＥＶの増強された取り込みを引き起こす候補結合剤を特定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）候補結合剤として、ＢＢＢを通っての分子の輸送を調節することができることが特定された内皮標的タンパク質に対するリガンドを特定するステップと、（ｂ）各候補結合剤を神経前駆ＥＶで発現させるステップと、（ｃ）修飾されたそのＥＶを末梢に対象に投与するステップと、（ｄ）対象の脳内でのそのＥＶの取り込みを測定するステップと、（ｅ）ＣＮＳ送達に関してＥＶにＢＢＢを通過する能力の増強をもたらした候補結合剤を特定するステップとを含む。
いくつかの実施形態では、上記方法は、特定された内皮標的タンパク質のそれぞれに対するリガンドを特定することによって、候補結合剤を特定するステップを含む。いくつかの実施形態では、このような特定は、受容体‐リガンドのペアの既知のデータベース、例えばhttps://baderlab.org/CellCellInteractionsを用いて行われる。
Ｃ．血液脳関門の通過を促進する内皮標的タンパク質及び結合剤
本開示は、関心の内皮細胞タンパク質標的に特異的に結合することができる結合剤を提供する。本明細書で例示されるように、脳及び／又は中枢神経系の内皮細胞の表面で発現される特定のタンパク質は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通っての輸送においてある役割を果たすことが特定されている。これらの内皮細胞タンパク質に特異的に結合する作用剤は、その作用剤及びそれに結び付けられた分子の血液脳関門を通っての輸送を増強し、それによってその作用剤及び結び付けられた積み荷を脳及び／又はＣＮＳへと送達する。従って本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されているように血液脳関門を通っての輸送においてある役割を果たすことが特定されている、脳内皮細胞で発現される標的タンパク質のうちのいずれか１つ以上に結合するように設計された結合剤である。このような結合剤は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通っての物質の取り込みを促進することができ、例えば増強することができる。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されているように血液脳関門（ＢＢＢ）を通っての物質の移動を促進することが特定されている、特定の脳内皮細胞タンパク質（例えば脳内皮細胞での受容体）を提供する。本明細書で例示として特定された上記脳内皮細胞タンパク質は、表１及び２で提供される。これらの脳内皮細胞タンパク質のうちのいずれか１つ以上を本開示の結合剤によって標的化することによって、ＢＢＢを通っての物質（例えば治療用化合物、細胞外小胞など）の取り込みを増強することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、表１に記載の標的タンパク質に特異的に結合する結合剤を提供する。他の実施形態では、本開示は、表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合する結合剤を提供する。
本明細書に記載の組成物及び方法に使用されることができる結合剤としては、これらに限定するものではないが、標的タンパク質のポリペプチドリガンドなどである。ポリペプチドリガンドは、標的タンパク質に特異的に結合する標的タンパク質の天然リガンド又はその一部（例えば断片）であることができる。あるいは、修飾ポリペプチドリガンドが、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するために操作されることができ、この修飾リガンドは、標的タンパク質に特異的に結合する能力を保持している。表１で提供される各標的タンパク質の例示のポリペプチドリガンドは、右側の列に記載されている。更なる結合剤としては例えば、表１で提供される標的タンパク質又は表２で提供される標的タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分などである。
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Figure 2023515708000045
いくつかの実施形態では、上記結合剤は、Ｂ３ＧＡＴ１、ＣＤ７４、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＨＬＡ‐ＤＯＡ、ＨＴＲ６、ＩＦＮＬＲ１、ＭＣＨＲ２、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＣＤ１６４、ＶＬＤＬＲ、及びＺＰ２から選択される１つ以上の標的タンパク質に特異的に結合する。他の実施形態では、上記結合剤は、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＯＸＤ４、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７、又はＶＬＤＬＲから選択される１つ以上の標的タンパク質に特異的に結合する。他の実施形態では、上記結合剤は、ＫＣＮＴ２、ＯＲ４Ｘ２、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴ２Ｄ２、ＴＭＥＤ１０、又はＶＬＤＬＲから選択される１つ以上の標的タンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態では、上記結合剤は、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＰ２、及びＶＬＤＬＲから選択される１つ以上の標的タンパク質に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、表１で提供されるようなＣＤ７４のいずれかの既知のアイソフォームを含む、ＣＤ７４（ＨＬＡクラスＩＩ組織適合性抗原γ鎖。ＤＨＬＡＧ、ＨＬＡＤＧ、ＩＩ、Ｉａ‐γ、又はｐ３３としても知られる）に特異的に結合する。ＣＤ７４はクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と結合し、免疫応答の抗原提示を調節するシャペロンである。またこれは、コードされたタンパク質に結合したときに生存経路及び細胞増殖を開始させるサイトカインマクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）のための細胞表面受容体としても機能する。またＣＤ７４は、アミロイド前駆体（ＡＰＰ）と相互作用して、アミロイドβ（Ａｂｅｔａ）の産生を抑制する。いくつかの実施形態では、ＣＤ７４に結合する本明細書に記載の結合剤は、例えばＡＰＰ、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ７４、ＣＴＳＦ、ＣＴＳＬ、ＣＸＣＲ４、ＥＲＢＢ４、ＨＬＡ‐ＤＰＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ２、ＨＬＡ‐ＤＱＢ１、ＨＬＡ‐ＤＱＢ２、ＨＬＡ‐ＤＲＡ、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１、ＨＬＡ‐ＤＲＢ３、ＭＩＦ、ＡＰ２Ｍ１、ＡＲ、ＣＤ４４、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＨ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＬＧＭＮ、ＰＮＰ、及びＰＰＡＲＡから選択されるリガンドのうちのいずれか１つ以上を含むＣＤ７４のリガンド（又はＣＤ７４と相互作用することが示されているもの）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ７４に結合する結合剤は、ＣＤ７４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＣＤ７４に結合する抗体は、例えばミラツズマブなど、当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、ＨＬＡ‐ＤＯＡ（ＨＬＡクラスＩＩ組織適合性抗原、ＤＯα鎖。ＨＬＡ‐ＤＮＡ、ＨＬＡ‐ＤＺＡ、又はＨＬＡＤＺとしても知られる）に特異的に結合する。ＨＬＡ‐ＤＯＡの例示のアミノ酸配列は表１で提供される。ＨＬＡ‐ＤＯＡは、ＨＬＡクラスＩＩα鎖パラログに属する。ＨＬＡ‐ＤＯＡはＨＬＡ‐ＤＯＢとヘテロ二量体を形成する。このヘテロ二量体ＨＬＡ‐ＤＯは、Ｂ細胞のリソソーム内に見られ、ＭＨＣクラスＩＩ分子へのＨＬＡ‐ＤＭ仲介性ペプチドの負荷を調節する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ‐ＤＯＡに結合する結合剤は、例えばＨＬＡ‐ＤＯＢ、ＨＬＡ‐ＤＰＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ２、ＨＬＡ‐ＤＱＢ１、ＨＬＡ‐ＤＱＢ２、ＨＬＡ‐ＤＲＡ、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１、ＨＬＡ‐ＤＲＢ３、ＩＴＧＡ２、及びＭＭＰ１を含むＨＬＡ‐ＤＯＡのリガンド（又はＨＬＡ‐ＤＯＡと相互作用することが示されているもの）である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ‐ＤＯＡに結合する結合剤は、ＨＬＡ‐ＤＯＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＨＬＡ‐ＤＯＡに対する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されているような免疫化、計算モデリング技法、並びにインビトロ選択法（例えばファージディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイプラットフォーム）などの当該技術分野で利用可能な方法を用いて、容易に生成されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、表１で提供されるＶＬＤＬＲの既知のアイソフォームのいずれかを含む、ＶＬＤＬＲ（超低密度リポタンパク質受容体。ＣＡＭＲＱ１、ＣＡＲＭＱ１、ＣＨＲＭＱ１、ＶＬＤＬ‐Ｒ、及びＶＬＤＬＲＣＨとしても知られる）に特異的に結合する。ＶＬＤＬＲは、低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバーであるリポタンパク質受容体であり、ＶＬＤＬ‐トリグリセリド代謝及びリーリンシグナル伝達経路に関与する。この遺伝子での突然変異は、ＶＬＤＬＲに関連する小脳低形成を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＶＬＤＬＲに結合する本明細書に記載の結合剤は、例えばＡＰＯＥ、ＣＬＵ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ＬＰＬ、ＬＲＰＡＰ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＲＥＬＮ、及びＳＥＲＰＩＮＥ１から選択されるリガンドのうちのいずれか１つ以上を含むＶＬＤＬＲのリガンド（又はＶＬＤＬＲと相互作用することが示されているもの）である。いくつかの実施形態では、ＶＬＤＬＲに結合する結合剤は、ＶＬＤＬＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＶＬＤＬＲに対する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されているような免疫化、計算モデリング技法、並びにインビトロ選択法（例えばファージディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイプラットフォーム）などの当該技術分野で利用可能な方法を用いて、容易に生成されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、表１で提供されるＺＰ２の既知のアイソフォームのいずれかを含む、ＺＰ２（透明帯糖タンパク質２。ＯＯＭＤ６、ＺＰＡ、及びＺｐ‐２としても知られる）に特異的に結合する。ＺＰ２は、卵母細胞及び初期胚を取り囲む細胞外マトリックスである。これは、受精中及び着床前の発達中での様々な機能を備えた３つの糖タンパク質で構成される。グリコシル化された成熟ペプチドは、透明帯の構造成分の１つであり、先体反応精子の２次結合及び貫通において機能する。いくつかの実施形態では、ＺＰ２に結合する本明細書に記載の結合剤は、例えばＺＰ１、ＺＰ３、ＺＰ４、ＺＰＢＰ、ＡＣＲ、ＡＤＡＭ２、ＯＶＧＰ１、及びＰＰＡＲＡから選択されるリガンドのうちのいずれか１つ以上を含むＺＰ２のリガンド（又はＺＰ２と相互作用することが示されているもの）である。いくつかの実施形態では、ＺＰ２に結合する結合剤は、ＺＰ２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＺＰ２に対する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されているような免疫化、計算モデリング技法、並びにインビトロ選択法（例えばファージディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイプラットフォーム）などの当該技術分野で利用可能な方法を用いて、容易に生成されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、ＩＦＮＬＲ１（インターフェロンλ受容体１。ＣＲＦ２／１２、ＩＦＮＬＲ、ＩＬ‐２８Ｒ１、ＩＬ２８ＲＡ、及びＬＩＣＲ２としても知られる）、又は表１で提供されるＩＦＮＬＲ１のいずれかの既知のアイソフォームに特異的に結合する。クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーに属するＩＦＮＬＲ１は、インターロイキン１０受容体β（ＩＬ１０ＲＢ）と受容体複合体を形成する。この受容体複合体は、インターロイキン２８Ａ（ＩＬ２８Ａ）、インターロイキン２８Ｂ（ＩＬ２８Ｂ）、及びインターロイキン２９（ＩＬ２９）を含む密接に関連する３つのサイトカインと相互作用することが示されており、その３つのサイトカインは、Ｉ型インターフェロンに関連する。これらのサイトカインとの相互作用は、微生物の攻撃への応答に重要な役割を果たし、ＪＡＫシグナル伝達系を活性化することが示されている。いくつかの実施形態では、ＩＦＮＬＲ１に結合する本明細書に記載の結合剤は、例えばＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬＲ１、及びＩＬ１０ＲＢから選択されるリガンドのうちのいずれか１つ以上を含むＩＦＮＬＲ１のリガンド（又はＩＦＮＬＲ１と相互作用することが示されているもの）である。いくつかの実施形態では、ＩＦＮＬＲ１に結合する結合剤は、ＩＦＮＬＲ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＩＦＮＬＲ１に対する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されているような免疫化、計算モデリング技法、並びにインビトロ選択法（例えばファージディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイプラットフォーム）などの当該技術分野で利用可能な方法を用いて、容易に生成されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、ＨＴＲ６（５‐ヒドロキシトリプタミン受容体６。５‐ＨＴ６又は５‐ＨＴ６Ｒとしても知られる）に特異的に結合する。ＨＴＲ６の例示のアミノ酸配列は表１で提供される。タンパク質の７回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体ファミリーに属するＨＴＲ６は、Ｇｓαサブユニットと結合し、アデニル酸シクラーゼを刺激して、サイクリックＡＭＰ依存性シグナル伝達経路を活性化させる。ＨＴＲ６は、脳内のコリン作動性ニューロン伝達を調節すると考えられる。いくつかの抗鬱薬及び抗精神病薬は、ＨＴＲ６に対する高い親和性を有することが示されている。いくつかの実施形態では、ＨＴＲ６に結合する本明細書に記載の結合剤は、ＨＴＲ６のリガンド（又はＨＴＲ６と相互作用することが示されているもの）であり、例えばＡＤＲＢＫ１を含む。いくつかの実施形態では、ＨＴＲ６に結合する結合剤は、ＨＴＲ６に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＨＴＲ６に対する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されているような免疫化、計算モデリング技法、並びにインビトロ選択法（例えばファージディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイプラットフォーム）などの当該技術分野で利用可能な方法を用いて、容易に生成されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、ＧＰＲ３７Ｌ１（Ｇタンパク質共役受容体３７ ｌｉｋｅ １。ＥＴ（Ｂ）Ｒ‐ＬＰ‐２、ＥＴＢＲ‐ＬＰ‐２、ＥＴＢＲＬＰ２としても知られる）に特異的に結合する。ＧＰＲ３７Ｌ１の例示のアミノ酸配列は表１で提供される。ＧＰＲ３７Ｌ１は、神経保護及びグリア細胞保護因子であるプロサポシン（ＰＳＡＰ）に結合しすることが示されており、これはエンドサイトーシスにつながり、その後にＥＲＫリン酸化連鎖反応が続く。ＧＰＲ３７Ｌ１は構成的に活性が高い受容体であり、これは１つ以上のグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇのサブユニットαを通してシグナル伝達し、Ｓｈｈ経路の調節によって出生後の小脳の発達に関与し、女性のベースライン血圧を調節し、そして男性を心血管ストレスから保護することが示唆されている。ＧＰＲ３７Ｌ１は、星状膠細胞のグルタミン酸トランスポータの阻害、及びニューロンのＮ‐メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸受容体活性の低減に介在することが示されている。いくつかの実施形態では、ＧＰＲ３７Ｌ１に結合する本明細書に記載の結合剤は、ＧＰＲ３７Ｌ１のリガンド（又はＧＰＲ３７Ｌ１と相互作用することが示されているもの）であり、例えばＰＳＡＰを含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＲ３７Ｌ１に結合する結合剤は、ＧＰＲ３７Ｌ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＧＰＲ３７Ｌ１に対する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されているような免疫化、計算モデリング技法、並びにインビトロ選択法（例えばファージディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイプラットフォーム）などの当該技術分野で利用可能な方法を用いて、容易に生成されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、ＭＣＨＲ２（メラニン濃縮ホルモン受容体２。ＧＰＲ１４５、ＧＰＲｖｌ７、ＭＣＨ‐２Ｒ、ＭＣＨ‐Ｒ２、ＭＣＨ２、ＭＣＨＲ‐２、及びＳＬＴとしても知られる）に特異的に結合する。ＭＣＨＲ２の例示のアミノ酸配列は表１で提供される。ＭＣＨＲ２は、摂食行動及びエネルギ代謝の制御において重要な役割を果たす神経ペプチドであるメラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）に対する、Ｇタンパク質共役受容体である。いくつかの実施形態では、ＭＣＨＲ２に結合する本明細書に記載の結合剤は、例えばｐｒｏ‐ＭＣＨを含む、ＭＣＨＲ２のリガンド（又はＭＣＨＲ２と相互作用することが示されているもの）である。いくつかの実施形態では、ＭＣＨＲ２に結合する結合剤は、ＭＣＨＲ２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＭＣＨＲ２に対する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されているような免疫化、計算モデリング技法、並びにインビトロ選択法（例えばファージディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイプラットフォーム）などの当該技術分野で利用可能な方法を用いて、容易に生成されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、Ｂ３ＧＡＴ１（β‐ｌ，３‐グルクロニルトランスフェラーゼ１。ＣＤ５７、ＧＬＣＡＴＰ、ＧＬＣＵＡＴＰ、ＨＮＫ１、ＬＥＵ７、ＮＫ‐１、及びＮＫ１としても知られる）によって生成されるエピトープに特異的に結合する。従って、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、Ｂ３ＧＡＴ１修飾タンパク質（Ｂ３ＧＡＴ１によって生成されたエピトープを含む）に特異的に結合する。Ｂ３ＧＡＴ１の既知のアイソフォームは表１で提供される。グルクロニルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーのメンバーであるＢ３ＧＡＴ１は、スルホグルクロニル残基を含有するニューロンで発現される炭水化物エピトープである炭水化物エピトープＨＮＫ‐１（ヒトナチュラルキラー‐１。ＣＤ５７及びＬＥＵ７としても知られる）の生合成中のグルクロニル転移反応において、重要な酵素として機能する。Ｂ３ＧＡＴ１はまた、グリコサミノグリカンの生合成に関与することも示されている。Ｂ３ＧＡＴ１は、ＨＮＫ‐１エピトープを細胞外タンパク質に配置するグルコサミントランスフェラーゼ酵素をコードする。従っていくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、ＨＮＫ‐１エピトープ、又はＨＮＫ‐１エピトープを含有するタンパク質に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＨＮＫ‐１エピトープに特異的に結合する結合剤は、ＨＮＫ‐１と特異的に相互作用することができる、ラミニン、Ｅ‐セレクチン、若しくはＰ‐セレクチン、又はこれらの断片である。いくつかの実施形態では、ＨＮＫ‐１エピトープに結合する結合剤は、ＨＮＫ‐１エピトープに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＨＮＫ‐１エピトープに対する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されているような免疫化、計算モデリング技法、並びにインビトロ選択法（例えばファージディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイプラットフォーム）などの当該技術分野で利用可能な方法を用いて、容易に生成されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、ＳＴ８ＳＩＡ３（ＳＴ８α‐Ｎ‐アセチル‐ノイラミニドα‐２、８‐シアリルトランスフェラーゼ３。ＳＩＡＴ８Ｃ及びＳＴ８ＳｉａＩＩＩとしても知られる）によって生成されるエピトープに特異的に結合する。従って、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、ＳＴ８ＳＩＡ３修飾タンパク質（ＳＴ８ＳＩＡ３によって生成されるエピトープを含む）に特異的に結合する。ＳＴ８ＳＩＡ３の例示のアミノ酸配列は表１で提供される。ＳＴ８ＳＩＡ３は、シアル酸のＣＭＰ結合シアル酸ドナーから、α‐２，８結合を介した受容体の末端シアル酸への移動を触媒することによって、シアリル‐α‐２，８‐シアリル‐Ｒ結合を複合糖質の非還元末端に形成する、シアリルトランスフェラーゼのファミリーに属する。ＳＴ８ＳＩＡ３は、細胞外タンパク質のグリコシル化シグネチャを変更することができるシアリルトランスフェラーゼである。従っていくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、ＳＴ８ＳＩＡ３に特徴的なグリコシル化シグネチャ、例えばシアリル‐α‐２，８‐シアリル‐Ｒ結合に特異的に結合することができる。ＳＴ８ＳＩＡ３は、Ａ２Ｂ５エピトープをタンパク質に配置する。従っていくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、Ａ２Ｂ５エピトープ、又はＡ２Ｂ５エピトープを含有するタンパク質に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書で例示されているＡ２Ｂ５抗体である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための結合剤は、表１で提供されるＣＤ１６４の既知のアイソフォームを含む、ＣＤ１６４（シアロムチンコアタンパク質２４。エンドリン、ＭＧＣ‐２４、ＭＵＣ‐２４としても知られる）に特異的に結合する。ＣＤ１６４はシアロムチンであり、これは細胞保護剤又は抗接着剤として及び接着受容体としての役割を果たすと思われる分泌型又は膜結合型ムチンである。ＣＤ１６４は、造血前駆細胞の増殖、接着、及び移動を調節することが示されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６４に結合する本明細書に記載の結合剤は、例えば本明細書で提供されるようなＣＸＣケモカイン受容体４型アイソフォームａ～ｅを含むＣＤ１６４のリガンド（又はＣＤ１６４と相互作用することが示されているもの）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６４に結合する結合剤は、ＣＤ１６４に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。ＣＤ１６４に対する抗体又はその抗原結合断片は、例えば本明細書に記載されているような免疫化、計算モデリング技法、並びにインビトロ選択法（例えばファージディスプレイ及び細胞ベースのディスプレイプラットフォーム）などの当該技術分野で利用可能な方法を用いて、容易に生成されることができる。
示されている標的タンパク質の天然リガンドに基づく例示の結合剤が、表１で提供される。他の実施形態では、その結合剤は、脳内皮細胞での標的タンパク質、例えば表１に記載の標的タンパク質、又は表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合することができるアプタマーであることができる。他の実施形態では、上記結合剤は、脳内皮細胞での標的タンパク質、例えば表１に記載の標的タンパク質、又は表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合部分であることができる。いくつかの実施形態では、その抗体又はその抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、又はシングルドメイン抗体である。
他の実施形態では、上記結合剤は、二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体、又はその抗原結合部分であることができ、ここで抗体又はその抗原結合部分に存在する第１の結合部位は、脳内皮細胞での標的タンパク質、例えば表１に記載の標的タンパク質、又は表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、上記二重特異性抗体又は多重特異性抗体は更に、神経疾患抗原に特異的に結合することができる第２の結合部位を含むことができる。例示の実施形態では、上記二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、ヒトアミロイドβに対する結合部位（例えばソラネズマブの抗原結合部分、アデュカヌマブの抗原結合部分、ガンテネルマブの抗原結合部分、レカネマブの抗原結合部分）、ヒトプログラム死１（ＰＤ‐１）に対する結合部位（例えばニボルマブの抗原結合部分）、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する結合部位（例えばベバシズマブの抗原結合部分）、ヒトＣＤ２０に対する結合部位（例えばオクレリズマブの抗原結合部分、ウブリツキシマブの抗原結合部分）、ヒトα‐４‐インテグリンに対する結合部位（例えばナタリズマブの抗原結合部分）、又はヒトＧＤ２ガングリオシドタンパク質に対する結合部位（例えばジヌツキシマブの抗原結合部分）を含む。
本明細書に記載の組成物及び方法で使用されることができる抗体は、ハイブリドーマの製造などの当該技術分野で公知の技法を用いて特定されることができる。ハイブリドーマは、例えばマウス系を用いて調製されることができる。融合のための脾臓細胞の免疫化及びそれに続く単離は、当該技術分野で公知である。ハイブリドーマの生成のための融合のパートナー及び手順も公知である。所望の抗体の作成において、選択した標的タンパク質（抗原）（タンパク質全体又はその断片）を、単離及び／又は精製する。動物の免疫化は、当該技術分野で公知のいずれかの方法で実施されることができる。例えばHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990を参照。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、及びウマなどの動物を免疫化する方法は、当該技術分野で公知である。例えば上記のHarlow and Lane、及び米国特許第５，９９４，６１９号を参照。所望の抗原をアジュバントと共に投与して、免疫応答を刺激することができる。当該技術分野で公知のアジュバントとしては、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）、又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などである。所望の抗原での動物の免疫化後に、抗体を産生する不死化された細胞株を、免疫化された動物から単離した細胞から調製する。免疫化後に動物を屠殺し、リンパ節及び／又は脾臓Ｂ細胞を、当該技術分野で公知の方法（例えば、癌遺伝子導入；発癌性ウイルス形質導入；発癌性又は突然変異性化合物への曝露；不死化された細胞、例えば骨髄腫細胞との融合；及び腫瘍抑制遺伝子の不活性化）で不死化する。例えば上記のHarlow and Laneを参照。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、旺盛な成長、高い抗体産生、及び望ましい抗体特性を含む望ましい特性に関してスクリーニングすることができる。ヒト抗ＰＣＤＨ１７抗体は、ＨｕＭＡｂ‐Ｍｏｕｓｅ（登録商標）又はＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）などのマウスでも生成されることができる。
抗体又は抗体フラグメントの高スループットスクリーニングのための方法では、標的タンパク質（抗原）に結合することができる分子のライブラリを用いて、本開示の方法に使用できる成熟した抗体を特定して、その親和性を向上させることができる。このような方法は、特にファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳類細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、及びｃＤＮＡディスプレイなどの当該技術分野で公知のインビトロディスプレイ技法を含む。生物学的に関連する分子に結合するリガンドを単離するためのファージディスプレイの使用は、例えばFelici et al., Biotechnol. Annual Rev. 1:149‐183, 1995、Katz, Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27‐45, 1997及びHoogenboom et al., Immunotechnology 4:1‐20, 1998で概説されており、これらの文献それぞれの開示は、インビトロディスプレイ技法に関連するものであるため、参照により本出願に援用される。ランダム化されたコンビナトリアルペプチドライブラリは、Kay, Perspect. Drug Discovery Des. 2:251‐268, 1995及びKay et al., Mol. Divers. 1:139‐140, 1996に記載されているようにして、細胞表面抗原に結合するポリペプチドを選択するために構築され、これらの文献それぞれの開示は、抗原結合分子の発見に関連するものであるため、参照により本出願に援用される。多量体タンパク質などのタンパク質は、機能性分子として良好にファージディスプレイされている（例えば欧州特許第０３４９５７８号、欧州特許第４５２７８３９号、及び欧州特許第０５８９８７７号、並びにChiswell and McCafferty, Trends Biotechnol. 10:80‐84 1992、これらの文献それぞれの開示は、抗原結合分子の発見のためのインビトロディスプレイ技法の使用に関連するものであるため、参照により本出願に援用される）。更に、Ｆａｂ及びｓｃＦｖ断片などの機能性抗体フラグメントが、インビトロディスプレイフォーマットで発現されている（例えばMcCafferty et al., Nature 348:552‐ 554, 1990、Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978‐7982, 1991及びClackson et al., Nature 352:624‐628, 1991を参照、これらの文献それぞれの開示は、抗原結合分子の発見のためのインビトロディスプレイプラットフォームに関連するものであるため、参照により本出願に援用される）。特にこれらの技法を用いて、標的タンパク質に結合する抗体を特定して、その親和性を向上させることができる。
インビトロディスプレイ技法に加えて、計算モデリング技法を用いて、標的タンパク質に結合する抗体又は抗体フラグメントをインシリコで設計及び特定することができる。例えば計算モデリング技法を用いて、当業者は、標的タンパク質の細胞外エピトープなどの特定のエピトープに結合することができる分子に関して、抗体又は抗体フラグメントのライブラリを、インシリコでスクリーニングすることができる。
本明細書に記載の血液脳関門内皮細胞標的タンパク質に特異的に結合することによって、結合剤及びそれに結び付けられたいずれの積み荷も、血液脳関門を通過することができる。従って、本明細書に記載の結合剤を治療剤と結合させることによって、本明細書に記載されているように、その結合剤及び治療剤を、対象の脳及び中枢神経系へと送達することができる。
Ｄ．結合剤と治療剤とのコンジュゲート
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）本明細書で（例えば表１及び／又は表２において）提供される血液脳関門内皮細胞標的タンパク質に特異的に結合する結合剤と、（ｉｉ）治療剤とを含むコンジュゲートに向けられる。いくつかの実施形態では、上記結合剤は、ＢＢＢを通っての上記治療剤の輸送を増強する。いくつかの実施形態では、上記コンジュゲートは、上記結合剤を用いない治療剤の輸送又は送達と比較して少なくとも１０％多く、１５％多く、２０％多く、２５％多く、３０％多く、３５％多く、４０％多く、４５％多く、５０％多く、５５％多く、６０％多く、６５％多く、７０％多く、７５％多く、８０％多く、９０％多く、１００％多く、１５０％多く、２００％多く、３００％多く、４００％多く、５００％多く、１０００％多く、又は１０００％よりも多く、ＢＢＢを通って輸送される。
いくつかの実施形態では、上記結合剤は上記治療剤と共有結合される。いくつかの実施形態では、上記結合剤は上記治療剤と非共有結合される。いくつかの実施形態では、上記結合剤は上記治療剤と直接結合される。他の実施形態では、上記結合剤は上記治療剤と、リンカーによって結合されることができる。例えばそのリンカーは、ペプチドリンカー又は小分子リンカーであることができる。いくつかの実施形態では、上記リンカーは切断可能である。他のいくつかの実施形態では、上記リンカーは切断不可能である。生体分子の共有結合又は非共有結合のためのいずれかの適した方法を用いて、本明細書で提供される結合剤を治療剤と結合させることができる。
いくつかの態様では、本開示のコンジュゲートは、本開示によるいずれかの結合剤を含んでもよい。一実施形態では、その結合剤はポリペプチド、例えば表１又は表２に記載される脳内皮細胞によって発現されるタンパク質のポリペプチドリガンドである。他の実施形態では、上記結合剤は、例えば表１又は表２に記載される脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分である。特定の実施形態では、上記結合剤は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、及びシングルドメイン抗体からなる群から選択される抗体フラグメントである。
一実施形態では、上記結合剤は、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合するアプタマーである。
特定の実施形態では、上記結合剤は、二重特異性抗体又はその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、その二重特異性抗体は、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合部位と、神経疾患抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む。
上述の態様のいくつかの実施形態では、上記結合剤は、表１に記載の標的タンパク質に特異的に結合する。他の実施形態では、上記結合剤は、表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、上記結合剤は、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＣＤ７４、ＣＤ１６４、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＬＡ‐ＤＯＡ、ＨＯＸＤ４、ＩＦＮＬＲ１、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＨＴＲ６、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＣＨＲ２、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７、ＶＬＤＬＲ若しくはＺＰ２、Ｂ３ＧＡＴ１修飾タンパク質、ＳＴ８ＳＩＡ３修飾タンパク質、又はそれらの組み合わせから選択される内皮細胞タンパク質に特異的に結合する。例示の実施形態では、上記結合剤は、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＯＸＤ４、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７、及びＶＬＤＬＲからなる群から選択される標的タンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態では、上記結合剤は、ＫＣＮＴ２、ＯＲ４Ｘ２、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴ２Ｄ２、ＴＭＥＤ１０、及びＶＬＤＬＲからなる群から選択される標的タンパク質に特異的に結合する。
一実施形態では、上記結合剤は、表１又は表２に記載の標的タンパク質のポリペプチドリガンドである。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドリガンドは、表１に記載の結合剤、又は本明細書に記載の標的タンパク質に結合する能力を保持したそれらの断片若しくは部分のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、上記結合剤は、本明細書に記載のＡ２Ｂ５抗体（Ａｂｃａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）カタログ番号ａｂ５３５２１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニューヨーク州グランドアイランド）カタログ番号４３３１１０）、ＡＣＲ、ＡＤＡＭ２、ＡＤＲＢＫ１、ＡＰ２Ｍ１、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＲ、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ７４、ＣＬＵ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＦ、ＣＴＳＨ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームａ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｂ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｃ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｄ、ＣＸＣＲ‐４タイプ４アイソフォームｅ、ＤＱＢ１、ＤＲＢ３、ＥＲＢＢ４、Ｅ‐セレクチン、ＨＬＡ‐ＤＯＢ、ＨＬＡ‐ＤＰＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ１、ＨＬＡ‐ＤＱＡ２、ＨＬＡ‐ＤＱＢ１、ＨＬＡ‐ＤＱＢ２、ＨＬＡ‐ＤＲＡ、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１、ＨＬＡ‐ＤＲＢ３、ＩＦＮＬ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ラミニン（ラミニンサブユニットγ‐１）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐２）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐１）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐２）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐１）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐５）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐３）、ラミニン（ラミニンサブユニットγ‐３）、ラミニン（ラミニンサブユニットα‐４）、ラミニン（ラミニンサブユニットγ‐２）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐３）、ラミニン（ラミニンサブユニットβ‐４）、ＬＧＭＮ、ＬＰＬ、ＬＲＰＡＰ１、ＭＩＦ、ＭＭＰ１、ＯＶＧＰ１、ＰＬＡＵ、ＰＬＡＵＲ、ＰＮＰ、ＰＰＡＲＡ、Ｐｒｏ‐ＭＣＨ、ＰＳＡＰ、Ｐ‐セレクチン、ＲＥＬＮ、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＺＰ１、ＺＰ３、ＺＰ４、ＺＰＢＰ、又は本明細書に記載の標的タンパク質に結合する能力を保持したそれらの断片若しくは部分から選択される、タンパク質を含む。
いくつかの態様では、本開示のコンジュゲートは、本明細書に記載の結合剤と結合した１つ以上の治療剤を含むことができる。例示の治療剤としては、これらに限定するものではないが、ポリペプチド、小分子、又は核酸などである。
いくつかの実施形態では、上記治療剤は治療用ペプチドである。このような実施形態では、上記結合剤及び上記治療用ペプチドは、任意で融合タンパク質として発現されてもよい。いくつかの実施形態では、上記治療剤は、抗体又はその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、上記治療剤は小分子である。いくつかの実施形態では、上記治療剤は、核酸、例えばｃＤＮＡ、ＤＮＡ分子、プラスミド、コスミド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、上記治療剤はアプタマーである。
上記コンジュゲートは、本開示の治療剤のうちのいずれか１つ以上に結合した、本開示の結合剤のうちのいずれか１つ以上を含んでもよい。その１つ以上の結合剤と１つ以上の治療剤とは、連結されるか、付着させられるか、直接結合されるか、共有結合されるか、非共有結合されるか、又はその１つ以上の結合剤と１つ以上の治療剤とをコンジュゲート化するためのいずれかの適した方法によってコンジュゲート化されてもよい。
例示の実施形態では、以下に記載されるように、本明細書に記載の結合剤はエクソソームなどの細胞外小胞（ＥＶ）に結合して、血液脳関門を通ってのＥＶの送達を促進することができる。
Ｅ．結合剤を含む細胞外小胞（ＥＶ）
特定の態様では、本開示は、対象の血液脳関門を通っての（例えば対象の中枢神経系への）ＥＶの送達を増強する細胞外小胞（ＥＶ）組成物、例えばエクソソーム及び／又は微小胞組成物に向けられる。例示の実施形態では、そのＥＶは、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する１つ以上の外因性結合剤を含む。その結合剤と、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質（例えば受容体）との間の相互作用によって、血液脳関門（ＢＢＢ）を通ってのＥＶの輸送が促進される。いくつかの実施形態では、上記結合剤は、上記結合剤を用いないＥＶの輸送又は送達と比較して少なくとも１０％多く、１５％多く、２０％多く、２５％多く、３０％多く、３５％多く、４０％多く、４５％多く、５０％多く、５５％多く、６０％多く、６５％多く、７０％多く、７５％多く、８０％多く、９０％多く、１００％多く、１５０％多く、２００％多く、３００％多く、４００％多く、５００％多く、１０００％多く、又は１０００％よりも多く、ＢＢＢを通ってＥＶを輸送することができる。
いくつかの実施形態では、上記ＥＶは、例えば治療用積み荷である積み荷を更に含むことができる。ＥＶの積み荷としては例えば、これらに限定するものではないが、小分子（例えば小分子薬物）、核酸（例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、及び／又はタンパク質若しくはペプチド（例えばホルモン、増殖因子、酵素、抗凝固剤、インターフェロン、インターロイキン、抗体、抗体フラグメント、抗体‐薬物コンジュゲートなど）などである。また、対象の血液脳関門を通ってＥＶを送達する方法も提供される。更に、これらに限定するものではないが、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、又は例えば神経膠芽腫である神経癌などの神経障害の治療に関連する様々な用途に、ＥＶ組成物を使用する方法が提供される。
細胞外小胞（ＥＶ）は、脂質二重層、例えば細胞原形質膜の一部によって取り囲まれた、小さな構造の不均質なグループを含む。ＥＶのサイズは直径約１０ｎｍ～１０μｍであることができ、最も一般的には約２５～５００ｎｍであり得る。ＥＶは大まかに２つの分類、即ちエクソソーム及びエクトソームに分けることができる。エクソソームは、多小胞体（ＭＶＢ）の変異中のエンドソーム膜の内向きの出芽を通じて、細胞によって形成され得る。そして、ＭＶＢと細胞表面との融合によって、エクソソームは細胞外空間に放出されることができる。エクソソームは、通常は直径２５～５００ｎｍであり、いくつかの実施形態では約２５～２５０ｎｍ、約５０～１５０ｎｍ、又は約５０～２００ｎｍとなり得る。微小胞としても知られるエクトソームは、原形質膜の出芽を通じて細胞によって形成され得る。エクトソームのサイズは約１０ｎｍから１０μｍまで様々であることができ、いくつかの実施形態では約１０～１０００ｎｍ、又は約５０～５００ｎｍとなり得る。
本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適したＥＶとしては、細胞の原形質膜から脱落する微小胞、エンド‐リソソーム経路に一般的には由来するエクソソーム、アポトーシス小体（例えばアポトーシス細胞から得られる）、微粒子（例えば血小板に由来するものであってもよい）、エクトソーム（血清中の好中球及び単球などから得ることができる）、プロスタトソーム（例えば前立腺癌細胞から得ることができる）、又はカーディオソーム（例えば心臓細胞から得ることができる）などのいずれの形態の細胞からも得ることができる、いずれの種類の小胞も含む。本明細書で開示される組成物及び方法での使用に適した他のＥＶとしては、細胞外小胞模倣体や、細胞押出、膜押出、小胞押出、又は他の技法によって得られる細胞及び／又は細胞膜ベースの小胞（例えば合成ＥＶ）などである。適したＥＶには、関心の治療剤の送達又は輸送用媒体として作用することができる、（小胞形態である、又は他のいずれかの種類の適した形態である）いずれの種類の脂質ベースの構造体も含まれる。
本開示の組成物及び方法での使用に適したＥＶは、いずれの適したソースに由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ＥＶは、神経細胞、例えば神経幹細胞、神経前駆細胞、又は分化した神経細胞（ニューロン、グリア細胞、若しくは星状細胞など）に由来することができる。例示の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の結合剤を含むＥＶは、神経前駆細胞及び／又は又は神経幹細胞由来である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の結合剤を含むＥＶは、非形質転換細胞に由来する。基本的に、ＥＶを産生することができるあらゆる種類の細胞が、本明細書に記載の組成物及び方法のためのＥＶのソースとして使用されることができる。他の適した細胞型としては、例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間質細胞、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、骨髄細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、及び肝細胞などである。他の細胞型としては、例えば樹立細胞株であり、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞、例えばＨＥＫ‐２９３細胞）、又は形質転換された神経幹細胞（例えばＣＴＸ０Ｅ０３）由来のものなどである。他の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適したＥＶは、合成によって生成されることができる。いくつかの実施形態では、ＥＶは、ｃ‐ｍｙｃなどの外因性増殖因子又は癌遺伝子の導入によって形質転換又は不死化された細胞に由来する。他の実施形態では、ＥＶは、形質転換又は不死化されていない細胞、例えば癌遺伝子又は発癌性突然変異の導入によって形質転換又は不死化されていない細胞に由来する。
一実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、エクソソーム及び／又は微小胞を含むＥＶの単離された集団を用いて実施される。例示の実施形態では、このＥＶの単離された集団は、神経前駆細胞、神経幹細胞、又は星状膠細胞などの神経細胞に由来する。いくつかの実施形態では、その神経細胞、例えば神経前駆細胞、神経幹細胞、又は星状膠細胞は、非形質転換細胞である。
細胞由来のＥＶ、例えばエクソソームは、その細胞起源を反映した多様な生物学的分子を含む。ＥＶは、ＥＶ内腔内にこれらの生体分子を有すること、及び／又は脂質二重層に埋め込むこと若しくは脂質二重層に付着されることができる。この天然の積み荷は、タンパク質、脂質、及び／又は核酸、例えばｍＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡを含むことができる。ＥＶが細胞によって産生される場合、積み荷の組成は細胞型に強く依存する。例えば、星状細胞、神経前駆細胞、及び間葉系幹細胞に由来するＥＶはそれぞれ、タンパク質積み荷の異なる補体を含有することが示されている（例えば米国特許出願公開第２０１８／０３２７７１４Ａ１号を参照。その文献の全内容は参照により本出願に援用される）。これらの異なる細胞型由来のＥＶはまた、ｍＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡを含む異なるプロファイルの核酸分子を含有する。ＥＶが細胞から得られる実施形態では、ＥＶは、このＥＶが由来する細胞によって産生されるＥＶの内容物を反映した、天然の積み荷を含有する。一実施形態では、本開示は、神経細胞、例えば神経前駆細胞に由来するＥＶの集団を提供する。このような神経ＥＶは、神経細胞由来の、サイトカイン及び増殖因子並びにコーディング及び非コーディングＲＮＡ分子などの異なるタンパク質の環境を含有する。神経ＥＶが含有する天然の積み荷は、神経保護の提供；炎症の低減；酸化ストレスの低減；血管の完全性の改善；代謝活性への影響；並びに神経新生及び分化の増大による神経再生効果の誘発によって、神経及び血管の機能に影響を及ぼすことができる。
ＥＶは細胞間コミュニケーションに関与し、細胞膜との融合によって、ＥＶから細胞への物質の移動を可能にする。ＥＶは、免疫調節；血管新生；腫瘍増殖に関連する内皮細胞の移動；又は虚血再灌流障害における損傷の低減などの多数の生理学的プロセスに関与することが報告されている。これらの機能の多くは、小胞内又は小胞表面に含有されるタンパク質、核酸、又は脂質が介在する。
ＥＶは、ＥＶ膜表面又はＥＶ内腔内にも外因性積み荷を積載することができる。本明細書に記載の組成物及び方法で使用するためのＥＶは、本明細書で特定されている結合剤をＥＶ表面に含有するように修飾される。ＥＶを本明細書に記載の結合剤と結合させることによって、脳及びＣＮＳへの送達のための、血液脳関門を通ってのＥＶ及びその内容物の輸送が促進される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の結合剤に結合されるＥＶには、外因性積み荷（例えば小分子、タンパク質、抗体、核酸など）を積載することができ、これによって脳及びＣＮＳへの積み荷の送達を増強することができる。
（ｉ）結合剤へのＥＶの結合
関心のタンパク質（例えば結合剤）を単独で又は積み荷と組み合わせてＥＶに積載する様々な方法は、本明細書に記載されているように当該技術分野で公知である。例えば本開示のＥＶが由来する本明細書に記載の細胞ソースのうちのいずれかを、外因性結合剤を発現させるための公知の方法を用いて組み換えによって修飾することができ、その外因性結合剤は、例えばエクソソームであるＥＶに入れられ（輸送され、運搬され、又は移送され）て、細胞から放出される。例えば様々な選別ドメイン又は選別配列モチーフを、（組み換え発現によって）結合剤と融合させることにより、（例えば選別ドメインと融合した結合剤を含む）この融合ポリペプチド構築物を、適した小胞構造体、即ちエクソソームなどの適したＥＶへ輸送、運搬、又は移送してもよい。このようなエクソソーム選別ドメインの例としては、これらに限定するものではないが、以下のタンパク質又はそれに由来する断片（例えばエクソソーム選別ドメインを含む断片）などである：ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、Ｓｙｎｔｅｎｉｎ‐１、Ｓｙｎｔｅｎｉｎ‐２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤｌｌａ、ＣＤｌｌｂ、ＣＤｌｌｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ‐Ｉ又はＭＨＣ‐ＩＩ構成要素、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ‐ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ‐１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ‐１α、Ｍａｃ‐１β、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、及びそれらのいずれかの組み合わせ。ポリペプチド構築物をＥＶへと輸送することができる他の多数のポリペプチドを、本開示の方法において使用することができる。選別ドメインと結合剤の融合により、例えば結合剤の表面ディスプレイの増強、結合活性の向上、又は標的タンパク質（例えば脳内皮細胞で発現されるタンパク質）との相互作用が可能となる。選別ドメインは、Ｕｎｉｐｒｏｔ又はＲＣＳＢなどの公開されている様々なデータベースで見つけることができる。
テトラスパニンエクソソーム選別タンパク質又は他のＥＶ膜タンパク質への本明細書に記載の結合剤の融合（例えば組み換え発現による）により、ＥＶ表面での結合剤を多くすることができる。一実施形態では、結合剤はＣＤ９のエクソソーム選別ドメインと融合する。別の実施形態では、結合剤はＣＤ６３のエクソソーム選別ドメインと融合する。別の実施形態では、結合剤はＣＤ８１のエクソソーム選別ドメインと融合する。別の実施形態では、結合剤はＬａｍｐ２ｂのエクソソーム選別ドメインと融合する。
エクソソームへの積み荷の積載を制御する更なるペプチド系配列モチーフが説明されている（例えば、その全体が参照により本出願に援用されるVillarroya‐Beltra, C. et al., Nat. Communications 4:2980, 2013を参照）。更に、例えばユビキチンタグ、ミリストイル化タグ、ホスファチジルイノシトール‐（４，５）‐ビスホスフェート（ＰＩＰ２）結合ドメイン、ホスファチジルイノシトール‐（３，４，５）‐トリホスフェート結合ドメイン、及び１型原形質膜タンパク質ＣＤ４３などのタグは、タンパク質を細胞外小胞へと向けることが示されている（例えば、その全体が参照により本出願に援用されるShen, B., et al., JBC 286(16): 14383‐95, 2011、Smith, VL et al., J. Immunology 195(6):2722‐2730, 2015、Cheng, Y. et al., Biotech. Bioeng. 113(6): 1315‐1324, 2016を参照）。更に、ＥＶ（例えばエクソソーム）への組み込みのために、標的結合タンパク質に対して特定の配列モチーフを操作することができる。例えばインスリン分解酵素（ＩＤＥ）のＣ末端のモチーフＥＫＰＰＨＹ（配列番号１０９）は、その酵素をエクソソームに向けることが示されている（その全体が参照により本出願に援用されるGlebov et al, JBC 286:22711‐715, 2011、Muphy et al., Exp. & Mol. Med. 51:32, 2019を参照）。関心のタンパク質をエクソソームに積載するための設計上の考慮事項及び戦略に関する概説については、Liu and Su（Theranostics 9(4):1015‐1028, 2019）も参照されたい。
あるいは又は加えて、細胞ソースから細胞外空間への小胞の放出に続いて小胞を操作することによって、１つ以上の外因性結合剤をＥＶ内又はＥＶ表面に組み込むことができる。このような方法は、例えば電気穿孔法、超音波処理、及びリポフェクション法などである。あるいは、結合剤を疎水性部分（例えばコレステロール、ビタミンＥなど）と結合させて、ＥＶの調製物と混合することによって、その結合剤を小胞膜にインターカレートすることができる。更に、公知の方法を用いて、１つ以上の外因性結合剤をＥＶの表面に結合させることができる。いくつかの実施形態では、クリックケミストリーを用いて外因性結合剤を小胞表面に結合させる。このような実施形態では、外因性結合剤は、２つの相補的なクリックケミストリー官能基の反応により生成されるリンカーによって、小胞に結合されることができる。従って、１つ以上の結合剤を、「クリックケミストリー」を用いて、ＥＶの表面に結合させることができる（例えばKolb, H. C.、Finn, M. G.、Sharpless, K. B. Angewandte Chemie, International Edition 2001, 40, 2004‐2021、Kolb, H. C.、Sharpless, K. B. Drug Discovery Today 2003, 8, 1128‐1137を参照。これらの文献の開示は、その全体が参照により本出願に援用される）。いずれかの適したクリック反応を用いて、結合剤をＥＶ表面に連結することができる。クリックケミストリー反応は、通常は迅速であり、モジュール式であり、効率的であり、多くの場合に有毒な廃棄物を生成せず、溶媒として水を用いてなされることができ、そして立体特異的に設定されることができるため、有利である。
用語「クリック官能基」は、用語「クリックケミストリー試薬」又は「クリック試薬」と相互交換可能なものとして使用され、水溶液中の穏やかな条件下で、対応するクリック試薬と迅速かつ選択的に反応（例えば環化付加反応を介した「クリック」）することができる試薬を指す。穏やかな条件は、中性のｐＨ、水溶液、及び環境温度を含むことができ、低い反応物濃度である。クリック官能基の例としては、アジド、アルケン、アルキン、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランスシクロオクテン、ニトロン、ニトリルイミン、酸化ニトリル、イソニトリル、テトラゾール、及びテトラジン基などである。例示のクリック反応としては、これらに限定するものではないが、Ｃｕ‐アジド‐アルキン、歪み促進型アジド‐アルキン、シュタウディンガーライゲーション、テトラジンライゲーション、光誘導型テトラゾール‐アルケン、チオール‐エン、ＮＨＳエステル、エポキシド、イソシアネート、及びアルデヒド‐アミノオキシなどである。いくつかの実施形態では、結合剤をＥＶに結合するリンカーは、２つの相補的なクリック官能基の反応から生成される（「クリックリンカー」）。ＥＶ‐結合タンパク質コンジュゲートは、クリックケミストリー反応を起こすことが知られている、第１のクリック官能基を含む結合タンパク質と、第２のクリック官能基を含むＥＶとを反応させることによって調製される。当業者に公知である例示のクリック試薬のペアは、これらに限定するものではないが、アルキン及びアジド、アジド（歪み促進型）及びアルキン、アルキン（歪み促進型）及びニトロン、アルケン及びアジド、テトラジン及びアルケン、アルケン及びテトラゾール、アジド及びジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ、ＤＩＢＯとしても知られる）、テトラジン及びトランスシクロオクテン、並びにテトラジン及びノルボルネンなどである。
上述のように合成によってＥＶが生成される実施形態では、公知の方法を用いた合成小胞の製造後に小胞を操作することによって、１つ以上の外因性結合剤をＥＶに導入することができる。
いくつかの実施形態では、表１又は表２で提供される標的タンパク質に結合する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は更に多数の外因性結合剤が、本開示のＥＶに組み込まれることができる。いくつかの実施形態では、外因性結合剤は、表１で提供される標的タンパク質のいずれか１つ以上に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、外因性結合剤は、表２で提供される標的タンパク質のいずれか１つ以上に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、表２で提供される遺伝子の標的タンパク質産物に結合する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は更に多数の外因性結合剤が、本開示のＥＶに組み込まれることができる。いくつかの実施形態では、表１及び２で提供される遺伝子の標的タンパク質産物に結合する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は更に多数の外因性結合剤が、本開示のＥＶに組み込まれることができる。
血液脳関門内皮細胞での標的タンパク質に特異的に結合する外因性結合剤は既に詳述されており、例えばポリペプチド、抗体、アプタマー、又は小分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質に結合する外因性結合剤は、その標的タンパク質の既知のポリペプチドリガンド又はその機能性断片及び／若しくは多様体である。表１及び２で提供される遺伝子のうちの１つ以上のタンパク質産物に対する既知のポリペプチドリガンドの例は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、標的タンパク質に結合する外因性結合剤は、その標的タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。表１及び２で提供される遺伝子のうちの１つ以上のタンパク質産物に結合する抗体の例は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、外因性結合剤はアプタマーである。標的タンパク質への特異的結合のための様々な結合剤を設計及び試験する方法は公知であり、当業者にとって利用可能である（例えば米国特許第５，７５６，２９１号を参照）。
外因性結合剤を、ＥＶにおいて、脳内皮細胞標的タンパク質に対するＥＶの結合を促進するのに十分な量で発現させることができる。いくつかの実施形態では、その結合剤を、ＥＶによる血液脳関門の通過を増強するのに十分な量で発現させることができる。他の実施形態では、結合剤を、脳及び中枢神経系（ＣＮＳ）へのＥＶの送達を増強するのに十分な量で発現させることができる。ＥＶでの外因性結合剤の濃度は、状況に応じて、例えば標的タンパク質の性質及び存在量に応じて、制御及び変更されることができる。いくつかの実施形態では、外因性結合剤はＥＶに、外因性結合剤を組み換え発現しない細胞ソースに由来するＥＶに存在する結合剤の濃度よりも、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、又は１００％よりも高い濃度で存在する。いくつかの実施形態では、外因性結合剤はＥＶに、同じ細胞ソースに由来するＥＶに見られる一般的なタンパク質因子の平均濃度よりも、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、又は１００％よりも高い濃度で存在する。
（ｉｉ）ＥＶの生成
本明細書で開示される組成物及び方法での使用に適したＥＶは、様々な細胞型によって産生されることができ、又は合成によって生成されることができる。ＥＶは、上述のようないずれかの細胞ソース（例えば、これらに限定するものではないが、初代細胞、幹細胞／前駆細胞、形質転換細胞、及び樹立細胞株などの培養された哺乳類細胞）から、公知の方法を用いて精製されることができる。例えばＥＶは、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、スピンフィルタでのろ過、タンジェンシャルフローろ過、中空糸膜でのろ過、遠心分離、免疫沈降、フローフィールドフラクショネーション、透析、マイクロ流体ベースの分離など、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む技法の群から選択される手順によって、精製されることができる。一実施形態では、ＥＶの精製は、ろ過（好ましくは限外ろ過（ＵＦ）、タンジェンシャルフローろ過、又は中空糸膜でのろ過）とサイズ排除液体クロマトグラフィ（ＬＣ）との連続的な組み合わせを用いて実施される。この精製ステップの組み合わせによって最適な精製が得られ、これは優れた治療活性につながる。更に、エクソソームなどのＥＶの精製に通常用いられる超遠心分離（ＵＣ）と比較して、連続的なろ過‐クロマトグラフィはかなり高速であり、より多い製造量へ拡大することができる。これは、より一般的に使用されている現行のＵＣ法の重大な欠点である。別の精製法は、拡張性及び精度を提供するタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）であり、これはろ過などの他の種類の精製技法と組み合わされることができる。
いくつかの実施形態では、ＥＶは、例えば間葉系幹細胞又は間質細胞又は線維芽細胞（例えば骨髄、脂肪組織、ホウォートンゼリー、周産期組織、歯芽、臍帯血、皮膚組織などから得ることができる）、羊膜細胞、より具体的には様々な初期マーカーを任意で発現する羊膜上皮細胞、骨髄由来抑制細胞、Ｍ２極性化マクロファージ、脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞などから精製されることができる。細胞株としては、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、内皮細胞株（微小血管又はリンパ内皮細胞、軟骨細胞、様々な起源のＭＳＣ、気道又は肺胞上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞など）などである。また、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞（ＤＣ）などの免疫細胞も、そこからＥＶを精製することができる適したソースである。ＥＶを産生することができるいずれの種類の細胞も、本明細書に包含される。
一実施形態では、ＥＶは、神経前駆細胞、ニューロン、希突起膠細胞、ミクログリア、シュワン細胞、又は星状細胞などの神経細胞に由来するものであることができる。他の実施形態では、ＥＶは、これらに限定するものではないが、神経膠細胞、血小板、網赤血球、ニューロン、免疫細胞、腸上皮細胞、腫瘍細胞、ＨＥＬＡ細胞、間葉系幹細胞、及びヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞）などの１つ以上の細胞型によって産生されることができる。一実施形態では、ＥＶはエクソソームである。エクソソームは上述の細胞型のいずれに由来するものであってもよい。例えば、本明細書で開示される組成物及び方法での使用に適したエクソソームは、神経エクソソームであることができる。神経エクソソームは、神経前駆細胞、ニューロン、又は星状細胞などの神経細胞に由来するものであることができる。他の実施形態では、エクソソームは、これらに限定するものではないが、神経膠細胞、血小板、網赤血球、ニューロン、免疫細胞、腸上皮細胞、腫瘍細胞、ＨＥＬＡ細胞、間葉系幹細胞、及びヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞）などの１つ以上の細胞型によって産生されることができる。別の実施形態では、エクソソームは合成によって生産される。別の実施形態では、ＥＶは、微小胞としても知られるエクトソームである。微小胞は上述の細胞型のいずれに由来するものであってもよい。例えば、本明細書で開示される組成物及び方法での使用に適した微小胞は、神経微小胞であることができる。神経微小胞は、神経前駆細胞、ニューロン、又は星状細胞などの神経細胞に由来するものであることができる。他の実施形態では、微小胞は、これらに限定するものではないが、神経膠細胞、血小板、網赤血球、ニューロン、免疫細胞、腸上皮細胞、腫瘍細胞、ＨＥＬＡ細胞、間葉系幹細胞、及びヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞）などの１つ以上の細胞型によって産生されることができる。別の実施形態では、微小胞は合成によって生産される。
いくつかの例では、本開示のＥＶは、細胞がＥＶを産生するのに十分な時間にわたって、神経細胞などの細胞を培養することによって得ることができる。ＥＶを産生するために使用される細胞は、いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得ることができる。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞から分化した神経細胞又はＭＳＣから、ＥＶが単離される。多能性幹細胞は、ステージ特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及び４のうちの１つ以上と、Ｔｒａ‐１‐６０及びＴｒａ‐１‐８１と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーとを発現し得る（Thomson et al., Science 282:1145, 1998）。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ‐４、Ｔｒａ‐１‐６０、及びＴｒａ‐１‐８１（存在する場合は）の発現の喪失、並びにＳＳＥＡ‐１の発現の増加をもたらす。未分化の多能性幹細胞は、通常はアルカリホスファターゼ活性を有し、これは４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してから、製造元（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）の説明に従ってＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを基質として用いて展開することによって検出されることができる。また、未分化の多能性幹細胞は、通常はＲＴ‐ＰＣＲで検出される、Ｏｃｔ‐４及びＴＥＲＴを発現する。
使用され得る多能性幹細胞の種類としては、受精後に形成される組織に由来する多能性幹細胞の樹立株を含み、その組織としては、妊娠中のいずれかの時点に採取される、必ずしもそうではないが一般的には妊娠およそ１０～１２週より前に採取される、前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織、又は胎児組織などである。限定でない例としては、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞の確立された倫理的な系統、例えばヒト胚性幹細胞株ＷＡ０１、ＷＡ０７、及びＷＡ０９（ＷｉＣｅｌｌ）などである。このような細胞の初期確立又は安定化中での本開示の組成物の使用も考えられ、その場合には、ソースとなる細胞は、ソースとなる組織から直接採取された一次多能性細胞である。また、フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取された細胞も適している。また、例えばＢＧ０１ｖ（ViaCyte、カリフォルニア州サンディエゴ）などの変異ヒト胚性幹細胞株、並びにＷＡ０１、ＷＡ０７、ＷＡ０９（WiCell、ウィスコンシン州マディソン）、及びＢＧ０１、ＢＧ０２（ViaCyte、カリフォルニア州サンディエゴ）などの正常ヒト胚性幹細胞株も適している。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、例えばThomson et al.（米国特許第５，８４３，７８０号、Science 282:1145, 1998、Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995）によって説明されているような、当該技術分野における方法によって調製されることができる。あるいはこれらを商業的に入手してもよい。
エピブラスト肝細胞（ＥｐｉＳｃ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、着床後早期段階の胚から単離される。これらはＯＣＴ４を発現し、多能性である。ｉＰＳＣは、４つの遺伝子（ｃ‐ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４）のレトロウイルス形質導入によって成体の体細胞を脱分化して多能性状態に戻すことによって作製される。
ヒト神経前駆（ｈＮＰ）細胞をヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）から産生するための方法は、例えば米国特許第７，５３１，３５４号に記載されており、その文献は参照によりその全体が本出願に援用される。ヒト神経前駆細胞（ｈＮＰ）は、ネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ‐１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ３を含む最も早期の多分化能神経幹細胞に関連するマーカーを発現することが知られている。ある例では、ｈＮＰはＳＯＸ１を発現する（ＳＯＸ１＋）。別の例では、ｈＮＰはＳＯＸ２を発現する（ＳＯＸ２＋）。他のいくつかの例では、ｈＮＰはＳＯＸ３を発現する（ＳＯＸ３＋）。いくつかの具体的な例では、ｈＮＰはネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ‐１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ３のうちの少なくとも１つを発現する。他の例では、ｈＮＰはネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ‐１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ３のうちの２つ以上を発現する。更に別の例では、ｈＮＰはネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ‐１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ３のうちの３つ以上を発現する。いくつかの例では、ｈＮＰはネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ‐１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ３のうちの少なくとも１つを発現するが、ＯＣＴ４は発現しない。他のいくつかの例では、ｈＮＰはネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ‐１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ３のうちの少なくとも２つを発現するが、ＯＣＴ４は発現しない。更に別の例では、ｈＮＰはネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ‐１、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ３のうちの少なくとも３つを発現するが、ＯＣＴ４は発現しない。ある具体的な例では、ｈＮＰはＳＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ３を発現するが、ＯＣＴ４は発現しない。神経前駆細胞は、フィーダー細胞を用いて又は用いずに培養されることができる。いくつかの例では、米国特許第７，５３１，３５４号で提示されている方法に従って産生された神経前駆細胞は、フィーダー細胞を含まず、また胚様体も含まない。
本開示のＥＶは、場合によって、直接的又は間接的に多能性幹細胞に由来する、グリア細胞などの分化した神経細胞を、細胞培養培地で、ＥＶを産生するための条件下でＥＶを産生するのに十分な時間にわたって培養し、そのＥＶを培養培地から単離することによって得ることができる。グリア細胞の種類としては、希突起膠細胞、星状細胞、上衣細胞、シュワン細胞、ミクログリア、及び衛星細胞などである。ある例では、分化した神経細胞（例えばグリア細胞）は星状細胞を含む。使用されることができる分化した神経細胞としては、ｈＮ２（商標）神経細胞（Aruna Bio Inc.）、ＮｅｕｒｏＮｅｔ（商標）ニューロン、及びＡｓｔｒｏＰｒｏ（商標）星状細胞（Aruna Bio Inc.）などである。
ＥＶは、細胞培養培地又は組織培養上清から単離されることができる。細胞から産生されたＥＶは、いずれかの適した方法で培養培地から回収されることができる。通常は、単離されたＥＶの集団は、遠心分離、サイズ排除カラム、マイクロ流体デバイス、ポリマー沈殿、ろ過、又はそれらの方法の組み合わせによって、細胞培養物又は組織上清から調製されることができる。例えばＥＶは、米国特許出願公開第２０１４０３５６３８２号に記載されているようにして調製されることができ、その文献はその全体が参照により本出願に援用される。例えばＥＶは、分画遠心分離、即ち比較的大きな粒子をペレット化するための低速（＜２，００００ｇ）での遠心分離、及びこれに続くＥＶをペレット化するための高速（＞１００，０００ｇ）での遠心分離、適切なフィルタ（例えば０．２２μｍフィルタ）を用いたサイズろ過、勾配超遠心分離（例えばショ糖勾配を用いた）、又はそれらの方法の組み合わせによって調製されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＥＶ産生ＮＰ細胞及び／又は神経細胞は、細胞及びそのＥＶ産生能力に応じて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、若しくは１４日間にわたって、又は約１、２、３、４、５、６、７、８週間若しくは約１、２、３、４、５、若しくは６ヶ月の長期間にわたって培養される。ＥＶ産生細胞は、当業者によって容易に決定される条件下で、適した培地で培養されて増殖されることができる。細胞培養条件は細胞型によって変化することがあり、これ以降に提示される例は、適した培地及び条件を例示するものである。例えばウシ胎児血清（例えば１０％）を含み、任意でグルタミン又はグルタミン含有混合物及び抗生物質を補充した、ＣＭＲＬ １０６６培地（Invitrogen製）を使用し得る。細胞は、いくつかの実施形態では表面に付着させて増殖されることができ、例えば細胞は、表面（フィーダー細胞非含有）での単層又は複層として増殖されることができ、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は１００％コンフルエントとなるまで増殖されることができる。他の実施形態では、細胞は、浮遊培養中の細胞凝集体として増殖されることができる。
細胞増殖培地は当該技術分野において公知であり、少なくとも最小必須培地に加えて、増殖因子、アスコルビン酸、グルコース、非必須アミノ酸、塩（微量元素を含む）、グルタミン、インスリン（指示されており除外されていない場合）、アクチビンＡ、トランスフェリン、β‐メルカプトエタノール、及び当該技術分野において公知の、本明細書の他の箇所で記載されている他の作用剤などの１つ以上の任意の成分を含む。好ましい培地は、神経細胞をサポートする、低タンパク質で無血清ベースの増殖培地である。使用される増殖因子は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）であることができ、これは単独であるか、又は好ましくは白血病抑制因子（ＬＩＦ）と組み合わされる。増殖培地で増殖させるＮＰ又は神経細胞に応じてＬＩＦを含むことが好ましいが、これは必要でない場合もある。更なる培地としては基底細胞培地が挙げられ、これは血清、例えば約０．１％～２０％（好ましくは約２～１０％）のウシ胎児血清を含有してもよく、又は合成培地については、ウシ胎児血清及びＫＳＲを含まず、任意でウシ血清アルブミン（約１～５％、好ましくは約２％）を含む。いくつかの例では、培地は合成され、無血清であり、タンパク質含有量が低い。他の例では、培地はAruna Bio, Inc.製の培地及び補充物であり、これは神経培養物が、フィーダー細胞を必要とすることなしに、複数の継代にわたって安定した核型を維持することを可能にし、初期段階の創薬を含む多様な研究用途にとって優れた選択肢となる。増殖培地の成分は、増殖される神経細胞の種類に依存し、それらは全て当該技術分野において公知である。ある例では、ＡＢ２（商標）Ｎｅｕｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ Ｋｉｔが使用され、それはＡＢ２（商標）Ｂａｓａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｍｅｄｉｕｍ及びＡＮＳ（商標）Ｎｅｕｒａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含有する。ある具体的な例では、上記例で記載した培地及び補充物を、神経細胞の培養の要件を満たすように、多様性のために特別に操作する。ＡＢ２（商標）Ｂａｓａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｍｅｄｉｕｍ及びＡＮＳ（商標）Ｎｅｕｒａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは、ｈＮＰ１（商標）系統の分化を様々な神経表現型へと向けるための特別な培地のためのベースとして使用されることができる。培地及び補充物の各ロットは、細胞増殖、無菌性、ｐＨ、浸透圧、及びエンドトキシンに関する試験を行うことにより、事前に適性確認される。
培地に任意で添加してもよい他の作用剤としては、培地で増殖される細胞型に応じて、多数の成分の中でも特に、ニコチンアミド；ＴＧＦ‐β１、２、及び３を含むＴＧＦ‐βファミリーのメンバー；アクチビンＡ；Ｎｏｄａｌ；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ２～７）；血清アルブミン；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー；血小板由来増殖因子‐ＡＡ及び‐ＢＢ；血小板に富む血漿；インスリン増殖因子（ＩＧＦ‐Ｉ、ＩＩ、ＬＲ‐ＩＧＦ）；増殖分化因子（ＧＤＦ‐５、‐６、‐８、‐１０、１１）；グル積み荷ン様ペプチド‐Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ‐Ｉ及びＩＩ）；ＧＬＰ‐１及びＧＬＰ‐２ミメトボディ；エクセンディン‐４；副甲状腺ホルモン；インスリン；プロゲステロン；アプロチニン；ヒドロコルチゾン；エタノールアミン；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ガストリンＩ及びＩＩ；例えばトリエチレンペンタミンなどの銅キレート剤；フォルスコリン；Ｎａ‐ブチレート；βセルリン；ＩＴＳ；Ｎｏｇｇｉｎ；神経突起増殖因子；Ｎｏｄａｌ；バルプロ酸；トリコスタチンＡ；酪酸ナトリウム；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；スフィンゴシン‐１；ＶＥＧＦ；ＭＧ１３２（ＥＭＤ、カリフォルニア州）；Ｎ２及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州）；例えばシクロパミン（ＥＭＤ、ＣＡ）などのステロイドアルカロイド；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）；Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー；ウシ下垂体抽出物；膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）；インディアンヘッジホッグ；ソニックヘッジホッグ；プロテアソーム阻害剤；ノッチ経路阻害剤；ソニックヘッジホッグ阻害剤；ヘレグリン；又はそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上などである。それらの成分が含まれる場合には、それらの成分はそれぞれ有効量で含まれる。
いくつかの例では、適した培地は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１１９６５‐０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９‐０１８；ハムＦ１２／５０％ＤＭＥＭ基礎培地；２００ｍＭ Ｌ‐グルタミン、Ｇｉｂｃｏ ＃１５０３９‐０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ １１１４０‐０５０；β‐メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１３２５６‐０２９などの成分から作製されることができる。
細胞培地は市販されており、Invitrogen Corp. (GIBCO)、Cell Applications, Inc., Biological Industries, Beth HaEmek（イスラエル）、及びCalbiochemから入手可能なものなどの、合成された異種非含有成分を含む市販の成分で補うことができる。当業者であれば、本開示による標的細胞のうちのいずれか１つ以上を生産するために、細胞培地を容易に改変することができる。
本開示のＥＶ産生細胞は、その細胞を様々な方法で支持するフィーダー細胞の層上で培養してもよい。細胞をフィーダー細胞の層上で培養するためのアプローチは、当該技術分野において公知である。細胞は、細胞支持体若しくはマトリックス上での接着性の単層として、又は懸濁液中の細胞凝集体として、増殖されることができる。いくつかの例では、ＥＶを産生するために使用される細胞に応じて、細胞支持体の使用が好ましいかもしれない。細胞支持体が使用される場合、これは好ましくは、少なくとも１つの基質タンパク質を含む。基質タンパク質としては、例えば、ラミニン、テネイシン、トロンボスポンジン、及びそれらの混合物などの細胞外マトリックス中に見られるタンパク質である細胞外マトリックスタンパク質が挙げられ、これらは増殖の促進を示し、上皮増殖因子（ＥＧＦ）との相同性を有するドメインを含有し、増殖促進活性を示す。使用され得る他の基質タンパク質としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ポリリジン、ポリオルニチン、及びそれらの混合物などである。更に、これらの胚性幹細胞分化タンパク質のうちの１つ以上を有効濃度で含有する、ゲル及び他のゲルのメチルセルロースなどの他の材料も使用されることができる。例示の分化タンパク質又はこれらの分化タンパク質を含む材料としては、例えば特に、組み換えラミニン；ＢＤ Ｃｅｌｌ‐Ｔａｋ（商標）細胞・組織接着剤；ＢＤ（商標）ＦＩＢＲＯＧＥＮヒト組み換えコラーゲンＩ；ＢＤ（商標）ＦＩＢＲＯＧＥＮヒト組み換えコラーゲンＩＩＩ；ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基底膜マトリックス；ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基底膜マトリックス、高濃度（ＨＣ）；ＢＤ（商標）ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（商標）ペプチドヒドロゲル；コラーゲンＩ；コラーゲンＩ、高濃度（ＨＣ）；コラーゲンＩＩ（ウシ）；コラーゲンＩＩＩ；コラーゲンＩＶ；コラーゲンＶ；及びコラーゲンＶＩなどである。
あるいはこれらの細胞は、フィーダー細胞を含まない又はフィーダー細胞を基本的に含まないものの、ＥＶを産生するための細胞の増殖をサポートする培養システムで培養されることができる。フィーダー非含有培養における細胞の増殖は、別の細胞型で事前に培養を行うことによって調整された培地を用いてサポートされることができる。あるいは、分化を伴わないフィーダー非含有培養におけるＥＶ産生細胞の増殖は、既知組成培地を用いてサポートされることができる。これらのアプローチは当該技術分野において公知である。特定の実施形態では、細胞はフィーダー細胞非含有培地で増殖される。
ＥＶは、様々な時間間隔で（ＥＶの産生速度に応じて、例えば約１、２、４、６、８日目、又は３、６、９、１２日目、又はこれより長い間隔で）採集されることができる。ＥＶの例示の収量は、本明細書中の他の箇所に記載されているような増殖性及び非増殖性神経細胞の培養の約２４時間～７日の期間中に、細胞１００万個あたり少なくとも約１ｎｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約１０ｎｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約５０ｎｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約１００ｎｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約５００ｎｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約７５０ｎｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約８００ｎｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約９００ｎｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約１．０μｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約１．５μｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約２．０μｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約２．５μｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも例えば約３．０μｇのＥＶ、細胞１００万個あたり少なくとも約５．０μｇのＥＶ、及び細胞１００万個あたり少なくとも約１０．０μｇのＥＶ以上の範囲となり得る。
多くの例では、ＥＶは、超遠心分離又は分画遠心分離又はそれらのいずれかの組み合わせによって採集及び回収され、ペレット化されたＥＶが回収されて、回収後のペレット化されたＥＶは任意で適した媒体で洗浄される。例えば、ＥＶの調製物は、細胞培養物又は組織上清から、遠心分離、ろ過、又はそれらの方法の組み合わせによって調製されることができる。いくつかの実施形態では、ＥＶは、分画遠心分離、即ち比較的大きな粒子をペレット化するための低速（＜２，００００ｇ）での遠心分離、及びこれに続くＥＶをペレット化するための高速（＞１００，０００ｇ）での遠心分離、適切なフィルタ（例えば０．２２μｍフィルタ）を用いたサイズろ過、（例えばショ糖勾配を用いた）勾配超遠心分離、又はそれらの方法の組み合わせによって調製されることができる。ＥＶは、分画遠心分離、マイクロ及び限外ろ過、ポリマー沈殿、マイクロ流体分離、免疫捕捉、及びサイズ排除クロマトグラフィによって精製されることができる。ＥＶの単離及び精製のための上述の方法及び／又は関連する方法は、Thery, et al., Current Protocols in Cell Biology, (2006) 3.221‐3.22.29, copyright 2006 by John Wiley & Sons, Inc.、Sokolova, et al., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2011, 87, 146‐150、Wiklander, et al., Journal of Extracellular Vesicles, 2015, 4, 26316, pp. 1‐13、及びBoing, et al., Journal of Extracellular Vesicles, 2014, 3, 23430, pp. 1‐11に記載されている。電界無線周波数及び音響などの他の単離方法も開発されることができる。
合成エクソソームなどの合成小胞を製造する方法は、当該技術分野において公知である。本明細書において提供される組成物及び方法での使用に適した合成小胞を生産するために、このような方法が用いられてもよい。なお、ＥＶの内容物、即ち脂質二重層を除去又は排除して内容物を得たＥＶもまた、人工ＥＶを人工的に作り出すために使用されてもよい。
（ｉｉｉ）血液脳関門を通って送達されることができる積み荷
本明細書ではいくつかの態様において、上述のような１つ以上の外因性結合剤を含むＥＶが提供され、そのＥＶは更に、脳及びＣＮＳへの送達のための積み荷、例えば１つ以上の治療剤を含む。いくつかの実施形態では、その積み荷は外因性積み荷であり、それはＥＶが由来する細胞内でのその積み荷の組み換え発現によってＥＶに導入されることができ、又はＥＶを細胞から単離した後にＥＶに導入されることができる。いくつかの実施形態では、上記外因性積み荷は、１つ以上の治療剤を含むことができる。疾患及び／又は障害の治療管理又は治療に使用されることができる実質的にあらゆる分子作用剤を、ＥＶに積載することができる。ＥＶによる送達に適した治療剤は、（ｉ）化学合成によって合成された小分子治療剤、（ｉｉ）例えば天然のソースからの精製によって得ることができる天然由来の化合物、（ｉｉｉ）様々な種類の核酸ベースの化合物、例えばｓｉＲＮＡ；スプライススイッチングＲＮＡ；ＣＲＩＳＰＲガイド鎖；短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド；ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド；並びに２’‐Ｏ‐Ｍｅ、２’‐Ｏ‐アリル、２’‐Ｏ‐ＭＯＥ、２’‐Ｆ、２’‐ＣＥ、２’‐ＥＡ、２’‐ＦＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ホスホロチオエート、トリシクロ‐ＤＮＡなどの化学的に合成された核酸及び／又は化学的に修飾されたヌクレオチドを含む核酸、（ｉｖ）ペプチド合成によって又は組み換えタンパク質産生によって得られるものを含むいずれかの種類のペプチド及びポリペプチド（即ちタンパク質又は抗体）、などの幅広い活性剤を包含する。
治療剤は、基本的に全ての薬学的に及び／又は薬理学的に及び／又は診断上関連のある薬剤から得ることができ、その薬剤は例えば、抗癌剤、細胞増殖抑制剤、チロシンキナーゼ阻害剤、スタチン、ＮＳＡＩＤ、抗生物質、抗真菌剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗線維症剤、降圧剤、アロマターゼ又はエステラーゼ阻害剤、抗コリン剤、ＳＳＲＩ、ＢＫＴ阻害剤、ＰＰＡＲアゴニスト、ＨＥＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＢＣＲ‐ＡＢＬ阻害剤、シグナル伝達阻害剤、血管新生阻害剤、シンターゼ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ネプリライシン阻害剤、β２‐アゴニスト、ＣＲＴＨ２アンタゴニスト、ＦＸＲアゴニスト、ＢＡＣＥ阻害剤、スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体調節因子、ＭＡＰＫ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、ＭＤＭ２アンタゴニスト、ＬＳＤ１阻害剤、ラクタマーゼ阻害剤、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ＩＤＯ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、Ｃｈｋｌ阻害剤、スプライシング調節、ＤＮＡ又はＲＮＡインターカレーターなどである。本発明による薬理学的物質の他の限定でない例としては、例えば特にエベロリムス、トラベクテジン、アブラキサン、パゾパニブ、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＦＬＴ‐３阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦＲ ＴＫ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、ＰＩＫ‐１調節因子、Ｂｃｌ‐２阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ｃ‐ＭＥＴ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｃｄｋ阻害剤、ＥＧＦＲ ＴＫ阻害剤、ＩＧＦＲ‐ＴＫ阻害剤、抗ＨＧＦ抗体、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、チェックポイント１又は２阻害剤、接着斑キナーゼ阻害剤、Ｍａｐキナーゼ（ｍｅｋ）阻害剤、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、デカタニブ、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、ノラトレキセド、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、シレンジチド、ギマテカン、ルカントン、ニューラジアブ、ビテスパン、タランパネル、アトラセンタン、ロミデプシン、スニチニブ、５‐フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、５’‐デオキシ‐５‐フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、セリシクリブ、カペシタビン、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、アナストラゾール、エキセメスタン、レトロゾール、バタラニブ、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロリド、パモ酸トリプトレリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ロナファルニブ、チピファルニブ、アミホスチン、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド、バルプロ酸、トリコスタチン、ソラフェニブ、アムサクリン、アナグレリド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６‐メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３‐ｃｉｓ‐レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５‐デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６‐メルカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ‐３、ネオバスタット、スクアラミン、エンドスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド、シメチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトクス、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、パクリタキセル、クレモホール非含有パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンＢ、ドロロキシフェン、４‐ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、トポテカン、ラパマイシン、テムシロリムス、ゾレドロン酸、プレドニゾン、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、ａｌｌ‐ｔｒａｎｓ‐レチノイン酸、ケトコナゾール、メゲストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、イブリツモマブチウキセタン、アンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エチドロン酸、ミトタン、シクロスポリン、ダウノルビシンリポソーム、Ｅｒｗｉｎｉａアスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ‐１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセロトン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンα及びダルベポエチンα、エファビレンツなどである。更に治療剤はまた、以下のものも含む：例えば天然のソースからの精製によって得られる天然由来の化合物；いずれかの種類の核酸ベースの化合物、例えばｓｉＲＮＡ、スプライススイッチングＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド鎖、短ヘアピンＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、並びに特に、２’‐Ｏ‐Ｍｅ、２’‐Ｏ‐アリル、２’‐Ｏ‐ＭＯＥ、２’‐Ｆ、２’‐ＣＥ、２’‐ＥＡ、２’‐ＦＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ホスホロチオエート、トリシクロ‐ＤＮＡなどの化学的に合成された核酸ベースの薬剤及び／又は化学的に修飾されたヌクレオチドを含む核酸ベースの薬剤。更に、ペプチド及びポリペプチド、並びにペプチド合成によって得ることができるペプチド及び／又はタンパク質だけでなく、組み換えタンパク質産生によって得ることができるペプチド及びタンパク質もまた、本開示の組成物及び方法での使用に適した治療剤と考えられる。
いくつかの実施形態では、ＥＶは１つ以上の抑制性核酸を含むことができる。例えばいくつかの実施形態では、ＥＶは、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から選択される１つ以上の抑制性核酸を含むことができる。
いくつかの実施形態では、上記ＥＶは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、及びシングルドメイン抗体からなる群から選択される抗体フラグメントを含む１つ以上の治療用抗体又はその抗原結合部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、その抗体又はその抗原結合部分は、ヒト化抗体又はその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、その抗体又はその抗原結合部分は、完全ヒト抗体又はその抗原結合部分である。
いくつかの実施形態では、ＥＶは、１つ以上の神経栄養剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＥＶは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ‐６、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＩＦＮ‐γ、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ‐２）、ＩＧＦＢＰ‐６、ＩＬ‐１ｒａ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ‐１）、単核食細胞コロニー刺激因子（Ｍ‐ＣＳＦ）、神経栄養因子（ＮＴ３）、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ‐１）、ＴＩＭＰ‐２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ‐β）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ‐Ｄ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ＩＬ１‐ａ、ＩＬ‐３、レプチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子‐１（ＳＤＦ‐１）、血小板由来増殖因子‐ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ‐１）、及びＴＧＦβ‐３から選択される１つ以上の作用剤を含むことができる。
上記の治療剤及び他の積み荷は、ＥＶに結合剤を結合するのに有用であるとして上述された方法を含め、当該技術分野で認識されている方法を用いて、ＥＶに積載されることができる。そのような方法としては、これらに限定するものではないが、リポフェクション法；トランスフェクション法；電気穿孔法；クリックケミストリー；疎水性部分への結合；又はＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、若しくはＬａｍｐ２ｂのエクソソーム選別ドメイン又は本明細書に記載の更なるエクソソーム選別ドメインのいずれかなどのエクソソーム選別ドメインとの融合タンパク質としての治療剤の組み換え発現（ペプチド若しくはタンパク質ベースの療法のための）などである。ペプチド又はタンパク質治療剤は、ＡＬＩＸ又はシンテニンなどの一般的にＥＶ内腔内に見られるエクソソームタンパク質（又はそのエクソソーム選別ドメイン）との融合タンパク質として、組み換え発現されることもできる。他の実施形態では、その治療剤をトランスポータン、ペネトラチン、ＣＡＤＹ‐１、又はＶＰ２２などの細胞貫通性ペプチドと結合させることによって、治療剤をＥＶに積載することができる。更なる細胞貫通性ペプチドは、例えば米国特許出願公開第２０１０９／０３８８３４７号に記載されており、その文献の全内容は参照により本出願に援用される。
上述の治療剤又はその組み合わせのいずれかを、血液脳関門を通っての脳及び／又はＣＮＳへの送達のために、本明細書に記載の１つ以上の結合剤を含むＥＶに積載することができる。
Ｆ．製剤、送達、及び投与
本明細書で提供される１つ以上の外因性結合剤を含むＥＶは、対象への送達のための医薬組成物で製剤されることができる。医薬組成物は、治療有効量の本発明のＥＶ（例えば神経細胞由来のＥＶを含む）と、薬学的に許容可能な担体とを含むことができる。例えば、本開示の治療有効量のＥＶは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水中で提供されることができる。他の適した担体が当該技術分野において公知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990)に記載されている。従来用いられおり、活性治療剤に対して不活性であるいずれかの投与方法、賦形剤又は担体も、本開示の医薬用の修飾されたＥＶの調製及び投与のために利用してよいことは、当業者に理解される。このような方法、賦形剤及び担体の例は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 4th ed. (1970)に記載されているようなものであり、その文献の開示は参照により本出願に援用される。本開示の原理に触れた当業者は、好適かつ適切な賦形剤、添加剤、及び担体を決定すること、又は活性成分とこれらとを組み合わせて本開示の医薬組成物を形成することについて、何の困難もないであろう。
本開示のＥＶ（例えば神経細胞由来のＥＶを含む）を含有する製剤は、例えば溶液、懸濁液、乳液、徐放性製剤、ローション、エアロゾルなどの液体、固体、又は半固体の形態を取ることができ、任意で、正確な用量を簡単に投与するのに適した単位剤形の形態を取ることができる。医薬組成物は、通常は従来の医薬担体及び／又は添加剤を含み、更に他の薬剤、担体、アジュバント、添加剤などを追加で含んでもよい。ＥＶと１つ以上の添加剤との重量百分率の比は、約２０：１～約１：６０、又は約１５：１～約１：４５、又は約１０：１～約１：４０、又は約９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１若しくは１：１～約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０若しくは１：３５であることができ、好ましくは約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、又は５：１である。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、約１μｇ～約１ｇ以上のＥＶの合計量、例えば約１μｇ～約１００μｇ、約１００μｇ～約２００μｇ、約２００μｇ～約３００μｇ、約３００μｇ～約４００μｇ、約５００μｇ～約６００μｇ、約７００μｇ～約８００μｇ、約９００μｇ～約１ｍｇ、約１００μｇ～約５００μｇ、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約５ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約５００ｍｇ、約２５ｍｇ～約５００ｍｇ、約５０ｍｇ～約３５０ｍｇ、約７５ｍｇ～約４５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約４５０ｍｇ、約７５ｍｇ～約３２５ｍｇ、約１００ｍｇ～約６５０ｍｇ、又は約５００ｍｇ～約１ｇのＥＶの合計量を含み、更に任意で１つ以上の適した医薬担体、添加剤及び／又は添加剤を含有してもよい。
様々な例において、本明細書に記載の医薬組成物（例えば本開示のＥＶを含む医薬組成物）は、当業者に公知のいずれかの投与経路による細胞への及び／又は対象への送達のために製剤されることができる。投与方法は一般的に知られているか、又は当業者に明らかである。例えばRemington’ s Pharmaceutical Sciences(17th Ed., Mack Pub. Co. 1985)を参照。
本明細書で提供されるＥＶを含む組成物、並びに／又は本明細書で提供される１つ以上の結合剤及び１つ以上の治療剤を含むコンジュゲートは、これらに限定するものではないが、以下を含むいずれかの適した経路で、対象へと送達されることができる：例えば耳、頬、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、経腸、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊膜内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、尾部内、海綿体内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ）、腔内、大脳内、大槽内、角膜内、歯冠内（歯）、冠動脈内、海綿体内（ｉｎｔｒａｃｏｒｐｏｒｕｓ ｃａｖｅｒｎｏｓｕｍ）、皮内、椎間板内、乳管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、鼻腔内又は眼窩周囲の副鼻腔内投与、脊髄内、関節液のう内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、尿細管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈ボーラス、静脈内点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、密封療法、点眼、経口、口咽頭、その他、非経口、経皮、関節外、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（吸入）、眼球後方、軟部組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、及び／若しくは経膣投与、並びに／又は以上の投与経路のいずれかの組み合わせ（通常は治療される疾患に依存する）。
本明細書に記載の結合剤に結合されたＥＶ、又は本明細書に記載の１つ以上の結合剤及び１つ以上の治療剤を含むコンジュゲートの投与は、ＥＶを脳又は中枢神経系へと送達するのに適したものであり、特定の実施形態では血液脳関門を通って脳又は中枢神経系へと送達するのに適したものである。いくつかの実施形態では、投与は疾患及び／又は機能不全を有する組織（例えば脳）の部位において行われる。他の実施形態では、投与の部位は疾患及び／又は機能不全を有する組織から離れている（例えば静脈内又は鼻腔内送達の場合）。一実施形態では、本明細書に記載のＥＶ組成物は、対象に非経口投与される。一実施形態では、本明細書に記載のＥＶ組成物は、対象に静脈内投与される。別の実施形態では、本明細書に記載のＥＶ組成物は、対象に鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、結合剤に結合されたＥＶ、又は結合剤に結合された治療剤は、脳又はＣＮＳの遠位において投与された場合に、上記結合剤を用いないＥＶ又は治療剤の輸送又は送達と比較して少なくとも１０％多く、１５％多く、２０％多く、２５％多く、３０％多く、３５％多く、４０％多く、４５％多く、５０％多く、５５％多く、６０％多く、６５％多く、７０％多く、７５％多く、８０％多く、９０％多く、１００％多く、１５０％多く、２００％多く、３００％多く、４００％多く、５００％多く、１０００％多く、又は１０００％よりも多くＢＢＢを通って輸送されて、脳又はＣＮＳに到達する。
非経口投与（例えば静脈内、筋肉内、髄腔内、脳脊髄液内、又は鼻腔内）のための注射用組成物は、滅菌生理食塩水などの適したＩＶ溶液中に、本開示のＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートと、任意で更なる成分とを含有することができる。他の実施形態では、組成物は、水性乳液中の懸濁液として製剤される。
液体の医薬組成物は、本明細書に記載のＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートと、任意で医薬用アジュバントとの集合体を、例えば食塩水、水性デキストロース、グリセロール、又はエタノールなどの担体中に溶解又は分散させて、溶液又は懸濁液を形成することによって調製されることができる。
静脈内製剤は、本明細書に記載のＥＶ（例えば神経細胞由来のＥＶを含む）又は本明細書に記載の結合剤‐治療剤コンジュゲート、等張媒体、及びＥＶ又はコンジュゲートの凝集を防止する１つ以上の物質を含むことができる。例示の静脈内／髄腔内／脳脊髄液内製剤は、食塩水（例えば生理食塩水（ＮＳ）；約０．９１％ｗ／ｖのＮａＣｌ、約３００ｍＯｓｍ／Ｌ）、並びに／又は０．１８％食塩水中のデキストロース４％、及び任意で１％、２％、又は３％のヒト血清アルブミンを含有してもよい。更に、本開示のＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートを破壊して内容物を取得し、この内容物を本開示による組成物中で使用してもよい。
経口液体調製物での使用のために、組成物を、溶液、懸濁液、乳液、又はシロップとして調製することができ、これは液体形態で、又は水若しくは生理食塩水での水和に適した乾燥形態で供給される。経口投与についての上記添加剤としては、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、ショ糖、炭酸マグネシウムなどである。必要に応じて、その組成物は、湿潤剤、乳化剤、又は緩衝剤などの少量の非毒性補助物質を含んでもよい。
鼻腔内、気管内又は肺内投与の場合、組成物は、鼻、気管、及び／又は肺内へと噴霧できる液体製剤として提供されることができる。
組成物が経口投与用の固体調製物の形態で使用される場合、この調製物は、錠剤、顆粒、粉末、カプセルなどであることができる。錠剤製剤では、組成物は通常は添加剤、例えば糖類又はセルロースの調製物などの添加剤、でんぷんペースト又はメチルセルロースなどの結合剤、充填剤、崩壊剤、及び医薬調製物の製造に一般的に使用される他の添加剤と共に製剤される。
本明細書において提供される医薬組成物（例えば神経細胞由来のＥＶなどの本明細書に記載のＥＶを含む医薬組成物）又は結合剤‐治療剤コンジュゲートは、対象に１回投与されることができ、あるいはある期間にわたって複数回の投与を行ってもよい。例えば２回、３回、４回、５回、又はそれ以上の投与を、１回の治療中に又はある設定された期間にわたって、対象に行ってもよい。いくつかの例では、６回、８回、１０回、１２回、１５回、又は２０回以上の投与を、治療レジメンとして、１回の治療中に又はある設定された期間にわたって、対象に行ってもよい。他の例では、例えば神経学的障害に関連する症状が持続する限り、投与を必要に応じて行ってもよい。いくつかの実施形態では、対象の生涯にわたって反復投与を指示してもよい。例示の投薬スケジュールとしては、１日１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１か月に１回、２か月に１回、３か月に１回、６か月に１回、１２か月に１回、又はそれ以上の期間に１回の、本明細書に記載のＥＶを含む医薬組成物の投与などである。
本明細書に記載のＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む医薬組成物は、単剤療法（単一の薬剤）として、又は併用療法（対象は、ＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む医薬組成物を、１つ以上の追加の薬剤と組み合わせて投与される）で、対象に投与されることができる。本開示のＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む医薬組成物、及び１つ以上の追加の薬剤は、同時に、順次、又は時間を置いて、対象に投与されることができる。
一実施形態では、本開示は、神経学的障害、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、又は神経学的癌、例えば神経膠芽腫に罹患した対象の治療での使用のために、本明細書に記載のＥＶを含む医薬組成物（例えば、ＥＶ（例えば神経細胞由来のＥＶ）を含む医薬組成物）又は本明細書に記載の結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では、本開示は、神経学的障害、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、又は神経学的癌、例えば神経膠芽腫に罹患した対象の治療のための医薬品の製造で使用するために、本明細書に記載のＥＶを含む医薬組成物（例えば、ＥＶ（例えば神経細胞由来のＥＶ）を含む医薬組成物）又は結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの例では、医薬製剤は、流体媒体１ｍｌあたり約５０ｎｇ以上のＥＶを含むことができる。例示の医薬製剤は、流体媒体１ｍｌあたり約１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１．０μｇ、１．５μｇ、２．０μｇ、２．５μｇ、３．０μｇ、５．０μｇ、１０．０μｇ、１５．０μｇ、２０．０μｇ、１００μｇ、又はそれ以上のＥＶを含むことができる。
他の実施形態では、医薬製剤は、媒体１ｍｌあたり約０．１μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約０．２μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約０．３μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約０．４μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約０．５μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約０．６μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約０．７μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約０．８μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約０．９μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約１．０μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約１．５μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約２．０μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約２．５μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり少なくとも例えば約３．０μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり例えば少なくとも約５．０μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約１０．０μｇのＥＶ、静脈内投与用媒体１ｍｌあたり１５．０μｇのＥＶ、又は静脈内投与用媒体１ｍｌあたり約２０．０μｇ以上のＥＶを含んでもよい。
いくつかの例では、組成物の投与は、単回用量中に、１ｋｇあたり１×１０８以上の本明細書に記載のＥＶを含む。他の例では、ＥＶ組成物の投与は、１ｋｇあたり１×１０８、１×１０８～１×１０９、１×１０９～１×１０１０、１×１０１０～１×１０１１、１×１０１１～１×１０１２、１×１０１２又はそれ以上の本明細書に記載のＥＶ用量を含む。いくつかの例では、単回用量を複数回、対象に投与する。他の特定の例では、対象への複数回の投与は、静脈内、脳脊髄内、静脈内の注入及び注射のうちの２つ以上を含む。
いくつかの例では、医薬組成物は、少なくとも１ｍｇのＥＶ、少なくとも５ｍｇのＥＶ、少なくとも１０ｍｇのＥＶ、少なくとも２０ｍｇのＥＶ、少なくとも２５ｍｇのＥＶ、少なくとも５０ｍｇのＥＶ、少なくとも６０ｍｇのＥＶ、少なくとも７５ｍｇのＥＶ、少なくとも１００ｍｇのＥＶ、少なくとも１５０ｍｇのＥＶ、少なくとも２００ｍｇのＥＶ、少なくとも２５０ｍｇのＥＶ、少なくとも３００ｍｇのＡｂ‐ＥＶ、約３５０ｍｇのＥＶ、約４００ｍｇのＥＶ、約５００ｍｇのＥＶ、約７５０ｍｇのＥＶ、約１ｇ（１，０００ｍｇ）以上の本明細書に記載のＥＶを、単独で、又は治療有効量の少なくとも１つの追加の薬剤と組み合わせて含む剤形である。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、約１０ｍｇ～約７５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約６５０ｍｇ、又は約３０ｍｇ～約５００ｍｇ、又は約３５ｍｇ～約４５０ｍｇ、最も多くの場合約５０～約５００ｍｇの本明細書に記載のＥＶを含む。
例えば神経細胞由来のＥＶなどの本開示のＥＶを含む医薬組成物又は本開示の結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む医薬組成物の治療有効量は、重大な悪影響を引き起こす可能性のある量を超えることなく、治療される状態（例えば神経学的障害、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、又は神経学的癌、例えば神経膠芽腫）の１つ以上の症状を治療又は軽減するのに十分な量である。治療上有効な用量は、治療対象の状態の性質及び治療される特定の個体などの多数の因子に依存し得る。
Ｇ．治療の方法
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む組成物を用いて、対象を治療する方法を提供する。本明細書に記載のＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む組成物又は医薬組成物はいずれも、本明細書において提供される方法のいずれの使用にも適している。例示の実施形態では、本開示のＥＶは、神経細胞、例えば神経前駆細胞、ニューロン、又は星状細胞由来である。他の例示の実施形態では、本開示のＥＶは合成によって生産され、神経ＥＶの特徴である１つ以上のマーカー、例えばＭＳＣ由来のＥＶに存在しない、神経ＥＶに存在する１つ以上のタンパク質又は核酸を含有する。他の例示の実施形態では、ＥＶは、これらに限定するものではないが、１つ以上の更なる治療剤、例えばカルバマゼピン、バルプロ酸、ラモトリジン、オクスカルバゼピン、プレガバリン、ガバペンチン、及びトピラメート、並びにそれらの組み合わせなどの１つ以上のＡＥＤを含有する。
いくつかの態様では、本開示は、対象の神経学的障害、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、又は神経学的癌、例えば神経膠芽腫の治療（例えば治癒、抑制、関連症状の軽減、進行の遅延若しくは防止、発症の遅延若しくは防止、又は再発若しくはぶり返しの防止）方法を提供し、その方法は、本明細書に記載のＥＶ又は本明細書に記載の結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む組成物を、対象の疾患又は障害を治療するのに十分な量で対象に投与するステップを含む。疾患又は障害を治療するのに十分な量は、本明細書において提供されるように、好ましくは有効量、例えば治療有効量である。
治療の結果としての症状の変化は、いずれかの適した対象に対して測定されることができる。例えば、症状の変化は、治療開始前の同じ患者が経験した症状の頻度、重篤度、若しくは持続時間、又は回数に対して測定されることができる。他の実施形態では、症状の変化は、治療を受けていない、即ち本開示のＥＶ又は本開示の結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む組成物を投与されていない、同様の症状を有する異なる対象又は対象のグループが経験した、症状の頻度、重篤度、持続時間、又は回数に対して測定されることができる。いくつかの実施形態では、改善の程度は、適した対象に対して決定した場合に、少なくとも５％、即ち少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む組成物は、単回用量として対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＥＶ又は結合剤‐治療剤コンジュゲートを含む組成物は、複数回の用量で投与される。例えばいくつかの実施形態では、組成物を毎日、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、７日に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、８週間に１回、又は１２週間に１回投与することができる。
本明細書に記載の方法の他の適当な修正及び適応は明らかであり、適当な均等物を用いて、本明細書で開示される本発明又は実施形態の範囲から逸脱することなく実施することができることは、当業者には容易に明らかである。本発明を詳細に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによってより明確となるであろう。これらの実施例は、単なる例示を目的とするものであり、限定を意図したものではない。
以下の実施例は単なる例示であり、本明細書において提供される本開示の範囲を限定することは全く意図されていない。
実施例１：ＥＶの増強された取り込みのための内皮細胞マーカー及び経路の特定
概要
細胞集団中の各細胞がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて遺伝子ノックアウトされているインビトロシステムを、遺伝子スクリーニングに利用できる（Horlbeck, M.A., et al, Compact and highly active next‐generation libraries for CRISPR‐mediated gene repression and activation. Elife, 2016. 5）。
以下の実験は、ＥＶ取り込みに関与する経路の特定のために設計された遺伝子スクリーニングを説明するものである。これまでの結果は、神経幹細胞／神経前駆細胞に由来するＥＶが、未知の機構によってＢＢＢを通過できることを示している。形質転換されたヒト脳内皮細胞培養物は、ＢＢＢをインビトロで模倣するために使用されており、ＨＣＭＥＣ／Ｄ３（Ｄ３）という名称で市販されている（Weksler, B., I.A. Romero, and P.‐O. Couraud, The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and barriers of the CNS, 2013. 10(1): p. 16‐16）。以下の研究は、Ｄ３細胞、及び神経前駆細胞株（ＡＢ１２６）に由来するＥＶを用い、そのＥＶは、細胞によるＥＶの取り込みをフローサイトメータで検出できるように、蛍光標識されることができる。Ｄ３細胞は、Ｃａｓ９及びライブラリ形質導入を受けて単一遺伝子ノックアウトを生じ、続いて蛍光標識ＥＶ（ＡＢ１２６）で処置された。ＥＶ取り込みに関与するタンパク質の発現を欠く（遺伝子ノックアウトによって）細胞は、取り込みが障害されない細胞に比べて蛍光が減少し、これによって、ＥＶ取り込みにおいて重要な又はＥＶ取り込みに関与する内皮遺伝子及び経路が特定される。
予備実験
本明細書に記載の取り込みの研究の有効性、実現可能性、及び再現性を保証するために、例えば細胞倍加時間、ＥＶ標識特異性、取り込み時間経過、蛍光の最大化、抗生物質耐性プロファイル、及び毒性プロファイルを含む様々なパラメータを最適化するための予備実験が必要であった。例えば、１ｅ５細胞のＣａｓ９形質導入培養物は、Ｄ３細胞株の製造元が推奨する１０継代以内という制限を十分に満たす４継代で、８ｅ７細胞へと十分に増加させることができることが確認された。更に、ＥｘｏＧｌｏｗ（商標）タンパク質ＥＶ標識試薬は、標識の蛍光強度と共有結合メカニズムとの間のバランスが、ＲＮＡ又は膜を標識する試薬よりも魅力的なものであったため、今後の研究のために選択された。取り込みが多い細胞と取り込みが少ない細胞との蛍光の差を最大化するために、ＥＶの最大細胞取り込みの時点も決定した。一般に、２４時間にわたって上昇傾向が見られ、これは１６～２４時間の時点で安定状態となるようである。細胞は１日強ごとに倍になることを考え、最終時点として２４時間を使用することが決定された。更に、スクリーニングから選択された細胞は、対照より蛍光が低い細胞であり、これはＥＶの取り込みの減少を示している。従って、陽性対照細胞の蛍光が高いほど、取り込みに影響のある細胞を容易に区別できる。これを考慮して、例えば染色プロトコル及びフローサイトメトリー中のゲーティングを調整した。実験系の実現可能性にとって重要な他の最適化手順も、必要に応じて実施された。
細胞株の生成
Ｃｅｌｌｅｃｔａ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｐＲＣＣＢ‐ＣＭＶ‐Ｃａｓ９‐２Ａ‐Ｂｌａｓｔ（ウイルス調製物、４．６ｅ６ＴＵ／９００μＬ）を、Ｃｅｌｌｅｃｔａから購入した。細胞を、１、３、及び１０ＭＯＩでの接種、並びに未処置の対照に関する以下の表に従って、プレーティングした。過去に決定された１．３１日／倍加という割合を用いて、倍加時間を計算した。播種密度は、ウイルス接種のために３０，０００細胞／ｃｍ２に調整された。処置に必要な細胞数（３．２９Ｅ＋０５）は、プレーティングの１～２日後の一般的な細胞密度に従って、倍加時間及びウイルス力価から逆算した。
Figure 2023515708000046
Figure 2023515708000047
細胞を、播種のおよそ４８時間後に、ＭＯＩごとに適切な量のウイルスを用いて、１μＬ／ｍＬのＬｅｎｔｉＴｒａｎｓの存在下で形質導入した。細胞を７２時間成長させた後に、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンを補充した。細胞を２週間のブラストサイジン選択に供し、必要に応じて継代した。選択開始の１１日後に、細胞をＭＯＩごとに２／１２ウェルに分割して、ＣＲＩＳＰＲｕＴｅｓｔ（Ｃｅｌｌｅｃｔａ）を実施した。１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン中での２週間が終了した時点で細胞をＭＯＩごとに３グループに分割し、１倍、２倍、及び４倍のブラストサイジン濃度（１０、２０、４０μｇ／ｍＬ）に供した。ＭＯＩ１０が最良のＭＯＩとして選択された。ＭＯＩ１及び３は５日後に、より高い選択で「そのまま」冷凍された。３つのＭＯＩ１０を全て３×Ｔ２２５へと継代して、以下に記載のウイルス形質導入の準備を実施した。
１．ＣＲＩＳＰＲ有効性試験
Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ‐ＫＯに関するＣＲＩＳＰＲｕＴｅｓｔをＣｅｌｌｅｃｔａから購入し、製造元の説明書に従って実施した。簡潔に述べると、３つのＭＯＩ（１、３、及び１０）全てを、１２ウェルプレートのうちの２つのウェルに分割し、２０μＬのウイルスで処置した（ＣＴ‐Ａ又はＣＴ‐Ｂ、０日目）。細胞を３日後に継代した。５日目、細胞を解離させてフローサイトメトリーを実施した。フローサイトメトリーにより、３つのＭＯＩ全てがＧＦＰ発現の大半のノックアウトに効果的であることが示された。ＭＯＩ１０が最も効果的であり、次のステップのために選択された。ＭＯＩ１及びＭＯＩ３がそれに続いた（データは示されていない）。
２．ｇＲＮＡの試験的形質導入／ピュロマイシン濃度の決定
ｇＲＮＡライブラリを用いた試験的な形質導入と、それに続くピュロマイシンによる選択とを実施して、スクリーニングのセットアップに必要な１ｇＲＮＡ／細胞を選択するための最適な濃度を決定した。細胞を５０Ｋ／ｃｍ２でプレーティングし、２４時間後に約０．５のＭＯＩで形質導入した。３日後に細胞を６つのグループに分割し、０、０．５、１、２、４、及び８μｇ／ｍＬの濃度のピュロマイシン中に再度プレーティングした。細胞を必要に応じて継代した。選択の１０日後（形質導入の１３日後）に、細胞を継代して、プレーティングに不要な余剰の細胞をフローサイトメトリー用に保持した。ここで目標は、１０日目にベースライン選択を確立することであった。ピュロマイシン選択の目標は、１つのｇＲＮＡを有する細胞を選択することである。これは、選択された細胞（０．５、１、２、４、８μｇ／ｍＬ）を選択されていない細胞（０μｇ／ｍＬ）と比較することによって達成される。理想的な結果は、ＲＦＰについて９０％陽性であるにもかかわらず対照より高くはシフトされていない集団である。より高いＲＦＰは１個を超えるｇＲＮＡ／細胞を示す場合があり、これはスクリーニングプロセスに影響を及ぼす。フローデータを＋／－ＲＦＰ及びパーセントＧＦＰ＋／－でゲートし、各集団のモードを報告した（データは示されていない）。
これらの結果に基づくと、２μｇ／ｍＬは、より低い濃度と同様のモードを保持したまま９０％のＲＦＰ＋に最も近づくため、最適である。モード（及び他の測定指標の大半。データは示されていない）は、選択されていないもの（０μｇ／ｍＬ）よりも高いが、製造元は、ＲＦＰ＋蛍光強度に全く影響を与えないのではなく最小限に抑える濃度を選択することを推奨している。これらの結果から、最良の結果を得るために、形質導入後２週間にわたってピュロマイシン選択を継続することを決定した。完全な遺伝子ノックアウトを実現するためには少なくとも１０日が推奨されている。
３．ｇＲＮＡ形質導入
４０ｍｇ／ｍＬのブラストサイジンでのＭＯＩ１０（１０／４０）を、スクリーニングのための最良の細胞株として選択した。プレーティングの４日後に細胞を解離させて、ＴＣ‐１０細胞カウンタで計数した。１．２２ｅ８個という最終的な細胞数が得られた。続いてこれを１．２５ｅ６ＴＵ／μＬのウイルス３２μＬと組み合わせて、懸濁液中で細胞と混合された合計４ｅ７個のウイルス粒子を得た。最終的なＭＯＩは０．３３であり、またユニークｇＲＮＡあたり５００コピーであり、これらはいずれも推奨範囲内であった。細胞を、培地１ｍｌあたり１μＬのＬｅｎｔｉＴｒａｎｓを用いて、それぞれ約３０ｍＬの培地を内包した１４個のＴ２２５フラスコ内でプレーティングし、最終濃度は約３８Ｋ／ｃｍ２となった。ＭＯＩ１０／１０の残りは将来使用するために冷凍した（１０個のバイアル、バイアル１個あたり約３．３ｅ６）。
４．ｇＲＮＡ＋細胞の維持及び選択
継代の３日（約７２時間）後に、培地を、２μｇ／ｍＬのピュロマイシンを含む新鮮な培地に交換した。各継代において細胞を再懸濁し、計数して、２μｇ／ｍＬのピュロマイシン中に再プレーティングした。ピュロマイシン添加の３日及び８日後の継代は、Ａｓｔｒｉｏｓセルソーターでのテストランを含んでいた。
取り込み実験
１．ＥＶの調製
神経前駆細胞培養物から得られた最終体積２０ｍＬの細胞培養物上清から、ＥＶを単離した。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔで決定した場合におよそ５ｅｌ３のＥＶが生成された。ＥＶを４℃で一晩保管した。翌日、ＥＶを約１０ｍＬの複数の画分に分割し、ＥＶの精製のために、２つのｑＥＶ１０３５ｎｍサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムに積載した。３つのＥＶ含有画分を回収し（約３０ｍＬ）、４０μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）と３７℃で６０分反応させて標識した。３０ｍＬ全てを、製造元の説明書に従って、４ｍＬのアリコートとしてＺｅｂａ脱塩カラムに通過させた（１０ｍＬカラム、７ｋＤａのＭＷＣＯ）。ＥＶを光から保護して、４℃で一晩置いた。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔは、ＳＥＣ後の最終的なＥＶの回収量が３．８ｅ１２粒子であったことを示した。
２．取り込み実験
３０ｍＬのＥＶを、上述の１４個のＴ２２５フラスコのうちの７個に培地の交換中に加え（フラスコ１個あたり培地３０ｍＬ＋ＥＶ約４．４ｍＬ）、２４時間にわたって同時にインキュベートした。対照となるディッシュでは、等体積のＰＢＳ＋＋で培地交換を行った。処置の７．５時間後及び処置の２３．７５時間後に写真を撮影した（図１）。これらは時間依存性の蛍光ＥＶの取り込みを示す。処置された細胞を解離させて計数し、３つの等しいグループに分割し、選別のために３０ｅ６細胞／ｍＬで氷上に置いた。全体として、技術的な複製へと３分割する前に、ＥＶ処置グループ及びＰＢＳ処置グループからそれぞれ約２億５０００万個及び２億８０００万個の細胞を得た。
３．蛍光活性化細胞選別
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＭｏＦｌｏ Ａｓｔｉｏｓ ＥＱを用いて、一連の３つのゲートに基づいて細胞を選別した。使用したゲーティング戦略は、まず細胞とデブリとの間の線引きを行い、次に単一の細胞を分離し、続いてＣＦＳＥシグナルに基づいて下の３～４％の細胞を保持した（図２）。フローサイトメータのリアルタイムデータに基づき、各条件について約９００，０００個のイベントをゲートＲ４からキャプチャした。
４．細胞の冷凍及び出荷
細胞の選別中に残りのＰＢＳ処理細胞を解離させ、３つの等しいグループに分割してペレット化した。選別された細胞は５０ｍｌ試験管中で氷上に保持され、セルソーターから出る際にペレット化された。全ての細胞ペレットをＰＢＳ＋／＋中で再懸濁し、１．８ｍＬのＣｒｙｏｖｉａｌ（Ｎｕｎｃ）に移した。細胞を再びペレット化し、可能な限り多くのＰＢＳを吸引して、Ｃｒｙｏｖｉａｌを液体窒素中で急速冷凍した後、出荷まで－８０℃で保持した。その後に、６個の細胞ペレットを、シーケンシングのためにドライアイス上でＣｅｌｌｅｃｔａへと出荷した。
結果、及びヒットの決定
Ｃｅｌｌｅｃｔａは、８０，０００のｓｇＲＮＡそれぞれによって注釈が付けられた、６つの試料それぞれに関する読み取り値を含む生シーケンシングデータ（ｆａｓｔｑファイル）及びエクセルファイルを提供した。ガイドＲＮＡアラインメントを用いて配列のアラインメントを再度行い、以下の３種の分析を実施した：（ｉ）バッチ効果を除去したＭＡｇｅＣＫ（Li, W., et al., MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome‐scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology, 2014. 15(12): p. 554）プロトコル、（ｉｉ）バッチ効果を除去していないＭＡｇｅＣＫ、及び（ｉｉｉ）ＤＥＳｅｑ２発現差異解析とペアリングされたＭＡｇｅＣＫアラインメント。いずれのＭＡｇｅＣＫ分析も、信頼性の高いヒットのみを提供しなかった。しかしながら、ＤＥＳｅｑ２と組み合わされたＭＡｇｅＣＫは、堅牢な結果を提供した。全遺伝子セットのうち、６，４４２個のｇＲＮＡは、５，１２５個のユニーク遺伝子に対応する、０．０５未満の調整済みｐ値（ｐａｄｊ）を有していた。関心となるのは実験条件下で（枯渇するものとは対照的に）富化されるものであるため、調整済みｐ値（ｐａｄｊ）が０．０５未満であり正のｌｏｇ２倍率変化（ｌｏｇ２ＦＣ）を伴う全ての遺伝子を、リストから更に分離した。図３。これにより、リストは９５１個のユニーク遺伝子を表す９７６個のｇＲＮＡに絞り込まれ、２５個の遺伝子が２つのｇＲＮＡヒットを有していた。
続いてこれら９５１個のユニーク遺伝子を、（https://baderlab.Org/CellCellInteractionsからの）受容体‐リガンドペアのリストと相互参照し、１３２個のユニークタンパク質を得た（表２）。
Figure 2023515708000048
Figure 2023515708000049
Figure 2023515708000050
Figure 2023515708000051
Figure 2023515708000052
表２に記載のタンパク質に加えて、この取り込み実験によって、関心の標的としてＣＤ１６４、Ｂ３ＧＡＴ１、及びＳＴ８ＳＩＡ３が特定された。ＣＤ１６４は、ＣＤ１３３＋細胞の移動においてある役割を果たす。Ｂ３ＧＡＴ１及びＳＴ８ＳＩＡ３は、特定のエピトープを特定のタンパク質に配置する酵素であり、そのエピトープは、本発明の方法によって標的化できる。従って、Ｂ３ＧＡＴ１及びＳＴ８ＳＩＡ３によって生成されるエピトープも関心の標的として含まれた。
実施例２ ゲノムワイドスクリーニングの確認
本研究の早期段階において、ＥＶの取り込み及び／又はＨＣＭＥＣ／Ｄ３内皮細胞株への付着に関与する可能性がある約１，０００個の遺伝子を特定した。この大規模な遺伝子のセットを、この分析に固有の方法（ｇＲＮＡの数、ｐ値）に加えて遺伝子発現データ及び細胞内局在性データを用いて分析した。ＣＤ７４、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＨＬＡ‐ＤＯＡ、ＨＴＲ６、ＩＦＮＬＲ１、ＭＣＨＲ２、ＶＬＤＬＲ、ＺＰ２、Ｂ３ＧＡＴ１、ＳＴ８ＳＩＡ３、及びＣＤ１６４を含むいくつかの標的を、更なる確認のために選択した。各遺伝子を標的化する２つのユニークＣａｓ９レンチウイルス粒子を、Millipore Sigmaに注文した。
細胞株の形質導入
ＨＣＭＥＣ／Ｄ３細胞（Ｄ３）をMillipore Sigmaに注文して解凍した（ｐ０）。Ｄ３細胞を上述のようにして培養した。３日目、細胞を分割して、約１ｅ５個の細胞を、１μＬ／ｍＬのＬｅｎｔｉＴｒａｎｓ試薬（Ｃｅｌｌｅｃｔａ）、及びクローンあたり５ＭＯＩの、各遺伝子を標的化するｇＲＮＡレンチウイルス粒子の存在下で、１２ウェルのディッシュにプレーティングした。形質導入の７２時間後に培地を交換し、８μｇ／ｍＬのピュロマイシンを補充した。初期選択の３日後にウェルの培地を完全に交換し、５μｇ／ｍＬのピュロマイシンを補充した。合計１４日間にわたって、必要に応じて細胞をピュロマイシンの存在下で分割した。
取り込み実験
ラウンド１のピュロマイシン選択の最後に、細胞を１５０Ｋ細胞／ｃｍ２、７５Ｋ細胞／ｃｍ２、及び３７．５Ｋ細胞／ｃｍ２で１２ウェルのディッシュに継代した。継代の１日後に馴化培地をスクロース勾配プロトコルを用いて濃縮し、上述のようにＣＦＳＥで標識し、５ｍＬの７Ｋ ＭＷＣＯ Ｚｅｂａカラムを製造元の説明書に従って用いて遊離染料を除去した。最終的な体積を１．８ｍＬとし、３つの０．６ｍＬのアリコートに分割して４℃に維持した。翌日（継代の２日後）、１５０Ｋ／ｃｍ２のグループを、培地の完全な交換でＣＦＳＥ標識ＥＶによって処置した。処置時点において細胞は１００％コンフルエントであった。６時間後に細胞をＡｃｃｕｍａｘで解離させ、４％のＰＦＡ中で１０分間固定し、フローサイトメトリーのために９６ウェルプレートに移した。これに続く数日、このプロセスを７５Ｋ／ｃｍ２及び３７．５Ｋ／ｃｍ２のディッシュに対して繰り返した。更に、ＨＣＭＥＣ／Ｄ３を維持したプレートを、「細胞のみ」の対照として機能させるために、解離させて固定した。
試料をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓで分析した。分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて実施された。簡潔に述べると、単一の細胞をゲーティングし、複製物を連結した。４８８～５２５エリア（ＦＬ１‐Ａ）チャネルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を対数変換し、「細胞のみ」グループ及び「ＣＲＩＳＰＲ対照」グループに基づいてスケーリングした（図４）。連結された生物学的複製からの、対数変換された蛍光強度中央値を、細胞のみの場合（０％に設定）、及びＣＲＩＳＰＲ対照（１００％に設定）に対してスケーリングした。蛍光強度の低下は約３４％～８８％であった。全体として１１個の細胞株のうちの８個が検証され、ヒト脳微小血管内皮細胞でのＥＶの増強された取り込みのための標的としてのこれらの適合性が示された。
ＥＶの修飾
これら８つのヒットのうちの以下の４つを、ＥＶを修飾してＢＢＢを通っての取り込みを増強するためのコンセプトの実証研究のために選択した：ＧＰＲ３７Ｌ１、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＺＰ２、及びＶＬＤＬＲ。
実施例３：修飾されたエクソソームによる、インビトロでの脳内皮細胞の貫通
神経前駆細胞由来のＥＶを、Ｌａｍｐ２ｂ‐ＰＳＡＰ融合遺伝子構築物を用いて修飾して、スクリーニングで特定されたＧＰＲ３７Ｌ１に特異的に結合するＰＳＡＰを発現させる。これとは別に、単離後のＥＶを、ＳＴ８ＳＩＡ３酵素によってコードされるＡ２Ｂ５エピトープに特異的に結合するＡ２Ｂ５抗体をＥＶに結合させることによって修飾した。修飾済みのＥＶの両方のセットを、可視化のためにＣＦＳＥで標識する。未修飾のＥＶもＣＦＳＥで修飾する。これは対照として機能することになる。
未修飾のＤ３脳内皮細胞を６ウェルのディッシュにプレーティングし、標準条件下で成長させる。ＣＦＳＥで標識された、修飾済みのＥＶ及び未修飾のＥＶを、６ウェルのディッシュに以下のように加える（グループごとに３つの複製）：
グループ１：未修飾のＥＶ、低用量、２００ＥＶ／細胞
グループ２：未修飾のＥＶ、中用量、１０００ＥＶ／細胞
グループ３：未修飾のＥＶ、高用量、５０００ＥＶ／細胞
グループ４：ＰＳＡＰを発現するように修飾されたＥＶ、低用量、２００ＥＶ／細胞
グループ５：ＰＳＡＰを発現するように修飾されたＥＶ、中用量、１０００ＥＶ／細胞
グループ６：ＰＳＡＰを発現するように修飾されたＥＶ、高用量、５０００ＥＶ／細胞
グループ７：Ａ２Ｂ５抗体を発現するように修飾されたＥＶ、低用量、２００ＥＶ／細胞
グループ８：Ａ２Ｂ５抗体を発現するように修飾されたＥＶ、中用量、１０００ＥＶ／細胞
グループ９：Ａ２Ｂ５抗体を発現するように修飾されたＥＶ、高用量、５０００ＥＶ／細胞
Ｄ３脳内皮細胞によるＥＶの取り込みを経時的に監視する。２４時間の時点で細胞を解離させて洗浄し、ＦＡＣＳを用いて経口を定量する。
実施例４：脳及びＣＮＳへの、修飾されたエクソソームのインビボでの送達
神経前駆細胞由来のＥＶを上述のように修飾して、ＰＳＡＰ又はＡ２Ｂ５抗体を発現させ、１．５～２ｍＣｉのインジウム１１１‐オキシンで標識する。未修飾のＥＶもインジウム１１１で標識して、対照として機能させる。ＥＶを以下のようにして、マウスの尾部静脈に静脈内注射する（グループごとに３つの複製）：
グループ１：未修飾のＥＶ、低用量、２．７ｅ９ＥＶ／ｋｇ
グループ２：未修飾のＥＶ、中用量、２．７ｅ１０ＥＶ／ｋｇ
グループ３：未修飾のＥＶ、高用量、２．７ｅ１１ＥＶ／ｋｇ
グループ４：ＰＳＡＰを発現するように修飾されたＥＶ、低用量、２．７ｅ９ＥＶ／ｋｇ
グループ５：ＰＳＡＰを発現するように修飾されたＥＶ、中用量、２．７ｅ１０ＥＶ／ｋｇ
グループ６：ＰＳＡＰを発現するように修飾されたＥＶ、高用量、２．７ｅ１１ＥＶ／ｋｇ
グループ７：Ａ２Ｂ５抗体を発現するように修飾されたＥＶ、低用量、２．７ｅ９ＥＶ／ｋｇ
グループ８：Ａ２Ｂ５抗体を発現するように修飾されたＥＶ、中用量、２．７ｅ１０ＥＶ／ｋｇ
グループ９：Ａ２Ｂ５抗体を発現するように修飾されたＥＶ、高用量、２．７ｅ１１ＥＶ／ｋｇ
グループ１０：インジウム１１１‐オキシンなし
注射の１、１２、及び２４時間後の頭部及び全身の単一光子放出分光画像生成によって、ＥＶの取り込みを決定し、脳内及び全身の放射能の相対強度を決定する。
参照による援用
本出願全体を通して引用されている参考文献、特許、係属中の特許出願、及び刊行物の内容は、その全体が参照により本出願に明示的に援用される。
均等物
当業者であれば、本明細書に記載の具体的実施形態の多数の同等物を認識するか、又は通常の実験のみを用いて確認できるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (65)

  1. 脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する外因性結合剤を含む細胞外小胞（ＥＶ）。
  2. 前記外因性結合剤が、血液脳関門を通過する前記ＥＶの輸送を増強する、請求項１に記載のＥＶ。
  3. 前記外因性結合剤が、表１に示される標的タンパク質に特異的に結合する、請求項１又は２に記載のＥＶ。
  4. 前記ＥＶが、複数の外因性結合剤を含み、そのそれぞれが表１に記載の標的タンパク質に特異的に結合する、請求項１又は２に記載のＥＶ。
  5. 前記ＥＶが、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の外因性結合剤を含む、請求項４に記載のＥＶ。
  6. 前記外因性結合剤が、表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合する、請求項１又は２に記載のＥＶ。
  7. 前記ＥＶが複数の外因性結合剤を含み、そのそれぞれが表２に記載の標的タンパク質に特異的に結合する、請求項１又は２に記載のＥＶ。
  8. 前記ＥＶが、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の外因性結合剤を含む、請求項７に記載のＥＶ。
  9. 前記外因性結合剤が、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＯＸＤ４、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７及びＶＬＤＬＲからなる群から選択される内皮細胞タンパク質に特異的に結合する、請求項１から８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  10. 前記外因性結合剤が、ＫＣＮＴ２、ＯＲ４Ｘ２、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴ２Ｄ２、ＴＭＥＤ１０、及びＶＬＤＬＲからなる群から選択される内皮細胞タンパク質に特異的に結合する、請求項１から９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  11. 前記外因性結合剤が、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＶＬＤＬＲ、ＺＰ２、ＩＦＮＬＲ１、ＨＴＲ６、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＭＣＨＲ２、ＣＤ１６４、Ｂ３ＧＡＴ１修飾タンパク質、及びＳＴ８ＳＩＡ３修飾タンパク質からなる群から選択される内皮細胞タンパク質に特異的に結合する、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＥＶ。
  12. 前記外因性結合剤が、抗体又はその抗原結合部分である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  13. 前記抗体又はその抗原結合部分が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、及びシングルドメイン抗体からなる群から選択される抗体フラグメントである、請求項１２に記載のＥＶ。
  14. 前記抗体又はその抗原結合部分が、ヒト化抗体又はその抗原結合部分である、請求項１２又は１３に記載のＥＶ。
  15. 前記抗体又はその抗原結合部分が、完全ヒト抗体又はその抗原結合部分である、請求項１２又は１３に記載のＥＶ。
  16. 前記外因性結合剤がポリペプチドリガンドである、請求項１から１１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  17. 前記外因性結合剤がアプタマーである、請求項１から１１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  18. 前記ＥＶが、約２０ｎｍから約２５０ｎｍのサイズである、請求項１から１７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  19. 前記ＥＶがエクソソームである、請求項１から１８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  20. 前記ＥＶが微小胞である、請求項１から１９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  21. 前記ＥＶが、初代細胞、形質転換細胞、又は幹細胞／前駆細胞に由来する、請求項１から２０のいずれか１項に記載のＥＶ。
  22. 前記ＥＶが、神経細胞、筋細胞、免疫細胞、脂肪細胞、又は腫瘍細胞に由来する、請求項１から２１のいずれか１項に記載のＥＶ。
  23. 前記ＥＶが、神経細胞、例えば、星状膠細胞、希突起膠細胞、ニューロン、又はグリア細胞に由来する、請求項２２に記載のＥＶ。
  24. 前記ＥＶが、免疫細胞、例えばミクログリア細胞又は樹状細胞に由来する、請求項２２に記載のＥＶ。
  25. 前記ＥＶが、幹細胞／前駆細胞に由来する、請求項２１に記載のＥＶ。
  26. 前記ＥＶが、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞に由来する、請求項２５に記載のＥＶ。
  27. 前記ＥＶが、神経前駆細胞、神経幹細胞、又は間葉系幹細胞に由来する、請求項２５に記載のＥＶ。
  28. 前記ＥＶが、培養された細胞株、例えばＣＨＯ細胞株、ＨＥＫ２９３細胞株、又はＶｅｒｏ細胞株に由来する、請求項１から２７のいずれか１項に記載のＥＶ。
  29. 前記ＥＶが、前記外因性結合剤を組み換え発現する細胞に由来する、請求項１から２８のいずれか１項に記載のＥＶ。
  30. 前記ＥＶが、小分子を更に含む、請求項１から２９のいずれか１項に記載のＥＶ。
  31. 前記ＥＶが、外因性核酸を更に含む、請求項１から３０のいずれか１項に記載のＥＶ。
  32. 前記外因性核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はそれらの組み合わせである、請求項３１に記載のＥＶ。
  33. 前記ＥＶが、外因性ポリペプチドを更に含む、請求項１から３２のいずれか１項に記載のＥＶ。
  34. 請求項１から３３のいずれか１項に記載のＥＶの治療有効量と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
  35. 請求項１から３３のいずれか１項に記載のＥＶ又は請求項３４に記載の医薬組成物を含む組成物を対象に投与することを含む、前記対象の血液脳関門を通ってＥＶを送達する方法。
  36. 前記組成物が、静脈内、動脈内、又は鼻腔内に投与される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記組成物が、経口で、筋肉内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、頭蓋内に、皮下に、又は吸入によって投与される、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記ＥＶが、前記対象の脳に送達される、請求項３５から３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記ＥＶが、前記対象の中枢神経系に送達される、請求項３５から３７のいずれか１項に記載の方法。
  40. 治療剤に結合された、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する結合剤を含むコンジュゲート。
  41. 前記結合剤が、血液脳関門を通っての前記治療剤の輸送を増強する、請求項４０に記載のコンジュゲート。
  42. 前記結合剤がポリペプチドである、請求項４０に記載のコンジュゲート。
  43. 前記結合剤が、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質のポリペプチドリガンドである、請求項４２に記載のコンジュゲート。
  44. 前記結合剤が、脳内皮細胞により発現されるタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分である、請求項４２に記載のコンジュゲート。
  45. 前記結合剤が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、及びシングルドメイン抗体からなる群から選択される抗体フラグメントである、請求項４４に記載のコンジュゲート。
  46. 前記結合剤が、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合するアプタマーである、請求項４０に記載のコンジュゲート。
  47. 脳内皮細胞により発現される前記タンパク質が、表１に記載の標的タンパク質である、請求項４０から４６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  48. 脳内皮細胞により発現される前記タンパク質が、表２に記載の標的タンパク質である、請求項４０から４６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  49. 脳内皮細胞によって発現される前記タンパク質が、ＡＲＨＧＥＦ１８、ＡＳＢ１２、ＢＡＤ、ＤＣＡＦ１２Ｌ１、ＥＣＨＳ１、ＧＯＲＡＳＰ２、ＧＰＨＡ２、ＧＲＩＤ２ＩＰ、ＨＯＸＤ４、ＫＣＮＴ２、ＬＩＰＪ、ＭＥＳＤＣ２、ＭＴＨＦＳ、ＯＣＭ、ＯＲ４Ｘ２、ＳＣＬＴ１、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴＤ２、ＳＨＯＣ２、ＳＰＲＹＤ３、ＳＴＡＧ１、ＴＭＥＤ１０、ＴＲＩＭ６７、ＴＴＬＬ７及びＶＬＤＬＲからなる群から選択される、請求項４０から４６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  50. 脳内皮細胞によって発現される前記タンパク質が、ＫＣＮＴ２、ＯＲ４Ｘ２、ＳＥＲＡＣ１、ＳＦＴ２Ｄ２、ＴＭＥＤ１０、及びＶＬＤＬＲである、請求項４０から４６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  51. 前記結合剤が前記治療剤に直接結合されている、請求項４０から５０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  52. 前記結合剤が、リンカーによって前記治療剤に共有結合されている、請求項４０から５０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  53. 前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項５２に記載のコンジュゲート。
  54. 前記治療剤が小分子である、請求項４０から５３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  55. 前記治療剤が、ペプチド又はポリペプチドである、請求項４０から５３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  56. 前記治療剤が核酸である、請求項４０から５３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  57. 前記核酸が、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ分子、プラスミド、コスミド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｇＲＮＡである、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  58. 前記結合剤が、二重特異性抗体又はその抗原結合部分である、請求項４０から５７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  59. 前記二重特異性抗体又はその抗原結合部分が、脳内皮細胞によって発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合部位と、神経疾患抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む、請求項５８に記載のコンジュゲート。
  60. 請求項４０から５９のいずれか１項に記載のコンジュゲートを対象に投与することを含む、前記対象の血液脳関門を通って治療剤を送達する方法。
  61. 前記コンジュゲートが静脈内に投与される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記コンジュゲートが、鼻腔内又は動脈内に投与される、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記コンジュゲートが、経口で、筋肉内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、頭蓋内に、皮下に、又は吸入によって投与される、請求項６０に記載の方法。
  64. 前記コンジュゲートが前記対象の脳に送達される、請求項６０から６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記コンジュゲートが前記対象の中枢神経系に送達される、請求項６０から６３のいずれか１項に記載の方法。
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Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6372250B1 (en) * 2000-04-25 2002-04-16 The Regents Of The University Of California Non-invasive gene targeting to the brain
US8877714B2 (en) * 2005-06-14 2014-11-04 Raptor Pharmaceutical Inc. Compositions comprising receptor-associated protein (RAP) variants specific for LRP2 and uses thereof
US20090098118A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
RU2561130C2 (ru) * 2009-07-02 2015-08-20 Санофи НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 1,2,3,4-ТЕТРАГИДРОПИРИМИДО{1,2-a}ПИРИМИДИН-6-ОНА, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
US20110065645A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 The Regents Of The University Of California Compositions and Methods for Modulating Neuron Degeneration and Neuron Guidance
GB201220474D0 (en) * 2012-11-14 2012-12-26 Sagetis Biotech Sl Polypeptides
WO2016172598A1 (en) * 2015-04-22 2016-10-27 The Broad Institute Inc. Exosomes and uses thereof

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