JP2021511053A - 標的サイレンシングタンパク質の細胞内送達 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞外小胞（ＥＶ）を媒介したタンパク質系治療剤の送達に関する。より具体的には、本発明は、典型的には、標的タンパク質の細胞外、細胞内、または細胞膜に結合する複合ポリペプチド系薬剤の送達に関する。

Description

本発明は、タンパク質特異的タンパク質媒介性分解を誘導する薬剤の送達に関する。

治療法としてのタンパク質生物学的製剤は、がん、遺伝子障害、自己免疫疾患を含む広範囲の疾患の治療および予防への導入が増加している。これらの大部分は、今日のブロックバスター薬であり、それらの細胞外治療活性の結果、送達剤なしで投与されることが非常に多い。タンパク質生物学的製剤（組換え産生モノクローナル抗体など）の最も一般的な作用モードは、その細胞外標的を罠にかけ、任意選択で、次いで、免疫系活性化、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強することである。

重要なことには、細胞内環境は、大きなタンパク質ベースの生物学的物質に高度に制限され、つまり、細胞内標的タンパク質の罠にかけること（例えば、サイレンシングすること）は、ほとんどのタンパク質治療法の範囲外であることを意味する。しかしながら、遺伝子発現または翻訳を妨害する様々な形態のＲＮＡ治療法（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、スプライス切換ＲＮＡなど）の送達ベクターを開発し、それによって特定の遺伝子、および重要なことには、それらの対応するタンパク質のサイレンシングをもたらすことに、かなりの努力がなされている。しかしながら、ＲＮＡ治療法は、標的タンパク質の既存の集団を処理せず、長寿命タンパク質またはさもなければ枯渇に抵抗性のタンパク質に対して遅延した有効性を示す。したがって、ＲＮＡ治療法は、例えば臓器不全、脳卒中、または感染症において、速効性治療が必要とされる急性疾患にはあまり適していない場合がある。細胞膜を容易に横断する低分子阻害剤の使用は、標的タンパク質の即時枯渇／不活性化における有効性を示しているが、しかしながら、これらの方法はまた、非特異的な効果も伴う。ＵＳ８，５３０，６３６、ＷＯ２０１２／０７８５５９、ＷＯ２０１０／１２５６２０は、翻訳後タンパク質枯渇の試みがなされてきたが、これらのアプローチは特定の標的蛋白質に特異的であり、新規の薬物様式またはクラスに必要とされる一般的な適用性を欠いていることを教示する。したがって、最近まで、標的タンパク質集団を枯渇させるための広く適用可能な手段は利用できなかった。ＴＲＩＭ−Ａｗａｙ法（Ｃｌｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ、２０１８）は、翻訳後のタンパク質依存性様式で特定のタンパク質集団を枯渇させる能力を有する最近のシステムである。このシステムは、細胞内の多くの範囲のタンパク質に広く適用可能である。ＴＲＩＭ−Ａｗａｙシステムは、ユビキチンリガーゼの作用による標的タンパク質のユビキチン化に依存する。より具体的には、ＴＲＩＭ２１（ユビキチンリガーゼ）は、タンパク質標的化抗体のＦｃドメインと特異的に相互作用し、この相互作用は、標的タンパク質の分解を刺激するＴＲＩＭ２１による適切なユビキチン化内に標的タンパク質をもたらす。ＴＲＩＭ−Ａｗａｙシステムは、ＴＲＩＭ２１のインビボ送達ならびに目的のタンパク質を標的化する適切な抗体がインビボ設定におけるかなりの障害であるため、インビトロ用途に限定されている。ＴＲＩＭシステム（および好適なユビキチンリガーゼの作用に基づく任意の他のシステム）の二成分性はまた、脂質ナノ粒子（Ｌｎｐ）、高分子送達系、および／またはリポソームなどの従来の送達ビヒクルが有効である可能性が低いことを意味し、ＴＲＩＭシステムは治療的に適切な用量のユビキチンリガーゼの送達を必要とし、ほとんどの場合、標的タンパク質に対する適切な抗体も必要とするからである。

ＵＳ８，５３０，６３６ ＷＯ２０１２／０７８５５９ ＷＯ２０１０／１２５６２０

Ｃｌｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ、２０１８

したがって、大きな生体分子ユビキチンリガーゼベースのタンパク質分解技術の細胞内生物活性送達を取り巻く上記の問題を克服することが、本発明の目的である。本発明は、複雑なタンパク質分解系の産生および送達に関連する多くの障害、例えば、１つの送達ビヒクル内に２つの別個の大きなタンパク質を送達すること、標的タンパク質分解を媒介するユビキチンリガーゼ酵素および抗体などのタンパク質生物学的薬剤の細胞内送達を可能にすること、ユビキチンリガーゼベースのタンパク質分解系の標的送達を可能にすること、ならびにこの技術のインビボでの治療的使用を支持するために任意選択的に適切な抗体と組み合わされたユビキチンリガーゼの大規模に実現可能な製造および精製を可能にすること、などの問題に対処する。

本発明の発明者らは、驚くべきことに、細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームを、ユビキチンリガーゼを送達するように操作して、ユビキチンを介した標的タンパク質の分解を可能にすることができることを見出した。したがって、本発明は、少なくともユビキチンリガーゼを含むが、任意選択で分解される標的タンパク質に結合する抗体も含む、遺伝子操作されたＥＶに関する。したがって、本発明は、他の手段によって送達不可能な非常に複雑な生物システムのための、高度に改変可能で標的化可能であり、かつモジュール化された送達ビヒクルを提供する。

第１の態様では、本発明は、ユビキチンリガーゼを含むＥＶに関する。ユビキチンリガーゼは、好ましくはＥ３ユビキチンリガーゼであり得、さらに好ましくはＴＲＩＭ２１リガーゼまたはそのドメインもしくは領域であり得る。好ましい実施形態では、ユビキチンリガーゼは、ＥＶ当たり多数の酵素でＥＶにリガーゼを積載するために、エキソソームタンパク質に融合される。さらに、好ましい実施形態では、ＥＶは、抗体、好ましくは細胞内標的に対する抗体を優先的に含む。

第２の態様では、本発明は、標的タンパク質を分解する方法であって、（ｉ）抗体によって結合された標的抗原を提供するステップと、（ｉｉ）ＥＶを使用して、ユビキチンリガーゼを抗体の近傍に送達するステップと、を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、分解のために標的とされるタンパク質上に存在する標的抗原に結合することを意図する抗体もまた、任意選択で同じＥＶであってもよいＥＶによって送達される。

さらなる態様では、本発明は、エキソソームタンパク質およびユビキチンリガーゼを含むポリペプチド構築物に関し、さらに他の態様では、本発明は、かかるポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物、およびポリヌクレオチド構築物を含むベクターに関する。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＥＶを産生するための方法に関する。ＥＶ産生のためのかかる方法は、典型的には、ＥＶ産生細胞内に少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物を導入し、ＥＶ産生細胞内で少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド構築物を発現するステップを含む。最後に、ＥＶ産生細胞によって産生されるＥＶは、ＥＶ単離および／または精製のための従来の方法を介して得られる。

さらなる態様では、本発明は、本発明によるＥＶの集団と、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤と、を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、少なくとも１つの抗体をさらに含んでよい。当然、ＥＶ、ＥＶの集団、および／または本発明の薬学的組成物は、医薬、例えば、癌、自己免疫または炎症疾患、および／または心臓血管疾患などの治療において使用され得る。

本発明による様々な実施形態を示す。上から下まで、図面は〜（を示す。（ｉ）ユビキチンリガーゼ（ＵＬ）の複数のコピーを含むように遺伝子操作されたＥＶ、（ｉｉ）エキソソームタンパク質（ＥＰ）とユビキチンリガーゼとの間の融合ポリペプチドを含むように操作されたＥＶを示し、（ａ）エキソソームタンパク質は、膜タンパク質であり、例えば、ＣＤ６３（ｂ）エキソソームタンパク質は、可溶性タンパク質であり、例えば、シンテニン（ｃ）エキソソームタンパク質は、ユビキチンリガーゼから放出され、（ｉｉｉｉ）ルーメン内のユビキチンリガーゼの複数のコピーを含むように操作されたＥＶであり、エキソソームタンパク質とＦｃ結合ポリペプチド（ＦＢＰ）の間の融合タンパク質の発現を通じて達成される可能性のある、表面に付着した抗体（ＡＢ）と組み合わされているＥＶ、および（ｉｖ）ユビキチンリガーゼとエキソソームタンパク質との間に融合ポリペプチドを含むように操作されたＥＶであり、ここで、ユビキチンリガーゼは、有利にはＴＲＩＭ２１であり得、標的タンパク質に対する抗体に結合しているＥＶ。 ＴＲＩＭ２１および抗ＧＦＰ抗体を含むＥＶによる処置後の標的細胞におけるＧＦＰ低減を示す。ＧＦＰ低減の最大の効果は、ＥＶがユビキチンリガーゼ（ＴＲＩＭ ２１）と抗ＧＦＰ抗体の組み合わせを含み、ＧＦＰ発現細胞と同時インキュベートした場合に観察されたが、ＥＶ、抗体またはユビキチンリガーゼの個々の組み合わせはほとんど効果がなかった。 抗ＮＦｋＢ抗体およびＴＲＩＭ２１を含むＥＶとの細胞の同時インキュベートによるＮＦｋＢ経路阻害の用量応答を示す。装填されたＥＶの濃度の増加は、レポーター細胞株における阻害応答をさらに増加させる。

本発明の発明者らは、意外にも、細胞外小胞（ＥＶ）、例えばエキソソームを、ユビキチンリガーゼを送達するように操作して、ユビキチンを介した標的タンパク質の分解を可能にすることができることを見出した。ＥＶは、ＥＶ産生細胞によって細胞外環境に分泌される天然に存在するナノサイズの小胞である。ＥＶ、および特にエキソソームは、抗体およびデコイ受容体などのタンパク質生物学的製剤を標的細胞内に輸送することができることが示され、組み換えタンパク質の特異性と組み合わせてＥＶの特性を利用する、完全に新規の形態の高度な生物学的治療学的利用を可能にする。ＥＶは、生物学的投与の従来の方法よりもいくつかの利点を提供する。例えば、生物学的製剤がＥＶを使用して送達されるとき、ＥＶは分解から保護され、より安定している。ＥＶは有効性の向上をもたらし得る多価薬物送達様式を構成する。ＥＶはタンパク質生物学的薬物動態および薬物力学を改善し得る。ＥＶは目的の組織および細胞を標的にすることができる。ＥＶはそれらの細胞起源を反映する固有の治療効果を有し得る。ならびに、ＥＶはまた、血液脳関門の浸透を可能にし、ＣＮＳ送達を改善し得る。

したがって、本発明は、少なくともユビキチンリガーゼを含むが、任意選択で分解される標的タンパク質に結合する抗体をも含む、遺伝子操作されたＥＶに関する。さらに、本発明は、以下でより詳細に説明される様々な隣接する態様、例えば、ＥＶの積載および逸脱を補助するポリペプチド構築物、かかるポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物、かかるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド構築物を含むベクターおよび細胞、製造方法、複数のかかるポリペプチド含有ＥＶを含む組成物、ならびにかかるＥＶおよびかかかるＥＶを含有する薬学的組成物の医学的用途に関する。したがって、本発明は、他の手段によって送達不可能な非常に複雑な生物システムのための、高度に改変可能で標的化可能であり、かつモジュール化された送達ビヒクルを提供する。

簡便かつ明確にするために、本明細書で用いる特定の用語を以下にまとめ、説明する。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。

簡便かつ明確にするために、本明細書で用いる特定の用語を以下にまとめ、説明する。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、ＥＶに関連して説明されるユビキチンリガーゼは、ユビキチンリガーゼ含有ポリペプチドの文脈においても、ＥＶを含む薬学的組成物（次に、そのようなポリペプチド構築物を含む）の文脈においても、または本発明によるポリヌクレオチド構築物の発現産物として、開示され、関連するものと理解されるべきである。ＥＶを含む薬学的組成物の文脈においても開示され、関連するものと理解されるべきである。さらに、特定の態様に関連して説明される特定の実施形態、例えば、特定の医学的適応の治療に関連する態様に関連して説明されるＥＶの投与経路はまた、当然本発明の薬学的組成物または細胞内送達方法に関連する態様／実施形態などの他の態様および／または実施形態に関連してもよい。一般的な注釈として、本発明によるユビキチンリガーゼ、抗体、エキソソームソーティングドメイン（交換可能に称されるＥＶソーティングドメインまたはＥＶタンパク質または同様のもの）、多量体化ドメイン、切断ドメイン、エンドソームエスケープドメイン、ならびに標的化部分、細胞ソース、ならびに全ての他の態様、実施形態、および代替物は、本発明の範囲および要旨から逸脱することなく、ありとあらゆる可能な組み合わせで自由に組み合わせられ得る。さらに、本発明の任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列（それぞれ、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）は、任意の所与の分子がそれと関連付けられる技術的効果を実行する能力を保持する限り、元のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および配列から大幅に逸脱してもよい。それらの生物学的特性が保持される限り、できるだけ高い配列同一性が好ましいものの、本用途に従うポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列は、天然配列と比較して５０％も（例えば、ＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを使用して計算して）逸脱してもよい。例えば、少なくとも１つのユビキチンリガーゼおよび少なくとも１つのエキソソーム選別ドメインの組み合わせ（融合）は、対応するポリペプチドの特定のセグメントが代置および／または修飾されていてもよいことを示唆し、これは、天然配列からの逸脱が、主要な特性が保存される限り多大であってもよいことを意味する。したがって、同様の論拠が、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に必然的に適用される。

「細胞外小胞」または「ＥＶ」または「エキソソーム」という用語は、例えば、細胞から得られる任意の種類の小胞、例えば、マイクロ小胞（例えば、細胞の形質膜から脱落した任意の小胞）、エキソソーム（例えば、エンドリソソーム経路に由来する任意の小胞）、アポトーシス体（例えば、アポトーシス細胞から得られる）、マイクロ粒子（例えば、血小板に由来し得る）、エクトソーム（例えば、血清中の好中球および単球から得られる）、プロスタソーム（例えば、前立腺癌細胞から得られる）、または心臓体（例えば、心臓細胞から得られる）などに関係することを理解されたい。さらに、当該用語は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＨＤＬおよびカイロミクロンなどのリポタンパク質粒子、ならびに細胞外小胞模倣物、膜押し出しまたは他の技術によって得られた細胞膜小胞などに関係することも理解されたい。本質的に、本発明は、ユビキチンリガーゼ、および任意選択で抗体のための送達または輸送媒体として作用することができる任意のタイプの脂質ベースの構造（小胞形態を有するか、または任意の他のタイプの好適な形態を有する）に関係することができる。ＥＶの医学的および科学的使用ならびに適用を説明するとき、本発明は、通常、複数のＥＶ、すなわち、数千、数百万、数十億、またはさらには数兆ものＥＶ、例えば、体積単位当たり１０^５、１０^８、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、１０^１８、１０^２５、１０^３０などの濃度を含み得るＥＶの集団に関することが当業者には明らかとなる。同じように、例えば、ユビキチンリガーゼおよび抗体の種々の組み合わせまたは提示を含むＥＶに関係し得る「集団」という用語は、かかる集団を共に構築する複数の実態を包含することが理解される。換言すると、個々のＥＶは、複数で存在する場合、ＥＶ集団を構築する。このため、当然、本発明は、ユビキチンリガーゼを含む個々のＥＶ、またはユビキチンリガーゼと抗体との様々な組合せ、および当業者に明らかなように、このようなユビキチンリガーゼおよび／または抗体構築物を順に含むＥＶを含む集団の両方に関する。

本明細書に記載される「抗体」および「ｍＡｂ」ならびに「Ａｂ」という用語は、抗原結合特性を有する両方の抗体の全体（すなわち、全抗体）およびその任意の誘導体を含むことが理解されるべきである。従来、抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）鎖および２つの軽鎖（Ｌ）鎖、またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に細分化され、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域と分散され得る。重要なことに、本発明の目的のために、目的の抗体は、ＥＶ表面のコーティングを可能にするために、Ｆｃ結合剤が結合することができるＦｃドメインを有することが好ましい。本発明で使用する抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはポリクローナル抗体、好ましくはｍＡｂであり得る。本発明で使用する抗体は、本発明による融合タンパク質に含まれるＦｃ結合タンパク質に結合することができる限り、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ナノボディ、ヒトまたはヒト化抗体、またはそれらの任意の誘導体であってもよい。抗体の産生は、本発明の範囲外であるが、典型的には、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方は、ヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスなどの非ヒト哺乳類において実験的に上昇するが、好適な抗体は、他の産生方法、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術の結果でもあり得る。ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、非常に確立された手順であり、当技術分野で周知の技術を使用して達成することができる。本発明で使用する抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、および／または任意の種類のキメラ抗体であり得る。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明で使用するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダムまたは部位特異的変異誘発またはインビボにおける体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。「抗体誘導体」という用語は、抗体の任意の修飾形態、例えば、抗体および別の薬剤または抗体のコンジュゲートを指す。「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を指すことが意図される。追加のフレームワーク領域修飾は、ヒトフレームワーク配列内で行われ得る。本発明による抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＭ、ＩｇＤなどの全てのアイソタイプおよびサブタイプ、ならびにそれらのモノマー、二量体、およびオリゴマーを含んでよい。さらに、本発明による抗体は、ＥＶに表示されるとき、いくつかの機能を有し得る。（１）抗体は、本発明の好ましい実施形態に従って、本明細書に記載のユビキチンリガーゼ系を使用して分解されることが意図される、特定の標的生体分子に含まれる抗原を認識し、それに結合し得る。（２）抗体は、本明細書に記載のＥＶベースの治療剤の再分布を指示し、送達を最適化するために、特定の細胞型、組織、および／または臓器を標的化し得る。（３）目的の標的抗原と相互作用する治療抗体は、ＥＶを使用して目的の組織に効率的に送達され得る（例えば、ＣＮＳまたは脳に）。（４）ＥＶ表面上の多重抗体は、ユビキチンリガーゼ誘発分解を受けることが意図される標的抗原を含む、標的抗原において有意に良好であり得る。（５）抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、ＥＶ上で多重化され、それらの治療有効性を有意に高めることができる。（６）抗体によるＥＶのコーティングは、オプソニン化および／またはＥＶの免疫媒介クリアランスを低下させることができ、このことは次に、治療活性にとって重要であり得る。

「ＥＶタンパク質」および「ＥＶポリペプチド」および「エキソソームポリペプチド」および「エキソソームタンパク質」などの用語は、本明細書では同義に使用され、ポリペプチド構築物（典型的には、ＥＶタンパク質に加えて、Ｆｃ結合ポリペプチドを含む）を好適な小胞構造、すなわち好適なＥＶに輸送するために利用することができるいずれのポリペプチドにも関係することを理解されたい。より具体的には、これらの用語は、融合タンパク質構築物をＥＶなどの小胞構造に輸送する、出入りする、または往復揺動することが可能ないずれのポリペプチドも含むものとして理解されるべきである。かかるエキソソームポリペプチドの例は、例えば、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体としても知られる）およびそのエンドソートドメイン、すなわち、トランスフェリン受容体エンドソートドメイン、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８（シンデカン−１）、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、シンデカン−２、シンデカン−３、シンデカン−４、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ成分、ＣＤ２、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ３ｚｅｔａ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＴＳＧ１０１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１α、Ｍａｃ−１β、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、他のエキソソームポリペプチド、およびこれらの任意の組み合わせが含まれるが、ポリペプチド構築物をＥＶに輸送することができる多数の他のポリペプチドが本発明の範囲内に含まれる。典型的には、本発明の多くの実施形態では、少なくとも１つのエキソソームポリペプチドは、ＥＶに存在する融合タンパク質を形成するために、少なくとも１つのユビキチンリガーゼおよび／または本質的に任意のＦｃ結合ポリペプチドに融合される。かかる融合タンパク質はまた、リンカー、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、多量体化ドメインなどを含む、それらの機能（複数可）を最適化するための様々な他の成分を含んでもよい。本明細書で言及されるタンパク質およびポリペプチドは、ヒト起源であることが好ましいが、他の哺乳類または非哺乳類から得ることもできる。

「ソース細胞」もしくは「ＥＶソース細胞」もしくは「親細胞」もしくは「細胞ソース」もしくは「ＥＶ産生細胞」という用語、または任意の他の類似した用語は、好適な細胞培養条件下で、通常、インビトロ、エクスビボ、もしくはインビボで、ＥＶ、例えば、エクソソソームを産生することができる任意の種類の細胞に関係することが理解されるべきである。かかる条件は、懸濁細胞培養もしくは付着細胞培養、または任意の他の種類の培養系であり得る。中空繊維バイオリアクタ、振盪インキュベータ、および他の種類のバイオリアクタは、懸濁細胞に対する非常に適切な細胞培養インフラストラクチャを表し、様々なバイオリアクタも同様である。本発明によるソース細胞は、広範囲の細胞および細胞株、例えば間葉幹細胞または間質細胞または線維芽細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、ウォートンゼリー、周産期組織、胎盤、アミニオン、歯芽、臍帯血、皮膚組織などから得られる）、アミニオン細胞、およびより具体的にはアミニオン上皮細胞から選択されてもよく、様々な初期マーカーなどを任意選択で発現する。特に関心のある細胞株としては、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト羊膜上皮細胞、微小血管またはリンパ管内皮細胞などの内皮細胞株、軟骨細胞、ＭＳＣ、気道または肺胞上皮細胞、ならびに細胞源の様々な他の非限定的な例が挙げられる。上述のように、ＭＳＣは、様々な供給源、例えば、骨髄、脂肪組織、Ｗｈａｒｔｏｎゼリー、周産期組織（例えば、羊膜、羊膜、羊水、絨毛膜、胎盤、臍帯、Ｗｈａｒｔｏｎゼリー）、歯芽、臍帯血、皮膚などから得ることができる。一般に、ＥＶ産生ソース細胞は、治療される患者に対して、同種、自家、またはさらには異種の性質のいずれかであってもよく、すなわち、細胞は、患者自身からであっても、または無関係または関連、一致または一致しないドナーからであってもよい。本発明のソース細胞は、特に治療対象がヒトである場合、ヒト起源であることが好ましい。しかしながら、他のＥＶ産生細胞源はまた、本発明の範囲内であり、例えば、他の哺乳類、げっ歯類、または任意の他の好適な種もしくは属から得ることができる細胞である。

第１の態様では、本発明は、ユビキチンリガーゼを含むように操作されたＥＶに関する。遺伝子操作および過剰発現戦略を使用することによって、ユビキチンリガーゼの複数のコピーが、それぞれの小胞、例えば、それぞれのエキソソームに装填されてもよく、これは、ＥＶの任意の集団が多数のユビキチンリガーゼを含むことを意味する。ＥＶは、ユビキチンリガーゼ、特にインビボ設定内のユビキチンリガーゼにユニークな輸送手段を提供する。加えて、ＥＶは、様々な生物活性巨大分子を会合させ、送達することができるプラットフォームを提供し、したがって、ユビキチンリガーゼを、特定の組織への活性標的化、免疫回避、生物活性ＤＮＡ／ＲＮＡ種、生物活性タンパク質種（抗体など）、および生物活性小分子を含む、その活性のための追加の成分と共に輸送することを可能にする。

本発明の一実施形態では、ＥＶに含まれるユビキチンリガーゼは、Ｅ３ユビキチンリガーゼである。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、それらの標的のユビキチン化に直接関与し、したがって、タンパク質特異的タンパク質調節を媒介する。単一種のＥ３ユビキチンリガーゼをＥＶに充填（会合）することが好ましいが、いくつかの種のＥ３リガーゼをＥＶに充填することが可能である。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、以下の基のユビキチンリガーゼのいずれか１つから選択され得る。ＡＦＦ４、ＡＭＦＲ、ＡＮＡＰＣ１１、ＡＮＫＩＢ１、ＡＲＥＬ１、ＡＲＩＨ１、ＡＲＩＨ２、ＢＡＲＤ１、ＢＦＡＲ、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ７、ＢＩＲＣ８、ＢＭＩ１、ＢＲＡＰ、ＢＲＣＡ１、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＢＬＬ１、ＣＣＤＣ３６、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＧＲＲＦ１、ＣＨＦＲ、ＣＮＯＴ４、ＣＵＬ９、ＣＹＨＲ１、ＤＣＳＴ１、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、ＤＴＸ３、ＤＴＸ３Ｌ、ＤＴＸ４、ＤＺＩＰ３、Ｅ４Ｆ１、ＦＡＮＣＬ、Ｇ２Ｅ３、ＨＡＣＥ１、ＨＥＣＴＤ１、ＨＥＣＴＤ２、ＨＥＣＴＤ３、ＨＥＣＴＤ４、ＨＥＣＷ１、ＨＥＣＷ２、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＣ５、ＨＥＲＣ６、ＨＬＴＦ、ＨＵＷＥ１、ＩＲＦ２ＢＰ１、ＩＲＦ２ＢＰ２、ＩＲＦ２ＢＰＬ、Ｉｔｃｈ、ＫＣＭＦ１、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＬＮＸ１、ＬＮＸ２、ＬＯＮＲＦ１、ＬＯＮＲＦ２、ＬＯＮＲＦ３、ＬＲＳＡＭ１、ＬＴＮ１、ＭＡＥＡ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ１０、ＭＡＲＣＨ１１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ３、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ５、ＭＡＲＣＨ６、ＭＡＲＣＨ７、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、Ｍｄｍ２、ＭＤＭ４、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＸ３Ａ、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＥＸ３Ｃ、ＭＥＸ３Ｄ、ＭＧＲＮ１、ＭＩＢ１、ＭＩＢ２、ＭＩＤ１、ＭＩＤ２、ＭＫＲＮ１、ＭＫＲＮ２、ＭＫＲＮ３、ＭＫＲＮ４Ｐ、ＭＮＡＴ１、ＭＳＬ２、ＭＵＬ１、ＭＹＣＢＰ２、ＭＹＬＩＰ、ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＮＥＵＲＬ１、ＮＥＵＲＬ１Ｂ、ＮＥＵＲＬ３、ＮＦＸ１、ＮＦＸＬ１、ＮＨＬＲＣ１，ＮＯＳＩＰ、ＮＳＭＣＥ１、ＰＡＲＫ２、ＰＣＧＦ１、ＰＣＧＦ２、ＰＣＧＦ３、ＰＣＧＦ５、ＰＣＧＦ６、ＰＤＺＲＮ３、ＰＤＺＲＮ４、ＰＥＬＩ１、ＰＥＬＩ２、ＰＥＬＩ３、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ２、ＰＨＦ７、ＰＨＲＦ１、ＰＪＡ１、ＰＪＡ２、ＰＬＡＧ１、ＰＬＡＧＬ１、ＰＭＬ、ＰＰＩＬ２，ＰＲＰＦ１９、ＲＡＤ１８、ＲＡＧ１、ＲＡＰＳＮ、ＲＢＢＰ６、ＲＢＣＫ１、ＲＢＸ１、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、ＲＣＨＹ１、ＲＦＦＬ、ＲＦＰＬ１、ＲＦＰＬ２、ＲＦＰＬ３、ＲＦＰＬ４Ａ、ＲＦＰＬ４ＡＬ１、ＲＦＰＬ４Ｂ、ＲＦＷＤ２、ＲＦＷＤ３、ＲＩＮＧ１、ＲＬＦ、ＲＬＩＭ、ＲＭＮＤ５Ａ、ＲＭＮＤ５Ｂ、ＲＮＦ１０、ＲＮＦ１０３、ＲＮＦ１１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ１１２、ＲＮＦ１１３Ａ、ＲＮＦ１１３Ｂ、ＲＮＦ１１４、ＲＮＦ１１５、ＲＮＦ１２１、ＲＮＦ１２２、ＮＦ１２３、ＲＮＦ１２５、ＲＮＦ１２６、ＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３、ＲＮＦ１３０、ＲＮＦ１３３、ＲＮＦ１３５、ＲＮＦ１３８、ＲＮＦ１３９，ＲＮＦ１４、ＲＮＦ１４１、ＲＮＦ１４４Ａ、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＲＮＦ１４５、ＲＮＦ１４６、ＲＮＦ１４８、ＲＮＦ１４９、ＲＮＦ１５０、ＲＮＦ１５１、ＲＮＦ１５２、ＲＮＦ１５７、ＲＮＦ１６５、ＲＮＦ１６６、ＲＮＦ１６７、ＲＮＦ１６８、ＲＮＦ１６９、ＲＮＦ１７、ＲＮＦ１７０、ＲＮＦ１７５、ＲＮＦ１８０、ＲＮＦ１８１、ＲＮＦ１８２、ＲＮＦ１８３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ１８６、ＲＮＦ１８７、ＲＮＦ１９Ａ、ＲＮＦ１９Ｂ、ＲＮＦ２、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ２０７、ＲＮＦ２０８、ＲＮＦ２１２、ＲＮＦ２１２Ｂ、ＲＮＦ２１３、ＲＮＦ２１４、ＲＮＦ２１５、ＲＮＦ２１６、ＲＮＦ２１７、ＲＮＦ２１９、ＲＮＦ２２０、ＲＮＦ２２２、ＲＮＦ２２３、ＲＮＦ２２４、ＲＮＦ２２５、ＲＮＦ２４、ＲＮＦ２５、ＲＮＦ２６、ＲＮＦ３１、ＲＮＦ３２、ＲＮＦ３４、ＲＮＦ３８、ＲＮＦ３９、ＲＮＦ４、ＲＮＦ４０、ＲＮＦ４１、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ４４、ＲＮＦ５、ＲＮＦ６、ＲＮＦ７、ＲＮＦ８、ＲＮＦＴ１、ＲＮＦＴ２、ＲＳＰＲＹ１、ＳＣＡＦ１１、ＳＨ３ＲＦ１、ＳＨ３ＲＦ２、ＳＨ３ＲＦ３、ＳＨＰＲＨ、ＳＩＡＨ１、ＳＩＡＨ２、ＳＩＡＨ３、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＴＵＢ１、ＳＹＶＮ１、ＴＭＥＭ１２９，Ｔｏｐｏｒｓ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ７，ＴＲＡＩＰ、ＴＲＩＭ１０、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２２、ＴＲＩＭ２３、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２６、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ３１、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３５、ＴＲＩＭ３６、ＴＲＩＭ３７、ＴＲＩＭ３８、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ４０、ＴＲＩＭ４１、ＴＲＩＭ４２、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４７、ＴＲＩＭ４８、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ４９Ｂ、ＴＲＩＭ４９Ｃ、ＴＲＩＭ４９Ｄ１、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５１、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４、ＴＲＩＭ５５、ＴＲＩＭ５６、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ６０、ＴＲＩＭ６１、ＴＲＩＭ６２，ＴＲＩＭ６３、ＴＲＩＭ６４、ＴＲＩＭ６４Ｂ、ＴＲＩＭ６４Ｃ、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６８、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ７１、ＴＲＩＭ７２、ＴＲＩＭ７３、ＴＲＩＭ７４、ＴＲＩＭ７５Ｐ、ＴＲＩＭ７７、ＴＲＩＭ８，ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭＬ１、ＴＲＩＭＬ２、ＴＲＩＰ１２、ＴＴＣ３、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ３Ｄ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ３、ＵＢＲ４、ＵＢＲ５、ＵＢＲ７、ＵＨＲＦ１、ＵＨＲＦ２、ＵＮＫ、ＵＮＫＬ、ＶＰＳ１１、ＶＰＳ１８、ＶＰＳ４１、ＶＰＳ８、ＷＤＲ５９、ＷＤＳＵＢ１、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＸＩＡＰ、ＺＢＴＢ１２、ＺＦＰ９１、ＺＦＰＬ１、ＺＮＦ２８０Ａ、ＺＮＦ３４１、ＺＮＦ５１１、ＺＮＦ５２１，ＺＮＦ５９８、ＺＮＦ６４５、ＺＮＲＦ１、ＺＮＲＦ２、ＺＮＲＦ３、ＺＮＲＦ４、Ｚｓｗｉｍ２、ＺＸＤＣ。本発明のリガーゼは、ＥＶを産生するソース細胞によって過剰発現され得る、すなわち、ＥＶ産生細胞は、操作された修飾ＥＶを作製するために、本明細書のリガーゼを大量に発現するように遺伝子操作され得る。

好ましい実施形態では、Ｅ３ユビキチンリガーゼはＴＲＩＭリガーゼであり、好ましくはＴＲＩＭ２１リガーゼまたはその任意のドメイン、領域または機能誘導体である。多くのＴＲＩＭリガーゼ、例えば、ＴＲＩＭ２１リガーゼは、Ｆｃドメインに結合する能力を有し、これにより、（１）ＥＶを抗体でコーティングするために使用することができる抗体結合剤そのものとして、および（２）ＴＲＩＭリガーゼの酵素性ユビキチンリガーゼ活性を介したユビキチン誘導標的タンパク質分解の媒介物質として、ＴＲＩＭリガーゼの二重使用を可能にし、プロテアソーム媒介標的タンパク質分解をもたらす。

本発明による特に有利な融合タンパク質は、ユビキチンリガーゼの少なくとも１つのコピーに融合したＥＶタンパク質ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、Ｌａｍｐ２、シンデカン、およびシンテニンを含み得る。ユビキチンリガーゼ（例えば、任意のＴＲＩＭリガーゼ、例えば、ＴＲＩＭ２１）をＥＶの管腔内に存在するように設計することは、ＴＲＩＭ２１のＦｃ結合ドメインと血清内の天然存在のＦｃドメインとの相互作用を防止するために好ましい場合がある。したがって、好ましい実施形態では、ユビキチンリガーゼは、ＥＶ内に本質的に存在し、すなわち、ユビキチンリガーゼの大部分は、小胞内に存在する。これは、ユビキチンリガーゼを、ＥＶの管腔内に存在する、または融合パートナーとして使用して、ＥＶ内にユビキチンリガーゼを配置することができる好適なＥＶタンパク質に融合することによって達成することができる。かかるＥＶタンパク質の例には、いくつかのテトラスパニン、例えばＣＤ６３の好適なドメインおよび部分が含まれるが、シンテニン、シンデカン、またはアリックスのような可溶性ＥＶタンパク質も含まれる。ＴＲＩＭ２１は、典型的に、Ｆｃドメインに結合するため、血清のような環境への曝露は、それが環境抗体と結合することをもたらし得、標的化された分解能力の効果が低下する可能性がある。しかしながら、代替実施形態では、ＴＲＩＭ２１は、ＥＶの膜内またはＥＶの表面上に存在してもよい。

さらなる態様では、ＥＶは、抗体をさらに含むであろう。かかる抗体は、ＴＲＩＭリガーゼ、例えば、抗体のＦｃドメインに対するＴＲＩＭ２１の天然の親和性を使用してＥＶ内に、またはＥＶ上に装填されてもよい。しかしながら、抗体はまた、ＥＶタンパク質への融合などの他の手段によって、またはＦｃ結合ポリペプチドをＥＶに導入することによってＥＶに装填され得る。抗体に加えて、ＴＲＩＭなどのユビキチンリガーゼがそれと相互作用することを可能にするために、任意の種類のポリペプチドおよび／またはタンパク質をＦｃドメインに融合させてもよい。Ｆｃドメインに融合されたそのようなタンパク質は、ナノボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ、モノボディ、アンチケイリン、ならびにＦＣドメインと融合された任意の他のタンパク質を含むタンパク質標的化のためにもあり得る。当然、１つの単一ＥＶは、例えば同時標的化を可能にするために、２つ以上の種類のＦｃドメイン含有タンパク質、例えば、異なる抗原に結合する２つの異なる種類の抗体を含んでよい。１つの単一ＥＶはまた、典型的な場合と同様に、１つのタイプのモノクローナル抗体などの実質的な複数の１つの単一タイプのＦｃドメイン含有タンパク質を含んでもよい。標的化抗体、治療用抗体、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、およびオプソニゼーションおよび／または免疫細胞媒介性クリアランスを低減するための抗体の様々な組み合わせは、本発明の好ましい実施形態を構成する。有利な実施形態では、本発明によるＥＶは、Ｆｃドメインを含む複数のタンパク質を含む。したがって、本発明は、Ｆｃドメインを含む少なくとも１０個のタンパク質、好ましくはＦｃドメインを含む少なくとも５０個のタンパク質、さらにより好ましくはＦｃドメインを含む少なくとも１００個のタンパク質を収容し得る。かかるタンパク質は、同じタンパク質または２つ以上のタンパク質のコピーであってもよい。一実施形態では、ＥＶに関連する抗体は、細胞内、細胞外、および／または膜貫通局在のいずれかに位置する特異的標的を有する。宿主細胞のユビキチン化および分解経路の使用を可能にするため、細胞内標的が好ましいが、細胞外標的も強い治療関心を有する。有利には、ＥＶは、サブセットがユビキチン化のための細胞内標的と相互作用し、別のサブセットが細胞外標的と相互作用し、特定の組織または細胞型への標的化を容易にする、２つ以上の種類の抗体を含んでもよい。抗体の混合集団は、ＥＶ管腔内のみ、ＥＶの外側のみ、またはＥＶの内側および外側の両方に存在し得ることが考えられる。一例は、標的化分解のための細胞内標的に関連する抗体が管腔内に装填され得、組織標的化に関連する抗体がＥＶ表面に表示される。

さらなる実施形態では、ＥＶの外面に結合した抗体は、ＥＶ表面との非共有相互作用によって、例えば、特定の抗体結合タンパク質、例えば、タンパク質ＡのＺドメインとの相互作用によって、または任意のＦｃ受容体、例えば、ＦＣＧＲ（ＣＤ６４）、ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２Ａ）、ＦＣＧＲ２Ｂ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦＣＧＲ２Ｃ（ＣＤ３２Ｃ）、ＦＣＧＲ３Ａ（ＣＤ１６Ａ）、ＦＣＧＲ３Ｂ（ＣＤ１６Ｂ）、ＦＣＡＭＲ、ＦＣＥＲＡ、ＦＣＡＲ、またはマウスＦＣＧＲＩ、ＦＣＧＲＩＢ、ＦＣＧＲＩＩＩ、ＦＣＧＲＩＶ、および／またはＦＣＧＲｎによって結合される。あるいは、ＥＶ−抗体相互作用は、例えば、適切な化学受容体を有するＥＶに結合した正しいリガンドを有する適切に修飾された抗体、例えば、スクシニミジルエステルの形成のための共有結合、またはアジド−アルキン環化付加反応による結合によって促進され得る。あるいは、上述のように、本明細書で言及されるエキソソームポリペプチドを使用して、抗体をＥＶに直接、および／またはＥＶ上に装填することができるが、エクソームポリペプチドを使用して、Ｆｃ結合ポリペプチドと共に融合ポリペプチドを作製してもよく、Ｆｃ結合ポリペプチドは次に抗体のＦｃドメインに結合することができる。上述のように、抗体のＦｃドメインは、例えば、ＴＲＩＭ２１の抗体結合能力を使用して、ＥＶに含まれるＦｃ結合ポリペプチドおよび／または実際にはユビキチンリガーゼ自体によって結合され得る。ユビキチンリガーゼと抗体（典型的には、ＩｇＧ抗体）のＦｃドメインとの間のこの相互作用は、細胞内ＥＶ前駆細胞環境内で、任意のＥＶ産生プロセス中、細胞外環境などの血清を含有する環境内で、および抗体の標的を含有する細胞内環境内などの様々な環境で生じ得る。

本発明のさらなる実施形態では、ＥＶは、ユビキチン結合酵素（Ｅ２ユビキチン結合酵素など）および／またはユビキチン活性化酵素（Ｅ１ユビキチン活性化酵素など）をさらに含み得る。ユビキチンリガーゼ系のこれらの追加の成分をＥＶに操作することによって、ユビキチン化機械全体が単一の小胞内に含まれ、標的タンパク質の分解が非常に効率的であることを意味する。

さらなる態様では、本発明は、（ｉ）抗体によって結合された標的抗原を提供するステップと、（ｉｉ）ＥＶを使用してユビキチンリガーゼを抗体の近接に送達するステップと、を含む、標的タンパク質を分解するための方法に関する。標的タンパク質を分解するための当該方法は、インビトロまたは非治療方法であり得る。

さらに別の態様では、本発明は、ＥＶを使用したユビキチンリガーゼおよび抗体の送達によって標的タンパク質を分解する方法に関する。標的タンパク質の分解は、ＥＶによって送達されるユビキチンリガーゼによってそのユビキチン化によって誘導される。標的タンパク質（抗原）の認識は、適切な抗体によって容易にされ、本質的には、標的タンパク質／抗原とユビキチンリガーゼとの間のアダプター分子として機能する。タンパク質分解の好ましい方法は、同じＥＶまたは少なくとも同じＥＶ集団におけるユビキチンリガーゼおよび抗体のＥＶ媒介共送達によるものであるが、それらの送達は別個の事象であり得る。さらに、の送達および抗原−抗体相互作用は、ユビキチンリガーゼ送達から完全に独立した事象であってもよい。したがって、好ましい後続の実施形態では、抗体およびユビキチンリガーゼの両方は、ＥＶによって、好ましくは同じＥＶによって送達される。

さらなる態様では、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド構築物に関する。本発明によるポリヌクレオチド構築物は、典型的には、少なくとも１つのユビキチンリガーゼおよび少なくとも１つのエキソソームポリペプチドをコードするヌクレオチドストレッチを含む。非限定的な例は、ユビキチンリガーゼ、好ましくはＥ３ユビキチンリガーゼ、より好ましくはユビキチンリガーゼＴＲＩＭ２１、および任意のエキソソームポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物であろう。好ましいエキソソームポリペプチドとしては、ＣＤ８１、シンテニン、シンデカン、ＣＤ６３、Ａｌｉｘ、トランスフェリン受容体、トランスフェリン受容体のエンドソームドメインなどが挙げられる。したがって、本発明は、当然、対応するポリペプチド構築物、すなわち、少なくとも１つのユビキチンリガーゼポリペプチドおよび少なくとも１つのエキソソームポリペプチドを含むポリペプチド構築物にも関する。さらに、本発明はまた、上述のポリヌクレオチド構築物（複数可）および／または上述のポリペプチド（複数可）を含むＥＶ産生細胞（典型的には、細胞培養の形態で存在する細胞であるが、その個々の細胞も含む）に関する。

さらに別の実施形態では、本発明のＥＶは、少なくとも１つの標的化部位をさらに含む。典型的には、標的化部位は、ＥＶの表面（すなわち、ＥＶ膜から小胞外環境に突出する）に存在し、インビボおよび／またはインビトロで正しい組織または細胞型に到達することを容易にする。ＥＶはまた、ユビキチンリガーゼのＥＶへの装填およびそれらのレシピエント細胞内での機能を増強する要素をさらに含んでよい。かかる要素としては、ＥＶ装填を増強する多量体化ドメイン、取り込み後のＥＶ貨物の脱出効率を増強するエンドソーム脱出ドメイン、ＥＶ管腔内貨物の溶解性を向上させる放出ドメインが挙げられる。ポリペプチド構築物は、ユビキチンリガーゼ、エキソソームタンパク質、標的化部分または単一の化合物としての増強要素を含んでもよく、あるいは、これらの異なるドメインは、単一または複数のポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る別個のポリペプチド構築物に存在してもよい。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド構築物を含むベクターに関する。かかるベクターを使用して、ユビキチンリガーゼおよび任意選択で抗体を装填したＥＶを作製することができるが、それらはまた、それら自体が治療薬として使用され得る。本発明によるポリヌクレオチド構築物を担持するベクターの非限定的な例としては、任意の直鎖または環状化ポリヌクレオチド、円形ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド、プラスミド、ミニ円形、アデノウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルス、アデノ関連ウイルス、キャプシドを含まないウイルス、ウイルスゲノム、ｍＲＮＡ、および／または修飾ｍＲＮＡが挙げられる。

好適なポリヌクレオチド構築物のソース細胞への導入（典型的には、ＥＶの産生に好適なＥＶ産生細胞型を含む細胞培養において）は、遺伝子導入、ウイルス媒介形質転換、エレクトロポレーションなどの様々な従来技法を使用して達成され得る。遺伝子導入は、リポソーム、ＣＰＰ、陽イオン性脂質またはポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマーなどの従来の遺伝子導入試薬を使用して行われ得る。ウイルス媒介形質導入はまた、非常に好適な方法論であり、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターなどの従来のウイルスベクターを使用して行われ得る。安定した遺伝子導入のためのウイルス媒介形質導入および非ウイルス方法は、研究開発目的のための細胞バンキングのための安定した細胞および細胞株、すなわち、ＥＶ産生細胞源のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）およびワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）の作成に際して特に関連する。本発明のポリヌクレオチド構築物および／またはベクターを使用して、生成細胞内のユビキチンリガーゼを過剰発現することができ、それによって、プロデューサ細胞によって生成されるＥＶ内に導入されるユビキチンリガーゼのレベルを増加させる。これにより有利には、より高いレベルのユビキチンリガーゼを装填した遺伝子操作されたＥＶがもたらされ、したがって、同じ治療効果を達成するために用量当たりのＥＶがより少ないという意味でより治療効果が高い。

さらに別の態様では、本発明は、本発明によるＥＶの産生のための方法に関する。当該方法は、（ｉ）本明細書に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物をＥＶ産生細胞に導入するステップと、（ｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物によってコードされた少なくとも１つのポリペプチド構築物をＥＶ産生細胞に発現させるステップと、（ｉｉｉ）前記ＥＶ産生細胞によって産生されたＥＶを得るステップと、を含み得る。ＥＶ産生スケールおよびタイムラインは、ＥＶ産生細胞または細胞株に大きく依存することになるため、当業者によって相応に適合され得る。本発明による方法は、ＥＶ精製ステップをさらに含み得る。抗体または任意の他の種類のＦｃ含有タンパク質がＥＶ表面上のＦｃ結合ポリペプチドに結合される場合、ＥＶはまた、問題のＦｃドメイン含有タンパク質（典型的には、抗体）と同時インキュベートすることによって、一段階でもよい。これは、ＥＶ産生ソース細胞によるＥＶ産生の直後に行われ得るか、または様々な精製および単離技術を使用してＥＶが１回以上精製された後に行われ得る。ＥＶは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、イオン交換ＬＣ、サイズ排除ＬＣ、ビーズ溶出ＬＣ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、スピン濾過、接線流濾過（ＴＦＦ）、中空糸濾過、遠心分離、免疫沈降、フローフィールドフラクショネーション、透析、マイクロ流体系分離など、またはそれらの任意の組合せを含む技術の群から選択される１つ以上の手順により精製されてもよい。

有利な実施形態では、ＥＶの精製は、濾過（好ましくは限外濾過（ＵＦ）、接線流濾過、または中空糸濾過）およびサイズ排除もしくはイオン交換液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、またはビーズ溶出ＬＣの逐次併用を使用して実行される。この精製ステップの組み合わせにより、最適化された精製が得られ、これにより今度は優れた治療効果がもたらされる。

さらなる実施形態では、本方法は、追加のポリヌクレオチド構築物をＥＶ産生細胞に導入することを含み得、追加の構築物は、Ｆｃ結合ポリペプチドをコードするので、Ｆｃドメインを含む抗体および／または他のタンパク質に結合するためにＥＶに装填される。かかるプロデューサ細胞からのＥＶの産生は、抗体などのＦｃ含有ポリペプチドの結合のために、それらの表面上にＦｃ結合成分を含むために有利であり、それによってＥＶ標的化を増強する。有利には、本発明によるＥＶは、したがって、ＥＶに遺伝子操作されるＦｃ結合剤とＦｃドメインを含む少なくとも１つのタンパク質との相互作用を通じて、Ｆｃドメインを含む複数のタンパク質でコーティングされ得る。Ｆｃ結合剤とタンパク質、典型的にはＦｃドメインを含む抗体との間の相互作用は、典型的には、主に非共有相互作用に基づく。当然、１つの単一ＥＶは、例えば、その後のユビキチン媒介分解のための同時標的化および治療抗原結合を可能にするために、２つ以上の種類のＦｃドメイン含有タンパク質、例えば、異なる抗原に結合する２つの異なる種類の抗体でコーティングされ得る。１つの単一ＥＶはまた、典型的な場合と同様に、特定の標的を有する１つのタイプのモノクローナル抗体などの、実質的に複数の１つの単一タイプのＦｃドメイン含有タンパク質を含むことができる。上述のように、抗体は、プロデューサ細胞による外来的装填または内因性産生によってＥＶに導入されてもよい。典型的には、抗体または抗体誘導体の外因的付加は、プロデューサ細胞からのＥＶの産生後に行われる。あるいは、抗体または抗体誘導体は、ＥＶプロデューサ細胞内で内因性に産生され得、細胞内でＥＶと関連し得る。

さらに別の態様では、本発明は、本発明のように、通常はＥＶの集団の形態であるＥＶを含む薬学的組成物に関する。典型的には、本発明による薬学的組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化された１種類の治療用ＥＶ（すなわち、エキソソームタンパク質およびユビキチンリガーゼを含むある特定の種類の融合タンパク質を含むＥＶの集団、および任意選択で１種類以上の抗体を含む）を含むが、しかし、例えばコンビナトリアルタンパク質分解処理が望ましい場合には、１つの薬学的組成物中に２つ以上のタイプのＥＶ集団を自然に含むことができる。しかしながら、当然、上述のように、単一のＥＶまたは単一の集団のＥＶは、ユビキチンリガーゼを超え、２つ以上のＦｃ含有タンパク質（例えば、２つ以上の抗体）を含んでよい。少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤は、任意の薬学的に受容可能な材料、組成物またはビヒクル、例えば、固体または液体充填剤、希釈剤、賦形剤、担体、溶媒または封入材料を含む群から選択され得、これらは、例えば、１つの器官または身体の一部から、別の器官または身体の一部への（例えば、血液から関心のある組織および／または器官および／または身体部分への）ＥＶ集団の懸濁、維持、またはその活性の保持もしくは輸送に関与し得る。さらなる実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも１つの抗体をさらに含み得る。組成物は、単一の抗体種またはいくつかの抗体種を含有し得る。

さらに別の態様では、本発明は、医薬で使用するための本発明によるＥＶに関する。当然、エキソソームタンパク質とユビキチンリガーゼ、および１つ以上のタイプの抗体を含むＥＶが医薬で使用される場合、実際に使用されているのは実際には通常ＥＶの集団である。患者に投与されるＥＶの用量は、例えば、ＥＶを含有するユビキチンリガーゼの数、ＥＶに関連する目的の抗体、治療または緩和される疾患または症状、投与経路、治療タンパク質自体の薬理作用、ＥＶの固有の特性、任意の標的化抗体または他の標的化実体の存在、および様々な他の当業者に既知の他の関連するパラメータに依存することになる。

本発明によるＥＶおよびそのＥＶ集団は、このため、予防目的および／または治療目的、例えば、様々な疾患および障害の予防および／または治療および／または緩和における使用のために使用され得る。本発明によるＥＶが適用され得る疾患の非限定的な試料としては、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期症候群（トラップ）、インターロイキン−１受容体拮抗薬（ＤＩＲＡ）の欠乏、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、強皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、血管炎、ギランバレー症候群、急性心筋梗塞、ＡＲＤＳ、敗血症、髄膜炎、脳炎、肝不全、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、腎不全、心不全または任意の急性または慢性臓器不全ならびにそれに関連する根本的な病因、移植片対宿主病、デュシェン筋ジストロフィーおよび他の筋ジストロフィー、ガウチャー病、ファブリー病、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ（ハンター症候群）、およびＩＩＩ、ニーマンピック病、ポンペ病などのリソーム蓄積疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および他のトリヌクレオチド反復関連疾患を含む神経変性疾患、認知症、ＡＬＳ、癌誘発性カケキシア、拒食症、糖尿病２型、様々な癌。ほぼ全ての種類の癌は、本発明の関連疾患標的であり、例えば、急性リンパ芽球性白血病（全て）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、Ａｉｄｓ関連癌、ａｉｄｓ関連リンパ腫、肛門癌、付録癌、アストロサイトーマ、小脳または脳、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳癌、脳腫瘍（小脳星細胞腫、脳星細胞腫／悪性神経膠腫、エペンディマ、髄芽芽腫、腱上原性神経外胚葉腫瘍、視覚経路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫・カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児期、胃腸）、原発不明のがん、中枢神経系リンパ腫、脳星状細胞腫・悪性神経膠腫、子宮頸がん、慢性リンパ球外白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼がん（眼内黒色腫、網膜芽腫）、胆嚢がん、胃がん（胃がん）、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫（脳幹神経膠腫、脳星細胞腫、視覚経路および視床下部神経膠腫）、胃カルチノイド、有毛細胞性白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎臓細胞癌）、喉頭癌、白血病（急性リンパ芽球性（急性リンパ球性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄性（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、慢性リンパ性（慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、慢性骨髄性（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、有毛細胞性白血病））、口唇および口腔癌、空洞癌、脂肪肉腫、肝臓癌（原発性）、肺癌（非小細胞、小細胞）、リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキン、髄芽芽腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮性頸部がん、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫・プラズマ細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成・骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（急性、慢性）、骨髄腫、鼻腔・副鼻腔癌、上咽頭癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫・骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性電位腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（腫瘍肉腫のユーイングファミリー、カポジ肉腫、軟組織肉腫、子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫、黒色腫）、小腸癌、扁平上皮細胞、扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣腫瘍、咽喉癌、胸腺腫および胸腺がん、甲状腺癌、腎盂と尿管の移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ウォルデンストロームマクログロブリン血症、および／またはウィルムス腫瘍。

本発明によるＥＶは、様々な異なる投与経路を介してヒトまたは動物対象に投与することができる。例えば、耳（耳）、頬、結膜、皮膚、歯科、エレクトロオスモーシス、子宮頸部、洞内、気管内、経腸、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊水内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、ブルサル内、心臓内、軟骨内、馬尾内、海綿体内、腔内、脳内、大槽内、角膜内、歯冠内（歯科内）、冠動脈内、体内海綿体内、皮膚内、椎間板内、導管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、鼻腔内、脊髄内、腱滑液鞘内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、管内、腫瘍内、中耳内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオン導入、灌注、喉頭、鼻腔、鼻腔胃、密封療法、眼科、経口、口腔咽頭、その他、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸（吸入）、眼球後、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤性、経気管、経鼓室、尿管、尿道、および／または膣投与、および／または上記投与経路の任意の組み合わせであって、典型的には、治療される疾患および／または抗体またはＥＶ集団の特徴に依存する、上記投与経路の任意の組み合わせである。

上記の例示的態様、実施形態、代替形、および変化形は、本発明の範囲から逸脱することなく改変され得ることを理解されたい。ここで、本発明を添付の実施例によってさらに例示するが、これらの実施例も当然に本発明の範囲および要旨から逸脱することなく大幅に改変され得る。

実施例１ ＴＲＩＭ２１−抗ＧＦＰ−Ａｂ−ＥＶによる細胞内取り込みおよびＧＦＰ枯渇
ＥＶは、限外濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ウォートンのゼリー由来ＭＳＣ（融合ＣＤ８１−インテイン−ＴＲＩＭ２１（インテインモダリティはＥＶ装填後にＴＲＩＭ２１ｆｒｉｍＣＤ８１を分離する放出機構を行う）およびＦｃ結合剤ＣＤ ６３−ＺＺの安定発現）の馴化培地から単離した。ＥＶを装填するために、４×１０＾１１のＥＶを４００μＬ中で、合計３μｇの抗ＧＦＰ ＩｇＧと共に１６時間（一晩）インキュベートした［ａｂｃａｍ（ａｂ１２１８）抗ＧＦＰ抗体［９Ｆ９．Ｆ９］］。ＴＲＩＭ２１およびＦｃ結合を含むＥＶをＧＦＰの細胞内枯渇に用いることができるかどうかを調査するために、ＧＦＰ発現Ｈｕｈ７細胞を４８ウェルプレートに１ウェル当たり３０，０００個の細胞で蒔いて、２．４×１０＾１０ＥＶと１２時間（一晩）同時インキュベートした。細胞を加湿雰囲気中で３７℃および５％のＣＯ２で２時間インキュベートした後、トリプシン化し、図２に示すようにフローサイトメトリーによって分析した。データは、ＥＶ、ＴＲＩＭ２１、および抗ＧＦＰ抗体の組み合わせのみが、ＧＦＰシグナルの有意な枯渇をもたらすことを実証する。

実施例２ＴＲＩＭ２１−抗ＮＦｋＢ−Ａｂ−ＥＶによるＮＦｋＢ枯渇の用量応答
実施例１と同様に、ＥＶを、言外濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、Ｗｈｅｒｔｏｎのゼリー由来ＭＳＣの条件付き培地（融合ＣＤ８１−インテイン−ＴＲＩＭ２１およびＦｃ結合ＣＤ６３−ＺＺを安定して発現する）から単離した。ＥＶを装填するために、４×１０＾１１のＥＶを４００μＬ中で１６時間（一晩）、合計３μｇの抗ＮＦｋＢ ＩｇＧと共にインキュベートした［ａｂｃａｍ：（ａｂ３２３６０）抗ＮＦｋＢ ｐ１０５／ｐ５０抗体［Ｅ３８１］］。ＴＲＩＭ２１およびＦｃ結合を含むＥＶを用量依存的様式でＮＦｋＢの細胞内枯渇のために用いることができるかどうかを調査するために、ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼ細胞を安定して発現するＫｅｎ２９３のレポーター細胞株を４８ウェルプレートに１ウェル当たり３０，０００個の細胞でプレート蒔いて、２．４×１０＾１０ＥＶおよび５ｎｇ／ｍｌ ｈＴＮＦ−αと同時インキュベートした。処置の１２時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。図３において、用量依存的様式で抗ＮＦｋＢ−ａ ｂがＴＲＩＭ２１ＥＶと共に送達されるときに、正常化されたルシフェラーゼレベルを示し、成功した阻害を示す。

Claims (22)

1. ＴＲＩＭリガーゼまたはそのドメインもしくは領域を含む、遺伝子操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
2. 前記ＴＲＩＭリガーゼまたはそのドメインもしくは領域が、ＴＲＩＭ２１リガーゼまたはそのドメインもしくは領域である、請求項１に記載のＥＶ。
3. 前記ＴＲＩＭリガーゼが、エキソソームタンパク質に融合されている、請求項１または請求項２に記載のＥＶ。
4. 前記ＥＶが、少なくとも１つの抗体をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＥＶ。
5. 前記抗体が、エキソソームタンパク質との融合タンパク質に含まれる、請求項４に記載のＥＶ。
6. 前記抗体のＦｃドメインが、前記ＥＶに含まれるＦｃ結合ポリペプチドによって、および／または前記ＴＲＩＭリガーゼのＦｃ結合領域によって結合されている、請求項４に記載のＥＶ。
7. 前記少なくとも１つの抗体の標的タンパク質が、前記ＴＲＩＭリガーゼの作用によって分解される、請求項４〜６のいずれか一項に記載のＥＶ。
8. 前記ＥＶが、ユビキチン結合酵素および／またはユビキチン活性化酵素をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＥＶ。
9. 標的タンパク質を分解するための方法であって、（ｉ）抗体をその抗原に結合させるステップと、（ｉｉ）ＥＶの補助を受けて、ユビキチンリガーゼを前記抗体の近傍に送達するステップと、を含む、方法。
10. 前記抗体もまた、ＥＶによって、任意選択で同じＥＶによって送達される、請求項９に記載の方法。
11. 前記標的抗原が、細胞内標的である、請求項９または請求項１０に記載の方法。
12. エキソソームタンパク質およびＴＲＩＭ２１リガーゼを含むポリペプチド構築物。
13. 請求項１２に記載のポリペプチド構築物をコードする、ポリヌクレオチド構築物。
14. 請求項１３に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、ベクター。
15. 前記ベクターが、直鎖または環状化ポリヌクレオチド、環状ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド、プラスミド、ミニ環、ウイルス、アデノ関連ウイルス、キャプシドを含まないウイルス、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、および／または合成ｍＲＮＡを含む群から選択される、請求項１４に記載のベクター。
16. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＥＶを産生するための方法であって、
    （ｉ）請求項１３に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物をＥＶ産生細胞に導入するステップと、
    （ｉｉ）前記ＥＶ産生細胞内で、前記少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド構築物を発現させるステップと、
    （ｉｉｉ）前記ＥＶ産生細胞によって産生されたＥＶを得るステップと、を含む、方法。
17. 前記ＥＶ産生細胞内に別のポリヌクレオチド構築物を導入して、前記別のポリヌクレオチド構築物から、Ｆｃ結合ポリペプチドを含むポリペプチド構築物を、発現させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記Ｆｃ結合ポリペプチドが、抗体に結合する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記抗体が、溶液中で前記ＥＶに外因的に付加されるか、または前記ＥＶ産生細胞によって内因的に産生される、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＥＶの集団と、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
21. 少なくとも１つの抗体をさらに含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
22. 医薬で使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＥＶ、または請求項２０もしくは請求項２１に記載の薬学的組成物。

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