CN117304320A - 靶向小鼠clec12b蛋白的纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种靶向小鼠CLEC12B蛋白的抗体或抗原结合片段及其应用。该抗体或抗原结合片段选自下列至少之一的重链可变区CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1～3。所述抗体或抗原结合片段可以与小鼠CLEC12B蛋白胞外段结合，阻断了肿瘤细胞通过CLEC12B对NK细胞的抑制信号传递，促进小鼠脾脏NK细胞分泌穿孔素，进而增强NK细胞和其他免疫细胞的杀伤功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种靶向小鼠CLEC12B蛋白的纳米抗体及其应用，更具体地，本发明涉及一种抗体或抗原结合片段、重组蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、制药用途以及检测CLEC12B的试剂盒。
背景技术
CLEC12B是一种具有276个蛋白质的单型跨膜Ⅱ型跨膜蛋白，可分为胞外段，跨膜段和胞内段三个部分。它属于C型凝集素家族的一种新蛋白。据文献报道，CLEC12B的胞外结构域与激活的自然受体NKG2D具有相当大的同源性。不同之处在于，CLEC12B在其胞内段结构域具有一段免疫受体络氨酸的抑制基序。这一发现与当前公认的免疫检查点(如TIGIT和NKG2A)相似，这暗示CLEC12B可能具有成为免疫检查点的潜力。
在骆驼科动物体内存在一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体(又称VHH)。重链抗体的可变区仅由重链组成，直径小于10纳米，因此也被称为纳米抗体。纳米抗体具有分子量小、穿透性强、易于表达、易于改造基因以及易于结合多个靶标的等优点。但目前还没有关于靶向小鼠CLEC12B蛋白的纳米抗体的报道。
因此，本领域亟需开发一种新的抗小鼠CLEC12B蛋白的羊驼源抗体，以满足研究和应用的需求。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。
在本发明的的第一方面，本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体含有选自下列至少之一的重链可变区CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1～3。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段可以与小鼠CLEC12B蛋白胞外段结合，阻断了肿瘤细胞通过CLEC12B对NK细胞的抑制信号传递，促进小鼠脾脏NK细胞分泌穿孔素，进而增强NK细胞和其他免疫细胞的杀伤功能。
需要说明的是，所述抗体或抗原结合片段适用于多种动物肿瘤模型，包括但不限于小鼠肿瘤模型。
GPIFSIYTW(SEQ ID NO:1)。
AVFGSGASTN(SEQ ID NO:2)。
TAVYYCQMQTGSGTGWTKEDY(SEQ ID NO:3)。
根据本申请的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本申请的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列所示或与SEQ ID NO:1、2和3具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本申请的实施例，所述抗体或抗原结合片段进一步含有重链框架区序列，所述重链框架区序列的至少一部分来自于羊驼源抗体、鲨鱼源抗体、鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本申请的实施例，所述抗体或抗原结合片段进一步含有重链恒定区，所述重链恒定区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本申请的实施例，所述抗体或抗原结合片段进一步含有轻链可变区，所述轻链可变区包括轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3。
根据本申请的实施例，所述轻链可变区进一步包括轻链框架区，所述轻链框架区序列的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、羊驼源抗体或其突变体的至少之一。
根据本申请的实施例，所述抗体或抗原结合片段进一步含有轻链恒定区，所述轻链恒定区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本申请的实施例，所述抗体包括选自多抗、全长单抗、Fab抗体、Fab’抗体、F(ab’)2抗体、F(ab)2抗体、Fv抗体、单链抗体、二聚体、微抗体、纳米抗体以及最小识别单位中的至少之一；或者所述抗原结合片段包括选自F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一。
根据本申请的实施例，所述抗体为纳米抗体。根据本申请的实施例，所述纳米抗体为发明人首次制备得到，且在MC38小鼠肿瘤模型中展现出优良的肿瘤抑制效果。
在本申请中，所述纳米抗体来自于羊驼源。需要说明的是，也可通过其他来源获得前述纳米抗体，如鲨鱼源等。
根据本申请的实施例，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，
QLQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGPIFSIYTWGWHRQAPGKQRELVAVFGSGASTNYADSVKGRFTISKDNAKNTIYLQMNSLKPEDTAVYYCQMQTGSGTGWTKEDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:4)。
需要说明的是，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中互补决定区(CDR1，CDR2，CDR3)如划线部分所示，其余部分为框架区氨基酸序列。
在本申请的第二方面，本申请提出了一种重组蛋白。根据本申请的实施例，所述重组蛋白包括本申请第一方面所述的抗体或抗原结合片段。根据本申请的实施例，所述重组蛋白能够靶向结合小鼠CLEC12B蛋白胞外段(65-276位氨基酸)，阻断了肿瘤细胞通过CLEC12B对NK细胞的抑制信号传递，促进小鼠脾脏NK细胞分泌穿孔素，进而增强NK细胞和其他免疫细胞的杀伤功能。
根据本申请的实施例，上述重组蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本申请的实施例，所述重组蛋白进一步包括选自生物活性蛋白或其片段、生物活性多肽或其片段中的至少之一。
根据本申请的实施例，所述生物活性蛋白或其片段包括选自蛋白标签、蛋白毒素或其片段、肿瘤坏死因子或其片段、干扰素或其片段、生物反应调节物或其片段和Fc片段中的至少之一。
需要说明的是，所述“蛋白标签”通常是指与目标蛋白(抗体或抗原结合片段)一起融合表达的一种多肽或者蛋白，其可用于目标蛋白的表达、检测、失踪或纯化等。包括但不限于His标签(又称His-Tag，序列为HHHHHH)、Flag标签(又称Flag-Tag，序列为DYKDDDDK)、GST标签(又称GST-Tag、谷胱甘肽巯基转移酶标签)、SUMO标签和C-Myc标签等。
需要说明的是，所述“毒素”通常是指对宿主有毒物质，包括蛋白毒素和非蛋白毒素。其中，蛋白毒素包括但不限于相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素和白喉毒素等。在本申请中，蛋白毒素优选为具有酶活性的蛋白毒素。
需要说明的是，所述“肿瘤坏死因子”通常是指能使多种肿瘤发生出血性坏死的物质，包括但不限于TNF-α和TNF-β。
需要说明的是，所述“干扰素”通常是指一种具有直接杀伤或抑制病毒的糖蛋白。包括但不限于IFN-α、INF-β和IFN-γ。
需要说明的是，所述“生物反应调节物”通常是指一类通过免疫系统直接或间接增强机体的抗肿瘤效应的蛋白物质。包括但不限于淋巴因子、IL-2、IL-6、IL-10和GM-CSF等。
需要说明的是，所述“Fc片段”通常是指来自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的Fc区，包括CH2、CH3区和任选地铰链区。优选的，IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM来源于鼠源、人源、灵长目源或羊驼源。
在本申请的第三方面，本申请提出了一种核酸分子。根据本申请的实施例，所述核酸分子编码本申请第一方面所述的抗体或抗原结合片段或本申请第二方面所述的重组蛋白。根据本申请的实施例，所述核酸分子所编码前述的抗体或抗原结合片段、重组蛋白。
根据本申请的实施例，上述核酸分子还可包括下列附加技术特征：
根据本申请的实施例，所述核酸分子为DNA。
需要说明的是，对于本发明中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本申请的第四方面，本申请提出了一种表达载体。根据本申请的实施例，所述表达载体携带本申请第三方面所述的核酸分子。
根据本申请的实施例，将所述表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的抗体或抗原结合片段、重组蛋白的表达，进而实现抗体或抗原结合片段、重组蛋白的体外大量制备。
需要说明的是，在将上述核酸分子连接到载体上时，所述核酸分子与载体上的控制元件可直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即，并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等。
根据本申请的实施例，上述表达载体还可包括下列附加特征的至少之一：
根据本申请的实施例，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体。
根据本申请的实施例，所述表达载体为质粒表达载体。
在本申请的第五方面，本申请提出了一种重组细胞。根据本申请的实施例，所述重组细胞携带本申请第三方面所述的核酸分子或第四方面所述的表达载体；或表达本申请第一方面所述的抗体或抗原结合片段或本申请第二方面所述的重组蛋白。根据本申请的实施例，利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述的抗体或抗原结合片段、重组蛋白。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述抗体或抗原结合片段、重组蛋白或前述的多特异性抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合所述抗体或抗原结合片段、重组蛋白表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体或抗原结合片段、重组蛋白表达的条件。
根据本申请的实施例，所述重组细胞是通过将本申请第四方面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本申请的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
需要说明的是，所述重组细胞包括但不限于哺乳动物细胞，也可是酵母细胞等。
在本申请的第六方面，本申请提出了一种药物组合物。根据本申请的实施例，所述药物组合物包括本申请第一方面所述的抗体或抗原结合片段、本申请第二方面所述的重组蛋白、本申请第三方面所述的核酸分子、本申请第四方面所述的表达载体或本申请第五方面所述的重组细胞。本申请的药物组合物能够结合小鼠CLEC12B蛋白胞外段(65-276位氨基酸)，阻断肿瘤细胞通过CLEC12B对NK细胞的抑制信号传递，促进小鼠脾脏NK细胞分泌穿孔素，进而增强NK细胞和其他免疫细胞的杀伤功能。所述药物组合物可应用于多种肿瘤模型中，如Lewis肺癌模型等。
根据本申请的实施例，上述药物组合物还可包括下列技术特征：
根据本申请的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体或辅料。
需要说明的是“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。
例如，本申请的抗体或抗原结合片段可掺入适用于胃肠外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)脂质体。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射、或者肌肉内或皮下注射来施用。
在本申请的第七方面，本申请提出了一种第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的重组蛋白、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤。
根据本申请的实施例，上述用途还可包括下列附加技术特征：
根据本申请的实施例，所述肿瘤包括：肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、食管癌、甲状腺癌、皮肤癌、前列腺癌、肾癌、子宫内膜癌、子宫颈癌和血液系统肿瘤。
根据本申请的实施例，所述血液系统肿瘤包括急性髓系白血病、多发性骨髓瘤和急性淋巴细胞性白血病。
在本申请的第八方面，本申请提出了一种第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的重组蛋白、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CLEC12B。
根据本申请的实施例，本申请提供的试剂盒，可以用于免疫印迹、免疫沉淀、Elisa，Flow Cytometry等涉及到利用CLEC12B抗原和抗体特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗CLEC12B抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗CLEC12B抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。
在本申请的第九方面，本申请提出了一种试剂盒。根据本申请的实施例，所述试剂盒包括：第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的重组蛋白、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。本申请提供的试剂盒中的抗体或抗原结合片段能够与CLEC12B有效结合，此外，在合适条件下，所述核酸分子、表达载体或重组细胞均能够表达所述抗体或抗原结合片段，进一步地，包含上述物质的试剂盒能够与CLEC12B进行有效结合，可用于有效检测CLEC12B。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的CLEC12B，也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的CLEC12B水平后，判断其CLEC12B水平是否过高于或低于正常水平，所述生物样本可以为细胞、组织、血液等。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例2的mouse-CLEC12B-FC融合蛋白的纯化结果；
图2是根据本发明实施例2的mouse-CLEC12B-FC融合蛋白的酶切结果；
图3是根据本发明实施例4的单克隆噬菌体展示的结果；
图4是根据本发明实施例6的纳米抗体FC融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳结果；
图5是根据本发明实施例5的Elisa检测所述纳米抗体的FC融合蛋白与mouse-CLEC12B-his的结合；
图6是根据本发明实施例8的凝胶过滤层析表征纳米抗体FC融合蛋白与CLEC12B的结合；
图7是根据本发明实施例7的流式细胞术检测纳米抗体与293T细胞过表达的CLEC12B抗原的结合；
图8是根据本发明实施例9的纳米抗体刺激小鼠脾脏细胞增强NK细胞分泌perforin的能力；
图9是根据本发明实施例10的纳米抗体能抑制MC38肿瘤的生长。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。
定义和说明
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“抗体”通常是指可识别一种或多种抗原表位的抗体，包括但不限于单抗、多抗、多聚体抗体和CDR移植抗体。
在本文中，术语“CDR移植抗体”和“改型化抗体”均是指将一个物种单抗的CDR移植至另一物种抗体可变区。例如，可将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，以便替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。需要说明的是，本申请中的多抗和单抗均可为CDR移植抗体。
在本文中，术语“单抗”是指仅可识别一种特定抗原表位的抗体。其中，常见的单抗为包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子，该重链或轻链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，该重链或轻链的羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)；L链和H链的V区分别称为VL和VH。单抗还可以为小分子抗体，小分子抗体主要包括：Fab抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体与最小识别单位。
在本文中，术语“Fab抗体”通常是指仅含Fab分子的抗体，其由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成，轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中，术语“Fv抗体”通常是指仅由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过非共价键连接而成的抗体，是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本文中，术语“单域抗体”、“纳米抗体”和“VHH抗体”可互换使用，其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC,AtarhouchT,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,HamersR.:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”；Nature 363,446-448(1993))，只包含重链可变区(VH)和常规的CH2与CH3区，其通过重链可变区与抗原特异性结合。
在本文中，术语“单链抗体”通常是指由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过连接肽连接而成的抗体。
在本文中，术语“最小识别单位”和“MRU”均是指仅由一个CDR组成的抗体，其分子量十分小仅占完全抗体的1％左右。
在本文中，术语“多抗”是指可识别多种抗原表位的抗体，例如可识别两种抗原表位的抗体(简称双抗)、三种抗原表位的抗体或者四种抗原表位的抗体，其为广义理解，具体结构不受限制，可识别多种抗原表位即可。
在本文中，术语“免疫原性”是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。
在本文中，术语“片段”是指目标蛋白或多肽，以及具有N-末端(N端)或C-末端(C端)截短、和/或内部删除的目标蛋白或多肽。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecμLar Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见AltschμL等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(AltschμL等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST AltschμL等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中，术语“至少80％同一性”指与各参考序列至少为80％，可为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性。
在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的例子包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Cap细胞(人羊水来源的细胞)和CoS细胞。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原能力的抗体片段。
需要说明的是，本申请中所述的“抗体或其抗原结合片段”还可以具有人源化修饰。
在本文中，术语“人源化修饰”是指能够使得抗体或抗原结合片段的免疫原性降低的氨基酸的改变，包括氨基酸的突变、插入、缺失、化学基团的赘合等等。示例性地，人源化修饰通常是采用框架移植法及蛋白表面氨基酸人源化的方法完成的。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：Mouse-CLEC12B-ECD的纳米抗体制备
在本实施例中，使用同源重组方法将CLEC12B基因克隆到PTT5载体中，并通过体外哺乳动物表达得到mouse(小鼠)-CLEC12B-FC重组蛋白。随后，利用TEV酶对其进行切割，得到纯净的mouse(小鼠)-CLEC12B-ECD(胞外域)分子。接着，使用这个纯净的分子进行4次免疫，对一头健康活跃的羊驼进行免疫过程。在第四次免疫后两周，从羊驼的外周血细胞中分离出细胞并提取总RNA。随后，将RNA反转录成cDNA。
利用得到的cDNA作为模板，使用特异性引物扩增出纳米抗体的序列。通过分离纳米抗体的序列，得到了一种新的纳米抗体，命名为sh-aClec12B-1。纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
CAGCTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGAGCGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCCCGATTTTTAGCATTTATACCTGGGGCTGGCATCGCCAGGCGCCGGGCAAACAGCGCGAACTGGTGGCGGTGTTTGGCAGCGGCGCGAGCACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCAAAGATAACGCGAAAAACACCATTTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCCAGATGCAGACCGGCAGCGGCACCGGCTGGACCAAAGAAGATTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:5)。
具体步骤如下所示：
利用同源重组技术，从公司(擎科生物)合成的CLEC12B全长基因中通过PCR获得CLEC12B-ECD基因，并将其同样克隆到PTT5载体中。随后，采用293F哺乳动物表达系统对重组蛋白抗原进行表达，并利用TEV酶进行酶切，获得纯度大于95％的重组抗原CLEC12B-ECD。
接下来，以此CLEC12B-ECD抗原作为免疫原，对一头成年的健康羊驼进行免疫。免疫完成后，从羊驼外周血中抽取样本，利用淋巴细胞分离液Ficoll采用梯度离心法分离淋巴细胞，并抽提淋巴细胞溶液中的总RNA，随后进行反转录成cDNA。
利用得到的cDNA作为模板，使用特异性引物扩增出VHH基因序列。将VHH基因序列插入PR2噬菌体扩增产物中，然后点转化到TG1感受态细菌中，在涂布平板上进行培养，最后刮取平板上的菌落，得到噬菌体展示抗体文库。
接着，通过多重筛选、重组表达和纯化过程，得到了驼源纳米抗体针对mouse-CLEC12B-ECD的重组抗体。这些纳米抗体具有高亲和力，能够靶向mouse-CLEC12B-ECD蛋白。为进一步的检测mouse-CLEC12B-ECD抗原，使用配对的纳米抗体进行检测。
在多重筛选、重组表达和纯化过程中，噬菌体抗体文库首先经过淘洗和噬菌体ELISA筛选得到阳性克隆子，然后通过测序鉴定得到抗体序列。将抗体序列构建到重组表达载体中，诱导表达并纯化获得mouse-CLEC12B-ECD的驼源纳米抗体。
其中，羊驼的免疫方案包括共进行四轮免疫，前两次为皮下注射，后两次为肌肉注射，免疫间隔两周进行一次。在最后一次免疫后两周抽取羊驼外周血，用于后续实验。
扩增VHH序列所用的引物如下：
正向引物：5’GCTGCACAGCCTGCTATGGCACAGKTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGG 3’；
反向引物：5’GAGTTTTTGTTCGGCTGCTGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCC 3’。
噬菌体PR2扩增产物由PR2噬菌粒扩增获得：
正向引物：5’AGCAGCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAG 3’；
反向引物：5’CCATAGCAGGCTGTGCAGCATAGAAAGGTACCACTAAAGGAATTGC 3’。
mouse-CLEC12B-ECD(抗原)的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
CTGCAGGTGAGCAACGATATTAACAGCGATAGCGAAAAACTGAGCCAGCTGCAGAAAAGCATTCATCCGCAGCAGGATAACCTGAGCGAAAGCCTGAACAGCAGCCGCAAAAGCCTGACCGAAGAAAGCCTGCAGAGCCAGATTAGCGCGCTGCTGGAACGCCAGGAACAGATGGCGACCAAACTGTGCAAAGAATTTCTGATTCATGCGAGCGATCATAAATGCAACCCGTGCCCGAAAACCTGGCAGTGGTATGGCAACAGCTGCTATTATTTTAGCATTAACGAAGAAAAAAGCTGGAGCGATAGCCGCAAAGATTGCATTGATAAAAACGCGACCCTGGTGAAAATTGATAGCACCGAAGAACGCGATCTGCTGCAGAGCCAGCTGAGCCTGACCTTTAGCTTTTTTTGGCTGGGCCTGAGCTGGAACAGCAGCGGCCGCAACTGGCTGTGGGAAGATGGCAGCTTTCCGCCGCCGACCCTGTTTAGCGATAAAGAACTGGCGAGCTTTAACGGCAGCCGCGATTGCGCGTATTTTGAACGCGGCAACATTTATGCGAGCCGCTGCAGCGCGGAAATTCCGTGGATTTGCGAAAAAACCGCGAGCCTGGTGAAAACCGAAGATCTGGAT(SEQ ID NO:6)。
实施例2：mouse-CLEC12B-FC蛋白的表达和纯化
1)抗原的分子克隆
将CLEC12B基因(Gene ID:71183)的全长序列合成到PTT5载体上。随后，设计引物并通过PCR方法克隆mouse-CLEC12B的外细胞域(aa65-276)序列到PTT5载体，并在其与human IgG1 Fc区域之间引入TEV酶切位点序列。
2)抗原的真核表达和纯化
首先，使用转染试剂PEI将质粒转染到悬浮培养的哺乳动物细胞HEK293F中。转染体系包括300ml细胞培养液，其中质粒用量为0.3mg，PEI用量为0.6ml，还有20ml DMEM(培养基)。在转染前，将DMEM预先放置在37℃的水浴锅中。转染时，先将2个50ml离心管分别装有10ml DMEM，其中一管标记为PEI，另一管标记为DNA。然后，将PEI和DNA分别加入到DMEM中并静置15分钟，随后将PEI混入DNA中并再次静置20分钟。最后，将此混合液转移到300ml细胞培养液中，混匀并再次静置20分钟。
转染后的细胞培养3-4天，然后在4347rcf(水平离心机的最大转速)下离心30分钟，以收集上清。接下来，上清经过0.45um和0.22um的滤膜过滤，以防止未完全离心下来的细胞堵塞纯化柱。然后，使用蠕动泵在proteinA柱子上进行蛋白纯化。由于ProteinA能够特异性地与蛋白上连接的Fc部分结合，因此可以将目标蛋白富集到柱子上。在上样完成后，使用AKTA PRIME Plus纯化系统洗脱蛋白，收集到含0.2M Tris-HCL pH 7.5的溶液中。A液为PBS，B液为0.1M乙酸，蛋白的纯化结果见图1。
接下来，使用TEV酶(来自碧云天公司)进行TEV酶切，反应体系将在过夜进行16小时。然后，将酶切后的蛋白液分次通过proteinA和Ni柱去除Fc片段和TEV酶，最终得到mouse-CLEC12B-ECD蛋白，结果见图2。
实施例3：噬菌体展示纳米抗体文库的构建
首先取0.3mg的抗原(mouse-CLEC12B-FC，实施例1中制备的蛋白)，第一次与完全弗式佐剂均匀混合。后续三次免疫则与不完全弗式佐剂混合，其中前两次采用皮下注射方式，后两次采用肌肉注射方式，免疫间隔为两周。最后一次免疫后两周，抽取羊驼的外周血进行后续实验。
在第四次免疫完成后，静脉抽取羊驼血，并分离其中的白细胞。使用omegabiotek公司的RNA抽提试剂盒提取总RNA，并采用DNA酶消除基因组的影响。随后，使用TAKARA公司的PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis kit根据试剂盒说明，将RNA反转录成cDNA；
为单域重链抗体设计VHH特异性引物，使用上述cDNA作为模板进行扩增，获得VHH编码基因片段。将扩增的VHH序列克隆至噬菌体PR2的NcoI和NotI位点之间，得到的连接产物即为初始纳米抗体噬菌体文库。
其中，VHH引物序列如下所示：
正向引物：5’GCTGCACAGCCTGCTATGGCACAGKTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGG 3’
反向引物：5’GAGTTTTTGTTCGGCTGCTGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCC 3’
进行电转化：使用10％甘油洗涤法制备大肠杆菌TG1感受态细胞，将连接产物和500μL感受态细胞混合，并通过电穿孔转染(2500V，5ms)将连接产物转移到大肠杆菌TG1菌株感受态中。分别取0.2μL和0.02μL涂布在含有100mm LB/100μg/ml氨苄青霉素(购买自Jason Biotech)2％甘露糖的平板上。剩余菌液涂布在含有150mmLB/Amp2％甘露糖的平板上。
扩增纳米抗体噬菌体文库：将每个含有150mm LB/Amp/2％甘露糖的平板中加入4ml 2TY培养基，使用涂布棒刮取菌落，收集到离心管中，涡旋混匀后，快速冷冻保存在-80℃。在含有250ml 2TY培养基(含2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素)的培养瓶中，加入100μL文库菌液和1012pfu的辅助噬菌体KM13(购买自MRC Laboratory of MolecμLar Biology)。将培养瓶放入37℃振荡培养，使菌液处于对数生长期，然后静置侵染45分钟。之后取出50ml菌液进行离心，去除上清，然后加入100ml的2TY培养基重悬，加入0.1％葡萄糖、100μL/氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素(购买自碧云天)，在25℃下180rpm培养约16小时。接下来使用PEG沉淀法浓缩噬菌体，然后用PBS缓冲液进行重悬。
实施例3：噬菌体的淘洗
第一轮淘洗：
1)抗原的包被：将0.1mg/ml浓度的CLEC12B-his融合蛋白(Cat No.Ag23396，proteintech)包被至免疫板(Cat No.100096HL)，每个孔加入100μL抗原，空白对照用PBS，4度过夜包被；
2)封闭：免疫板用PBST(PBS+0.1％Tween)清洗三次后，每个孔中加入250μL的Mpbs(含有5％的BSA)，在室温条件下封闭2小时；
3)噬菌体孵育：PBST清洗三次后，加入1X1011pfu的文库噬菌体，与5％的BSA溶液相混匀，每个孔中加入100μL，震荡孵育1小时；
4)洗脱：用PBST清洗10-15次后，拍干免疫板，每个孔中加入100μL胰蛋白酶(0.5mg/ml)，在室温下洗脱1小时，并收集洗脱液；
5)侵染：取10μL上一步获得的噬菌体，侵染1ml对数生长期的TG1细菌，37度水浴45分钟，然后分别取100μL、10μL和1μL涂布在含有LB/2％G/Amp的平板上，放置在37度培养箱过夜；
6)收集细菌：第二天向每个细胞板中加入4ml含有20％甘油的2TY培养基，收集所有的菌液，即为第一轮淘洗的菌液。
第二轮淘洗：
步骤与第一轮淘洗类似，但有以下两点不同：
1)加入的噬菌体量减少至1X108pfu；
2)加入噬菌体孵育后洗脱的次数增加到20-30次。
实施例4：单克隆噬菌体Elisa筛选出阳性克隆
1、制备单克隆噬菌体
1)在第二轮淘洗后，从涂布的平板上挑取单克隆，转移到96孔细胞培养板中(每孔加入100μL2TY/2％G/Amp)，在37度和250rpm条件下培养4-5小时；
2)将培养后的菌液取5μL接种到另一块对应的96孔空板细胞培养板中(每孔加入200μL2TY/2％G/AMP/KM13)，在37度和250rpm条件下培养1.5小时后，静置侵染45分钟。然后使用排枪混匀并吸走150μL菌液，剩余的菌液以300rpm离心30分钟，甩掉上清。每孔中加入200μL2TY/0.1％/Amp/Kan进行重悬，在25度和250rpm条件下培养16小时后，以3000rpm离心30分钟，储存在4度待使用。
2、包被抗原
抗原包被的量为0.2μg/孔，每个孔中加入100μL对照组为PBS，包被至免疫板中，在4度过夜。
3、封闭
免疫板用PBST(PBS+0.1％Tween)清洗三次后，每个孔中加入250μL的Mpbs(含有5％的BSA)，在室温条件下封闭2小时。
4、孵育噬菌体
PBST清洗3次后，取步骤1获得的噬菌体溶液50μL上清加入200μL 5％BSA溶液，室温下孵育1小时。
5、孵育二抗
PBST清洗5次后，使用HRP-antiM13抗体(北京义翘神州)，与BSA混匀100μL加入免疫板的孔中，室温孵育1小时。
6、显色
在避光的条件下，每个孔中加入100μL TMB显色底物(碧云天)，室温孵育8分钟，直至阳性孔呈现较深的蓝色。然后每孔中加入50μL 1M H2SO4终止反应，并读取OD450值。挑选OD450大于1的克隆送生工公司测序，Elisa结果如图3所示。
7、测序结果分析
比对阳性单克隆序列，最终根据序列的差异挑选出纳米抗体进行下一步的实验。
8、纳米抗体的真核表达
将测序所得到的纳米抗体序列克隆到PTT5载体中，转染293F悬浮细胞，利用proteinA柱子纯化得到纳米抗体。
实施例5：Elisa表征纳米抗体与抗原的亲和力
1、包被抗原
每孔使用0.2μg抗原，用PBS稀释，加入100μL，在4℃过夜。
2、封闭
免疫板用PBS洗三次，然后每孔加入250μL的MPBS(含有BSA，用于阻断非特异性结合位点)，在室温下封闭2小时。
3、孵育一抗
免疫板用PBST洗三次，从起始孔开始加入200nM带有Fc标签的抗体(溶于MPBS)，之后每一横排依次四倍稀释，每孔加入100μL，室温条件下振荡孵育一个小时。
4、孵育二抗
免疫板用PBST洗4次，然后加入HRP偶联的抗IgG1 Fc的抗体(来自北京义翘神州)，用于检测与抗原结合的纳米抗体-Fc融合蛋白，室温条件下振荡孵育1小时。
5、显色
免疫板用PBST洗四次，然后每孔加入100μL TMB(显色底物)，室温避光孵育8分钟后，每孔加入50μL Elisa终止液，终止反应并进行数据测量。
6、处理数据
结果如附图5所示。
实施例6：SDS检测纳米抗体的大小
取适量的纳米抗体加入5X loading buffer，将混合物煮沸10分钟，温度为100度。接着，使用SDS-PAGE胶快速配置试剂盒(雅酶)来制备12.5％的SDS胶。在90V条件下电泳运行30分钟，然后切换至120V继续电泳45-60分钟。最后，使用考马斯亮蓝染色的方法染色并脱色SDS-PAGE胶，结果如图4所示。
实施例7：流式细胞术检测293T细胞过表达mouse-CLEC12B后与纳米抗体的结合
将293T细胞在6孔板中培养，每孔中加入2ml培养基，含有10％胎牛血清(FBS，Thermo Fisher)、100mg/ml链霉素和100单位/ml青霉素，并在加湿的5％ CO2培养箱中孵育24小时，温度为37摄氏度。当细胞达到80％的汇合时，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染，将25μgpTT5载体转染至细胞，表达全长CLEC12B。经过36小时的生长后，收集细胞并将其重悬于含有200nM CLEC12B-Fc融合物的0.2ml DMEM中，并设立一个空白对照组，冰上孵育30分钟。随后，洗涤细胞，并与PBS缓冲液中稀释1:200的FITC偶联抗体hIgG Fc(Beyotime)孵育30分钟。最后一次洗涤后，将细胞加载到FACScan流式细胞仪(Beckman Coulter)中，使用FlowJo软件(V10)进行分析，结果如图7所示。
实施例8：采用凝胶过滤层析表征纳米抗体FC融合蛋白与CLEC12B的结合
将纳米抗体FC融合蛋白与CLEC12B蛋白以摩尔蛋白比2：1混匀，并放置在冰上孵育1h，然后上样到SuperDEX200凝胶过滤层析柱，记录280mm处吸光度变化情况并且绘制层析图谱，于此同时，设置纳米抗体FC融合蛋白对照和CLEC12B蛋白对照，实验结果见图6。
实施例9：纳米抗体与小鼠脾脏细胞共孵育增强NK细胞分泌穿孔素的能力
1、小鼠脾脏细胞的分离：
1)摘取小鼠脾脏，并将200目铁砂网放在小皿上，加入1ml 1X PBS润湿铁砂网与注射器芯端塑料，将0.1g脾脏剪成3-4段，放在200目筛网上压碎，同时用PBS冲洗，直至参与组织全部为白色结缔组织，收集细胞悬液。
2)离心800g，4℃，10min，弃去上清液，在吸水纸中倒扣10s，吸走残余上清，涡旋分散细胞沉淀，加入1ml红细胞裂解液，立即重悬细胞，4℃静置裂解5min，细胞悬液由浑浊变为清澈透亮。
3)过滤裂解充分后，加入10ml 1X PBS终止裂解，通过200目滤网过滤并离心800g，4摄氏度，10min。
4)洗涤细胞，使用1X PBS重悬，并进行细胞计数。
2、纳米抗体刺激脾脏：
将纳米抗体稀释至1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml，分别加入1X106小鼠脾脏细胞中，37℃，5％ CO2共孵育12小时。随后，离心收集细胞，添加PMA(30ng/ml)、离子霉素(1μg/ml)和莫能霉素(2.5μg/ml)刺激培养4小时。进行封闭、标记外标抗体、破膜固定、标记内标抗体，并使用流式细胞仪进行检测。纳米抗体共孵育后，明显增强了NK细胞分泌穿孔素的能力(图8)。
实施例10：纳米抗体抑制MC38肿瘤模型的生长
小鼠荷瘤实验：
将C57BL/6小鼠分为对照组和治疗组，每组6只。第0天，皮下注射MC38肿瘤细胞1X105。从第7天开始，对治疗组进行腹腔注射纳米抗体治疗，治疗剂量为20mg/kg，每隔一天治疗一次，共计治疗5次。每隔一天测量小鼠肿瘤体积，体积按照长乘宽2的二分之一计算。结果如图9所示，表明纳米抗体明显抑制了MC38肿瘤的生长和发展，具有良好的抗肿瘤效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (12)
1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括选自下列至少之一的重链可变区CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1～3。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3氨基酸序列所示或与SEQ ID NO:1、2和3具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；
任选地，所述抗体或抗原结合片段进一步含有重链框架区序列，所述重链框架区序列的至少一部分来自于羊驼源抗体、鲨鱼源抗体、鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一；
任选地，所述抗体或抗原结合片段进一步含有重链恒定区，所述重链恒定区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段进一步含有轻链可变区，所述轻链可变区包括轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；
任选地，所述轻链可变区进一步包括轻链框架区，所述轻链框架区序列的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、羊驼源抗体或其突变体的至少之一；
任选地，所述抗体或抗原结合片段进一步含有轻链恒定区，所述轻链恒定区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括选自多抗、全长单抗、Fab抗体、Fab’抗体、F(ab’)2抗体、F(ab)2抗体、Fv抗体、单链抗体、二聚体、微抗体、纳米抗体以及最小识别单位中的至少之一；或者
所述抗原结合片段包括选自F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一；
优选地，所述抗体为纳米抗体；
任选地，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
5.一种重组蛋白，其特征在于，包括：权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段；
任选地，进一步包括选自生物活性蛋白或其片段、生物活性多肽或其片段中的至少之一；
任选地，所述生物活性蛋白或其片段包括选自蛋白标签、蛋白毒素或其片段、肿瘤坏死因子或其片段、干扰素或其片段、生物反应调节物或其片段和Fc片段中的至少之一。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求5所述的重组蛋白；
任选地，所述核酸分子为DNA。
7.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求6所述的核酸分子；
任选地，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体；
优选地，所述表达载体为质粒表达载体。
8.一种重组细胞，其特征在于，包括：
携带权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的表达载体；或
表达权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求5所述的重组蛋白；
任选地，所述重组细胞是通过将权利要求7所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的；
任选地，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求5所述的重组蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体或权利要求8所述的重组细胞；
任选地，进一步包括药学上可接受的载体或辅料。
10.权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求5所述的重组蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的重组细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防肿瘤；
任选地，所述肿瘤包括：肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、食管癌、甲状腺癌、皮肤癌、前列腺癌、肾癌、子宫内膜癌、子宫颈癌和血液系统肿瘤；
任选地，所述血液系统肿瘤包括急性髓系白血病、多发性骨髓瘤和急性淋巴细胞性白血病。
11.权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求5所述的重组蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体或权利要求8所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CLEC12B。
12.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求5所述的重组蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体或权利要求8所述的重组细胞。
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