JPWO2018207638A1 - 抗ｃｌｄｎ−５抗体、及びその抗体を含有する医薬 - Google Patents

抗ｃｌｄｎ−５抗体、及びその抗体を含有する医薬 Download PDF

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Abstract

新たな、CLDN-5特異性の高い、CLDN-5の細胞外ドメインを認識する分子を提供するという課題を、Claudin-5タンパク質の細胞外領域の立体構造又は一次構造を特異的に認識する、抗体により解決する。

Description

本発明は、抗CLDN-5抗体、及びその抗体を含有する医薬に関する。より詳細には、CLDN-5の細胞外領域を認識する抗体、血液脳関門制御用医薬等に関する。
血液脳関門は、血液と脳の間での物質交換を制限する機構であり、異物侵入から脳を保護する重要な役割を果たしている。一方で、血液脳関門は静脈内投与された薬物の脳への移行を妨げるため、脳疾患治療薬開発の大きな妨げとなっている。この血液脳関門の機能は、脳毛細血管内皮細胞間に形成される高度な密着結合により生み出されており、物質透過を許容する他の臓器の毛細血管内皮細胞間の間隙とは大きく異なる。これまで、この物質輸送を制限する密着結合を制御し、細胞間隙を介して薬物を輸送する方法論として、マンニトール高張液を頸動脈より投与する方法が考案されてきた。しかし、本手法では、細胞の脱水による物理的な細胞形態の変化、密着結合の破壊を介するため副作用も大きい。そこで、密着結合のみを特異的に制御する新たな技術の開発が望まれている。
上皮細胞や血管内皮細胞の細胞間に存在する密着結合の形成には、CLDNファミリー分子が重要な役割を担っている。CLDNファミリーは、27種の4回膜貫通タンパク質のメンバーからなり、細胞外に2つのループ（N末端側から第1、第2細胞外ループ）を持ち、これらの細胞間での相互作用が密着結合形成に寄与する。各組織において発現するCLDNファミリー分子の種類（構成比率）や量は異なっており、この違いが組織特異的な密着結合、バリア機能を生み出している。特に、脳血管内皮細胞間の密着結合においては、CLDN-5が高発現し、血液脳関門の機能に大きな影響を与えている。実際、CLDN-5欠損マウスでは、血液脳関門の機能が失われ分子量1000以下の物質透過が許容される。また、CLDN-5 siRNAをマウスに静脈内投与する実験では、脳血管内皮細胞のCLDN-5の発現低下による分子量1000以下の物質の脳内移行が誘導され、かつ重篤な副作用がないことも報告されている（非特許文献1）。これらの知見から、CLDN-5の機能制御が、細胞間隙を介する新たな脳内薬物送達戦略になると期待されている。
これまでにCLDN-5によるバリア機能の阻害を目的とし、いくつかのCLDN-5相互作用分子が作製されてきた。例えば、CLDN-1の第1細胞外ループの部分配列由来ペプチド（約20アミノ酸）を用いて、CLDN-1及びCLDN-5の相互作用の阻害を介して、マウス脳毛細血管内皮細胞のバリアを制御できることが報告されている（非特許文献2）。また、CLDN-3とCLDN-4に結合し、高いバリア制御活性を持つ分子として知られるClostridium perfringens enterotoxinのC末端に変異を導入し、CLDN-5結合分子を創製した例も報告されている（非特許文献3）。しかし、これらの分子は、CLDN-5への結合特異性が低く、他のCLDN分子にも結合する問題があるため、これらを用いた血液脳関門制御技術の開発は、バリア制御活性の増強、副作用低減の観点から非常に難しいと考えられている。別の例として、CLDNファミリー分子の細胞接着を調節するペプチド類及び抗体に関する報告があるが、該報告においては抗CLDN-5抗体による血液脳関門制御に関する実証データは示されていない（特許文献1）。このように、CLDN-5特異的に相互作用し、その機能を制御する分子は未だ存在しない。
Matthew Campbell, Anna-Sophia Kiang, Paul F. Kenna, Christian Kerskens, Christoph Blau, Laurence O'Dwyer, Amanda Tivnan, Julie Anne Kelly, Brenda Brankin, Gwyneth-Jane Farrar, Peter Humphries. RNAi-mediated reversible opening of the blood-brain barrier. The journal of gene medicine 10 (2008) 930-947. Christian Staat, Caroline Coisne, Sebastian Dabrowski, Svetlana M. Stamatovic, Anuska V. Andjelkovic, Hartwig Wolburg, Britta Engelhardt, Ingolf E. Blasig. Mode of action of claudin peptidomimetics in the transient opening of cellular tight junction barriers. Biomaterials 54 (2015) 9-20. Jonas Protze, Miriam Eichner, Anna Piontek, Stefan Dinter, JanRossa, Kinga Grazyna Blecharz, Peter Vajkoczy, Joerg Piontek, Gerd Krause. Directed structural modification of Clostridium perfringens enterotoxin to enhance binding to claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences 72 (2015) 1417-1432
特表2003-524384号公報
本発明は、新たな、CLDN-5特異性の高い、CLDN-5の細胞外ドメインを認識する分子を提供することを課題とする。さらには、同分子を用いたCLDN-5発現細胞の検出技術及び血液脳関門制御技術を提供することを課題とする。
CLDN-5に対し特異性の高い結合分子を作製し、その有用な活性、好ましくは血液脳関門のバリアを制御する活性を実証した例は存在しない。その一因としてCLDN-5が膜タンパク質であるため、溶解度や凝集性の観点から精製が困難であり、ファージディスプレイ法に用いるスクリーニングマテリアルや免疫原として十分な質・量のものが得られないといったことが挙げられる。本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、CLDN-5タンパク質の細胞外ドメイン内の領域を認識する抗体（本明細書において、「本発明の抗体」、「CLDN-5細胞外ドメイン抗体」などと示すこともある。）を作り出すことに成功した。かつ、驚くべきことに、本発明の抗体が、脳内血管内皮細胞間の連結を開く作用、すなわち血液脳関門制御活性を有することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
本発明は、一実施形態として、下記の態様を包含する：
項1．
Claudin-5タンパク質の細胞外領域の立体構造又は一次構造を特異的に認識する、抗体。
項2．
Claudin-1タンパク質、Claudin-2タンパク質、Claudin-3タンパク質、Claudin-4タンパク質、Claudin-6タンパク質、並びにClaudin-7タンパク質の細胞外領域のすべてに結合しない項1記載の抗体。
項3．
配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質における、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域内を特異的に認識する、項1又は2に記載の抗体。
項4．
配列番号45で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトClaudin-5タンパク質の第1細胞外ループをヒトClaudin-1タンパク質の第1ループに置換したタンパク質1-1-5に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項1〜3のいずれかに記載の抗体。
項5．
配列番号41で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質点変異体D68Eに対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項4に記載の抗体。
項6．
配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質における、N末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域内を特異的に認識する、項1又は2に記載の抗体。
項7．
配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトClaudin-5タンパク質の第2細胞外ループをヒトClaudin-1タンパク質の第2ループに置換したタンパク質5-5-1に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項1、2及び6に記載の抗体。
項8．
配列番号43で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質点変異体S151Tに対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項7に記載の抗体。
項9．
配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質においては、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造内を特異的に認識する、項1又は2に記載の抗体。
項10．
配列番号44で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトClaudin-5タンパク質の細胞外領域以外をマウスClaudin-5タンパク質に置換した変異体TMに対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項1、2及び9に記載の抗体。
項11．
下記抗体からなる群より選択されるいずれかの抗体であって、項1〜10のいずれかに記載の抗体：
（I）
配列番号106で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号108で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号110で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号197で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号199で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号201で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体I；
（E）
配列番号78で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号80で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号82で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号169で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号171で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号173で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体E；
（B）
配列番号57で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号59で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号61で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号148で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号150で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号152で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体B；
（F）
配列番号85で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号87で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号89で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号176で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号178で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号180で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体F；
（C）
配列番号64で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号66で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号68で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号155で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号157で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号159で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体C；
（A）
配列番号50で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号52で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号54で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号141で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号143で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号145で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体A；
（K）
配列番号120で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号122で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号124で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号211で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号213で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号215で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体K；
（D）
配列番号71で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号73で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号75で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号162で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号164で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号166で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体D；
（G）
配列番号92で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号94で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号96で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号183で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号185で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号187で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体G；
（H）
配列番号99で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号101で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号103で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号190で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号192で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号194で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体H；
（J）
配列番号113で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号115で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号117で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号204で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号206で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号208で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体J；
（L）
配列番号127で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号129で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号131で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号218で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号220で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号222で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体L；並びに
（M）
配列番号134で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号136で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号138で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号225で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号227で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号229で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体M。
項12．
抗体の可変領域VHの配列が配列番号1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23若しくは25又はこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、且つVLの配列が2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24若しくは26又はこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、項1〜11のいずれかに記載の抗体。
項13．
項1〜12のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する、細胞。
更に、本発明は、別の実施形態として、下記の態様も包含する：
項1A．
Claudin-5タンパク質の細胞外領域の立体構造又は一次構造を特異的に認識する、抗体。
項2A．
Claudin-1タンパク質、Claudin-2タンパク質、Claudin-3タンパク質、Claudin-4タンパク質、Claudin-6タンパク質、並びにClaudin-7タンパク質の細胞外領域のすべてに結合しない項1記載の抗体。
項3A．
配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質における、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域内を特異的に認識する、項1又は2に記載の抗体。
項4A．
配列番号45で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトClaudin-5タンパク質の第1細胞外ループをヒトClaudin-1タンパク質の第1ループに置換したタンパク質1-1-5に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項1〜3のいずれかに記載の抗体。
項5A．
配列番号41で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質点変異体D68Eに対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項4に記載の抗体。
項6A．
配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質においては、N末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域内を特異的に認識する、項1又は2に記載の抗体。
項7A．
配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトClaudin-5タンパク質の第2細胞外ループをヒトClaudin-1タンパク質の第2ループに置換したタンパク質5-5-1に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項1、2及び6に記載の抗体。
項8A．
配列番号43で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質点変異体S151Tに対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項7に記載の抗体。
項9A．
配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質においては、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造内を特異的に認識する、項1又は2に記載の抗体。
項10A．
配列番号44で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトClaudin-5タンパク質の細胞外領域以外をマウスClaudin-5タンパク質に置換した変異体TMに対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項1、2及び9に記載の抗体。
項11A．
下記のいずれかの抗体A〜Mからなる群より選択される、項1〜10のいずれかに記載の抗体：
（A）
配列番号50で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号52で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号54で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号141で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号143で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号145で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体A；
（B）
配列番号57で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号59で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号61で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号148で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号150で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号152で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体B；
（C）
配列番号64で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号66で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号68で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号155で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号157で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号159で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体C；
（D）
配列番号71で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号73で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号75で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号162で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号164で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号166で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体D；
（E）
配列番号78で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号80で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号82で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号169で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号171で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号173で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体E；
（F）
配列番号85で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号87で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号89で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号176で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号178で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号180で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体F；
（G）
配列番号92で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号94で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号96で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号183で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号185で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号187で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体G；
（H）
配列番号99で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号101で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号103で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号190で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号192で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号194で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体H；
（I）
配列番号106で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号108で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号110で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号197で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号199で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号201で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体I；
（J）
配列番号113で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号115で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号117で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号204で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号206で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号208で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体J；
（K）
配列番号120で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号122で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号124で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号211で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号213で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号215で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体K；
（L）
配列番号127で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号129で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号131で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号218で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号220で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号222で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体L；並びに
（M）
配列番号134で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号136で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号138で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号225で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号227で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号229で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体M。
項12A．
抗体の可変領域VHの配列が配列番号1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23若しくは25又はこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、且つVLの配列が2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24若しくは26又はこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、項1〜11のいずれかに記載の抗体。
項13A．
項11又は12に記載の抗体の可変領域を有するヒトIgG1キメラ抗体、ヒトIgG4キメラ抗体、ヒトIgG1変異体キメラ抗体又はヒトIgG4変異体キメラ抗体若しくはこれらの改変型キメラ抗体。
項14A．
請求11又は12に記載の抗体の相補性決定領域を有するヒト化抗体又は改変型ヒト化抗体。
項15A．
項11又は12に記載の抗体の可変領域を有するFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、ミニボディ、scFv‐Fc、scFv、ディアボディ、トリアボディ、又はテトラボディ。
項16A．
項1〜15のいずれかに記載の抗体又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する、細胞。
項17A．
項1〜15のいずれかに記載の抗体又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する、ハイブリドーマ。
項18A．
項1〜15のいずれかに記載の抗体又はフラグメントと薬物との複合体。
項19A．
項1〜15のいずれかに記載の抗体又はそのフラグメント、及び項18に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬。
項20A．
項1〜15のいずれかに記載の抗体又はそのフラグメント、及び項18に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬。
項21A．
血液脳関門制御用である、項20に記載の医薬。
項22A．
Claudin-5タンパク質の局在性変動用である、項20に記載の医薬。
本発明により取得されたCLDN-5の細胞外領域を認識するモノクローナル抗体は、既存のCLDN-5の細胞外領域に結合する分子と異なり、高いCLDN-5特異性を有している。そのため、CLDN-5を発現している細胞ポピュレーションの小さい細胞を、細胞の固定・透過処理なしで検出・単離することも可能である。また、本発明により取得された抗体は学術的な利用も可能である。脳内血管内皮細胞を含む血管内皮細胞はヘテロな集団であることが知られているが、本発明で得られた抗体を用いれば、これらの細胞をCLDN-5の発現量の違いによりグループ分けして解析することが可能になるなど、血液脳関門の仕組みや病的破綻の理解の一端を紐解くための有用な試薬に成り得る。
本発明で開発された抗体は、十分な脳内血管内皮細胞が作り出す密着結合によるバリアを制御する活性を有していたことより、例えば薬物と併用投与することにより、又は薬物と抗体との複合体を投与することによって、薬物の血液脳関門の通過を促進することができ、ひいては中枢神経疾患などの疾患に対するその薬物の予防又は治療効果をより高めることが可能となる。
本発明によれば、新規な抗体としてCLDN-5細胞外ドメインに対する抗体を提供することができ、ひいてはCLDN-5、血液脳関門等に関する研究に資することができる。
実施例3-1) で得られた抗CLDN-5抗体のCLDN特異性の結果を示す。縦軸は各抗体を各CLDN発現細胞と反応させた際の平均蛍光強度を、溶媒を各CLDN発現細胞と反応させた際に得られる平均蛍光強度で除した値である。横軸は各抗体を示し、カラムは各CLDN又はmock（mockはCLDNタンパク質を発現しない細胞である）発現細胞と抗体を反応させたことを示す。図1AにはヒトCLDNを、図1BにはマウスCLDNへの結合性を示している。 実施例3-2) で得られた抗CLDN-5抗体の各動物種CLDN-5への結合性を示すFACSヒストグラムである。ヒストグラムの最上方に、レトロウイルスを用いて細胞に発現させている各動物種CLDN-5名（hはヒトの略称を示し、cはカニクイザルの略称を示し、mはマウスの略称を示し、mockはCLDNタンパク質を発現しないレトロウイルス感染細胞を示す）を示している。ヒストグラムの最左側に、1次抗体として使用した抗体を示す。各ヒストグラム中、横軸が蛍光シグナル、縦軸が細胞数を示す。Vehicleは1次抗体を作用させない場合を示す。 実施例3-4) で得られた抗CLDN-5抗体がCLDN-5の第1又は第2のどちらの細胞外領域に結合するかを示唆するFACSヒストグラムである。ヒストグラムの最上方に、レトロウイルスを用いて細胞に発現させているCLDN-5の細胞外領域をCLDN-1の細胞外領域に置換したCLDN-5変異体名を示し、その上部にそのCLDN-5変異体の概要を示している。ヒストグラムの最左側に、1次抗体として使用した抗体を示す。各ヒストグラム中、横軸が蛍光シグナル、縦軸が細胞数を示す。Vehicleは1次抗体を作用させない場合を示す。 実施例3-5) で得られた抗CLDN-5抗体がCLDN-5の認識にどの部位が必要かを示唆するFACSヒストグラムである。ヒストグラムの最上方に、レトロウイルスを用いて細胞に発現させているCLDN-5の細胞外領域をCLDN-1の細胞外領域に置換したCLDN-5変異体名を示し、その上部にそのCLDN-5変異体の概要を示している。ヒストグラムの最左側に、1次抗体として使用した抗体を示す。各ヒストグラム中、横軸が蛍光シグナル、縦軸が細胞数を示す。Vehicleは1次抗体を作用させない場合を示す。 実施例3-6) で得られた抗CLDN-5抗体のCLDN-5の1次構造認識性を示すウェスタンブロッティングの写真である。写真の最上方に用いた1次抗体を示し、その下に用いた細胞を示す。写真左側に、バンドが表すタンパク質名を示す。 実施例4-2) で得られたMDCKIIに、各動物種CLDN-5をレトロウイルスで強制発現させて作製した細胞のTEERの経日的変動の結果を示す。縦軸にTEER、横軸に細胞がコンフルエントに達した日からの日数を示す。 実施例4-3) で得られたMDCKIIに、各動物種CLDN-5をレトロウイルスで強制発現させて作製した細胞に、抗CLDN-5抗体を処置した際のTEERの経時的変動の結果を示す。横軸に被験物質添加後からの時間を示し、縦軸に各時間に測定したTEER値を、試験開始時のTEER値で除して百分率にした値を示す。グラフ内に表示される濃度は各被検物の培地中の濃度を示し、Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。各プロットは平均値（n=3）であり、バーは標準偏差を示す。図7AにはMDCKII/mockでの結果を、図7BにはMDCKII/hCLDN-5での結果を、図7CにはMDCKII/cCLDN-5での結果を、図7DにはMDCKII/mCLDN-5での結果を示し、左側にはマウス抗体を処置した際の結果を、右側にはラット抗体を処置した際の結果を示す。また、左と右側のグラフのVehicle処置群とC-CPEmt処置群の結果は共通の値である。 実施例4-3) で得られたMDCKIIに、各動物種CLDN-5をレトロウイルスで強制発現させて作製した細胞に、抗CLDN-5抗体を処置して12時間経過後に培地交換を行い、さらに24時間培養した後のTEERを測定した結果を示す。縦軸に各時間に測定したTEER値を、試験開始時のTEER値で除して百分率にした値を示す。横軸には各被験物質名及び濃度を示し、カラムはそれぞれ試験開始時、培地交換を行う直前、培地交換を行ってから24時間後のTEERの測定結果を示す。Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。各値は平均値（n=3）であり、バーは標準偏差を示す。図8AにはMDCKII/mockでの結果を、図8BにはMDCKII/hCLDN-5での結果を、図8CにはMDCKII/cCLDN-5での結果を、図8DにはMDCKII/mCLDN-5での結果を示し、左側にはマウス抗体を処置した際の結果を、右側にはラット抗体を処置した際の結果を示す。また、左と右側のグラフのVehicle処置群とC-CPEmt処置群の結果は共通の値である。 実施例4-4) で得られたMDCKIIに、各動物種CLDN-5をレトロウイルスで強制発現させて作製した細胞に、抗CLDN-5抗体を処置して12時間経過後にフルオロセインナトリウムの透過性を評価した結果を示す。縦軸は見かけ上の透過係数を示し、横軸には各被験物質名及び濃度を示す。Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。各値は平均値（n=3）であり、バーは標準偏差を示す。グラフの1段目にはMDCKII/mockでの結果を、2段目ににはMDCKII/hCLDN-5での結果を、3段目にはMDCKII/cCLDN-5での結果を、4段目にはMDCKII/mCLDN-5での結果を示し、左側にはマウス抗体を処置した際の結果を、右側にはラット抗体を処置した際の結果を示す。また、同段上の左と右側のグラフのVehicle処置群とC-CPEmt処置群の結果は共通の値である。 実施例4-4) で得られたMDCKIIに、各動物種CLDN-5をレトロウイルスで強制発現させて作製した細胞に、抗CLDN-5抗体を処置して12時間経過後に4 kDa FITC-dextranの透過性を評価した結果を示す。縦軸は見かけ上の透過係数を示し、横軸には各被験物質名及び濃度を示す。Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。各値は平均値（n=3）であり、バーは標準偏差を示す。グラフの1段目にはMDCKII/mockでの結果を、2段目ににはMDCKII/hCLDN-5での結果を、3段目にはMDCKII/cCLDN-5での結果を、4段目にはMDCKII/mCLDN-5での結果を示し、左側にはマウス抗体を処置した際の結果を、右側にはラット抗体を処置した際の結果を示す。また、同段上の左と右側のグラフのVehicle処置群とC-CPEmt処置群の結果は共通の値である。 実施例5-1) で得られた血液脳関門模倣系に、抗CLDN-5抗体を処置した際のTEERの経時的変動の結果を示す。横軸に被験物質添加後からの時間を示し、縦軸に各時間に測定したTEER値を、試験開始時のTEER値で除して百分率にした値を示す。グラフ内に表示される濃度は各被検物の培地中の濃度を示し、Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。各プロットは平均値（n=3）であり、バーは標準偏差を示す。左側にはマウス抗体を処置した際の結果を、右側にはラット抗体を処置した際の結果を示す。また、左と右側のグラフのVehicle処置群とC-CPEmt処置群の結果は共通の値である。 実施例5-2) で得られた血液脳関門模倣系に、抗CLDN-5抗体を処置して12時間経過後にフルオロセインナトリウムの透過性を評価した結果を示す。縦軸は見かけ上の透過係数を示し、横軸には各被験物質名及び濃度を示す。Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。各値は平均値（n=3）であり、バーは標準偏差を示す。左側にはマウス抗体を処置した際の結果を、右側にはラット抗体を処置した際の結果を示す。また、左と右側のグラフのVehicle処置群とC-CPEmt処置群の結果は共通の値である。 実施例5-2) で得られた血液脳関門模倣系に、抗CLDN-5抗体を処置して12時間経過後に4 kDa FITC-dextranの透過性を評価した結果を示す。縦軸は見かけ上の透過係数を示し、横軸には各被験物質名及び濃度を示す。Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。各値は平均値（n=3）であり、バーは標準偏差を示す。左側にはマウス抗体を処置した際の結果を、右側にはラット抗体を処置した際の結果を示す。また、左と右側のグラフのVehicle処置群とC-CPEmt処置群の結果は共通の値である。 実施例5-3) で得られた血液脳関門模倣系に、抗CLDN-5抗体を処置して12時間経過後に、免疫染色によりZO-1及びCLDN-5の局在性を評価した結果を示す。画像の最上部に用いた1次抗体を示し、左側がZO-1の染色像、右側がCLDN-5の染色像を示す。各画像の左側上部に処置した被験物質名を示す。Vehicleは抗体の希釈に用いた液を添加した場合を示す。
1．定義
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
本明細書中において、「CDR」とは、Complementarity Determining Regionの略であり、相補性決定領域とも称される。CDRとは、イムノグロブリンの可変領域に存在する領域であり、抗体が有する抗原への特異的な結合に深く関与する領域である。そして、「軽鎖CDR」とはイムノグロブリンの軽鎖の可変領域に存在するCDRであり、「重鎖CDR」とはイムノグロブリンの重鎖の可変領域に存在するCDRのことを意味する。
本明細書中において、「可変領域」とは、CDR1〜CDR3（以下、単に「CDRs1-3」という）を含む領域のことを意味する。これらのCDRs1-3の配置順序は特に限定はされないが、好ましくは、N末端側からC末端側の方向に、CDR1、CDR2、及びCDR3の順か、若しくはこの逆の順に、連続又は後述するフレームワーク領域（FR）と称される他のアミノ酸配列を介して、配置された領域を意味する。そして「重鎖可変領域」とは、上述の重鎖CDRs1-3が配置された領域であり、「軽鎖可変領域」とは、上述の軽鎖CDRs1-3が配置された領域である。
各可変領域の上記CDR1-3以外の領域は、上述するようにフレームワーク領域（FR）と称される。特に可変領域のN末端と上記CDR1との間の領域をFR1、CDR1とCDR2との間の領域をFR2、CDR2とCDR3との間の領域をFR3、CDR3と可変領域のC末端との間をFR4とそれぞれ定義される。
FRは、上述した抗原認識配列として特に重要なCDRs1-3を繋ぐリンカー配列としての機能も兼ね備えており、可変領域全体の立体構造形成に寄与する領域である。
本明細書においては、各種Claudinタンパク質を、「X CLDN-Y」又は「X CLDN-Yタンパク質」と表記することもある。Xは由来生物種（h：ヒト、c：カニクイザル、m：マウス）を示し、YはClaudinタンパク質の番号を示す。例えば、ヒトClaudin-5タンパク質は「hCLDN-5」又は「hCLDN-5タンパク質」と表記する。
2．抗体
本発明は、一実施形態として、CLDN-5タンパク質の細胞外領域の立体構造又は一次構造を特異的に認識する、抗体（本明細書において、「本発明の抗体」、「CLDN-5細胞外ドメイン抗体」あるいは単に「抗CLDN-5抗体」などと示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
Claudin-5タンパク質は、Claudin-5（CLDN-5、Cldn-5、CLDN5、Cldn5などと称されることもある）遺伝子の発現産物であり、生物内で発現しているCLDN-5タンパク質である。CLDN-5タンパク質の由来生物種としては、特に制限されず、動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、ヒト、サル（特にカニクイザル）等が好ましい。
種々の生物種由来CLDN-5タンパク質のアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトCLDN-5タンパク質としては配列番号27に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられ、カニクイザルCLDN-5タンパク質としては配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられ、マウスCLDN-5タンパク質としては配列番号29に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられる。
CLDN-5タンパク質は、その本来の活性、CLDN-5タンパク質同士でその細胞外ループを介して相互作用して密着結合を形成可能な限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などのアミノ酸変異を有していてもよい。変異としては、活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
CLDN-5タンパク質の好ましい具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
（a）配列番号27、28及び29のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（b）配列番号27、28及び29のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ密着結合形成能を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
上記（a）及び（b）において、アミノ酸配列は、好ましくは配列番号27及び28である。
上記（b）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号27、28及び29のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つイノシトール リン酸結合加水分解活性を有するタンパク質
が挙げられる。 上記（b’）において、複数個とは、例えば2〜20個であり、好ましくは2〜10個であり、より好ましくは2〜5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
CLDN-5タンパク質の細胞外領域は、CLDN-5タンパク質が細胞膜（好ましくは内皮細胞膜、好ましくは血管内皮細胞膜、より好ましくは脳毛細血管内皮細胞膜）に4回膜貫通して配置された状態において、細胞外に露出する領域であり、その限りにおいて特に制限されない。また、CLDN-5タンパク質の細胞外領域は、N末端側に存在する第1細胞外ループと、C末端側に存在する第2細胞外ループからなる。各CLDN-5タンパク質の細胞外領域、さらには第1細胞外ループ及び第2細胞外ループは、既に公知であるか、或いは各種膜貫通領域予測ツール（例えば、SOSUI：http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/など）などを用いて容易に決定することができる。
細胞外領域の具体例としては、例えば配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質においては、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域（第1細胞外ループ）、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域（第2細胞外ループ）が挙げられる。他のCLDN-5タンパク質における細胞外ドメインの具体例としても、これに対応する領域が挙げられる。ここで、本明細書において、「対応する領域」とは、例えばヒトCLDN-5タンパク質のアミノ酸配列と、他のCLDN-5アミノ酸配列とを、配列分析用ツール（FASTA、BLASTなど）で比較した場合に、対応する領域である。
本発明の抗体は、CLDN-5タンパク質の細胞外領域の立体構造又は一次構造を特異的にを認識する。換言すれば、本発明の抗体は、CLDN-5タンパク質の細胞外領域の立体構造又は一次構造に対して、結合する又は結合性を有する。
本発明の抗体の認識領域が一次構造の場合、認識領域は、連続するアミノ酸配列である。また、本発明の抗体の認識領域が立体構造の場合、認識領域は、連続するアミノ酸配列であってもよいし、複数の、互いに連続していないアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体の認識領域を構成するアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば40以下、35以下、6〜30、6〜25、6〜20、6〜15、又は6〜10である。
本発明の抗体の認識領域の好ましい具体例としては、第1細胞外ループ内の領域（一次構造又は立体構造）、第2細胞外ループ内の領域（一次構造又は立体構造）、第1細胞外ループ及び／又は第2細胞外ループから形成される立体構造などが挙げられ、より好ましい具体例としては、第2細胞外ループ内の領域（一次構造又は立体構造）が挙げられる。
本発明の抗体の認識領域の好ましい具体例である第1細胞外ループ内の領域としては、例えば配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質においては、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域が挙げられ、好ましくはN末端から68番目のアミノ酸（アスパラギン酸）を含む領域が挙げられる。他のCLDN-5タンパク質における具体例としても、これに対応する領域が挙げられる。
本発明の抗体の認識領域の好ましい具体例である第2細胞外ループ内の領域としては、例えば配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質においては、N末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域が挙げられ、好ましくはN末端から151番目のアミノ酸（セリン）を含む領域が挙げられる。他のCLDN-5タンパク質における具体例としても、これに対応する領域が挙げられる。
本発明の抗体の認識領域が第1細胞外ループ内の領域である場合、好ましい一実施形態として、ヒトCLDN-5タンパク質に対する抗体であれば、配列番号45で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトCLDN-5タンパク質の第1細胞外ループがヒトCLDN-1タンパク質の配列に置換されたタンパク質（1-1-5：実施例3-4）に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、又は1/10000以下である抗体が挙げられる。
本発明の抗体の認識領域が第1細胞外ループ内の領域ある場合、好ましい一実施形態として、ヒトCLDN-5タンパク質に対する抗体であれば、配列番号41で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質点変異体D68E（実施例3-5）に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、又は1/10000以下である抗体が挙げられる。
本発明の抗体が、第1細胞外ループ内の領域を認識領域とする、ヒトCLDN-5タンパク質に対する抗体である場合、好ましい一実施形態として、配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトCLDN-5タンパク質の第2細胞外ループがヒトCLDN-1タンパク質の配列に置換されたタンパク質（5-5-1：実施例3-4）に対する結合性を有する抗体が挙げられる。
本発明の抗体の認識領域が第2細胞外ループ内の領域である場合、好ましい一実施形態として、ヒトCLDN-5タンパク質に対する抗体であれば、配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトCLDN-5タンパク質の第2細胞外ループがヒトCLDN-1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質（5-5-1：実施例3-4）に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、又は1/10000以下である抗体が挙げられる。
本発明の抗体の認識領域が第2細胞外ループ内の領域ある場合、好ましい一実施形態として、ヒトCLDN-5タンパク質に対する抗体であれば、配列番号43で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質点変異体S151T（実施例3-5）に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、又は1/10000以下である抗体が挙げられる。
本発明の抗体が、第2細胞外ループ内の領域を認識領域とする、ヒトCLDN-5タンパク質に対する抗体である場合、好ましい一実施形態として、配列番号45で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトCLDN-5タンパク質の第1細胞外ループがヒトCLDN-1タンパク質の配列に置換されたタンパク質（1-1-5：実施例3-4）に対する結合性を有する抗体が挙げられる。
なお、被検抗体の、対象CLDNタンパク質に対する結合性は、実施例1-4と同様にして、対象CLDNタンパク質を発現する細胞を被検抗体（又はその抗体希釈に用いた溶液）を用いて蛍光染色し、蛍光染色細胞をFACS解析することにより調べることができる。細胞の蛍光シグナルの総和を、被検抗体の対象CLDNタンパク質の結合性とみなすことができる。被検抗体を用いた場合の蛍光シグナルの総和が、その抗体希釈液を用いた場合（Vehicle）の蛍光シグナルの総和の1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、5000倍、又は10000倍以上である場合に、被検抗体は対象タンパク質に対して「結合性を有する」と判定することができる。結合性については、以下においても同様である。
本発明の抗体の認識領域の好ましい具体例である第1細胞外ループ及び／又は第2細胞外ループから形成される立体構造としては、例えば配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質においては、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造が挙げられ、好ましくはN末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜67番目のアミノ酸（チロシン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造が挙げられ、より好ましくはN末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜55番目のアミノ酸（バリン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造が挙げられ、さらに好ましくはN末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜48番目のアミノ酸（リシン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造が挙げられる。他のCLDN-5タンパク質における具体例としても、これに対応する領域が挙げられる。
本発明の抗体の認識領域が第1細胞外ループ及び／又は第2細胞外ループから形成される立体構造である場合、好ましい一実施形態として、ヒトCLDN-5タンパク質に対する抗体であれば、配列番号44で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトCLDN-5タンパク質の膜貫通領域にマウスCLDN-5のアミノ酸を導入した変異体（TM：実施例3-5）に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、1/10000以下である抗体が挙げられる。
本発明の抗体が、第1細胞外ループ及び／又は第2細胞外ループから形成される立体構造を認識領域とする、ヒトCLDN-5タンパク質に対する抗体である場合、好ましい一実施形態として、配列番号46及び47で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質変異体（1-5-5、及び5-1-5：実施例3-4）に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質に対する結合性の1/5以下、1/20以下、1/100以下、1/500以下、1/2000以下、1/10000以下である抗体が挙げられる。
本発明の抗体は、CLDN-5タンパク質に対する特異性がより高いことが好ましい。これにより、血液脳関門以外の密着結合を開くことによる副作用を、より低減することが可能である。この観点から、本発明の抗体として、好ましくは、CLDN-5タンパク質以外のCLDNファミリータンパク質に対する結合性が、CLDN-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である抗体が挙げられる。
この結合性判定のための比較対象である「CLDN-5タンパク質以外のCLDNファミリータンパク質」としては、例えばヒトの場合であれば、CLDN-1、CLDN-2、CLDN-3、CLDN-4、CLDN-6、CLDN-7などが挙げられ、マウスの場合であれば、CLDN-1、CLDN-2、CLDN-3、CLDN-4などが挙げられる。上記結合性を判定するに当たって、比較対象であるCLDNファミリータンパク質は、1種のみであってもよいし、2種以上を任意に組み合わせたものであってもよいし、全種であってもよい。
本発明の抗体は、CLDN-5タンパク質に対する特異性の観点から、ヒト及びマウスCLDN-1タンパク質、ヒト及びマウスCLDN-2タンパク質、ヒト及びマウスCLDN-3タンパク質、ヒト及びマウスCLDN-4タンパク質、ヒトCLDN-6タンパク質、並びにヒトCLDN-7タンパク質の細胞外領域のすべてに結合しないことが好ましい。
本発明の抗体の解離定数（Kd）は、特に制限されない。Kdは、例えば1×10−7（M）以下、好ましくは3×10−8（M）以下、より好ましくは1×10−8（M）以下、さらに好ましくは5×10−9（M）以下である。
本発明の抗体として、CLDN-5タンパク質に対する結合性、血液脳関門制御活性などの観点から、好ましくは下記抗体A〜Mが挙げられる。そして、抗体A〜Mとして、より好ましくはマウス抗CLDN-5抗体5クローン、ラット抗CLDN-5抗体8クローンが挙げられる。抗体はそれぞれハイブリドーマのクローン名より、M3、M11、M23、M29、M48、R2、R3、R8、R9、R11、R14、R20、R28と命名している。これらの中でも、M48及びR9が好ましい。以下、抗体A〜Mについて説明する。
（抗体A）
配列番号50で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号52で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号54で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号141で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号143で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号145で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体A。
抗体Aにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表２及び４に記載の抗体M3の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Aとして、より具体的には、抗体M3が挙げられる。
（M3）
マウス抗CLDN-5抗体M3は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号1で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号2で示されるアミノ酸配列であった。本抗体は、第2細胞外ループの立体構造を認識すると推定される。また、本抗体は、hCLDN-5の膜貫通領域が作り出す立体構造を認識すると推定される。
（抗体B）
配列番号57で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号59で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号61で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号148で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号150で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号152で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体B。
抗体Bにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表２及び４に記載の抗体M11の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Bとして、より具体的には、抗体M11が挙げられる。
（M11）
マウス抗CLDN-5抗体M11は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号3で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号4で示されるアミノ酸配列であった。本抗体は、第1細胞外ループの立体構造を認識すると推定される。
（抗体C）
配列番号64で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号66で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号68で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号155で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号157で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号159で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体C。
抗体Cにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表２及び４に記載の抗体M23の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Cとして、より具体的には、抗体M23が挙げられる。
（M23）
マウス抗CLDN-5抗体M23は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号5で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号6で示されるアミノ酸配列であった。本抗体は、第2細胞外ループの立体構造を認識すると推定される。
（抗体D）
配列番号71で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号73で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号75で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号162で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号164で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号166で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体D。
抗体Dにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表２及び４に記載の抗体M29の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Dとして、より具体的には、抗体M29が挙げられる。
（M29）
マウス抗CLDN-5抗体M29は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号7で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号8で示されるアミノ酸配列であった。本抗体は、第2細胞外ループを認識すると推定される。
（抗体E）
配列番号78で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号80で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号82で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号169で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号171で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号173で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体E。
抗体Eにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表２及び４に記載の抗体M48の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Eとして、より具体的には、抗体M48が挙げられる。
（M48）
マウス抗CLDN-5抗体M48は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号9で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号10で示されるアミノ酸配列であった。本抗体は、第2細胞外ループの立体構造を認識すると推定される。
（抗体F）
配列番号85で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号87で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号89で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号176で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号178で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号180で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体F。
抗体Fにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表２及び４に記載の抗体R2の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Fとして、より具体的には、抗体R2が挙げられる。
（R2）
ラット抗CLDN-5抗体R2は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号11で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号12で示されるアミノ酸配列であった。本抗体は、第1細胞外ループの立体構造を認識すると推定される。
（抗体G）
配列番号92で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号94で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号96で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号183で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号185で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号187で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体G。
抗体Gにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表２及び４に記載の抗体R3の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Gとして、より具体的には、抗体R3が挙げられる。
（R3）
ラット抗CLDN-5抗体R3は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号13で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号14で示されるアミノ酸配列であった。本抗体は、第2細胞外ループの立体構造を認識すると推定される。
（抗体H）
配列番号99で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号101で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号103で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号190で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号192で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号194で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体H。
抗体Hにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表３及び５に記載の抗体R8の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Hとして、より具体的には、抗体R8が挙げられる。
（R8）
ラット抗CLDN-5抗体R8は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号15で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号16で示されるアミノ酸配列であった。
（抗体I）
配列番号106で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号108で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号110で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号197で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号199で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号201で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体I。
抗体Iにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表３及び５に記載の抗体R9の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Iとして、より具体的には、抗体R9が挙げられる。
（R9）
ラット抗CLDN-5抗体R9は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号17で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号18で示されるアミノ酸配列であった。本抗体は、第2細胞外ループの一次構造を認識すると推定される。
（抗体J）
配列番号113で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号115で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号117で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号204で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号206で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号208で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体J。
抗体Jにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表３及び５に記載の抗体R11の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Jとして、より具体的には、抗体R11が挙げられる。
（R11）
ラット抗CLDN-5抗体R11は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号19で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号20で示されるアミノ酸配列であった。
（抗体K）
配列番号120で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号122で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号124で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号211で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号213で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号215で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体K。
抗体Kにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表３及び５に記載の抗体R14の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Kとして、より具体的には、抗体R14が挙げられる。
（R14）
ラット抗CLDN-5抗体R14は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号21で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号22で示されるアミノ酸配列であった。本抗体は、第2細胞外ループの一次構造及び立体構造を認識すると推定される。また、本抗体は、hCLDN-5の膜貫通領域が作り出す立体構造を認識すると推定される。
（抗体L）
配列番号127で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号129で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号131で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号218で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号220で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号222で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体L。
抗体Lにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表３及び５に記載の抗体R20の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Lとして、より具体的には、抗体R20が挙げられる。
（R20）
ラット抗CLDN-5抗体R20は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号23で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号24で示されるアミノ酸配列であった。
（抗体M）
配列番号134で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号136で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号138で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
配列番号225で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号227で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号229で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体M。
抗体Mにおいて、少なくとも上記重鎖及び軽鎖のCDR1〜3を含んでいればよく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のFRをさらに含んでいてもよい。重鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、軽鎖可変領域のFR1〜FR4の配列、重鎖可変領域全体の配列、軽鎖可変領域全体の配列としては、表３及び５に記載の抗体R28の各配列又は該配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。抗体Mとして、より具体的には、抗体R28が挙げられる。
（R28）
ラット抗CLDN-5抗体R28は、重鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が、配列番号25で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域全体（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）の配列が配列番号26で示されるアミノ酸配列であった。
抗体M3、M11、M23、M29、M48、R2、R3、R8、R9、R11、R14、R20、R28の重鎖可変領域全体の配列、及び軽鎖可変領域全体の配列の上記好ましい例（配列番号1~26）において、そのアミノ酸配列は、変異していてもよい。例えば、上記好ましい例（配列番号1~26）に対して、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、よりさらに好ましくは99％以上の同一性を有する配列も、抗体M3、M11、M23、M29、M48、R2、R3、R8、R9、R11、R14、R20、R28の重鎖可変領域全体の配列、及び軽鎖可変領域全体の配列として採用することができる。変異部位は、任意であってもよいが、抗体の親和性を減弱させることを目的としない場合は、CDR以外の部位であることが好ましい。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいが、Kd値、特異性などの観点から、好ましくはモノクローナル抗体である。
本発明の抗体の分子量は、特に制限されないが、下限は、例えば20,000、好ましくは50,000、好ましくは100,000、より好ましくは120,000であり、上限は、例えば1,000,000、好ましくは500,000、より好ましくは200,000である。
本発明の抗体の構造は、特に制限されない。本発明の抗体は、定常領域を含むものであってもよいし、定常領域を含まないものであってもよい。定常領域を含む場合、重鎖の定常領域（CH1、CH2、及びCH3）並びに軽鎖の定常領域（CL）の全てを含んでいてもよいし、これらの内の任意の1種又は2種以上の組み合わせを含んでいてもよい。
本発明の抗体の構造の具体例としては、イムノグロブリン、Fab、F(ab’)2、ミニボディ（minibody）、scFv‐Fc、Fv、scFv、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）などが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果の観点から、好ましくはイムノグロブリンが挙げられる。
イムノグロブリンは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する1本の重鎖と軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する1本の軽鎖から成る構造が2つ組み合わされた構造を有する。
Fabとは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域中のCH1を含む重鎖の断片と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域（CL）を含む軽鎖とを含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが上述する非共有結合性の分子間相互作用によって会合するか、またはジスルフィド結合によって結合してなる構造を有する。Fabにおいて、CH1とCLとは、それぞれに存在するシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合していてもよい。
F(ab’)2とは、2対の上記Fabを有し、CH1同士がこれらに含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなる構造である。
ミニボディとは、下記scFVを構成する重鎖可変領域にCH3が結合した断片2つが、CH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。
scFv‐Fcとは、下記scFv、CH2、およびCH3を含む抗体断片2つが、上記ミニボディと同様にCH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合し、それぞれのCH3に含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合した構造である。
Fvとは、抗体の最小構造単位ともいわれ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。Fvにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に存在するシステイン残基のチオール基同士がジスルフィド結合していても良い。
scFvとは、重鎖可変領域のC末端と軽鎖可変領域のN末端がリンカーで繋がれた構造、又は重鎖可変領域のN末端と軽鎖可変領域のC末端とがリンカーで繋がれた構造であり、単鎖抗体とも呼ばれる。
ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディとは、それぞれ上記scFvが2量体、3量体および4量体を形成し、Fvなどと同様に可変領域同士の非共有結合性の分子間相互作用等により、構造的に安定な状態で会合した構造である。
本発明の抗体がイムノグロブリンである場合、そのクラスは特に制限されない。該クラスとしては、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、IgMなど、さらにはこれらのサブクラスが挙げられる。好ましいクラスとしては、例えばIgG、IgMなどが挙げられ、好ましくはIgGが挙げられ、より好ましくはIgG2が挙げられ、さらに好ましくはIgG2aが挙げられる。
本発明の抗体の由来は特に制限されない。本発明の抗体は、例えばヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体、サル由来抗体、チンパンジー由来抗体などであり得る。また、本発明の抗体は、キメラ抗体（例えばヒト以外の生物（マウスなど）由来抗体の定常領域のアミノ酸配列をヒト由来抗体の定常領域のアミノ酸配列に置き換えられてなる抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体などであってもよい。
本発明の抗体は、例えば、配列番号27で示されるヒトCLDN-5タンパク質を発現するプラスミドを免疫原として用い、それ以外は定法に従った又は準じた方法によって製造することができる（製造方法1）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、該プラスミドを、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、プラスミドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られたリンパ節又は脾臓から回収したリンパ球と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
プラスミドを免疫する対象動物は、抗体を製造可能な動物である限り特に制限されない。該対象動物としては、好ましくは自己免疫疾患動物（マウスの場合であれば、例えばBXSBマウスなど）が挙げられる。
本発明の抗体の少なくともCDRのアミノ酸配列が既に分かっている場合、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにより形質転換させた宿主を培養し、本発明の抗体を含む画分を回収する工程を含む方法（製造方法2）によっても製造することができる。
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、本発明の抗体を発現可能な状態で含む限りにおいて特に制限されず、本発明の抗体のコード配列以外に、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、本発明の抗体コード配列に隣接して配置される分泌シグナルペプチドコード配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、複製基点、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。また、
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド（ベクターなど）であってもよい。
本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、（I）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、（II）本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであっても、（III）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含む核酸、並びに本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。

宿主は、特に制限されず、例えば昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。中でも、抗体をより効率的に発現させる観点から、哺乳類細胞であるHEK細胞、CHO細胞、NS0細胞、SP2/O細胞、P3U1細胞などが好ましい。
形質転換、培養、及び回収の方法は、特に制限されず、抗体製造における公知の方法を採用することができる。
回収後は、必要に応じて本発明の抗体を精製してもよい。精製は、抗体製造における公知の方法、例えばクロマトグラフィー、透析などにより行うことができる。
3．複合体
本発明は、一実施形態として、本発明の抗体と薬物との複合体（本明細書において、「本発明の複合体」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
薬物は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。薬物としては、例えば、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子、及びこれらの類縁体、グリコサミノグリカン及びその誘導体、オリゴ糖、多糖及びこれらの誘導体、タンパク質及びペプチドなどの生理活性的物質；抗神経剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、抗炎症剤、ステロイド剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血管拡張剤、平滑筋細胞の増殖及び／又は遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、免疫抑制剤、脂質取込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、血管内皮細胞の増殖又は抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫賦活剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成酵素（NOS；Nitric Oxide Synthase）阻害剤、終末糖化産物（AGEs；Advanced glycation endproducts）阻害剤、抗Ａβ抗体、抗Ｔａｕ抗体等の神経疾患抗体及びラジカルスカベンジャー等の薬理的活性物質などが挙げられる。本発明の複合体は、本発明の抗体を部分構造として含んでおり、これにより血液脳関門をより効率的に透過できることから、薬物の中でも、抗神経剤（例えば、中枢神経系の治療及び／又は診断に用いることができる薬物）が好ましい。
抗神経剤の具体例としては、コンスタン、セパゾン、セルシン、セレナール、ソラナックス、デパス、バランス、メイラックス、リーゼ、リボトリール、レキソタン、ワイバックス、セディール、グランダキシン、エリスパン等の抗不安剤；アナフラニール、トフラニール、トリプタノール、アモキサン、アンプリット、プロチアデン、テシプール、テトラミド、ルジオミール、デジレル、レスリン、アビリット、ドグマチール、ミラドール、リタリン、デプロメール、パキシル、ルボックス、トレドミン等の抗うつ剤；アモバン、ハルシオン、エバミール、マイスリー、リスミー、レンドルミン、ロラメット、サイレース、ドラール、ベンザリン、ユーロジン、ロヒプノール、インスミン、ソメリン、ダルメート、フェノバール、イソミタール等の抗不眠剤；ウインタミン、コントミン、ニューレプチル、ヒルナミン、ＰＺＣ、メレリル、インプロメン、セレネース、オーラップ、クレミン、クロフェクトン、デフェクトン、ホーリット、ロドピン、アタラックス等の精神安定剤；リーマス、テグレトール等の躁鬱剤；エトトイン、フェニトイン、アセチルフェネトライド、プリミドン、スルチアム、エトスクシミド、クロナゼパム、カルバマゼピン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド等の抗てんかん剤；レボドパ剤、メシル酸ペルゴリド、塩酸アマンダジン、塩酸トリヘキシフェニジル、塩酸ピロヘプチン、塩酸マザチコ−ル、塩酸メチキセン、ビペリデン、プロフェナミン、ドロキシドパ等のパーキンソン病治療剤などが挙げられる。
本発明の複合体は、本発明の抗体と薬物とが、直接又はリンカーなどを介して間接的に結合することによって形成される。結合態様は特に制限されず、例えば共有結合、配位結合、イオン結合などが挙げられる。また、リポソームなどの微粒子の表面に本発明の抗体を修飾し、微粒子内に薬物を含有させてもよい。本発明の抗体と薬物との結合は、その結合態様に応じて、公知の方法に従って又は準じて実施することができる。
共有結合は、例えば、本発明の抗体と薬物の各々が有する官能基又は必要に応じて導入された官能基を反応させることによって行われ得る。当該官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基とカルボキシル基、カルボキシル基とヒドロキシル基、マレイミド基とチオール基、チオール基とチオール基、ヒドラジド基とケトン基、ヒドラジド基とアルデヒド基、アミノ基とアルデヒド基、チオール基とカルボキシル基、アミノ基とスクアリン酸誘導体、ジエニルアルデヒド基とアミノ基、ハロエステルとチオール基、アジドとアルキン等が挙げられる。
4．医薬
本発明は、一実施形態として、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬（本明細書において、「本発明の医薬」と示すこともある。）に関する。
本発明の抗体は、脳血管内皮細胞間の連結を開き、血液脳関門の物質透過を促進することができる。このため、本発明の抗体、本発明の複合体は、医薬、特に血液脳関門制御（抑制）用、脳血管内皮細胞層バリア機能制御（抑制）用、血液脳関門の薬物透過促進用、CLDN-5タンパク質の局在変動用（すなわち、通常は細胞間隙に存在するCLDN-5の局在を変化させ、細胞間隙の密着性を弱める、という用途）などの用途に用いられる医薬の有効成分として、好適に利用することができる。
本発明の医薬は、本発明の抗体を含むが本発明の複合体を含まない場合であれば、薬物と併用することにより、その薬物の血液脳関門の透過促進を図ることができる。また、本発明の医薬は、本発明の複合体を含む場合であれば、そのまま、或いは薬物と併用することにより、該複合体中の薬物又は併用された薬物の血液脳関門の透過促進を図ることができる。
本発明の医薬中の有効成分の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重等を考慮して適宜設定することができる。例えば、本発明の医薬中の有効成分の含量は、本発明の医薬全体を100重量部として0.0001重量部〜100重量部程度をすることができる。
本発明の医薬の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与であり、より好ましくは静脈注射である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、抗体又は細胞を注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤等を添加することができる。医薬は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
本発明の医薬は、血液脳関門制御（抑制）活性、脳血管内皮細胞層バリア機能制御（抑制）活性、血液脳関門の薬物透過促進活性など高めることが可能な他の成分をさらに含有していることが好ましい。このような成分としては、例えばoccludin抗体等が挙げられる。
本発明の医薬は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。本発明の医薬は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸等の成分を配合することもできる。
本発明の医薬の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を用いることができる。
本発明の医薬の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができる。本発明の医薬の投与量は、例えば、一日当たりで、1 μg/kg（体重）〜10 g/kg（体重）程度とすることができる。本発明の医薬の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の1日当たりの投与量で、1日〜1月に1回投与することできる。
5．試薬
本発明は、一実施形態として、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬（本明細書において、「本発明の試薬」と示すこともある。）、より詳細には、CLDN-5発現細胞や可溶化状態のCLDN-5を検出などするための試薬に関する。ここで、「試薬」には、CLDN-5を検出などすることにより検査、検出、診断など行うための「検査薬」も包含される。
本発明の試薬は、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
本発明の試薬は、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含むキットの形態であってもよい。該キットには、CLDN-5発現細胞や可溶化状態のCLDN-5の検出、分離などの実施に用いられ得る器具、試薬などが含まれていてもよい。このような器具、試薬としては、例えば試験管、マイクロタイタープレート、アガロース粒子、ラテックス粒子、精製用カラム、標識抗体、標準試料（陽性対照、陰性対照）、エクソソームを抽出する試薬（WO2016/088689号公報）などが挙げられる。
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例1) 抗体の作製
実施例1-1) 細胞融合
哺乳細胞用タンパク質発現ベクターpcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific, V79020)等に、野生型ヒトCLDN-5タンパク質（配列番号27）のコード配列からなるDNA断片を挿入することで免疫用プラスミドを作製した。作製した免疫用プラスミドを用いて皮下免疫を行った。免疫により、血清中抗体の上昇が観察されたBXSBマウス及びWistarラット個体に対し、最終免疫を行った。最終免疫後、常法に従い、動物からリンパ節細胞を回収し、マウスミエローマ細胞（P3U1）と細胞融合を行った。融合後の細胞を96 ウェルプレート 10枚に播種し、培養培地1＊にて10日間、37℃、10 % CO2下で培養した。
＊培養培地1：Hybridoma SFM (Thermo Fisher Scientific, 12045084) + 1x BM condimed H1 Hybridoma cloning supplement (Roche, 1088947), 1x HAT supplement (Thermo Fisher Scientific, 21060017), 1x Penicillin-Streptomycin solution (Wako, 168-23191)。
実施例1-2) スクリーニング用細胞の調製
pCX4purベクター（大阪バイオサイエンス研究所製）に、野生型ヒトCLDN-5タンパク質（配列番号27）のコード配列からなるDNA断片を挿入して、レトロウイルス作製用ベクターを得た。パッケージング細胞（Phoenix A細胞）を12 well plateの各ウェルに0.5×105 cellsずつ播種し、24時間培養した。その後、X-treme GENE HP DNA (Roche Diagnosis, 06366244001) 3 μLを用いて、pCL amphoベクター0.5 μg及びレトロウイルス作製用ベクター0.5 μgをphoenix A細胞へトランスフェクションした。24時間後に培地交換を行い、更に24時間培養した。レトロウイルスを含む培養上清を回収し、これを孔径0.45 μmのフィルターで濾過することで夾雑物を除き、そこへ8 μg/mLとなるようにポリブレン（SigmaAldrich, H9268-5G）を加えた。得られた溶液を用いて、ヒト繊維肉腫由来細胞（HT-1080細胞）を24時間培養した。その後、細胞を、10 cmディッシュ中に5 μg/mLのピューロマイシン（InvivoGen, ant-pr-1）を含む10% FBS添加DMEMを用いて37℃、5% CO2下で2日培養し、未感染細胞を除去した。ピューロマイシン耐性遺伝子のみを発現させた細胞をHT-1080/mock、ピューロマイシン耐性遺伝子及びhCLDN-5を発現させた細胞をHT-1080/hCLDN-5とした。
実施例1-3) 特異モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの樹立
培養後、全ての96 ウェルプレートから培養上清を回収し、HT-1080/hCLDN-5を用いたcell-ELISA解析を行った。Cell-ELISA解析は、96 ウェルプレート表面に接着させたHT-1080/hCLDN-5に対し、回収した培養上清、及びHRP標識抗ラットIgG抗体で染色した後、蛍光基質Amplex Red reagent (Thermo Fisher Scientific, A12222)と反応させ、プレートリーダーで蛍光強度を測定した。
更に、陽性のウェル分の培養上清に関して、以下のようにフローサイトメーター (FCM解析を行った。具体的には、HT-1080/mock及びHT-1080/hCLDN-5に対し、培養上清、及びPE標識抗ラットIgG抗体で染色し、FCM解析に供した。
FCM解析で陽性のウェルからそれぞれハイブリドーマ細胞を回収し、単クローン化作業を行った。具体的には、各FCM陽性ウェルのハイブリドーマ細胞に関し1.2 cells/wellで96 ウェルプレート 1枚に撒き、培養培地1にて10〜12日間、37℃、10 % CO2下で培養した。培養後、全ての96ウェルプレートから培養上清を回収し、HT-1080/hCLDN-5を用いた前述のcell-ELISA解析を行った。
Cell-ELISAで陽性の確認されたウェルから、顕微鏡下でシングルコロニー形成の認められるウェルを選択し、24 ウェルプレート、6ウェルプレートに順次、拡大培養を行った。培養後、6ウェルプレートから培養上清を回収し、前述のHT-1080/mock及びHT-1080/hCLDN-5を用いたFCM 解析を行った。
FCM解析でシフト強度が強いクローンを、単クローン化前のウェルあたり1クローンずつ選択し、15 cmディッシュに拡大し、37℃、10% CO2下で培養を行った。培養後、細胞を回収しセルバンカー1（ZENOAQ, CB011）にて細胞ストックを作製した。また、ストック時の培養上清を用いて、Iso Strip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, 11493027001) 及びRat Monoclonal Antibody ISotyping Test Kit (Bio-Rad, RMT1)を用いて抗体のクラス、サブクラス決定を行った。
各抗体のクラス、サブクラス決定についての結果を下記表１に記載する。
Figure 2018207638
実施例1-4) 抗体の精製
Balb/c nu/nuマウスの腹腔に、プリスタン (フナコシ, 980-60542) を0.5 mL投与し、その1週間後に、樹立したハイブリドーマ細胞（1×107cells）を腹腔内投与した。ハイブリドーマを投与したマウスは投与後7-10日から急激に腹水が溜まるので、腹部の腫れが最大となったころを見計らい、麻酔下で腹水を採取した。腹水は15 mLのチューブに採取し、遠心分離（3000 rpm, 10 min）により不要物を除去した。腹水は-80℃で保存した。
腹水に対しその3倍量のStarting buffer＊を加え、20分間静置した後、遠心分離（3000 rpm, 30分間）、及び孔径0.8 μmのメンブランスフィルターを通すことにより、不溶物を除去した。得られたサンプルを、Starting Bufferで十分に平衡化されたプロテインG (GE healthcare, 17061801) カラム（カラム長 0.7×5 cm）にロードした。サンプル液が完全に流出した後、30 mLのStarting bufferでカラムを洗浄した。その後、Elution buffer＊ 10 mLをカラムに通し、抗体を溶出させた。溶出液は、フラクションコレクターを用いて50滴ずつ分取した。この際、フラクションコレクターの各フラクションには、予め50 μLのNeutralize buffer＊を加えておいた。得られた抗体画分を、4℃の条件下、PBS中で透析（Slide A Lyzer 20 kMWCO, Thermo Fisher Scientific, 66003）した。以下、精製されたモノクローナル抗体の名称は、上記ハイブリドーマと同じとする（例えば、ハイブリドーマM3から得られた抗体は、「抗体M3」又は単に「M3」と表記する。）。
＊Starting buffer： 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0 ＊Elution buffer：100 mM glycine HCl, pH 2.7 ＊Neutralize buffer：1.0 M tris HCl, pH 9.0。
実施例2) 抗体のアミノ酸配列決定
実施例1) でクローニングしたハイブリドーマのゲノム情報より、抗体のアミノ酸配列を決定した。各抗体における、重鎖可変領域内の各領域（CDR1~3及びFR1~4）のアミノ酸配列を表２及び表３に、軽鎖可変領域内の各領域（CDR1~3及びFR1~4）のアミノ酸配列を表４及び表５に示す。表２〜５中、アミノ酸は一文字表記で示し、各配列は最上段左側がN末端側であり、括弧内の数字はその配列の配列番号を示し、「全体」は重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の全体の配列（N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列）を示す。
Figure 2018207638
Figure 2018207638
Figure 2018207638
Figure 2018207638
実施例3) 抗体の結合特異性解析
実施例3-1) CLDN特異性の評価
hCLDN-1タンパク質（配列番号30）のコード配列、hCLDN-2タンパク質（配列番号31）のコード配列、hCLDN-3タンパク質（配列番号32）のコード配列、hCLDN-4タンパク質（配列番号33）のコード配列、hCLDN-6タンパク質（配列番号34）のコード配列、hCLDN-7タンパク質（配列番号35）のコード配列、mCLDN-1タンパク質（配列番号37）のコード配列、mCLDN-2タンパク質（配列番号38）のコード配列、mCLDN-3タンパク質（配列番号39）のコード配列、又はmCLDN-5タンパク質（配列番号29）のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-2) で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種CLDNタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体産出ハイブリドーマの培養上清を1次抗体として用いて、下記に示す方法でFACS解析を行った。
10 cmディッシュに、得られた各CLDN発現細胞を播種し、翌日、細胞を回収した。得られた細胞1.0×105cellsに対して、100 μLの1次抗体を添加し、4℃で1時間反応させた。この際、非特許文献3で用いられたC-CPE変異体（C-CPEmt）とmouse anti-His tag antibody (Abcam) の混合溶液をポジティブコントロールとして用いている。細胞を0.2% BSA-PBSを用いて3回洗浄した後、1% BSA-PBSで400倍希釈した2次抗体溶液（FITC conjugated goat anti-mouse IgG 又は anti-rat IgG (Jackson ImmuneResearch, 115-095-003 or 112-095-003) 100 μLと混合し、4℃で1時間反応させた。細胞を0.2% BSA-TBSを用いて洗浄した後、FACS caliber (BD Bioscience) を用いた。
図1Aに各抗体クローンの各ヒトCLDNとの反応性を示し、図1Bに各マウスCLDNとの反応性を示す。図1Aに示されるように、取得した抗CLDN-5抗体はhCLDN-5とのみ反応した。図1Bに示されるように取得した抗CLDN-5抗体は、マウスCLDNとは強い反応性を示さなかった。M48とR9は、非常に弱いながらも、mCLDN-5への結合性を示した。
実施例3-2) CLDN-5種間交差性の評価
実施例1-2) と同様にして、pCX4purベクターに、cCLDN-5タンパク質（配列番号28）のコード配列、又はmCLDN-5タンパク質（配列番号29）のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-2) で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各動物種CLDN-5タンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体（抗体濃度5 μg/mL、1次抗体として）を用いて、3-1) と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図2に示す。
図2に示されるように、取得した抗CLDN-5抗体は、hCLDN-5及びcCLDN-5に対し、強い結合性を示す。また、R9は非常に弱いながらもmCLDN-5への結合性を示した。
実施例3-3) 抗体のKd値の決定
HT-1080/hCLDN-5と、1.0% BSA-PBSで希釈した各濃度の抗CLDN-5抗体 100 μLを用いて、実施例3-1) と同様にしてFACS解析を行った。FACS解析で得られたMFIをY軸とした飽和結合曲線を描き、50％飽和結合濃度を求めることによってKd値を算出した。この際、Graph Pad prisim 7（GraphPad Software）の飽和結合―1サイト特異的結合の式を用いた。各抗体のKd値を表６に示す。
Figure 2018207638
実施例3-4) hCLDN-5/hCLDN-1キメラCLDNによるエピトープ解析
実施例1-2) と同様にして、pCX4purベクターに、野生型ヒトCLDN-5タンパク質と野生型ヒトCLDN-5タンパク質とのキメラタンパク質［1-1-5：ヒトCLDN-5タンパク質において第1細胞外ループがヒトCLDN-1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質（配列番号45）、1-5-5：ヒトCLDN-5タンパク質において第1細胞外ループのN末端側約半分がヒトCLDN-1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質（配列番号46）、5-1-5：ヒトCLDN-5タンパク質において第1細胞外ループのC末端側約半分がヒトCLDN-1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質（配列番号47）、5-5-1：ヒトCLDN-5タンパク質において第2細胞外ループがヒトCLDN-1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質（配列番号48）］をコードするDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-2) で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種キメラCLDNタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体（抗体濃度5 μg/mL、1次抗体として）を用いて、実施例3-1) と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図4に示す。
図3より、1-1-5を認識できないが5-5-1を認識できることより抗体M11及びR2は第1細胞外ループを認識し、5-5-1を認識できないが1-1-5を認識できることより抗体M3、M23、M48、R3、R9、R14は第2細胞外ループを認識することが示唆された。また、第1細胞外ループを認識する抗体M11とR2であっても、R2は1-5-5を認識できる一方で、M11は1-5-5を認識できないなど、識別するCLDN-5の立体構造は異なることが示唆された。
実施例3-5) hCLDN-5/mCLDN-5キメラCLDNによるエピトープ解析
実施例1-2) と同様にして、pCX4purベクターに、hCLDN-5タンパク質の点変異体［D68E：hCLDN-5タンパク質においてN末端から68番目のアミノ酸（アスパラギン酸）がグルタミン酸（mCLDN-5タンパク質における対応位置のアミノ酸）に変異してなるタンパク質（配列番号41）、T75A：mCLDN-5タンパク質においてN末端から75番目のアミノ酸（トレオニン）がアラニン（mCLDN-5タンパク質における対応位置のアミノ酸）に変異してなるタンパク質（配列番号42）、S151T：hCLDN-5タンパク質においてN末端から151番目のアミノ酸（セリン）がトレオニン（mCLDN-5タンパク質における対応位置のアミノ酸）に変異してなるタンパク質（配列番号43）］及びドメイン置換体［TM：hCLDN-5タンパク質における細胞外領域第1ループを含むN末端から28〜86番目のアミノ酸及び第2ループを含むN末端から147〜176番目のアミノ酸以外をmCLDN-5タンパク質における対応位置のアミノ酸に置換してなるタンパク質（配列番号44）］ をコードするDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-2) で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種キメラCLDNタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体（抗体濃度5 μg/mL、1次抗体として）を用いて、実施例3-1) と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図3に示す。
図4より、M3及びR14はhCLDN-5の膜貫通領域が作り出す立体構造を認識していること、M11及びR2は第1細胞外ループに存在するN末端から68番目のアミノ酸付近を認識していること、M23、M48、R3、R9及びR14は第2細胞外ループに存在するN末端から151番目のアミノ酸付近を認識していることが明らかとなった。
実施例3-6) Western blotting作動性の確認
実施例1-2) で得られたHT-1080/mock及びHT-1080/hCLDN-5から細胞ライセートを調製し、該ライセートを還元条件下のSDS-PAGEにより分離した。1次抗体として実施例1で得られた各抗体（抗体濃度10 μg/mL）を用いて、定法に従ってウェスタンブロッティングを行った。1次抗体としては、ポジティブコントロールとしてCLDN-5のC末端を認識する市販のモノクローナル抗体（4C3C2, Invitrogen, 35-2500）、及びローディングコントロールとしてβアクチン抗体 (SigmaAldrich, A1978)も用いた。結果を図5に示す。
図5より、抗体R9は強く、R14は弱く直鎖状のペプチドを認識した。その他のwestern blotting作動性を示さなかった抗体は、CLDN-5の立体構造を認識することが示唆された。
実施例4) CLDN-5強制発現系を用いた抗体のバリア制御活性の評価
実施例4-1) 細胞の作製
実施例1-2) と同様にして、pCX4purベクターに、cCLDN-5タンパク質（配列番号28）のコード配列、又はmCLDN-5タンパク質（配列番号29）のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-2) で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各動物種CLDN-5タンパク質発現MDCKII細胞を作製した (それぞれ、MDCKII/mock、MDCKII/hCLDN-5、MDCKII/cCLDN-5、MDCKII/mCLDN-5)。これらは培養培地3＊により培養した。
＊培養培地3：DMEM (ニッスイ) + 10% FBS (ニチレイバイオメディカル), 50 μg/mL Penicillin/Streptomycin (ナカライテスク、26253-84), 2 mM L-Glutamine (ナカライテスク、04260-64)。
実施例4-2) CLDN-5強制発現系の経上皮/内皮電気抵抗値（TEER）の測定
底面がポリエチレンテレフタレート製の透過膜（孔径0.4 μm、1.6×106 pores/cm2）である単層培養用インサート（BD Falcon, 353095）を24ウェルプレートの各ウェルにセットし、該膜上で実施例4-1) で作製したMDCKII/mock、MDCKII/hCLDN-5、MDCKII/cCLDN-5、MDCKII/mCLDN-5細胞を培養した。顕微鏡観察下において、細胞がコンフルエントに達した後から、ミリセルERS抵抗値測定システム（Milipore）を用いて、経日的にTEERを評価した。
図6に示すように、各細胞のTEERは、MDCKII/mockは低い値で安定する（約30〜40 Ω・cm2）一方、MDCKII/hCLDN-5、MDCKII/cCLDN-5、MDCKII/mCLDN-5は高い値で安定した（それぞれ約200〜220、240〜260、390〜420 Ω・cm2）。
実施例4-3) 抗体処置がCLDN-5強制発現系のTEERへ与える影響評価
実施例4-2) と同様に、細胞を培養し、TEER値が安定した後に実施例1-4) で得られた各抗体、コントロールIgG又は抗体の希釈に用いた溶液を、下側の培養wellに90 μL添加した。ポジティブコントロールとして非特許文献3で用いられたC-CPEmtを用いた。その後、ミリセルERS抵抗値測定システム（Milipore）を用いて、経時的にTEERを評価した。結果を図7に示す。さらに、抗体添加12時間後に、培養培地3で3回洗浄後、培養培地3で培養を24時間続け、抗体添加により変動したTEERが、可逆的に戻るかを評価した。結果を図7Bに示す。
図7A〜Dに示すように、ポジティブコントロールであるC-CPEmtはMDCKII/mock、MDCKII/hCLDN-5、MDCKII/cCLDN-5、MDCKII/mCLDN-5の全てにおいてTEERの下降を誘導したが、抗CLDN-5抗体はMDCKII/hCLDN-5、MDCKII/cCLDN-5においてのみ、TEERの下降を誘導した。この傾向は、抗CLDN-5抗体の種間交差性と相関する。この抗体のTEERの下降作用は、抗体の投与量依存的であり、M3、M48及びR9のように、TEERを大きく減少させる作用を持つ抗体もあることが分かった。
図8A〜8Dに示すように、抗体処置後に抗体を培養培地から十分に取り除き、24時間培養した場合、各抗CLDN-5抗体により下降したTEERは、抗体添加前と同等の値に回復することが分かった。このことは、抗CLDN-5抗体が可逆的に作用していることを示す。
実施例4-4) 抗体処置がCLDN-5強制発現系の物質透過性へ与える影響評価
実施例4-2) と同様に、細胞を培養し、TEER値が安定した後に実施例1-4) で得られた各抗体、C-CPEmt、コントロールIgG、又は抗体の希釈に用いた液の溶液を、下側の培養wellに90 μL添加した。ポジティブコントロールとして非特許文献3で用いられたC-CPEmtを用いた。抗体添加12時間後に、試験培地＊の入った24 well plateへ単層培養用インサートを移し、インサート側の培地を試験培地に交換した。その後、試験培地の入ったHIENAI plate warmer上で保温している24 well plateへ単層培養用インサートを移し、インサート側の培地を100 μg/mLのフルオロセインナトリウム（和光純薬）又は10 mg/mLの4 kDa FITC-dextran (SigmaAldrich) を含む試験培地に交換し、30分間計測した（インサート毎に個別に操作を行う）。その後、下側の培養wellの試験培地を回収し、培地中の蛍光強度をTriSTAR LB 941（Berthold Technologies）により測定した。見かけ上の透過係数（Papp）は、次式により算出した；Papp (cm/s) = （培養well側の培地量×培養well側に透過したフルオロセインナトリウムの濃度）/（インサートの透過膜の表面積×蛍光物質のインサート側への添加濃度×実験時間）。フルオロセインナトリウムを添加した場合の結果を図9、4 kDa FITC-dextranを添加した場合の結果を図10に示す。
図9に示すように、ポジティブコントロールであるC-CPEmtはMDCKII/mock、MDCKII/hCLDN-5、MDCKII/cCLDN-5、MDCKII/mCLDN-5の全てにおいてフルオロセインナトリウムの透過性を向上させたが、抗CLDN-5抗体はMDCKII/hCLDN-5、MDCKII/cCLDN-5においてのみ、フルオロセインナトリウムの透過性を向上させた。この傾向は、抗CLDN-5抗体の種間交差性と相関する。この抗体のフルオロセインナトリウム透過性向上作用は、投与量依存的であった。
図10に示すように、ポジティブコントロールであるC-CPEmtはMDCKII/mock、MDCKII/hCLDN-5、MDCKII/cCLDN-5、MDCKII/mCLDN-5の全てにおいて4 kDa FITC-dextranの透過性を向上させたが、抗CLDN-5抗体は4 kDa FITC-dextranの透過性を向上させなかった。＊試験培地：DMEM (ニッスイ) + 50 μg/mL Penicillin/Streptomycin (ナカライテスク、26253-84), 2 mM L-Glutamine (ナカライテスク、04260-64)。
実施例5) 血液脳関門模倣系を用いた抗体のバリア制御活性の評価
実施例5-1) 抗体処置が血液脳関門模倣系のTEERへ与える影響評価
血液脳関門を模倣した培養物（サル型BBBキット、ファーマコセル社製）を用いて、バリア機能制御活性を評価した。該培養物は、底面がポリエチレンテレフタレート製の透過膜（孔径3.0 μm、1.6×106pores/cm2）であるインサートが培養ウェルにセットされた構造を有しており、インサート底面の上側にサル脳毛細血管内皮細胞の単層状シートが形成されており、該底面の下側にラットペリサイトの細胞シートが形成されており、且つ培養ウェルの底面上にラットアストロサイトの細胞シートが形成されている。培養には付属の専用培地を使用する。
該培養物のTEER値が150 Ω・cm2に達したのを確認後、インサート側（血管側）の培地に、実施例1-4) で得られた各抗体、C-CPEmt、コントロールIgGの溶液、又は抗体の希釈に用いた液を30 μL添加した。添加後、TEER値の経時変化を測定した。結果を図11に示す。
図11より、各抗CLDN-5抗体は、血液脳関門模倣系のTEERを下降させる作用があることが分かった。また、このTEER降下作用は投与量依存的であった。
実施例5-2) 抗体処置が血液脳関門模倣系の物質透過性へ与える影響評価
サル型BBBキットのTEER値が150 Ω・cm2に達したのを確認後、該培養物のインサート側（血管側）の培地に、実施例1-4) で得られた各抗体、C-CPEmt、コントロールIgGの溶液、又は抗体の希釈に用いた液を30 μL添加した。添加12時間後、実施例4-3) と同様の方法で蛍光物質（10 μg/mLのフルオロセインナトリウム又は1 mg/mLの4 kDa FITC-dextran）の透過性を評価した。フルオロセインナトリウムを添加した場合の結果を図12、4 kDa FITC-dextranを添加した場合の結果を図13に示す。
図12に示すように、各抗CLDN-5抗体は、血液脳関門模倣系のフルオロセインナトリウム透過性を向上させる作用があることが分かった。また、このフルオロセインナトリウム透過性向上作用は投与量依存的であった。
図13に示すように、各抗CLDN-5抗体の内、血液脳関門模倣系の4 kDa FITC-dextranの透過性を向上させる作用を示したものは、M48とR9のみであった。これは、抗体の活性の強さと相関している。
実施例5-3) 抗体処置が血液脳関門模倣系のCLDN-5の局在性へ与える影響評価
サル型BBBキットのTEER値が150 Ω・cm2に達したのを確認後、該培養物のインサート側（血管側）の培地に、実施例1-4) で得られた各抗体、C-CPEmt、又は抗体の希釈に用いた液を30 μL添加した。添加12時間後、PBSで洗浄を行い、インサート下部に付着しているぺリサイトをスクレーパーで剥がした後、4% PFA-PBSで固定操作を行った。その後、0.1% triton-Xで透過処理を行った後、1% BSA-PBSによるブロッキング操作を経て、rabbit anti-ZO-1 (Thermo Fisher Scientific)又はrabbit anti-CLDN-5 (SigmaAldrich) を1次抗体、Alexa488 conjugated goat anti-rabbit (Jackson ImmuneReseach) を2次抗体として用いて、免疫染色を行った。観察は蛍光顕微鏡（Keyence, BZ-X910）を用いて行った。結果を図14に示す。
図14に示すように、ZO-1はVehicle、M48、R9、C-CPEmt処置ではその局在性は変動せず、細胞間隙に局在したままであるが、CLDN-5はM48及びR9処置でその細胞間隙に局在する性質が乱れ、細胞表面に分散する様子が観察された。このCLDN-5の局在性が変動する現象は、抗CLDN-5抗体のバリア機能低下作用の機序に密接に関係していると考えられる。

Claims (13)

  1. Claudin-5タンパク質の細胞外領域の立体構造又は一次構造を特異的に認識する、抗体。
  2. Claudin-1タンパク質、Claudin-2タンパク質、Claudin-3タンパク質、Claudin-4タンパク質、Claudin-6タンパク質、並びにClaudin-7タンパク質の細胞外領域のすべてに結合しない請求項1記載の抗体。
  3. 配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質における、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域内を特異的に認識する、請求項1又は2に記載の抗体。
  4. 配列番号45で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトClaudin-5タンパク質の第1細胞外ループをヒトClaudin-1タンパク質の第1ループに置換したタンパク質1-1-5に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、請求項1〜3のいずれかに記載の抗体。
  5. 配列番号41で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質点変異体D68Eに対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、請求項4に記載の抗体。
  6. 配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質における、N末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域内を特異的に認識する、請求項1又は2に記載の抗体。
  7. 配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトClaudin-5タンパク質の第2細胞外ループをヒトClaudin-1タンパク質の第2ループに置換したタンパク質5-5-1に対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、請求項1、2及び6に記載の抗体。
  8. 配列番号43で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質点変異体S151Tに対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、請求項7に記載の抗体。
  9. 配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLDN-5タンパク質においては、N末端から28番目のアミノ酸（プロリン）〜80番目のアミノ酸（アラニン）までの領域、及びN末端から147番目のアミノ酸（フェニルアラニン）〜163番目のアミノ酸（アラニン）までの領域から形成される立体構造内を特異的に認識する、請求項1又は2に記載の抗体。
  10. 配列番号44で示されるアミノ酸配列からなる、ヒトClaudin-5タンパク質の細胞外領域以外をマウスClaudin-5タンパク質に置換した変異体TMに対する結合性が、配列番号27で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin-5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、請求項1、2及び9に記載の抗体。
  11. 下記抗体からなる群より選択されるいずれかの抗体であって、請求項1〜10のいずれかに記載の抗体：
    （I）
    配列番号106で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号108で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号110で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号197で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号199で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号201で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体I；
    （E）
    配列番号78で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号80で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号82で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号169で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号171で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号173で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体E；
    （B）
    配列番号57で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号59で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号61で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号148で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号150で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号152で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体B；
    （F）
    配列番号85で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号87で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号89で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号176で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号178で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号180で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体F；
    （C）
    配列番号64で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号66で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号68で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号155で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号157で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号159で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体C；
    （A）
    配列番号50で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号52で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号54で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号141で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号143で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号145で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体A；
    （K）
    配列番号120で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号122で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号124で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号211で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号213で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号215で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体K；
    （D）
    配列番号71で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号73で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号75で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号162で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号164で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号166で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体D；
    （G）
    配列番号92で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号94で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号96で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号183で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号185で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号187で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体G；
    （H）
    配列番号99で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号101で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号103で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号190で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号192で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号194で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体H；
    （J）
    配列番号113で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号115で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号117で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号204で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号206で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号208で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体J；
    （L）
    配列番号127で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号129で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号131で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号218で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号220で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号222で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体L；並びに
    （M）
    配列番号134で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号136で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
    配列番号138で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
    を含む重鎖可変領域、並びに／或いは
    配列番号225で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号227で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
    配列番号229で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体M。
  12. 抗体の可変領域VHの配列が配列番号1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23若しくは25又はこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、且つVLの配列が2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24若しくは26又はこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項1〜11のいずれかに記載の抗体。
  13. 請求項1〜12のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する、細胞。
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