KR102536017B1 - 고급 당화 최종 산물(age)에 대한 항체를 사용하여 암을 치료하고, 전이성 암 세포를 사멸시키고, 암 전이를 예방하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

고급 당화 최종 산물(age)에 대한 항체를 사용하여 암을 치료하고, 전이성 암 세포를 사멸시키고, 암 전이를 예방하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

암의 치료 방법, 전이성 암 세포의 사멸 방법, 잠재적으로-악성인 신생물 세포의 사멸 방법 및/또는 암 전이의 예방 방법은 대상체에게 항-AGE 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 전이성 암의 진단 방법은 AGE 변형물을 발현시키는 세포에 결합된 항-AGE 항체를 포함하는 면역 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.

Description

고급 당화 최종 산물(AGE)에 대한 항체를 사용하여 암을 치료하고, 전이성 암 세포를 사멸시키고, 암 전이를 예방하기 위한 방법 및 조성물
노쇠 세포(senescent cell)는 부분-기능성 또는 비-기능성이고, 증식 정지 상태인 세포이다. 노쇠는 세포의 구별되는 상태이며, 바이오마커, 예컨대 바이오마커 p16Ink4a)("p16")의 활성화, 및 β-갈락토시다제의 발현과 연관된다. 노쇠는 세포의 손상 또는 스트레스(예컨대, 성장 인자의 과자극)으로 시작된다. 손상 또는 스트레스는 세포 내의 미토콘드리아 DNA에 부정적으로 영향을 미쳐서 그것이 자유 라디칼을 생산하도록 하는데, 이것은 세포 내의 당(sugar)과 반응하여 메틸 글리옥살(MG)을 형성한다. MG는 결국 단백질 또는 지질과 반응하여 고급 당화 최종 산물(advanced glycation end product: AGE)을 생성시킨다. 단백질 구성성분 라이신의 경우, MG는 반응하여 AGE인 카복시메틸라이신을 형성한다. AGE는 또한 혈액 중의 당과 외부 세포 단백질과의 비-효소적 반응으로부터 형성된다.
미토콘드리아 DNA에 대한 손상 또는 스트레스가 또한 DNA 손상 반응을 유발하며 이것은 세포가 세포 주기 차단 단백질을 생산하는 것을 유도한다. 이들 차단 단백질은 세포가 분열하는 것을 방지한다. 계속되는 손상 또는 스트레스는 mTOR 생산을 유발하고, 이것은 결국 단백질 합성을 활성화시키고 단백질 분해를 불활성화시킨다. 세포의 추가 자극은 예정된 세포사(아포토시스)로 이어진다.
p16은 S 단계를 저해함으로써, 세포 주기의 조절에 관여하는 단백질이다. 그것은 노화 동안 또는 다양한 스트레스, 예컨대 DNA 손상, 산화 스트레스 또는 약물에 대한 노출에 대한 반응으로 활성화될 수 있다. p16은 전형적으로 세포를 DNA 손상에 반응하여 뇌쇠하게 하고, 세포가 과증식성 상태에 도달하는 것을 비가역적으로 방지하는 종양 억제 단백질로서 간주된다. 그러나, 이와 관련하여 일부 불명확한 점이 존재하는데, 이는 일부 종양은 p16의 과발현을 나타내는 반면, 나머지 것은 하향조절된 발현을 나타내기 때문이다. 증거는, 일부 종양에서 p16의 과발현은 결함이 있는 망막모세포종 단백질("Rb")로부터 초래된다는 것을 시사한다. p16은 Rb 상에서 작용하여 S 단계를 저해하고, Rb는 p16을 하향조절하여, 음성 피드백을 생성시킨다. 결함이 있는 Rb는 S 단계를 저해하고, p16을 하향조절하는 것을 모두 실패하여, 과증식하는 세포에서 p16의 과발현을 초래한다(Romagosa, C. et al., p16Ink4a overexpression in cancer: a tumor suppressor gene associated with senescence and high-grade tumors, Oncogene, Vol. 30, 2087-2097 (2011)).
노쇠 세포는 암 세포의 성장에 영양을 공급한다고 공지되어 있다. 노쇠 세포는 전염증성 인자를 비롯한, 세포간 신호전달에 관여되는 다수의 인자의 분비와 연관되고; 이들 인자의 분비는 노쇠-연관된 분비 표현형 또는 SASP라 지칭되어 왔다. 한 연구는 노쇠 간엽성 줄기 세포가 IL-6의 분비에 의해서 유방암 세포의 증식 및 이동을 촉진시킨다는 것을 보여주었다(문헌[Di, G-h. et al. IL-6 Secreted from Senescent Mesenchymal Stem Cells Promotes Proliferation and migration of Breast Cancer Cells, PLOS One, Vol. 9, 11, e113572 (2014)]). 또 다른 연구는 노쇠 인간 섬유아세포가 매트릭스 메탈로프로테이나제의 분비에 의해서 종양의 성장을 증가시킨다는 것을 보여주었다(문헌[Liu, D. et al. Senescent Human Fibroblasts Increase the Early Growth of Xenograft Tumors via Matrix Metalloproteinase Secretion, Cancer Res, Vol. 67, 3117-3126 (2007)]).
노쇠 세포는 SASP의 일부로서 반응성 산소 종("ROS")을 분비한다. ROS는 세포의 노쇠를 유지시키는 데 중요한 역할을 한다고 여겨진다. ROS의 노쇠는 방관자 효과를 생성하는데, 이 때 노쇠 세포는 이웃 세포에서 노쇠를 유도하고: ROS는 노쇠로 이어지는 p16 발현을 활성화시킨다고 공지된 그러한 세포 손상을 생성시킨다(Nelson, G., A senescent cell bystander effect: senescence-induced senescence, Aging Cell, Vo. 11, 345-349 (2012)). p16/Rb 경로는 ROS의 유도로 이어지고, 이것은 결국 ROS를 추가로 향상시키는 양성 피드백 루프를 생성시키고, 비가역적 세포 주기 정지를 유지시키는 데 도움을 주는 단백질 카이나제 C 델타를 활성화시키며; 이것은 암 세포를 ROS에 노출시키는 것은 과증식성 세포에서 세포 단계 정지를 유도함으로써 암을 치료하는 데 효과적일 수 있음을 시사한다(Rayess, H. et al., Cellular senescence and tumor suppressor gene p16, Int J Cancer, Vol. 130, 1715-1725 (2012)).
고급 당화 최종-산물AGE; AGE-변성 단백질, 또는 당화 최종-산물이라고도 지칭됨)은 당과 단백질 측쇄의 비-효소적 반응으로부터 일어난다(문헌[Ando, K. et al., Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)]). 이 과정은 환원당과 아미노기 간의 가역적 반응으로 시작하여 시프 염기(Schiff base)를 형성하는데, 이것은 공유-결합된 아마도리 재배열(Amadori rearrangement) 산물을 형성하게 된다. 형성된 후, 아마도리 산물은 추가로 재배열되어 AGE를 생성한다. 진성 당뇨병(diabetes mellitus: DM), 및 산화 스트레스에 의해서 유발된 고혈당은 이러한 막 단백질의 번역후 변형을 촉진시킨다(문헌[Lindsey JB, et al., "Receptor For Advanced Glycation End-Products (RAGE) and soluble RAGE (sRAGE): Cardiovascular Implications", Diabetes Vascular Disease Research, Vol. 6(1), 7-14, (2009)]). AGE는 당뇨 합병증, 염증, 망막증, 신증, 죽상 경화증, 뇌졸중, 내피 세포 기능이상, 및 신경변성 장애를 비롯한 몇몇 병리학적 병태와 연관되어 있다(문헌[Bierhaus A, "AGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I. The AGE concept", Cardiovasc Res, Vol. 37(3), 586-600 (1998)]).
AGE-변형된 단백질은 또한 노쇠 세포의 마커이다. 당화 최종-tks물과 노쇠의 이러한 연관은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 그루버, 엘.(Gruber, L.)(국제 특허 공개 제WO 2009/143411호(2009년 11월 26일)), 문헌[Ando, K. et al. (Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999))], [Ahmed, E.K. et al. ("Protein Modification and Replicative Senescence of WI-38 Human Embryonic Fibroblasts" Aging Cells, vol. 9, 252, 260 (2010))], [Vlassara, H. et al. (Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface Induce Receptor-Mediated Phagocytosis by Macrophages, J. Exp. Med., Vol. 166, 539, 545 (1987)] 및 [Vlassara et al. ("High-affinity-receptor-mediated Uptake and Degradation of Glucose-modified Proteins: A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromolecules" Proc. Natl. Acad. Sci. USAI, Vol. 82, 5588, 5591 (1985)]을 참고하기 바란다. 추가로, 아메드, 이.케이.(Ahmed, E.K.) 등은 당화 최종-산물이 "세포 및 세포외 단백질에 대한 자발적인 손상의 주요 원인 중 하나"라고 나타낸다(상기 아메드, 이.케이 등의 문헌 제353면 참고). 따라서, 당화 최종-산물의 축적은 노쇠와 연관된다. 당화 최종-산물의 형성은 산화와 연관되기 때문에, 당화 최종-산물의 축적은 노쇠 세포에서 ROS의 형성의 결과일 수 있다(Fu, M.-X., et al., The Advanced Glycation End Product, N E -(Carboxymehtyl)lysine, Is a Product of both Lipid Peroxidation and Glycoxidation Reactions, J. Biol. Chem., Vol. 271, 9982-9986 (1996)).
제1 양상에서, 본 발명은 대상체에게 항-AGE 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법, 전이성 암 세포의 사멸 방법, 잠재적으로-악성인 신생물 세포의 사멸 방법 및/또는 암 전이의 예방 방법이다.
제2 양상에서, 본 발명은 제1 항-AGE 항체 및 제2 항-AGE 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법, 전이성 암 세포의 사멸 방법, 잠재적으로-악성인 신생물 세포의 사멸 방법 및/또는 암 전이의 예방 방법이다. 제2 항-AGE 항체는 제1 항-AGE 항체와 상이하다.
제3 양상에서, 첫 번째로 항-AGE 항체를 투여하는 단계; 그 다음 대상체를 암의 치료, 전이성 암세포의 사멸, 잠재적으로-악성인 신생물 세포의 사멸 및/또는 암 전이의 예방에서 제1 투여의 효과에 대해서 시험하는 단계; 그 다음 두 번째로 항-AGE 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상체의 치료 방법, 전이성 암 세포의 사멸 방법, 잠재적으로-악성인 신생물 세포의 사멸 방법 및/또는 암 전이의 예방 방법이다.
제4 양상에서, 본 발명은 암의 치료, 전이성 암 세포의 사멸, 잠재적으로-악성인 신생물 세포의 사멸 및/또는 암 전이의 예방을 위한 의약의 제조를 위한 항-AGE 항체의 용도이다.
제5 양상에서 본 발명은 암의 치료, 전이성 암 세포의 사멸, 잠재적으로-악성인 신생물 세포의 사멸 및/또는 암 전이의 예방에 사용하기 위한 항-AGE 항체를 포함하는 조성물이다.
제6 양상에서, 본 발명은 제1 항-AGE 항체, 제2 항-AGE 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 암의 치료 방법, 전이성 암 세포의 사멸 방법, 잠재적으로-악성인 신생물 세포의 사멸 방법 및/또는 암 전이의 예방 방법이다. 제1 항-AGE 항체는 제2 항-AGE 항체와 상이하다.
제7 양상에서, 본 발명은 AGE 변형물을 발현시키는 세포에 결합된 항-AGE 항체를 포함하는 면역 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 전이성 암의 진단 방법이다.
제8 양상에서, 본 발명은 전이성 암 세포에 결합된 항-AGE 항체를 포함하는 면역 복합체이다. 전이성 암 세포는 AGE 변형물을 발현시킨다.
제9 양상에서, 본 발명은 항-AGE 항체, 대조군 샘플 및 임의로 항-AGE 항체에 결합하는 시약을 포함하는 전이성 암의 진단용 키트이다.
정의
용어 "펩타이드"는 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 분자를 의미한다.
용어 "단백질"은 50개 초과의 아미노산으로 구성된 분자를 의미한다.
용어 "고급 당화 최종-산물", "AGE", "AGE-변형된 단백질 또는 펩타이드", "당화 최종-산물" 및 "AGE 항원"은 추가로 재배열하여 비가역적 가교-연결을 형성하는 당과 단백질 측쇄의 반응의 결과로서 형성된 변형된 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 이 과정은 환원당과 아미노기 간의 가역적 반응으로 시작하여 시프 염기를 형성하는데, 이것은 공유-결합된 아마도리 재배열 산물을 형성하게 된다. 형성된 후, 아마도리 산물은 추가로 재배열되어 AGE를 생성한다. AGE-변형된 단백질 및 AGE-변형된 단백질에 대한 항체는 부칼라(Bucala)("부칼라")의 미국 특허 제5,702,704호 알-아베드(Al-Abed) 등("알-아베드")의 미국 특허 제6,380,165호에 기술되어 있다. 필수적인 재배열을 겪지 않고 AGE, 예컨대 당화 알부민 상에서 발견되는 N-데옥시프룩토실라이신을 형성하는 당화 단백질 또는 펩타이드는 AGE가 아니다. AGE는 AGE 변형(또한 AGE 에피토프 또는 AGE 모이어티라 지칭됨), 예컨대 2-(2-푸로일)-4(5)-(2-푸란일)-1H-이미다졸("FFI"); 5-하이드록시메틸-1-알킬피롤-2-카바알데하이드("피랄린"); 1-알킬-2-폼일-3,4-다이글리코실 피롤("AFGP"), 비-형광 모델 AGE; 카복시메틸라이신; 및 펜토시딘의 존재에 의해서 식별될 수 있다. ALI, 또 다른 AGE가 알-아베드에 기술되어 있다.
"세포 상의 AGE-변형된 단백질에 결합하는 항체", "항-AGE 항체" 또는 "AGE 항체"는 AGE-변형된 단백질 또는 펩타이드에 결합하고, 항체의 불변 영역을 포함하는 항체 또는 다른 단백질을 의미하고, 여기서 AGE-변형된 단백질 또는 펩타이드는 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포, 보다 바람직하게는 인간, 고양이, 개, 말, 낙타과(예를 들어, 낙타 또는 알파카), 소, 양, 또는 염소 세포의 표면 상에 결합된 것으로 일반적으로 발견되는 단백질 또는 펩타이드이다. "세포 상의 AGE-변형된 단백질에 결합하는 항체", "항-AGE 항체" 또는 "AGE 항체"는 AGE-변형된 단백질 또는 펩타이드, 및 동일한 비-AGE-변형된 단백질 또는 펩타이드 둘 모두에 대해서 동일한 특이성 및 선택성으로 결합하는(즉, AGE 변형의 존재가 결합을 증가시키지 않음)항체 또는 다른 단백질을 포함하지 않는다. AGE-변형된 알부민은 세포 상의 AGE-변형된 단백질이 아닌데, 그 이유는 알부민이 세포의 표면 상에 결합된 것으로 일반적으로 발견되는 단백질이 아니기 때문이다. "세포 상의 AGE-변형된 단백질에 결합하는 항체", "항-AGE 항체" 또는 "AGE 항체"는 세포의 제거, 파괴 또는 죽음으로 이어지는 이들 항체 만을 포함한다. 또한 예를 들어, 독소, 약물, 또는 다른 화학물질 또는 입자에 접합된 항체가 포함된다. 바람직하게는, 항체는 단클론성 항체이지만, 다클론성 항체가 또한 허용된다.
용어 "노쇠 세포"는 증식 정지 상태로 존재하고, 노쇠의 하나 이상의 바이오마커, 예컨대 p16Ink4a의 활성화 또는 노쇠-연관된 β-갈락토시다제의 발현을 발현시키는 세포를 의미한다.
용어 "변종"은 구체적으로 명시된 서열과 상이한 뉴클레오타이드, 단백질 또는 아미노산 서열을 의미하고, 여기서 하나 이상의 뉴클레오타이드, 단백질 또는 아미노산 잔기는 결손, 치환 또는 부가되어 있다. 변종은 자연-발생 대립 형질 변종, 비-자연-발생 변종일 수 있다. 식별된 서열의 변종은 식별된 서열의 기능적 특징 중 일부 또는 전부를 보유할 수 있다.
용어 "백분율(%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입하여 최대 백분율 서열 동일성을 달성한 후 기준 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보군 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 부분으로서 고려하지 않는다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 바람직하게는, % 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수 가능하거나 또는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서로 제출되고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록된 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한, UNIX 구동 시스템 상에서 사용하기 위해서 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해서 설정되고, 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해서 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 이것과의 또는 이것을 향한 주어진 아미노산 서열 A의 % 서열 동일성(이것은 대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 이것과의 또는 이것을 향한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 서술될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다: 분수 X/Y의 100배, 여기서 X는 A와 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해서 동일한 매칭으로서 점수 매겨진 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 여기서 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 % 아미노산 서열 동일성은 B 대 A의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것이다. 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수득된다.
용어 "면역 복합체"는 항원에 결합된 항체의 조합물을 의미한다. 면역 복합체는 또한 "항체-항원 복합체"라고 지칭될 수 있다.
도 1은 항체 결합 실험에서의 반응 대 시간의 그래프.
도 2는 암 전이의 진단용 키트를 예시한 도면.
도 3은 종양 성장, 전이 가능성 및 악액질에 대한 항-AGE 항체의 효과를 조사하는 생체내 연구의 기간에 걸친 정규화된 종양 체적의 그래프.
도 4는 종양 성장, 전이 가능성 및 악액질에 대한 항-AGE 항체의 효과를 조사하는 생체내 연구의 기간에 걸친 정규화된 마우스의 체중의 그래프.
씨. 엘레간스(C. elegans)에서의 최근 연구는, 활발하게 증식하는 세포는 침습성이 아니고, 침습성 세포, 예컨대 전이중인(metastasizing) 암 세포는 증식하지 않고, 세포-주기 정지로 존재해야 한다는 것을 시사한다(Matus et al., Invasive Cell Fate Requires G1 Cell-Cycle arrest and Histone Deacetylase-Mediated Changes in Gene Expression, Developmental Cell, Vol. 35, 162-174 (2015)). 다른 연구자들은 ROS의 형성이 암 세포의 전이를 유도할 수 있다는 것을 발견하였다(Porporato, P. E., et al. A Mitochondrial Switch Promotes Tumor Metastasis, Cell Reports, Vol. 8, 754-766 (2014)).
세포 단계 정지 및 ROS의 생산은 노쇠 세포의 많은 특징인 전이중인 암 세포를 제공하고, 이것은 세포 표면 상의 AGE-변형된 단백질의 존재를 포함한다고 예상될 것이다. 따라서 AGE-변형된 단백질은 전이중인 암 세포를 찾아내어 파괴하기 위한, 항체를 사용하여 표적화될 수 있는 항원을 제공한다. 항-AGE 항체의 투여는 전이중인 암 세포를 사멸시키고, 이에 의해서 암을 치료할 것이다. 항-AGE 항체의 투여는 암 환자에서 전이를 예방할 것이고, 예방 방식으로 암의 확산을 예방하는 데 사용될 수 있다.
잠재적으로-악성인 신생물, 예컨대 지루 각화증, 광선 각화증 및 암종은 동일계에서 노쇠 세포의 많은 특징, 예컨대 p16의 발현을 가지며, 이것은 세포 표면 상의 AGE-변형된 단백질의 존재를 포함한다고 예상될 것이다. 따라서 AGE-변형된 단백질은 잠재적으로-악성인 신생물 세포를 찾아내어 파괴하기 위한, 항체를 사용하여 표적화될 수 있는 항원을 제공한다. 항-AGE 항체의 투여는 잠재적으로-악성인 신생물 세포를 사멸시키고, 이에 의해서 암을 예방할할 것이다. 항-AGE 항체의 투여는 예방 방식으로 암 환자에서 암을 예방할 것이다.
세포 상의 AGE-변형된 단백질에 결합하는 항체("항-AGE 항체" 또는 "AGE 항체")는 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예는 미국 특허 제5,702,704호(부칼라(Bucala)) 및 제6,380,165호(알-아베드(Al-Abed) 등)에 기술된 것을 포함한다. 예는 AGE 변형, 예컨대 FFI, 피랄린, AFGP, ALI, 카복시메틸라이신, 카복시에틸라이신 및 펜토시딘을 갖는 하나 이상의 AGE-변형된 단백질에 결합하는 항체 및 이러한 항체의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 카복시메틸라이신-변형된 단백질에 결합한다. 바람직하게는, 항체는 그것이 사용될 동물에 대해서 비-면역원성이고, 예컨대 인간; 고양이, 개, 및 말을 비롯한 반려 동물; 상업적으로 중요한 동물, 예컨대 낙타(또는 알파카), 소(소과 동물), 양, 및 염소에 대해서 비-면역원성이다. 보다 바람직하게는, 항체는 항체에 대한 면역 반응을 감소시키기 위해서 동물의 항체와 동일한 종 불변 영역을 갖고, 예컨대 (인간의 경우) 인간화되고, (고양이의 경우) 고양이화되고, (개의 경우) 개화되고, (말의 경우) 말화되고, (낙타 또는 알파카의 경우) 낙타화되고, (소의 경우) 소화되고, (양의 경우) 양화되고, (염소의 경우) 염소화된다. 가장 바람직하게는, 항체는 그것이 사용될 동물의 것(가변 영역 제외), 예컨대 인간 항체, 고양이 항체, 개 항체, 말 항체, 낙타 항체, 소 항체, 양 항체 또는 염소 항체와 동일하다. 이들 동물에 대한 항체의 불변 영역 및 다른 부분의 상세 사항은 하기에 기술되어 있다. 바람직하게는, 항체는 단클론성 항체이지만, 다클론성 항체가 또한 허용된다.
특히 바람직한 항-AGE 항체는 카복시메틸라이신 또는 카복시에틸라이신 AGE 변형을 나타내는 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 것을 포함한다. 카복시메틸라이신(N(엡실론)-(카복시메틸)라이신, N(6)-카복시메틸라이신, 또는 2-아미노-6-(카복시메틸아미노)헥산산이라고도 공지됨) 및 카복시에틸라이신(N-엡실론-(카복시에틸)라이신이라고도 공지됨)은 산화 스트레스 및 화학적 당화의 결과로서 단백질 또는 펩타이드 및 지질 상에서 발견된다. CML- 및 CEL-변형된 단백질 또는 펩타이드는 다양한 세포 상에서 발현되는 수용체 RAGE에 의해서 인식된다. CML 및 CEL은 널리 연구되어 있고, CML- 및 CEL-관련 제품은 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 셀 바이오랩스, 인크.(Cell Biolabs, Inc.)는 CML-BSA 항원, CML 다클론성 항체, CML 면역블롯 키트, 및 CML 경쟁성 ELISA 키트(www.cellbiolabs.com/cml-assays), 뿐만 아니라 CEL-BSA 항원 및 CEL 경쟁성 ELISA 키트(www.cellbiolabs.com/cel-n-epsilon-carboxyethyl-lysine-assays-and-reagents)를 판매한다. 특히 바람직한 항체는 인간 불변 영역(또는 그것이 투여될 동물의 불변 영역)을 갖도로 변형된, 알앤디 시스템스, 인크.(R&D Systems, Inc.)(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재; 카탈로그 번호 MAB3247)로부터 입수 가능한 카복시메틸 라이신 MAb(클론 318003)인, 키홀 림펫 헤모사이아닌과 접합된 카복시메틸 라이신에 대해서 발생된, 상업적으로 입수 가능한 마우스 항-당화 최종-산물 항체의 가변 영역을 포함한다. 상업적으로 입수 가능한 항체, 예컨대 알앤디 시스템스, 인크.로부터의 카탈로그 번호 MAB3247에 상응하는 카복시메틸 라이신 항체는 진단 목적을 위해서 의도될 수 있고, 동물 또는 인간에서 사용하기에 적합하지 않은 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상업적으로 입수 가능한 항체는 독소 또는 다른 잠재적으로 유해한 물질을 제거하기 위해서 동물 또는 인간에서 사용하기 전에 정제 및/또는 단리된다.
항-AGE 항체는 항체-항원 복합체로부터의 낮은 해리 속도(rate of dissociation), 또는 k d (k 백(back) 또는 오프-레이트(off-rate)라고도 지칭됨), 바람직하게는 최대 9 x 10-3, 8 x 10-3, 7 x 10-3 또는 6 x 10-3(초-1)를 갖는다. 항-AGE 항체는 세포의 AGE-변형된 단백질에 대해서 높은 친화도를 갖는데, 이것은 최대 9 x 10-6, 8 x 10-6, 7 x 10-6, 6 x 10-6, 5 x 10-6, 4 x 10-6 또는 3 x 10-6(M)의 낮은 해리 상수 K D 로서 표현될 수 있다. 바람직하게는, 도 1에 도시된, 항-AGE 항체의 결합 특성은 알앤디 시스템스, 인크.(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재; 카탈로그 번호 MAB3247)로부터 입수 가능한 카복시메틸 라이신 MAb(클론 318003)과 유사하거나, 동일하거나, 우수하다.
항-AGE 항체는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 통해서 AGE-변형된 세포를 파괴할 수 있다. ADCC는, 면역계의 효과기 세포가 막-표면 항원이 특이적 항체에 의해서 결합된 표적 세포를 활성적으로 용해시키는 세포-매개된 면역 방어의 기전이다. ADCC는 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구에 의해서 매개될 수 있다. 효과기 세포는 결합된 항체의 Fc 부분에 결합한다. 항-AGE 항체와 함께 또는 그 후에 NK 세포, 예컨대 NK92 세포(난트케이웨스트(NantKwest)(미국 캘리포니아주 컬버 시티 소재)로부터 입수 가능한 세포주)를 투여하는 것은 컴플리먼트 활성도(compliment activity) 및 이에 따라서 항-AGE 항체의 전이중인 암 세포의 사멸 효과를 향상시킬 수 있다. 항-AGE 항체 보체-의존성 세포독성(CDC)을 통해서 AGE-변형된 세포를 파괴할 수 있다. CDC에서, 면역계의 보체 캐스케이드는 표적 항원에 대한 항체 결합에 의해서 촉발된다.
항-AGE 항체는 AGE-변형된 세포의 파괴를 유발하는 작용제에 접합될 수 있다. 이러한 작용제는 독소, 세포독성제, 자성 나노입자, 및 자성 스핀-보텍스 디스크일 수 있다.
항-AGE 항체에 접합된, 독소, 예컨대 세공-형성 독소(PFT)(문헌[Aroian R. et al., "Pore-Forming Toxins and Cellular Non-Immune Defenses (CNIDs)", Current Opinion in Microbiology, 10:57-61 (2007)])는 환자에 주사되어 AGE-변형된 세포를 선택적으로 표적으로 하여 이것을 제거할 수 있다. 항-AGE 항체는 AGE-변형된 세포를 인식하고, 이것에 결합한다. 이어서, 독소는 세포 표면에서 세공 형성을 유발하고, 그 다음 삼투 용해를 통해서 세포를 제거한다.
항-AGE 항체에 접합된 자성 나노입자는 환자에 주사되어 AGE-변형된 세포를 표적으로 하고, 이것을 제거할 수 있다. 자성 입자는 AGE-변형된 세포를 선택적으로 제거하기 위해서 자기장을 인가함으로써 가열될 수 있다.
대안으로서, 혈관을 폐색시킬 수 있는 자기-응집을 회피하기 위해서 자기장이 인가되는 경우에만 자화되는, 자성 스핀-보텍스 디스크는 자기장이 인가되는 경우 회전하기 시작하여, 표적 세포의 막 분열을 유발한다. 항-AGE 항체에 접합된, 자성 스핀-보텍스 디스크는 다른 세포를 제거하지 않으면서, AGE-변형된 세포 유형을 특이적으로 표적화한다.
항체는 전형적으로 결합된 폴리펩타이드의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하여 "Y" 형 분자를 형성한다. 불변 영역은 항원을 표적화하는 데 사용되는 기전을 결정한다. "Y"의 팁(tip)(가변 영역)에서 아미노산 서열은 상이한 항체들 간에 상이하다. 이러한 변화는 항체에 항원에 결합하기 위한 이의 특이성을 제공한다. 경쇄 및 중쇄의 단부를 포함하는, 가변 영역은, 초가변(HV - 때로는 상보성 결정 영역, 또는 CDR이라고도 지칭됨) 및 프레임워크(FR) 영역으로 추가로 나뉜다. 항체가 재조합 방식으로 제조되는 경우, 2개의 상이한 항원에 결합하는 가변 영역(또는 상보성 결정 영역)을 갖는 단일 항체를 갖는 것이 또한 가능하고, 여기서 "Y"의 각각의 팁은 각각의 항원에 특이적이고; 이들은 이중-특이적 항체라 지칭된다.
본 발명에 따른 인간화된 항-AGE 항체는 서열번호 22에 제시된 아미노산의 인간 불변 영역 서열을 가질 수 있다. 인간화된 항-AGE 항체의 중쇄 상보성 결정 영역은 서열번호 23(CDR1H), 서열번호 24(CDR2H) 및 서열번호 25(CDR3H)에 제시된 단백질 서열 중 하나 이상을 가질 수 있다. 인간화된 항-AGE 항체의 경쇄 상보성 결정 영역은 서열번호 26(CDR1L), 서열번호 27(CDR2L) 및 서열번호 28(CDR3L)에 제시된 단백질 서열 중 하나 이상을 가질 수 있다.
인간(호모 사피엔스) 항체 면역글로불린 G1의 중쇄는 서열번호 1의 단백질 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 중쇄의 가변 도메인은 서열번호 2의 단백질 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 중쇄의 가변 도메인(서열번호 2)의 상보성 결정 영역은 서열번호 41, 서열번호 42 및 서열번호 43에 제시되어 있다. 인간(호모 사피엔스) 항체 면역글로불린 G1의 카파 경쇄는 서열번호 3의 단백질 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 카파 경쇄의 가변 도메인은 서열번호 4의 단백질 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 임의로, 서열번호 4의 위치 128에서의 아르기닌(Arg 또는 R) 잔기는 누락될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인(서열번호 4)의 상보성 결정 영역은 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46에 제시되어 있다. 가변 영역은 코돈-최적화되고, 합성되고, 인간 면역글로불린 G1 불변 영역을 함유하는 발현 벡터 내에서 클로닝될 수 있다. 또한, 가변 영역은 비-인간 항체의 인간화에서 사용될 수 있다.
항체 중쇄는 서열번호 12의 DNA 서열, 뮤린(murine) 항-AGE 면역글로불린 G2b 중쇄에 의해서 암호화될 수 있다. 서열번호 12에 의해서 암호화된 뮤린 항-AGE 면역글로불린 G2b 중쇄의 단백질 서열은 서열번호 16에 제시되어 있다. 뮤린 항체의 가변 영역은 서열번호 16의 위치 25 내지 142에 상응하는 서열번호 20에 제시되어 있다. 항체 중쇄는 대안적으로 서열번호 13의 DNA 서열, 키메라 항-AGE 인간 면역글로불린 G1 중쇄에 의해서 암호화될 수 있다. 서열번호 13에 의해서 암호화된 키메라 항-AGE 인간 면역글로불린 G1 중쇄의 단백질 서열은 서열번호 17에 제시되어 있다. 키메라 항-AGE 인간 면역글로불린은 위치 25 내지 142에서 서열번호 20의 뮤린 가변 영역을 포함한다. 항체 경쇄는 서열번호 14의 DNA 서열, 뮤린 항-AGE 카파 경쇄에 의해서 암호화될 수 있다. 서열번호 14에 의해서 암호화된 뮤린 항-AGE 카파 경쇄의 단백질 서열은 서열번호 18에 제시되어 있다. 뮤린 항체의 가변 영역은 서열번호 18에 상응하는 위칭 21 내지 132에 상응하는, 서열번호 21에 제시되어 있다. 항체 경쇄는 대안적으로 서열번호 15의 DNA 서열, 키메라 항-AGE 인간 카파 경쇄에 의해서 암호화될 수 있다. 서열번호 15에 의해서 암호화된 키메라 항-AGE 인간 카파 경쇄의 단백질 서열은 서열번호 19에 제시되어 있다. 키메라 항-AGE 인간 면역글로불린은 위치 21 내지 132에서 서열번호 21의 뮤린 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 인간화된 항-AGE 항체는 하나 이상의 인간화된 중쇄 또는 인간화된 경쇄를 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 인간화된 중쇄는 서열번호 30, 32 또는 34의 DNA 서열에 의해서 암호화될 수 있다. 서열번호 30, 32 및 34에 의해서 암호화된 인간화된 중쇄의 단백질 서열은 각각 서열번호 29, 31 및 33에 제시되어 있다. 인간화된 경쇄는 서열번호 36, 38 또는 40의 DNA 서열에 의해서 암호화될 수 있다. 서열번호 36, 38 및 40에 의해서 암호화된 인간화된 경쇄의 단백질 서열은 각각 서열번호 35, 37 및 39에 제시되어 있다. 바람직하게는, 인간화된 항-AGE 항체는 본래 항체 특이성을 보유하면서, 인간 서열의 양을 최대화시킨다. 서열번호 29, 31 및 33으로부터 선택된 단백질 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 35, 37 및 39로부터 선택된 단백질 서열을 갖는 경쇄를 함유하는 완전 인간화된 항체가 작제될 수 있다.
특히 바람직한 항-AGE 항체는 뮤린 단클론성 항-AGE 항체를 인간화시킴으로써 수득될 수 있다. 뮤린 단클론성 항-AGE 항체는 서열번호 47에 제시된 중쇄 단백질 서열(가변 도메인의 단백질 서열은 서열번호 52에 제시됨) 및 서열번호 57에 제시된 경쇄 단백질 서열(가변 도메인의 단백질 서열은 서열번호 62에 제시됨)을 갖는다. 바람직한 인간화된 중쇄는 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50 또는 서열번호 51에 제시된 단백질 서열을 가질 수 있다(인간화된 중쇄의 가변 도메인의 단백질 서열은 각각 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56에 제시됨). 바람직한 인간화된 경쇄는 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60 또는 서열번호 61에 제시된 단백질 서열을 가질 수 있다(인간화된 경쇄의 가변 도메인의 단백질 서열은 각각 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65 및 서열번호 66에 제시됨). 바람직하게는, 인간화된 항-AGE 단클론성 항체는 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 51로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60 및 서열번호 61로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 서열을 갖는 경쇄로 구성된다. 이들 단백질 서열로 구성된 인간화된 단클론성 항-AGE 항체는 면역계의 더 양호한 결합 및/또는 개선된 활성으 ㄹ가져서 더 큰 효능을 초래할 수 있다.
비-인간 종으로부터의 항체의 단백질 서열은 서열번호 2에 제시된 서열을 갖는 중쇄의 가변 도메인 또는 서열번호 4에 제시된 서열을 갖는 카파 경쇄를 포함하도록 변형될 수 있다. 비-인간 종은 반려 동물, 예컨대 애완묘 또는 애완견, 또는 가축, 예컨대 소, 말 또는 낙타일 수 있다. 바람직하게는, 비-인간 종은 마우스가 아니다. 말(에쿠우스 카발루스(Equus caballus)) 항체 면역글로불린 감마 4의 중쇄는 서열번호 5의 단백질 서열(EMBL/젠뱅크 수탁 번호(GenBank accession number) AY445518)을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 말(에쿠우스 카발루스) 항체 면역글로불린 델타의 중쇄는 서열번호 6의 단백질 서열(EMBL/젠뱅크 수탁 번호 AY631942)을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 개(캐니스 파밀리아리스(Canis familiaris)) 항체 면역글로불린 A의 중쇄는 서열번호 7의 단백질 서열(젠뱅크 수탁 번호 L36871)을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 개(캐니스 파밀리아리스) 항체 면역글로불린 E의 중쇄는 서열번호 8의 단백질 서열(젠뱅크 수탁 번호 L36872)을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 고양이(펠리스 카투스(Felis catus)) 항체 면역글로불린 G2의 중쇄는 서열번호 9의 단백질 서열(DDBJ/EMBL/젠뱅크 수탁 번호 KF811175)을 가질 수 있거나 포함할 수 있다.
낙타과의 동물, 예컨대 낙타(카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius) 및 카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus)), 라마(라마 글라마(Lama glama), 라마 파코스(Lama pacos) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna)), 알파카(비쿠그나 파코스(Vicugna pacos)) 및 과나코(라마 과니코에(Lama guanicoe))는 다른 포유동물에서 발견되지 않는 독특한 항체를 갖는다. 중쇄 및 경쇄 사량체로 구성된 종래의 면역글로불린 G 항체에 더하여, 낙타과는 또한 경쇄를 함유하지 않고, 중쇄 이량체로서 존재하는 중쇄 면역글로불린 G 항체를 갖는다. 이들 항체는 중쇄 항체, HCAb, 단일-도메인 항체 또는 sdAb로서 공지되어 있고, 낙타과 중쇄 항체의 가변 도메인은 VHH로서 공지되어 있다. 낙타과 중쇄 항체는 중쇄 CH1 도메인이 결여되어 있고, 다른 종에서 발견되지 않는 힌지 영역을 갖는다. 아라비아 낙타(카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius)) 단일-도메인 항체의 가변 영역은 서열번호 10의 단백질 서열(젠뱅크 수탁 번호 AJ245148)을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 아라비아 낙타(카멜루스 드로메다리우스) 사량체 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역은 서열번호 11의 단백질 서열(젠뱅크 수탁 번호 AJ245184)을 가질 수 있거나 포함할 수 있다.
낙타과에 더하여, 중쇄 항체는 또한 연골 어류, 예컨대 상어, 눈가오리(skate) 및 가오리(ray)에서 발견된다. 이러한 유형의 항체는 면역글로불린 신규 항원 수용체 또는 IgNAR로서 공지되어 있고, IgNAR의 가변 도메인은 VNAR로서 공지되어 있다. IgNAR은 각각 1개의 가변 도메인 및 5개의 불변 도메인으로 구성된 2개의 동일한 중쇄 이량체로서 존재한다. 낙타과와 마찬가지로, 경쇄가 존재하지 않는다.
추가적인 비-인간 종의 단백질 서열은 온라인 데이터베이스, 예컨대 인터내셔널 이뮤노제네틱스 인포메이션 시스템(International ImMunoGeneTics Information System)(www.imgt.org), 더 유러피언 바이오인포메틱스 인스티튜트(the European Bioinformatics Institute)(www.ebi.ac.uk), DNA 데이터뱅크 오브 재팬(Databank of Japan)(ddbj.nig.ac.jp/arsa) 또는 더 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(the National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 쉽게 발견될 수 있다.
항-AGE 항체 또는 이의 변종은 서열번호 2 또는 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(이의 번역후 변형 포함)을 포함할 수 있다. 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 가변 영역은 기준 서열에 비해서 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유할 수 있지만, 그 서열을 포함하는 항-AGE 항체는 AGE에 결합하는 능력을 보유한다. 치환, 삽입 또는 결실은 가변 영역 밖의 영역에서 발생할 수 있다.
항-AGE 항체 또는 이의 변종은 서열번호 4 또는 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(이의 번역후 변형 포함)을 포함할 수 있다. 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 가변 영역은 기준 서열에 비해서 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유할 수 있지만, 그 서열을 포함하는 항-AGE 항체는 AGE에 결합하는 능력을 보유한다. 치환, 삽입 또는 결실은 가변 영역 밖의 영역에서 발생할 수 있다.
대안적으로, 항체는 알앤디 시스템스, 인크.(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재; 카탈로그 번호 MAB3247)로부터 입수 가능한 카복시메틸 라이신 MAb(클론 318003)인, 키홀 림펫 헤모사이아닌(CML-KLH)과 접합된 카복시메틸 라이신에 대해서 발생된, 상업적으로 입수 가능한 마우스 항-당화 최종-산물 항체의 상보성 결정 영역을 가질 수 있다.
항체는 대상체의 면역계에 의해서 표적화된 세포를 파괴하게 하는 불변 영역을 가질 수 있거나 포함할 수 있다.
AGE-변형된 단백질의 하나를 초과하는 유형의 AGE에 결합하는 항체의 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
2개의 상이한 에피토프에 대해서 지향되는 항-AGE 항체인 이중 특이적 항체가 또한 사용될 수 있다. 이러한 항체는 하나의 항-AGE 항체의 것으로부터의 가변 영역(또는 상보성 결정 영역), 및 상이한 항체로부터의 가변 영역(또는 상보성 결정 영역)을 가질 것이다.
항체 단편이 전체 항체 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 G는 효소로의 소화에 의해서 더 작은 단편으로 절단될 수 있다. 파파인 소화는 중쇄-간 다이설파이드 브릿지의 N-말단 측면을 절단하여 Fab 단편을 생성시킨다. Fab 단편은 경쇄 및 중쇄의 2개의 N-말단 도메인(Fd 단편이라고도 공지됨) 중 하나를 포함한다. 펩신 소화는 중쇄-간 다이설파이드 브릿지의 C-말단 측면을 절단하여 F(ab')2 단편을 생성시킨다. F(ab')2 단편은 두 경쇄 모두 및 다이설파이드 브릿지에 의해서 연결된 2개의 N-말단 도메인을 포함한다. 펩신 소화는 또한 Fv(단편 가변) 및 Fc(단편 결정성) 단편을 형성할 수 있다. Fv 단편은 2개의 N-말단 가변 도메인을 함유한다. Fc 단편은 세포 상의 면역글로불린 수용체와 상호작용하고, 보체 캐스케이드의 초기 요소와 상호작용하는 도메인을 함유한다. 펩신은 또한 중쇄의 제3 불변 도메인(CH3) 앞에서 면역글로불린 G를 절단하여 큰 단편 F(abc) 및 작은 단편 pFc'를 생성할 수 있다. 항체 단편은 대안적으로는 재조합 방식으로 생산될 수 있다.
추가 항체가 바람직한 경우, 이것은 널리 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 다클론성 항체(pAb)는 면역원, 및 바람직할 경우, 아주반트의 1회 이상의 주사에 의해서 포유동물 숙주에서 발생될 수 있다. 전형적으로, 면역원(및 아주반트)은 피하 또는 복강내 주사에 의해서 포유동물에서 주사된다. 면역원은 세포의 AGE-변형된 단백질, 예컨대 AGE-항트롬빈 III, AGE-칼모듈린, AGE-인슐린, AGE-세룰로플라스민, AGE-콜라겐, AGE-카텝신 B, AGE-알부민, 예컨대, AGE-소 혈청 알부민(AGE-BSA), AGE-인간 혈청 알부민 및 오브알부민, AGE-크리스탈린, AGE-플라스미노겐 활성인자, AGE-내피 세포막 단백질, AGE-알데하이드 리덕타제, AGE-트랜스페린, AGE-피브린, AGE-구리/아연 SOD, AGE-아포 B, AGE-피브로넥틴, AGE-췌장 리보스(pancreatic ribose), AGE-아포 A-I 및 II, AGE-헤모글로빈, AGE-Na+/K+-ATPase, AGE-플라스미노겐, AGE-미엘린, AGE-리소자임, AGE-면역글로불린, AGE-적혈구 Glu 수송 단백질, AGE-β-N-아세틸 헥소미나제, AGE-아포 E, AGE-적혈구 막 단백질, AGE-알도스 리덕타제, AGE-페리틴, AGE-적혈구 스펙트린, AGE-알코올 데하이드로게나제, AGE-합토글로빈, AGE-투불린, AGE-갑상선 호르몬, AGE-피브리노겐, AGE-β2-마이크로글로불린, AGE-소비톨 데하이드로게나제, AGE-α1-항트립신, AGE-카보네이트 데하이드라타제, AGE-RNAse, AGE-저밀도 지질단백질, AGE-헥소카이나제, AGE-아포 C-I, AGE-RNAse, AGE-헤모글로빈, 예컨대 AGE-인간 헤모글로빈, AGE-알부민, 예컨대 AGE-소 혈청 알부민(AGE-BSA) 및 AGE-인간 혈청 알부민, AGE-저밀도 지질단백질(AGE-LDL) 및 AGE-콜라겐 IV일 수 있다. 전체, 용해된, 또는 부분적으로 소화된 AGE-변형된 세포, 예컨대 AGE-변형된 적혈구가 또한 AGE 항원으로서 사용될 수 있다. 아주반트의 예는 프로인트 완전, 모노포스포릴 리피드 A 합성-트레할로스 다이코리노마이콜레이트, 수산화알루미늄(알룸(alum)), 열 충격 단백질 HSP 70 또는 HSP96, 모노포스포릴 리피드 A 함유 스쿠알렌 에멀전, α2-마크로글로불린 및 오일 에멀전, 플레루로닉(pleuronic) 폴리올, 다음이온 및 다이나이트로페놀을 비롯한 표면 활성 물질을 포함한다. 면역 반응을 개선시키기 위해서, 면역원은 숙주에서 면역원성인 폴리펩타이드, 예컨대 키홀 림펫 헤모사이아닌(KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 콜레라 독소, 불안정한 엔테로톡신, 실리카 입자 또는 대두 트립신 저해제에 접합될 수 있다. 바람직한 면역원 접합체는 AGE-KLH이다. 대안적으로, pAb는 닭에서 제조되어, IgY 분자를 생산할 수 있다.
단클론성 항체(mAb)는 또한 숙주 또는 숙주로부터의 림프구를 면역화시키고, mAb-분비(또는 잠재적 분비) 림프구를 수확하고, 이들 림프구를 불멸화된 세포(예를 들어, 골수종 세포)에 융합시키고, 목적하는 mAb를 분비하는 이러한 세포를 선별함으로써 제조될 수 있다. 다른 기술, 예컨대 EBV-하이브리도마 기술이 사용될 수 있다. 인간(또는 다른 동물) 면역글로불린의 불변 도메인의 유전자에 항체의 가변 도메인을 암호화하는 유전자를 스플라이싱함으로써 키메라 항체를 생성하기 위한 기술은 아미노산 수준에서 실질적으로 인간(인간화된) 또는 또 다른 동물(예컨대, 고양이, 개, 말, 낙타 또는 알파카, 소, 양 또는 염소)로 실질적으로 "화된" "키메라 항체"를 생성한다. 바람직한 경우, mAb는 종래의 절차, 예컨대 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 황산암모늄 침전 또는 친화도 크로마토그래피에 의해서 세포 배지 또는 복수 유체로부터 정제될 수 있다. 추가로, 인간 단클론성 항체는 제3 카피 IgG 인간 트랜스-유전자좌 및 사일런싱된 내인성 마우스 Ig 유전자좌를 함유하는 유전자 이식된 마우스의 면역법에 의해서 또는 인간-유전자 이식된 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 인간화된 단클론성 항체 및 이의 단편의 생산은 또한 파지 디스플레이 기술을 통해서 생성될 수 있다.
"약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 투여와 상용성인, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 이러한 담체 및 희석제의 바람직한 예는 물, 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 보조 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 비경구 투여를 위해서 사용되는 용액 및 현탁물은 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염화수소산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알에 담겨있을 수 있다.
주사에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액 또는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 용액 또는 분산액을 포함한다. 주사에 적합한 항체의 약제학적 조성물에 다양한 부형제가 포함될 수 있다. 정맥내 투여를 위해서, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, CREMOPHOR EL(등록상표)(바스프(BASF); 미국 뉴저지주 파시파니 소재) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 주사를 사용하여 투여되도록 멸균되어야 하고, 유체여야 한다. 이러한 조성물은 제조 및 저장 동안 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균으로부터의 오염에 대해서 보존될 수 있어야 한다. 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 및 티메로살은 미생물 오염을 함유할 수 있다. 등장제, 예컨대 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소비톨, 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 흡수를 지연시킬 수 있는 조성물은 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 작용제를 포함한다. 멸균 주사 용액은 항체, 및 임의로는 다른 치료 구성성분을 필요에 따라서 성분 중 하나 또는 성분의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킨 후, 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 고체의 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조시켜 고체를 얻는 것을 포함한다.
흡입에 의한 투여를 위해서, 항체는 적합한 추진제, 예를 들어, 기체, 예컨대 이산화탄소를 함유하는 네블라이저 또는 가압 용기로부터 에어로졸 스프레이로서 전달될 수 있다. 항체는 또한 건조 분말로서, 예를 들어, iSPERSE(상표명) 흡입 약물 전달 플랫폼(풀매트릭스(PULMATRIX), 매사추세츠주 렉싱톤 소재)을 사용하여 흡입을 통해서 전달될 수 있다. 닭 항체(IgY)인 항-AGE 항체의 사용은 흡입에 의해서 투여되는 경우, 인간을 비롯한, 다양한 동물에서 비-면역원성일 수 있다.
국소 적용이 피부에 존재하는 암 및 잠재적으로-악성인 신생물, 예를 들어, 흑색종, 지루 각화증 및 광선 각화증에 효과적일 수 있다. 국소 투여용 조성물은 크림 또는 로션의 형태로 존재할 수 있다.
각각의 유형의 항체의 적절한 투여량 수준은 일반적으로 환자 체중당 약 0.01 내지 500㎎일 것이다. 바람직하게는, 투여량 수준은 약 0.1 내지 약 250㎎/㎏; 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 100㎎/㎏일 것이다. 적합한 투여량 수준은 약 0.01 내지 250㎎/㎏, 약 0.05 내지 100㎎/㎏, 또는 약 0.1 내지 50㎎/㎏일 수 있다. 이러한 범위 내에서, 투여량은 0.05 내지 0.5, 0.5 내지 5 또는 5 내지 50㎎/㎏일 수 있다. 각각의 유형의 항체가 1일당 1 내지 4회, 예컨대 1일당 1회 또는 2회의 요법으로 투여될 수 있지만, 항체는 전형적으로 생체내에서 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 각각의 유형의 항체는 1일 1회, 1주 1회, 2 또는 3주에 1회, 1개월에 1회, 또는 60 내지 90일에 1회 투여될 수 있다.
항-AGE 항체가 투여되는 대상체는 암이 신체의 상이한 부분으로, 특히 림프절 내로 확산되었는지를 관찰함으로써 그것이 암을 치료하는 데 효과적이었는지를 결정하기 위해서 시험될 수 있다. 임의의 적합한 진단 시험, 예컨대 생검, 내시경술, 혈액 검사 도는 진단 영상화 시험, 예컨대 X-선 또는 CT 스캔이 사용될 수 있다. 진단 시험은 또한 검출용 항-AGE 항체를 포함할 수 있다. 목적하는 치료 결과가 달성될 때까지 항체의 투여 및 후속 시험을 반복할 수 있다. 유사하게, 대상체를 시험하여 잠재적으로-악성인 신생물이 신생물의 크기 감소 또는 소멸에 의해서 효과적으로 치료되었는지를 결정한다.
단위 투여형을 생성하여 투여 및 투여량 균일성을 가능하게 할 수 있다. 단위 투여형은 필요한 약제학적 담체와 함께 1종 이상의 유형의 항체의 치료적 유효량을 함유하는, 치료하고자 하는 대상체를 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 개별적인 단위를 지칭한다. 바람직하게는, 단위 투여형은 밀봉된 용기에 존재하고, 멸균되어 있다.
전이성 암이 발생할 수 있는 임의의 포유동물이 본 명세서에 기술된 방법에 의해서 치료될 수 있다. 인간이 치료를 위한 바람직한 포유동물이다. 치료될 수 있는 다른 포유동물은 래트, 염소, 양, 소, 말 및 반려 동물, 예컨대 개 또는 고양이를 포함한다. 치료를 필요로 하는 대상체는 암의 진단에 의해서 식별될 수 있다. 특히 전이되기 쉬운 암은 폐암, 흑색종, 결장암, 신장 세포 암종, 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 직장암, 식도암, 간암, 구강 및 인후암, 다발성 골수종, 난소암, 위암을 포함한다. 치료는 전이성 암을 겪은 환자에 대해서 행해질 수 있다. 치료제는 또한 암을 갖지만, 전이를 예방하기 위해서, 임의의 식별된 전이 이전의 환자에게 투여될 수 있다. 유사하게, 잠재적으로-악성인 신생물이 발생할 수 있는 임의의 포유동물이 본 명세서에 기술된 방법에 의해서 치료될 수 있다. 인간이 치료를 위한 바람직한 포유동물이다. 치료될 수 있는 다른 포유동물은 래트, 염소, 양, 소, 말 및 반려 동물, 예컨대 개 또는 고양이를 포함한다. 치료를 필요로 하는 대상체는 잠재적으로-악성인 신생물의 진단에 의해서 식별될 수 있다.
특히 바람직한 치료군은 종래의 암 치료, 예컨대 수술, 방사선 요법 또는 화학요법이 제공될 수 없는 대상체를 포함한다. 전이성 암을 갖거나 또는 암 전이의 위험을 갖는 환자는 다른 진단, 신체 상태 또는 합병증으로 인해서 특정 암 치료제를 경험할 수 없다. 예를 들어, 임산부는 태아에 대한 유해 위험으로 인해서 방사선 요법이 제공될 수 없다. 고령 또는 약한 환자, 예컨대 암 악액질을 경험한 환자는 침습 시술을 견디지 못할 위험으로 인해서 수술을 위한 양호한 후보자가 아닐 수 있다. 이미 약화된 면역계 또는 만성 감염을 갖는 환자는 화학요법이 제공될 수 없는데, 그 이유는 다수의 화학요법 약물이 면역계에 유해하기 때문이다.
항-AGE 항체는 세포 정제 공정, 예컨대 면역패닝(immunopanning) 및 면역흡착에서 사용될 수 있다. 정제 공정은 조직 배양물, 세포 배양물 또는 혈액으로부터 목적하는 세포 또는 원치않는 세포를 단리하는 데 유용하다. 세포 정제는 이식, 예컨대 골수 이식, 또는 수혈, 예컨대 혈액 수혈에서 사용될 수 있다. 세포 정제는 전이성 악성 세포를 제거하고, 이로운 줄기 세포를 농축시키기 위해서 화학요법 동안 자가 줄기 세포 이식에 특히 유용하다. 항-AGE 항체를 사용하는 면역패닝 또는 면역흡착은 전이중인 암을 조직 배양물, 세포 배양물 또는 혈액 샘플로부터 단리할 수 있다.
항-AGE 항체는 또한 암 전이를 전단하기 위해서 사용될 수 있다. AGE-변형된 단백질을 발현시키는 전이성 암 세포에 결합된 항-AGE 항체를 비롯한 면역 복합체(항체-항원 복합체라고도 공지됨)는 전이성 암을 예측하거나 나타낼 수 있는 독특한 분석물이다. 전이중인 암 세포에 대한 항-AGE 항체의 특이적 결합은 임상미만 수준에서 암 전이의 검출을 가능하게 할 수 있다. 진단성 항-AGE 항체를 사용하여 새로운 위치에서 전이의 위험을 보유한 전이성 암 세포의 순환을 검출할 수 있다. 대안적으로, 진단성 항-AGE 항체를 사용하여 전이성 암 세포의 존재에 대해서 특정 위치로부터 획득된 세포를 시험할 수 있다. 생검은 전이성 암 세포의 축적에 대해서 공지된 위험이 있는 신체의 특정 부분, 예컨대 림프절, 폐, 간, 뇌 또는 뼈로부터 또는 다른 증상, 예컨대 의심스러운 덩어리로 인해서 전이가 의심되는 신체의 부분으로부터 세포를 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 항-AGE 항체는 관심 분석물의 검출을 위해서 항체를 사용하는 임의의 진단 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 복합체는 항체에 표지, 예컨대 형광 표지 또는 방사성표지를 부착한 후 적합한 영상화 기술을 사용하여; 세포학적 기술, 예컨대 면역형광법, 유세포 측정법 또는 형광-활성화 세포 분류법(FACS)을 사용하여; 생화학적 기술, 예컨대 면역검정, 특히 효소-결합 면역흡착 어레이(ELISA), 웨스턴 블롯팅 또는 면역침전을 사용하여; 또는 세포 정제 기술, 예컨대 면역패닝을 사용하여 검출될 수 있다.
도 2는 암 전이의 진단용 키트(200)를 예시한다. 키트는 항-AGE 항체(210), 대조군(220) 및 임의로 항-AGE 항체의 검출용 시약(230)을 포함할 수 있다. 항-AGE 항체, 대조군 및 임의적인 시약은 임의의 적합한 용기, 예컨대 병, 앰플, 봉투, 시험관, 바이알, 플라스크 또는 주사기에 내에 공급될 수 있다. 항-AGE 항체 및/또는 시약은 예컨대, 형광 표지, 방사성표지 또는 금 입자로 임의로 표지될 수 있다. 대조군은 2차 항체가 제조된 동물로부터의 정상 혈청, 알고 있는 양의 AGE-변형된 단백질 또는 펩타이드를 함유하는 용액 또는 AGE 변형물을 나타내는 고정 또는 보존된 세포일 수 있다. 항-AGE 항체를 검출하기 위한 시약의 예는 2차 항체, 예컨대, 당나귀에서 제조되고 로다민으로 표지된 항-인간 다클론성 항체를 포함한다. 키트는 용기(240) 내에 내에 임의로 수용될 수 있다. 키트는 인쇄된 지시서(250)를 임의로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트의 내용물은 멸균되고, 즉시 사용된다.
키트는 키트 성분을 수용하기 위한 용기를 임의로 포함할 수 있다. 용기는 강성의 내구성 재료, 예컨대 플라스틱으로 형성될 수 있거나, 또는 가요성, 예컨대 백 또는 부드러운 면을 갖는 상자일 수 있다.
키트는 사용을 위한 지시서를 임의로 포함할 수 있다. 지시서는 인쇄된 지시서로 또는 전자 포맷으로, 예컨대 범용 직렬 버스(USB) 드라이브 상에, 시큐어 디지털(secure digital: SD) 카드, 또는 인터넷 상의 호스트로 제공될 수 있고, 신속 대응(QR) 코드를 통해서 접근 가능할 수 있다.
키트는 추가 진단 물질 또는 장비, 예컨대 완충제, 고정화제, 차단 용액, 프로테아제 저해제, 분석용 물질, 예컨대, 현미경 슬라이드 및/또는 커버 슬립, 마이크로타이터 플레이트 및 세포 추출 시약, 예컨대 세제 및 세제 용액을 임의로 함유할 수 있다.
서열번호 1에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00001
Figure 112018089134479-pct00002
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상기 아미노산 서열의 위치 16 내지 133은 서열번호 2에 상응한다. 상기 아미노산 서열의 위치 46 내지 50은 서열번호 41에 상응한다. 상기 아미노산 서열의 위치 65 내지 81은 서열번호 42에 상응한다. 상기 아미노산 서열의 위치 114 내지 122는 서열번호 43에 상응한다.
서열번호 3에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00003
Figure 112018089134479-pct00004
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상기 아미노산 서열의 위치 16 내지 128은 서열번호 4에 상응한다. 임의로, 서열번호 4의 위치 128에서의 아르기닌(Arg 또는 R) 잔기는 누락될 수 있다. 상기 아미노산 서열의 위치 39 내지 54는 서열번호 44에 상응한다. 상기 아미노산 서열의 위치 70 내지 76은 서열번호 45에 상응한다. 상기 아미노산 서열의 위치 109 내지 117은 서열번호 46에 상응한다.
서열번호 12에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00005
Figure 112018089134479-pct00006
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서열번호 13에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00007
Figure 112018089134479-pct00008
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서열번호 14에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00009
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서열번호 15에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00010
Figure 112018089134479-pct00011
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서열번호 16에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00012
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상기 아미노산 서열의 위치 123에서의 알라닌 잔기는 세린 잔기로 임의로 대체될 수 있다. 상기 아미노산 서열의 위치 124에서의 알라닌 잔기는 페닐알라닌 잔기로 임의로 대체될 수 있다. 상기 아미노산 서열의 위치 25 내지 142는 서열번호 20에 상응한다. 서열번호 20은 위치 123 및 124에서 치환을 임의로 포함할 수 있다. 서열번호 20은 말단 발린 잔기 이후에 하나의 추가적인 라이신 잔기를 임의로 함유할 수 있다.
서열번호 17에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00013
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서열번호 18에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00014
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상기 아미노산 서열의 위치 21 내지 132는 서열번호 21에 상응한다.
서열번호 19에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00015
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서열번호 22에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
Figure 112018089134479-pct00016
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서열번호 23에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 SYTMGVS이다.
서열번호 24에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 TISSGGGSTYYPDSVKG이다.
서열번호 25에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 QGGWLPPFAX이고, 여기서 X는 임의의 자연 발생 아미노산일 수 있다.
서열번호 26에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 RASKSVSTSSRGYSYMH이다.
서열번호 27에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 LVSNLES이다.
서열번호 28에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 QHIRELTRS이다.
서열번호 29에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure 112018089134479-pct00017
서열번호 30에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같다:
Figure 112018089134479-pct00018
Figure 112018089134479-pct00019
서열번호 31에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 32에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같다:
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서열번호 33에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 34에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같다:
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서열번호 35에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 36에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같다:
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서열번호 37에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 38에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같다:
Figure 112018089134479-pct00030
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서열번호 39에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 40에 상응하는 DNA 서열은 다음과 같다:
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서열번호 47에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 48에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 49에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 50에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 51에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 52에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 53에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 54에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 55에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 56에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 57에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 58에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 59에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 60에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 61에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 62에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 63에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 64에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 65에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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서열번호 66에 상응하는 1-문자 아미노산 서열은 다음과 같다:
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실시예
실시예 1: 항-당화 최종-산물 항체의 투여의 생체내 연구
본 실시예는 항-AGE 항체가 세포 표면 상에서 AGE-변형된 단백질을 갖는 세포를 표적화할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 연구에서 고려되는 세포는 노쇠 세포이지만, 이것은 전이중인 암 세포의 모델로 간주될 수 있다.
항-당화 최종-산물 항체의 효과를 조사하기 위해서, 항체를 노화된 CD1(ICR) 마우스(찰스 리버 래보러토리스(Charles River Laboratories))에 3주 동안(1일, 8일 및 15일), 주 1회, 1일 2회 정맥내 주사에 의해서 투여하였고, 그 다음 10주 미-치료 기간이 존재하였다. 시험 항체는 알앤디 시스템스, 인크.(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재; 카탈로그 번호 MAB3247)로부터 입수 가능한 카복시메틸 라이신 MAb(클론 318003)인, 키홀 림펫 헤모사이아닌과 접합된 카복시메틸 라이신에 대해서 발생된, 상업적으로 입수 가능한 마우스 항-당화 최종-산물 항체였다. 생리 염수의 대조군 표준을 대조군 동물에서 사용하였다.
"젊음"이라고 지칭된 마우스는 8주령이었고, "늙음"이라고 지칭된 마우스는 88주(±2일)령이었다. 항체의 투여로부터 어떠한 부작용도 주목되지 않았다. 본 연구에서 사용된 동물의 상이한 군을 표 1에 나타낸다.
Figure 112018089134479-pct00058
노쇠 세포에 대한 마커인, P16INK4a mRNA를 실시간-qPCR에 의해서 군의 지방 조직에서 정량분석하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 표에서 ΔΔCt = ΔCt 평균 대조군(2) - ΔCt 평균 실험군(1 또는 3 또는 5); 배수 발현(Fold Expression)= 2 -ΔΔCt.
Figure 112018089134479-pct00059
상기 표는 예상된 바와 같이, 미치료 늙은 마우스(대조군 2)가 미치료 젊은 마우스(대조군 1)보다 2.55-배 더 많은 p16Ink4a를 발현시킨다는 것을 나타낸다.　 이는 회복 85일에 안락사시킨 미치료 늙은 마우스인 군 2를 치료 22일에 안락사시킨 미치료 ??은 마우스인 군 1에 비교할 때 관찰되었다. 미치료 늙은 마우스인 군 2로부터의 결과를 85일에 안락사시킨 치료된 늙은 마우스인 군 3으로부터의 결과와 비교하는 경우, p16Ink4a mRNA가 군 3에서보다 군 2에서 1.23-배 더 높은 것이 관찰되었다.　 따라서, p16Ink4a mRNA 발현의 수준은 늙은 마우스를 2.5㎍/그램/BID/주의 항체로 치료하는 경우 더 낮았다.
미치료 늙은 마우스인 군 2(대조군)로부터의 결과를 22일에 안락사시킨 치료된 늙은 마우스인 군 5(5㎍/그램)로부터의 결과와 비교하는 경우, p16Ink4a mRNA가 군 5(5㎍/그램)에서보다 군 2(대조군)에서 3.03-배 더 높은 것이 관찰되었다.　 이러한 비교는, 군 5 동물은, 그것을 5.0㎍/그램/BID/주로 치료하는 경우 p16Ink4a mRNA 발현의 더 낮은 수준을 가졌고, 이는 젊은 미치료 마우스(즉, 군 1)의 것에 대등한 p16Ink4a mRNA 발현 수준을 제공하였다. 　회복 85일에 안락사시킨 군 3(2.5㎍/그램) 마우스와 달리, 군 5 마우스를 치료 22일에 안락사시켰다.
이러한 결과는, 항체 투여가 노쇠 세포의 사멸을 초래하였다는 것을 나타낸다.
비복근(gastrocnemius muscle)의 질량을 또한 측정하여, 근감소증에 대한 항체 투여의 효과를 결정하였다. 결과를 표 3에 제공한다. 결과는 항체의 투여가 대조군과 비교할 때, 5.0㎍/gm/BID/주의 더 높은 투여량에서만 근육량을 증가시켰다는 것을 나타낸다.
Figure 112018089134479-pct00060
이 결과는, 세포의 AGE에 결합하는 항체의 투여가 노쇠의 바이오마커인 p16Ink4a 발현 세포의 감소를 초래하였다는 것을 예증한다. 이 데이터는, 노쇠 세포의 감소는 고령 마우스에서 근육량의 증가로 직접적으로 이어진다는 것을 나타낸다. 이 결과는, 근육감소증의 전통적인 징후인 근육량 감소가 세포의 AGE에 결합하는 항체의 투여에 의해서 치료될 수 있다는 것을 나타낸다. 이 결과는, 이러한 항체의 투여가 뇌소 세포를 제거함으로써 암 전이의 치료에 효과적일 것이라는 것을 시사한다.
실시예 2: 시험 항체의 친화도 및 동역학
Nα,Nα-비스(카복시메틸)-L-라이신 트라이플루오로아세테이트 염(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미조리주 세인트 루이스 소재)을 세포의 AGE-변형된 단백질에 대한 모델 물질로서 사용하여 실시예 1에서 사용된 시험 항체의 친화도 및 동역학을 분석하였다. BIACORE(상표명) T200(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 펜실베니아주 피츠버그 소재) 상에서, 블랭크로서 Fc1 세트 및 시험 항체(분자량 150,000Da)로 고정된 Fc2를 사용하여, 시리즈 S 센서 칩 CM5(지이 헬쓰케어, 미국 펜실베니아주 피츠버그 소재)를 사용하여 무-표지 상호작용 분석을 수행하였다. 전개 완충액(running buffer)은 25℃의 온도에서, HBS-EP 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% P-20, pH 7.4)이었다. 소프트웨어는 BIACORE(상표명) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0이었다. 이중 참조군(Fc2-1 및 완충액 만 주입)을 분석에서 사용하였고, 데이터를 랭뮤어(Langmuir) 1:1 결합 모델에 핏팅하였다.
Figure 112018089134479-pct00061
반응 대 시간의 그래프를 도 1에 도시한다. 하기 값을 분석으로부터 결정하였다: k a (1/Ms) = 1.857 x 103; k d (1/s) = 6.781 x 10-3; K D (M) = 3.651 x 10-6; R최대 (RU) = 19.52; 및 Chi2 = 0.114. 핏팅의 Chi2 값이 R최대의 10% 미만이기 때문에, 핏은 신뢰할 만하다.
실시예 3: 뮤린 항-AGE IgG2b 항체 및 키메라 항-AGE IgG1 항체의 작제 및 생산
뮤린 및 키메라 인간 항-AGE 항체를 제조하였다. 뮤린 항-AGE 항체 IgG2b 중쇄의 DNA 서열은 서열번호 12에 제시되어 있다. 키메라 인간 항-AGE 항체 IgG1 중쇄의 DNA 서열은 서열번호 13에 제시되어 있다. 뮤린 항-AGE 항체 카파 경쇄의 DNA 서열은 서열번호 14에 제시되어 있다. 키메라 인간 항-AGE 항체 카파 경쇄의 DNA 서열은 서열번호 15에 제시되어 있다. 유전자 서열을 합성하였고, 고발현 포유동물 벡터 내에 클로닝하였다. 서열을 코돈 최적화하였다. 완성된 작제물을 서열 확인한 후, 형질주입을 진행하였다.
형질주입 하루 전에 HEK293 세포를 진탕 플라스크에 시딩하고, 무-혈청 화학적으로 규정된 배지(chemically defined media)를 사용하여 성장시켰다. DNA 발현 작제물을 일시적으로 0.03리터의 HEK293 세포의 현탁액에 형질주입시켰다. 20시간 후, 세포를 샘플링하여 생존력 및 생존 가능한 세포 계수치를 얻었고, 역가를 측정하였다(옥텟 오케(Octet QKe), 포르테바이오(ForteBio)). 일시적인 형질주입 생산 실시 전체에서 추가 판독을 수행하였다. 배양물을 5일에 수확하였고, 각각에 대해서 추가 샘플을 세포 밀도, 생존력 및 역가에 대해서 측정하였다.
원심분리 및 여과에 의해서 일시적인 형질주입 생산 실시로부터 뮤린 및 키메라 항-AGE 항체에 대한 컨디셔닝된 배지를 수확 및 여과하였다. 상청액을 단백질 A 칼럼 상에서 통과시키고, 저 pH 완충액으로 용리시켰다. 0.2㎛ 막 필터를 사용한 여과를 수행한 후, 분취하였다. 정제 및 여과 후, OD280 및 흡광 계수로부터 단백질 농도를 계산하였다. 수율 및 분취량의 요약을 표 5에 나타낸다:
Figure 112018089134479-pct00062
랩칩(LabChip)(등록상표) GXII(퍼킨 엘머(PerkinElmer))를 사용하여 모세관 전기영동 소듐-도데실 설페이트(CE-SDS) 분석에 의해서 항체 순도를 평가하였다.
실시예 4: 뮤린(모) 및 키메라 항-AGE 항체
실시예 3에 기술된 뮤린(모) 및 키메라 항-AGE 항체의 결합을 직접 결합 ELISA에 의해서 관찰하였다. 항-카복시메틸 라이신(CML) 항체(알앤디 시스템스, MAB3247)를 대조군으로서 사용하였다. CML을 KLH에 접합시키고(CML-KLH), CML 및 CML-KLH 둘 모두를 ELISA 플레이트 상에 밤새 코팅하였다. HRP-염소 항-마우스 Fc를 사용하여 대조군 및 뮤린(모) 항-AGE 항체를 검출하였다. HRP-염소 항-인간 Fc를 사용하여 키메라 항-AGE 항체를 검출하였다.
항원을 pH 6.5에서 1x 인산염 완충액 중에서 1㎍/㎖로 희석시켰다. 96-웰 마이크로타이터 ELISA 플레이트를 100㎕/웰의 희석된 항원으로 코팅하고, 4ºC에서 밤새 정치시켰다. 플레이트를 1x PBS, 2.5% BSA로 블로킹시키고, 1 내지 2시간 동안 다음날 아침 실온에서 정치시켰다. 항체 샘플을 50㎍/㎖의 출발 농도를 갖는 1x PBS, 1% BSA를 사용하여 연속 희석법으로 제조하였다. 2차 항체를 1:5,000으로 희석시켰다. 100㎕의 항체 희석물을 각각의 웰에 적용하였다. 플레이트를 실온에서 0.5 내지 1시간 동안 마이크로플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 1x PBS로 3회 세척하였다. 100㎕/웰 희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 Fc 2차 항체를 웰에 적용하였다. 플레이트를 1시간 동안 마이크로플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 1x PBS로 3회 세척하였다. 100㎕ HRP 물질 TMB를 각각에 웰에 첨가하여 플레이트를 현상시켰다. 3 내지 5분 경과 후, 100㎕의 1N HCl을 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. CML 코팅 만을 사용하여 제2 직접 결합 ELISA를 수행하였다. OD450에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
CML 및 CML-KLH ELISA에 대한 OD450 흡광도 원 데이터를 하기 플레이트 맵에 나타낸다. 웰 플레이트에서 96웰 중 48개를 사용하였다. 플레이트 맵에서 블랭크 웹은 사용되지 않은 웰을 나타낸다.
Figure 112018089134479-pct00063
CML-단독 ELISA에 대한 OD450 흡광도 원 데이터를 하기 플레이트 맵에 나타낸다. 웰 플레이트에서 96웰 중 24개를 사용하였다. 플레이트 맵에서 블랭크 웹은 사용되지 않은 웰을 나타낸다.
Figure 112018089134479-pct00064
대조군 및 키메라 항-AGE 항체는 CML 및 CML-KLH 둘 모두에 대한 결합을 나타내었다. 뮤린(모) 항-AGE 항체는 CML 또는 CML-KLH에 대해서 매우 약한 결합 내지 비결합을 나타내었다. 반복된 ELISA로부터의 데이터는 CML에 대한 대조군 및 키메라 항-AGE의 결합을 확인해준다. 모든 완충액 대조군은 음성 신호를 나타내었다.
실시예 5: 인간화된 항체
모(마우스) 항체 서열의 선택된 부분과 인간 프레임워크 서열을 융합시킨 다중 혼성 서열을 생성함으로써 인간화된 항체를 설계하였다. 프레임워크 전반의 전체 서열 동일성, 일치하는 인터페이스 위치, 유사하게 분류된 CDR 정규 위치, 및 제거되어야 할 N-글리코실화 부위의 존재를 기반으로 억셉터 프레임워크를 식별하였다. 3종의 인간화된 경쇄 및 3종의 인간화된 중쇄를 2종의 상이한 중쇄 및 경쇄 인간 억셉터 프레임워크를 기반으로 설계하였다. 중쇄의 아미노산 서열이 서열번호 29, 31 및 33에 제시되어 있고, 이들은 각각 서열번호 30, 32 및 34에 제시된 DNA 서열에 의해서 암호화되어 있다. 경쇄의 아미노산 서열이 서열번호 35, 37 및 39에 제시되어 있고, 이들은 각각 서열번호 36, 38 및 40에 제시된 DNA 서열에 의해서 암호화되어 있다. 인간화된 서열을 육안 및 컴퓨터 모델링에 의해서 계통적으로 분석하여 항원 결합을 유지할 가능성이 가장 높은 서열을 단리하였다. 목표는 본래 항체 특이성을 보유하면서 최종 인간화된 항체에서 인간 서열의 양을 최대화시키는 것이었다. 인간화된 경쇄 및 중쇄를 조합하여 9종의 변종 완전 인간화된 항체를 생성할 수 있다.
3종의 중쇄 및 3종의 경쇄를 분석하여 이들의 인간성을 결정하였다. 항체 인간성 점수를 문헌[Gao, S. H., et al., "Monoclonal antibody humanness score and its applications", BMC Biotechnology, 13:55 (July 5, 2013)]에 기술된 방법에 따라서 계산하였다. 인간성 점수는 항체 가변 영역 서열이 얼마나 인간-유사하게 보이는 지를 나타낸다. 중쇄의 경우 79 이상의 점수가 인간-유사함을 나타내고; 경쇄의 경우 86 이상의 점수가 인간-유사함을 나타낸다. 3종의 중쇄, 3종의 경쇄, 모(마우스) 중쇄 및 모(마우스) 경쇄의 인간성을 하기 표 6에 나타낸다:
Figure 112018089134479-pct00065
먼저 가변 영역 서열을 합성함으로써 전장 항체 유전자를 작제하였다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해서 서열을 최적화시켰다. 이어서 이들 가변 영역 서열을 인간 Fc 도메인을 이미 함유하는 발현 벡터 내에서 클로닝시켰고; 중쇄의 경우, IgG1을 사용하였다.
중쇄 및 경쇄에 대한 플라스미드를 혈청의 부재 하에서 화학적으로 규정된 배지를 사용하여 현탁액 HEK293 세포 중에 형질주입시킴으로써 인간화된 항체의 소규모 생산을 수행하였다. 컨디셔닝된 배지 중의 전체 항체를 맵셀렉트 수레(MabSelect SuRe) 단백질 A 배지(지이 헬쓰케어)를 사용하여 정제하였다.
서열번호 29, 31 및 33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3종의 중쇄 및 서열번호 35, 37 및 39에 제시된 아미노산 서열을 갖는 3종의 경쇄의 각각의 조합물로부터 9종의 인간화된 항체를 생산하였다. 비교 키메라 모 항체를 또한 제조하였다. 항체 및 이의 각각의 역가를 하기 표 7에 나타낸다:
Figure 112018089134479-pct00066
예를 들어, 용량-의존성 결합 ELISA 또는 세포-기반 결합 검정법에 의해서 인간화된 항체의 결합을 평가할 수 있다.
실시예 6(예측적): 전이성 암 세포의 사멸, 및 전이성 암의 치료
인간 난소 암 세포의 응집물(크리에이티브 바이오어레이(Creative BioArray)(미국 뉴욕주 셔레이 소재))을 T 및 B 세포의 2개의 군(A 및 B)-결핍 prkdcscid(SCID) 마우스, 구체적으로 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories)(미국 코네티컷주 파밍톤 소재)로부터 입수 가능한 NSG 마우스에 i.p.로 접종하였다. 군 A는 생리 염수가 정맥내로 주사된 대조군이고, 군 B을 기술된 항-AGE 단클론성 항체 중 임의의 것이 마우스 그램당 5㎍으로 정맥내로 주사한다.
암 세포 접종 80일 후, 군 A 및 B 둘 모두로부터의 마우스에서 육안 조사 및 조직학적 조사를 수행한다. 항체-처리군 B 마우스는 군 A 대조군 마우스보다 상당히 더 적은 전이성 병소를 갖는다.
실시예 6: 카복시메틸 라이신 단클론성 항체의 투여의 생체내 연구
종양 성장, 전이 가능성 및 악액질에 대한 카복시메틸 라이신 항체의 효과를 조사하였다. 뮤린 유방암 종양 모델을 사용하여 마우스에서 생체내 연구를 수행하였다. 암컷 BALB/c 마우스(BALB/cAnNCrl, 챨스 리버(Charles River))는 연구 1일에 11주령이었다.
4T1 뮤린 유방 종양 세포(ATCC CRL-2539)를 10% 우태아 혈청, 2mM 글루타민, 25㎍/㎖ 젠타마이신, 100단위/㎖ 페니실린 G Na 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 황산염을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 배양하였다. 종양 세포를 37℃에서 5% CO2 및 95% 공기의 분위기에서 가습 인큐베이터 내의 조직 배양 플라스크 내에 유지시켰다.
이어서 배양된 유방암 세포를 마우스에 이식하였다. 4T1 세포를 대수 증식기 동안 수거하고, 이식일에 1x106개 세포/㎖의 농도로 인산염 완충 염수(PBS) 중에 재현탁하였다. 1 x 105개 4T1 세포(현탁액 0.1㎖)를 각각의 시험 동물의 우측 옆구리에 피하로 이식함으로써 종양을 개시시켰다. 종양의 체적이 80 내지 120㎣의 표적 범위에 접근할 때 종양을 모니터링하였다. 하기 식을 사용하여 종양 체적을 결정하였다: 종양 체적 = (종양 폭)2(종양 길이)/2. 1㎣의 종양 체적이 1㎎의 중량을 갖는다는 가정을 사용하여 종양 중량의 근사치를 계산하였다. 연구 1일로서 지정된 이식 13일 후, 마우스를 108 내지 126㎣ 범위의 개별 종양 체적 및 112㎣의 군 평균 종양 체적을 갖는 4개의 군(n=15/군)으로 분류하였다. 4개의 치료군을 하기 표 8에 나타낸다:
Figure 112018089134479-pct00067
항-카복시메틸 라이신 단클론성 항체를 치료제로서 사용하였다. 250㎎의 카복시메틸 라이신 단클론성 항체를 알앤디 시스템즈(R&D Systems)(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터 입수하였다. 카복시메틸 라이신 단클론성 항체의 투여 용액을 비히클(PBS) 중에서 1 및 0.5㎎/㎖로 제조하여 각각 10㎖/㎏의 투여 부피 중의 10 및 5㎍/g의 활성 투여량을 제공하였다. 투여 용액을 광으로부터 보호하면서 4℃에서 저장하였다.
모든 치료제는, 연구 1일에 마우스에게 1회 용량을 투여한 것을 제외하고는, 21일 동안 1일 2회 정맥내(i.v.)로 투여되었다. 연구 19일에, 꼬리 정맥 절단으로 인해서 i.v. 투여될 수 없는 동물의 경우에는 i.v. 투여를 복강내(i.p.) 투여로 변경하였다. 투여 체적은 체중 20그램당 0.200㎖(10㎖/㎏)였고, 각각의 개별 동물의 체중에 따라서 조정되었다.
연구를 23일 동안 계속하였다. 종양을 캘리퍼스를 사용하여 주 2회 측정하였다. 연구가 완결될 때까지 동물의 체중을 1일 내지 5일에는 매일, 이어서 주 2회 매일 칭량하였다. 동물을 또한 임의의 부작용에 대해서 관찰하였다. 허용 가능한 독성은 연구 동안 20% 미만의 군 평균 체중 감소 및 10% 이하의 치료-관련 사망으로서 정의되었다. 연구 최종일(23일)로부터의 데이터를 사용하여 치료 효능을 결정하였다.
군 1 내지 3에 대한 평균 종양 체적(MTV)을 비교함으로써 종양 성장을 저해하는 항-카복시메틸 라이신 항체의 능력을 결정하였다. 상기에 기술된 바와 같이 종양 체적을 측정하였다. 종양 성장 저해 백분율(TGI%)은 대조군(군 1)의 MTV와 약물-치료군의 MTV 간의 차이로서 정의되며, 대조군의 MTV의 백분율로서 표현되었다. TGI%는 하기 수학식에 따라서 계산될 수 있다: TGI% = (1-MTV치료군/MTV대조군) x 100. 도 3은 종양 성장, 전이 가능성 및 악액질에 대한 항-AGE 항체의 효과를 조사하는 생체내 연구의 기간에 걸친 정규화된 종양 체적의 그래프를 도시한다.
군 1 내지 3에 대해서 폐암 병소를 비교함으로써 암 전이를 저해하는 항-카복시메틸 라이신 항체의 능력을 결정하였다. 저해 백분율(저해%)은 대조군의 전이성 병소의 평균 계수치와 약물-치료군의 전이성 병소의 평균 계수치로서 정의되며, 대조군의 전이성 병소의 평균 계수치의 백분율로서 표현되었다. 저해%는 하기 수학식에 따라서 계산될 수 있다: 저해% = (1-병소치료군의 평균 계수치/병소대조군의 평균 계수치) x 100.
군 1 내지 3에 대한 폐 및 비복근의 중량을 비교함으로써 악액질을 저해하는 항-카복시메틸 라이신 항체의 능력을 결정하였다. 조직 중량을 또한 100g 체중에 정규화하였다. 도 4는 종양 성장, 전이 가능성 및 악액질에 대한 항-AGE 항체의 효과를 조사하는 생체내 연구의 기간에 걸친 정규화된 마우스의 체중의 그래프를 도시한다.
연구 동안 관찰된 퇴행 반응의 사건 및 정도에 의해서 치료 효능을 또한 평가하였다. 치료는 동물에서 부분적인 퇴행(PR) 또는 완전한 퇴행(CR)을 유발하였다. PR 반응에서, 종양 체적은 연구 과정 동안 3개의 연이은 측정치의 경우 1일 부피의 50% 이하였고, 이러한 3개의 측정치 중 하나 이상의 경우 13.5㎣ 이상이었다. CR 반응에서, 종양 체적은 연구 과정 동안 3개의 연이은 측정치의 경우 13.5㎣ 미만이었다.
윈도우 6.07용 프리즘(Prism)(그래프패드(GraphPad))을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 두 군의 23일 평균 종양 체적(MTV) 간의 차이의 통계학적 분석은 만-휘트니 U 시험(Mann-Whitney U test)을 사용하여 성취하였다. 전이성 병소의 비교는 ANOVA-Dunnett에 의해서 평가하였다. 정규화된 조직 중량을 ANOVA에 의해서 비교하였다. 양측 통계학적 분석을 P = 0.05의 유의 수준에서 수행하였다. 결과를 통계학적으로 유의함 또는 통계학적으로 유의하지 않음으로 분류하였다.
연구 결과를 하기 표 9에 나타낸다:
Figure 112018089134479-pct00068
모든 치료 요법은 치료-관련 사망이 없이 허용 가능하게 용인되었다. 유일한 동물 사망은 전이로 인한 미-치료-관련된 사망이었다. TGI%는 5㎍/g(군 2) 및 10㎍/g 치료군(군 3)의 경우 유의성(P > 0.05, 만-위트니)의 경향성이 있었다. 저해%는 5㎍/g 치료군의 경우 유의성(P > 0.05, ANOVA-Dunnett)의 경향성이 있었다. 저해%는 10㎍/g 치료군에 대해서 통계학적으로 유의하였다(P < 0.01, ANOVA-Dunnett). 카복시메틸 라이신 항체의 악액질을 치료하는 능력은 치료군과 대조군 간의 폐 및 비복근의 기관 중량의 비교를 기반으로 유의성(P > 0.05, ANOVA)의 경향성이 있었다. 이 결과는, 항-카복시메틸 라이신 단클론성 항체의 투여가 암 전이를 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 전이성 암의 진단(예측적)
유방암을 갖는 환자는 비대해진 림프절을 나타낸다. 종양학자는 유방암이 그녀의 림프절로 전이되었다고 의심한다. 종양학자는 그녀의 비대해진 림프절로부터 혈액샘플뿐만 아니라 생검물을 입수한다. 혈액 샘플 및 생검물로부터의 세포를 형광-표지된 항-AGE 항체 및 대조군을 함유한 키트를 사용하여 AGE-변형된 암 세포의 존재에 대해서 시험한다. 진단 시험은 환자의 혈액 중에서 순환하는 AGE-변형된 암 세포의 존재뿐만 아니라 림프절에서 전이성 유방암 세포의 존재를 나타낸다. 미국 특허 제7,541,150호(밀러 등)에 기술된 바와 같이, 널리 공지된 암 마커인 세포-표면 뉴클레오린에 대한 세포의 제2 염색은 암성 세포의 존재를 확인해준다.
참고 문헌
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SEQUENCE LISTING <110> Lewis S. Gruber <120> METHOD AND COMPOSITION FOR TREATING CANCER, KILLING METASTATIC CANCER CELLS AND PREVENTING CANCER METASTASIS <130> SIW01-013-WO <160> 66 <210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified Homo sapiens immunoglobulin G1 heavy chain <400> 1 Met Asn Leu Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Val Ala Gln 1 5 10 15 Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 20 25 30 Val Lys Leu Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Thr Tyr Trp 35 40 45 Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 50 55 60 Glu Ile Ser Pro Thr Asn Gly Arg Ala Tyr Tyr Asn Ala Arg Phe Lys 65 70 75 80 Ser Glu Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met 85 90 95 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110 Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val Ser Val Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 130 135 140 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 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atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60 ctgagctacg gccaggtgca gctggtgcag tctggcgccg aagtgaagaa acctggcgcc 120 tccgtgaggt gtcctgcaag gcttccggct acctgttcac cacctactgg atgcactggg 180 tgcgacaggc ccctggacag ggcctggaat ggatgggcga gatctcccct accaacggca 240 gagcctacta caacagaaat tccagggcag agtgaccatg accgtggaca agtccaccaa 300 caccgtgtac atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc 360 tagagcctac ggcaactacg attcgcctac tggggccagg gcaccctcgt gacagtgtcc 420 tctgctagca ccaagggccc cagcgtgttc cctctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 480 ggcggaaccg ccgccctggg ctgcctggga aggactactt ccccgagccc gtgaccgtgt 540 cctggaacag cggcgctctg accagcggag tgcacacctt ccctgccgtg ctgcagagca 600 gcggcctgta ctccctgagc agcgtggtga ccgtgccagc agcagcctgg gcacccagac 660 ctacatctgc aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc 720 taagagctgc gacaagaccc acacctgccc tccctgcccc gccccgagct gctgggcgga 780 cccagcgtgt tcctgttccc tcccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccgcaccccc 840 gaggtgacct gcgtggtggt 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Claims (39)

  1. 대상체에서 전이성 암을 치료하고/하거나 암 전이를 예방하기 위한 항-AGE 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 항-AGE 항체는 카복시메틸라이신-변형된 단백질에 결합하는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체는 인간, 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말, 개 및 고양이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-AGE 항체는 인간, 고양이, 개, 말, 낙타, 알파카, 소, 양 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 종에 대해서 비-면역원성인, 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체는 전이성 암을 갖는 것인, 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체는 전이성 암을 갖지 않는 것인, 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 단위 투여형(unit dosage form)인, 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 상기 대상체는 인간이고;
    (b) 상기 항-AGE 항체는 인간, 고양이, 개, 말, 낙타, 알파카, 소, 양 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 종에 대해서 비-면역원성이며;
    (c) 상기 대상체는 전이성 암을 가지고;
    (d) 상기 조성물은 단위 투여형인 것인, 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 다회 투여형(multidosage form)인, 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 멸균된 것인, 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 상기 항-AGE 항체는 AGE 변형물을 발현시키는 전이성 암 세포에 결합하는 것인, 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 상기 항-AGE 항체는 AGE 변형물을 발현시키는 순환 세포에 결합하는 것인, 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체는 임산부인, 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체는 암 악액질(cancer cachexia)을 갖는 것으로 이미 진단된 것인, 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체는 약화된 면역계(compromised immune system)를 갖는 것인, 조성물.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전이성 암은 전이성 유방암인, 조성물.
  18. 대상체에서 유방암을 치료하고/하거나 유방암을 예방하기 위한 항-AGE 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 항-AGE 항체는 카복시메틸라이신-변형된 단백질에 결합하는 것인, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는, 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 대상체는 인간, 염소, 양, 소, 말, 개 및 고양이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 조성물.
  22. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 항-AGE 항체는 인간, 고양이, 개, 말, 낙타, 알파카, 소, 양 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 종에 대해서 비-면역원성인, 조성물.
  23. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 대상체는 유방암을 갖는 것인, 조성물.
  24. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 대상체는 유방암을 갖지 않는 것인, 조성물.
  25. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 조성물은 단위 투여형(unit dosage form)인, 조성물.
  26. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 조성물은 다회 투여형(multidosage form)인, 조성물.
  27. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 조성물은 멸균된 것인, 조성물.
  28. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 상기 항-AGE 항체는 AGE 변형물을 발현시키는 유방암 세포에 결합하는 것인, 조성물.
  29. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 대상체는 임산부인, 조성물.
  30. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 대상체는 암 악액질(cancer cachexia)을 갖는 것으로 이미 진단된 것인, 조성물.
  31. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 대상체는 약화된 면역계(compromised immune system)를 갖는 것인, 조성물.
  32. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    (a) 상기 대상체는 인간이고;
    (b) 상기 항-AGE 항체는 인간에 대해서 비-면역원성이며;
    (c) 상기 대상체는 유방암을 가지고;
    (d) 상기 조성물은 단위 투여형인 것인, 조성물.
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