KR20070094950A - 3,4-ｄｇｅ에서 유래하는 ａｇｅ에 특이적으로 반응하는항체 - Google Patents

3,4-ｄｇｅ에서 유래하는 ａｇｅ에 특이적으로 반응하는항체 Download PDF

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가부시끼가이샤 제이엠에스
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Abstract

본 발명은 단백질이나 펩티드와의 반응성이 강한 카르보닐 화합물 유래의 AGE 항체를 제공하고 상기 카르보닐 화합물 유래 AGE의 검출 방법을 제공한다. 3,4-디데옥시글루코손-3-엔(3,4-DGE)과 단백질을 반응시켜, 그 반응 생성물 AGE를 숙주 동물에게 면역 감작하여, 상기 숙주 동물에게서 회수한 혈청으로부터 상기 반응 생성물 AGE에 대한 항체(항AGE 항체)를 단리한다. 이 단리한 항AGE 항체와 시료를 반응시켜, 상기 시료 중의 AGE와 항AGE 항체와의 항원 항체 반응을 검출함으로써, 상기 시료 중에 있어서의 AGE의 유무 또는 함량을 검출할 수 있다.

Description

3,4-ＤＧＥ에서 유래하는 ＡＧＥ에 특이적으로 반응하는 항체{ANTIBODY REACTIVE SPECIFICALLY TO AGE DERIVED FROM 3,4-DGE}
본 발명은 후기 당화 반응 생성물(AGE: advanced glycation endproduct)에 대한 항체 및 이것을 이용한 AGE의 검출 방법에 관한 것이다.
단백질 당화 반응(메일라드 반응)은 아미노산, 펩티드, 단백질의 아미노기와, 케톤이나 알데히드(특히 환원당)와의 비효소적 반응이며, 전기 단계와 후기 단계의 2 개의 반응으로 나뉜다. 전기 단계의 반응은 가역 반응이며, 예컨대, 아미노기와 환원당이 반응하여 쉬프 염기를 형성하고, 이어서 분자내 전이 반응에 의해 아마도리 화합물을 형성하기까지의 반응이다. 한편, 후기 단계의 반응은 불가역 반응이며, 상기 아마도리 화합물이 전이나 축합 등의 복잡한 반응 과정을 추가로 거쳐, 후기 당화 반응 생성물(AGE)이라 불리는 안정한 물질을 형성하는 반응이다. 상기 AGE로서는, 예컨대 카르복시메틸리신(CML), 펜토시딘, 피랄린, 크로스라인 등이 알려져 있지만, 생체 내에는 구조가 밝혀져 있지 않은 미지의 AGE가 다종 존재하고 있는 것으로 생각되고 있다.
최근, 상기 메일라드 반응의 생성물은 의학 영역에서 주목을 받고 있으며, 여러 가지 병, 질환, 노화와의 관련성이 발표되어 있다. 그 중에서도, 공지의 AGE 는 단백질의 기능을 저하시킬 뿐만 아니라, 세포 장해성이나 염증 반응을 유발한다는 것이 알려져 있고, 또한, AGE의 형성에 의해서, 단백질이 응집, 불용화하여 조직 중에 이상 축적하고, 이에 따라 조직을 변성시키는 것으로 생각되고 있다. 또한, 당뇨병 환자에게 있어서의 헤모글로빈 A1C(전기 반응의 아마도리 화합물)의 상승, 당뇨병성신증이나 만성신부전의 신장 또는 동맥경화 병변부에 있어서의 AGE의 축적은, 생체 내에서의 단백 당화 반응의 대표적인 예로서 알려져 있다.
전술한 것과 같은 메일라드 반응 생성물의 측정에는, 고속 액체 크로마토그래피나 가스 크로마토그래피 외에 면역학적인 측정 방법이 알려져 있다. 그 중에서도, 간편하고 또한 특수한 분석 기기를 필요로 하지 않는 등의 이유에 의해, 면역학적 검출 방법, 구체적으로는 면역조직학적 방법, 효소면역학적 측정 방법 등이 의학 분야에서의 연구나 임상 진단에서 널리 사용되고 있다. 이 때문에, 당화 단백질이나 AGE에 특이적으로 반응하는 항체가 각종 제작되어 있다. 구체적으로는, CML, 펜토시딘, 크로스라인, 피랄린에 대한 항체가 조제되어, 노화, 당뇨병, 신증 등의 질환 동물의 조직에 있어서의 면역학적 연구가 보고되어 있다(예컨대, 비특허문헌 1, 비특허문헌 2, 비특허문헌 3, 비특허문헌 4, 비특허문헌 5). 또한, 항CML 항체를 당뇨병 마커로서 이용하는 방법(특허문헌 1)이나, AGE인 Nδ-(5-하이드록시-4,6-디메틸피리미딘-2-일)오르티닌에 대한 모노클로날 항체(특허문헌 2)도 보고되어 있다.
그런데, 상기 메일라드 반응의 전기 단계나 생체 내에서의 당질의 대사분해, 환원당의 열분해 등에 있어서, 환원당이 분해하여, 3-데옥시글루코손(3-DG), 메틸 글리옥살, 글리옥살 등의 카르보닐 화합물의 생성이 확인되고 있다. 이들 3-DG, 메틸글리옥살, 글리옥살은 단백질과의 반응성이 풍부하고, 전술한 것과 같은 AGE 생성에 관여하는 강력한 매개체(이하 「AGE 전구체」라고도 함)임이 보고되어 있다. 그리고, 이들 카르보닐 화합물에서 유래하는 AGE가 혈액 투석 환자의 혈액 내에 다량으로 존재함으로써, 투석 합병증과의 관련성이 추측되고 있다(비특허문헌 6, 비특허문헌 7).
이와 같이, 환원당의 분해 생성물은, AGE 생산의 원인 물질로서 주목을 모으고 있으며, 연구가 진행되고 있다. 그러나, 환원당의 분해 경로는 복잡하며, 매우 다종 다양한 카르보닐 화합물을 생성한다는 것이 알려져 있지만, 실제로 어떠한 카르보닐 화합물이 AGE 생성에 관여하고 있는 것인지, 또, 이들 카르보닐 화합물에서 유래하는 AGE가 명확하게 되어 있지 못한 것이 많다. 따라서, AGE 정량을 비롯한 AGE의 연구에는, 구조가 명확하게 되어 있는 AGE, 특히 CML로 대용되는 것이 일반적이었다.
<비특허문헌 1>
Schleicher, E. D. et al., J. Clin. Invest. 99, 457, 1997
<비특허문헌 2>
Sanaka, T. et al., Nephron 91, 64, 2002
<비특허문헌 3>
Obayashi, H. et al., Biochem. Biophys. Res Commun. 226, 37, 1996
<비특허문헌 4>
Miyata, S. and Monnier, V., J. Clin. Invest. 89, 1102, 1992
<비특허문헌 5>
Hayase, F. et al., J. Biol. Chem. 263, 3758, 1989
<비특허문헌 6>
다케우치 마사요시 외, 일본임상 60권, 증간호 8, 2002년, 일본임상사
<비특허문헌 7>
Takeuchi, M. et al., Molecular Medicine 7, 783, 2001
<특허문헌 1>
일본 특허 공개 평9-178740호 공보
<특허문헌 2>
일본 특허 공개 평11-246599호 공보
<발명의 개시>
<발명이 해결하고자 하는 과제>
이 때문에, 의료의 분야에서는, 생체 내에 축적하고, 또 생물 활성을 갖는, 여러 가지 병이나 질환의 원인이 될 수 있는 새로운 AGE를 해석ㆍ측정하는 방법이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 단백질이나 펩티드와의 반응성이 강한, 즉 AGE 생산능이 높은 카르보닐 화합물을 특정하여, 상기 카르보닐 화합물에 기인하는 AGE의 항체를 제공하고, 또한, 상기 항체를 이용한 상기 AGE의 검출 방법을 제공하는 것이다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명의 항체는, 후기 당화 반응 생성물(AGE)에 대한 항체로서, 상기 AGE가 3,4-디데옥시글루코손-3-엔(3,4-DGE)과 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물인 것을 특징으로 한다.
<발명의 효과>
본 발명자들은, 예의 연구를 거듭한 결과, 글루코스로부터 생기는 카르보닐 화합물(3,4-DGE)이, 공지의 AGE 전구체(즉, 단백질 등의 AGE화 원인 물질이 되는 카르보닐 화합물 등)와 비교하여, 단백질과의 반응성이 매우 높고, 생체 기능에 미치는 영향이 큰 것을 알아냈다. 그리고, 이 지견에 기초하여, 상기 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물에 대한 항체를 제작하여, 본 발명을 완성시키기에 이른 것이다. 이와 같이 본 발명의 항체는 3,4-DGE와 단백질 등과의 반응 생성물을 특이적으로 인식하는 항체이기 때문에, 생체 기능에 미치는 영향이 크다고 생각되는 3,4-DGE 유래의 AGE를 효율적으로 검출하는 것이 가능하다. 이 때문에, 상기 3,4-DGE 유래의 AGE가 관여한다고 추측되는 후술하는 각종 질환의 진단이나 치료에 유용하다고 생각된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 있어서, 항3,4-DGE-RSA 항체의 결합 상수를 구하기 위한 그래프이다.
도 2의 (A) 및 (B)는 본 발명의 다른 실시예에 있어서의, 항3,4-DGE-RSA 항체의 반응 특이성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서의, 항3,4-DGE-RSA 항체의 웨스턴 블로팅 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 인간 복막 중피 세포를 3,4-DGE에 폭로한 후, 항3,4-DGE-RSA 항체와의 항원 항체 반응을 행한 결과를 나타내는 사진이며, (a)는 대조군이고, (b) 및 (c)가 실시예의 결과이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 래트 복강을 투석액에 폭로한 후, 항3,4-DGE-RSA 항체와의 항원 항체 반응을 행한 결과를 나타내는 사진이며, (A)는 대조군, (B)는 2 μM의 3,4-DGE 함유 투석액, (C)는 58 μM의 3,4-DGE 함유 투석액을 각각 사용한 결과이다.
도 6의 (A) 및 (B)는 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서의, 항3,4-DGE-RSA 항체의 반응 특이성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 상기 실시예에 있어서, 항3,4-DGE-RSA 항체의 결합 상수를 구하기 위한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서의, 항3,4-DGE-RS 항체와, 3,4-DGE 및 단백질의 반응 시간이 다른 AGE화 단백질과의 반응성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 참고예에 있어서, 3,4-DGE와 단백질과의 반응액의 정색을 나타내는 사진이다.
도 10은 상기 참고예에 있어서, 3,4-DGE와 단백질과의 반응에 있어서의, 경시적인 형광 강도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 상기 참고예에 있어서, 3,4-DGE와 단백질과의 반응 생성물에 관한, Arg 잔기 및 Lys 잔기의 잔존율의 경시적 변화를 나타내는 그래프이며, (A)가 Arg 잔기의 잔존율, (B)가 Lys 잔기의 잔존율을 나타낸다.
도 12는 상기 참고예에 있어서, 3,4-DGE와 단백질과의 반응 생성물에 관한 등전점의 경시적 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13은 상기 참고예에 있어서, 3,4-DGE와 단백질과의 반응 생성물에 관한 SDS-PAGE의 경시적 변화를 나타내는 그래프이며, (A)가 3,4-DGE의 결과, (B)가 MGO의 결과이다.
도 14는 본 발명의 다른 참고예에 있어서, 각종 카르보닐 화합물의 단백질에 대한 반응성을 나타내는 그래프이다.
도 15는 본 발명의 또 다른 참고예에 있어서, 각종 카르보닐 화합물과 단백질의 생성물에 관한 세포 독성을 나타내는 그래프이다.
도 16은 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서의, 항3,4-DGE-RSA 항체의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내는 사진이다.
도 17은 본 발명의 또 다른 실시예에 있어서의, 항3,4-DGE-RSA 항체의 웨스턴 블로팅의 결과를 도시하는 사진이다.
본 발명의 항AGE 항체는, 상술한 바와 같이, 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물 AGE에 대한 항체이다.
그리고, 본 발명의 항AGE 항체는, 예컨대 공지의 AGE 전구체인 메틸글리옥살(MGO), 글리옥살(GO), 3-데옥시글루코손(3-DG), 5-히드록시메틸-푸르푸랄(5-HMF), 푸르푸랄(Fur), 포름알데히드(FA), 글루코스(Glu), 아세트알데히드(AA) 등의 카르보닐 화합물 유래의 AGE, 특히 상기 카르보닐 화합물과 단백질 또는 펩티드의 반응 생성물에 반응하지 않고, 또한 공지의 AGE인, 펜토시딘 잔기 및 카르복시메틸리신(CML) 잔기 중 적어도 한 쪽을 갖는 단백질이나 펩티드에도 반응하지 않는 것이 바람직하다.
이하에 본 발명의 항AGE 항체의 조제 방법의 일례에 관해서 설명한다.
(1) 항원(면역원)이 되는 AGE의 조제
3,4-DGE와 단백질(또는 펩티드, 이하 동일)을 메일라드 반응시킴으로써, AGE를 조제한다. 후술하는 참고예 1에도 나타내는 바와 같이, 3,4-DGE는 AGE화에 관여하는 메틸글리옥살(MGO), 글리옥살(GO), 3-데옥시글루코손(3-DG) 등의 공지의 AGE 전구체에 비해서 단백질에 대한 반응성이 매우 높다. 이 때문에, 3,4-DGE와 단백질을 혼합하여 항온처리(incubate)하면, 3,4-DGE에 의한 단백질의 AGE화가 발생하여, 반응 생성물 AGE를 얻을 수 있다.
AGE화의 유무는 통상 3,4-DGE와 단백질과의 반응액이 갈색을 띠는지의 여부에 의해서 판단할 수 있으며, 그 진행은 갈색의 농도 변화에 의해서 판단할 수 있다. 한편, 상기 반응액의 갈색화에 대해서는 참고예에서 후술한다(도 9 참조). 또한, 3,4-DGE에 의한 단백질의 AGE화에 따라서, 반응 생성물은 형광을 띠므로, 예컨대, 형광 강도에 의해서 판단할 수도 있다. 형광 강도의 측정 조건은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 여기 파장 320∼370 nm, 형광 파장 400∼470 nm이며, 여기 파장 345 nm, 형광 파장 425 nm가 바람직하다.
3,4-DGE를 메일라드 반응시키는 단백질은 하등 제한되지 않고, 예컨대 혈청 알부민 등의 알부민, 헤모글로빈, 미오글로빈, 헤모시아닌 등을 들 수 있으며, 그 유래도, 예컨대 토끼, 소, 인간 등의 각종 포유류나, 닭, 메추리 등의 각 조류 등을 들 수 있다. 구체적인 예로서는, 예컨대 RSA(토끼 혈청 알부민), BSA(소 혈청 알부민), HSA(인간 혈청 알부민), 난백 알부민 등을 들 수 있다. 또한, 펩티드로서는, 천연 펩티드, 합성 펩티드 중 어느 것이라도 좋고, 또한, 올리고 펩티드라도 폴리펩티드라도 좋다.
제작한 항체는, 반응 정도(예컨대, 3,4-DGE의 첨가량)에 상관없이, 3,4-DGE 유래의 AGE를 검출할 수 있다. 항원을 조제할 때의 단백질의 완전한 AGE화에는, 예컨대 단백질의 NH2기에 대하여 등량 이상의 3,4-DGE를 첨가할 필요가 있다고 생각되며, 예컨대 단백질의 아미노기에 대하여 0.1∼100 등량이 되도록 3,4-DGE를 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1∼10 등량이며, 특히 바람직하게는 3∼5 등량이다. 또한, 단백질에 대한 3,4-DGE의 첨가는, 충분히 AGE화를 행하기 위해서, 2 회 이상 하더라도 좋다.
3,4-DGE와 단백질과의 항온처리 온도는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 25∼50℃이며, 바람직하게는 35∼40℃이고, 1 회당 항온처리 시간도 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 3∼14 일간이며, 바람직하게는 7∼10 일간이다.
3,4-DGE와 단백질과의 반응은, 통상 완충액 중에서 행하는 것이 바람직하고, 그 pH는 예컨대 6∼8, 바람직하게는 7∼7.5이다. 완충액의 종류나 농도는 특별히 제한되지 않고, 원하는 pH에 따라서 선택할 수 있지만, 예컨대 인산 완충액, 말레산수소나트륨-NaOH 완충액 등을 들 수 있고, 아미노기를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 반응액에 있어서의 완충액의 농도도 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 10∼500 mM의 범위이다.
또한, 상기 반응액에는, 디에틸렌트리아민5초산(DTPA) 등의 킬레이트제를 첨가하더라도 좋으며, 그 농도는 예컨대, 1∼100 mM의 범위이다.
3,4-DGE에 의해 단백질이 AGE화하면, 반응 생성물 AGE는 통상 형광을 발하고, 또한 갈색화가 생긴다. 이 때문에, 예컨대 상술한 바와 같이 반응 생성물을 눈으로 확인하여 관찰하거나, 형광 강도를 측정함으로써, AGE화의 유무를 확인할 수 있다.
얻어진 반응 생성물(AGE)은 통상 탈염이나 저분자 화합물(예컨대, 미반응 3,4-DGE 등)을 제거하기 위해서, 투석을 하고, 여과 멸균한 것을 면역원으로서 사용하는 것이 바람직하다.
(2) 항체의 조제
항체의 조제 방법은 하등 제한되지 않고, 예컨대 동물에의 면역 감작을 행함으로써 항체를 생산하는 종래 공지의 방법에 의해서, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 조제할 수 있다. 면역 감작시키는 숙주 동물의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예컨대 인간, 토끼, 래트, 마우스, 염소, 양, 말, 돼지, 몰모트 등의 인간을 제외한 포유류 동물, 닭, 비둘기, 집오리, 메추리 등의 조류 등을 사용할 수 있다. 또한, 항원의 투여 방법도 특별히 제한되지 않고, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여 등을 채용할 수 있고, 바람직하게는 피하 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 보다 바람직하게는 피하 투여이다.
예컨대, 폴리클로날 항체를 조제하는 경우에는, 전술한 것과 같은 숙주 동물에게 상기 항원(AGE)을 투여하여 면역하고, 회수한 혈청이나 복수액 등으로부터 항AGE 항체를 단리, 정제하면 된다. 또한, 모노클로날 항체를 조제하는 경우에는, 예컨대, 면역한 숙주 동물에 있어서의 비장 세포나 림프구양 세포 등의 항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합하여 하이브리도마를 조제하고, 상기 하이브리도마를 증식시켜, 특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 단리함으로써, 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.
폴리클로날 항체나 모노클로날 항체의 정제 방법도 하등 제한되지 않고, 예컨대 염석, 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 등 종래 공지된 방법에 의해서 행할 수 있다.
한편, 목적 항체의 생산을 스크리닝하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방사 면역 측정법(radioimmunoassay)(RIA)법, 효소 면역 분석법(enzyme immunoassay)(EIA)법 등을 채용할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 항체는, 통상 면역 글로불린 클래스가 IgM 또는 IgG이다. 또한, 얻어진 항체 분자는 그 자체를 항체로서 사용할 수도 있으며, 또한 효소 처리하여 얻어지는 Fab, Fab', F(ab')2 등의 항체의 활성 단편을 본 발명의 항체로서 사용할 수도 있다.
이어서, 본 발명의 항체를 이용하여, 3,4-DGE와 단백질(또는 펩티드)과의 반응 생성물 AGE를 검출하는 방법에 관해서 설명한다. 본 발명은, 시료와 AGE에 대한 항AGE 항체를 반응시켜, 상기 시료 중의 AGE와 항AGE 항체와의 항원 항체 반응에 의해 상기 시료 중의 AGE를 검출하는 방법으로서, 상기 AGE가 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물이며, 상기 항AGE 항체가 상기 본 발명의 항AGE 항체인 것을 특징으로 한다.
이러한 검출 방법을 이용하면, 여러 가지 시료에 있어서의 3,4-DGE에 의해 생성된 AGE를 검출할 수 있다. 상술한 바와 같이, 3,4-DGE는 단백질 등에 대한 반응성이 매우 높고, 그 자신 및 생성된 AGE도 세포에 대한 독성이 강한 것이다. 따라서, 이러한 3,4-DGE 유래의 AGE를 검출하는 본 발명의 방법을, 예컨대 임상 의료 등에 이용하면, 3,4-DGE 유래의 AGE가 영향을 준다고 생각되는 질환의 진단이나 예방에 유용하다고 이해된다. 구체적인 예로서는, 3,4-DGE 유래 AGE를 검출함으로써, 당뇨병이나 신부전 병태에 관련되는 각종 질환; 당뇨병이나 신부전의 합병증; 노화에 따른 질환; 복막섬유증, 복막경화증 및 경화성피낭성복막경화증 등의 복막 투석에 부수되는 합병증 등에 관해서, 발증의 가능성, 발증 정도, 진행도 등을 판단할 수 있다고 추측된다.
상기 항원 항체 반응은, 예컨대 EIA법(예컨대, 경합적 EIA법, 간접적 EIA법)이나 RIA법, 형광 면역 측정법(FIA), 화학 발광 면역 측정법(CLIA), 면역 비탁법(TIA)이나 라텍스 면역 비탁법(LTIA), 금 콜로이드 입자법 등의 면역 응집법 등에 의해 검출할 수 있다. 예컨대, 항AGE 항체와 시료(항원 AGE 함유 시료)를 반응시켜, 이 반응액을 미리 항원 AGE를 고정화한 담체에 첨가한다. 여기서, 상기 반응액에 있어서 시료 중의 항원과 반응하지 않은 항체는 상기 고정화 항원 AGE와 결합하게 된다. 이어서, 상기 담체로부터 상기 반응액을 제거하여, 상기 항AGE 항체에 대한 표지화 항체(이차 항체)를 첨가한다. 이로써, 상기 이차 항체를, 고정화 항원 AGE에 결합한 항AGE 항체에 결합시켜, 최종적으로 결합한 상기 이차 항체의 표지를 검출하면 된다.
상기 담체로서는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 비드, 플레이트[예컨대, 면역 플레이트(immunoplate)], 튜브 등을 들 수 있다. 또한, 상기 표지로서는, 예컨대 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제 등의 효소, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위원소 등을 들 수 있다.
항체의 표지화는, 표지의 종류에 따라서 통상의 방법에 의해 행할 수 있다. 상기 표지가 예컨대 효소인 경우에는, 효소 반응에 의해 발색하는 기질을 첨가하여, 상기 기질의 발색 정도를 흡광도 등에 의해 측정하면 된다. 또한, 방사성 동위원소인 경우에는, 예컨대 신틸레이션 카운터로 방사 활성을 측정하면 된다. 이러한 흡광도나 방사 활성, 형광 강도 등은 고정화 항원에 결합하고 있는 항체의 양과 상대 관계에 있기 때문에, 예컨대 미리 준비한 검량선 등을 이용하여 항체량을 정량할 수 있다. 또한, 고정화 항원에 결합하고 있는 항체량은, 시료 중의 항원과 반응하지 않은 유리 항체이다. 따라서, 유리 항체량으로부터 시료 중의 항원과 결합한 항체를 산출할 수 있고, 이것이 시료 중에 포함되는 항원에 상당하므로, 상기 시료 중의 항원 AGE도 정량이 가능하게 된다. 한편, 항원 항체 반응의 검출 방법은, 이들 방법에는 하등 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다.
이 검출 방법에 있어서의 피검 시료는 특별히 제한되지 않고, 예컨대 혈청, 혈장, 혈액, 뇨, 수액 등의 체액, 생체 세포의 추출액, 균체 등의 배양액 등 다양한 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법은 생체 조직에 대하여 직접 행하는 것도 가능하다.
이어서, 본 발명의 항체를 이용하여, AGE를 생성하는 카르보닐 화합물을 검출하는 방법에 관해서 설명한다. 본 발명의 카르보닐 화합물의 검출 방법은, AGE에 대한 항AGE 항체를 이용하여, 상기 AGE를 생성하는 시료 중의 카르보닐 화합물을 검출하는 방법으로서, 상기 카르보닐 화합물이 3,4-DGE이며, 상기 AGE가 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물이며, 상기 항AGE 항체가 상기 본 발명의 항AGE 항체이며, 상기 시료 중의 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드를 반응시키는 공정, 상기 반응에 의한 생성물과 상기 항AGE 항체를 반응시키는 공정, 상기 생성물과 상기 항AGE 항체와의 항원 항체 반응에 의해, 생성된 AGE를 검출하는 공정 및 상기 AGE의 유무 또는 양으로부터, 시료 중의 3,4-DGE를 정성 또는 정량하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상술한 바와 같이 3,4-DGE는 그 자신 또는 이에 따라 생성된 AGE도 세포에 대한 독성이 강한 것이다. 이 때문에, 예컨대 투석액 등에 3,4-DGE가 포함되면, 이들이 투여된 생체에는 3,4-DGE 유래의 AGE가 발생하여, 생체에 영향을 미치게 할 우려가 있다. 본 발명의 3,4-DGE의 검출 방법에 따르면, 예컨대 상기 투석액 등의 시료에 있어서의 3,4-DGE의 존재를 확인(정성)하거나, 그 함량을 정량할 수 있기 때문에, 위험성이 낮은 투석액인지 아닌지를 평가할 수 있어, 의료면에 있어서 매우 유용한 품질의 판단 방법이 된다고 말할 수 있다.
본 발명의 카르보닐 화합물의 검출 방법을 적용하는 피검 시료로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 전술한 것과 같은 투석액, 점적액, 주사액, 음료 등의 식품류 등을 들 수 있다. 특히, 투석액이나 점적액은, 일반적으로 당류가 포함되어 있어, 멸균을 위한 가열 처리에 의해서, 그 성분이 AGE화에 관여하는 물질(AGE 전구체)로 변화하고 있는 경우가 있다. 따라서, 미리 본 발명의 검출 방법에 의해서, AGE 전구체인 3,4-DGE의 존재를 확인함으로써, 보다 안정성이 높은 투석액이나 점적액 등을 환자에게 제공할 수 있다.
본 발명의 방법은, 시료와 단백질 또는 펩티드를 미리 반응시켜 놓고, 이 반응 생성물에 본 발명의 항체를 반응시키는 것 이외에는, 전술한 본 발명의 AGE 검출 방법과 같은 식으로 할 수 있다. 즉, 시료를 단백질 등과 반응시켜, 이 반응 생성물과 본 발명의 항체와의 항원 항체 반응이 확인된 경우에는, 3,4-DGE 유래의 AGE가 생성되고 있는 것으로 되기 때문에, 상기 시료 중에는 3,4-DGE가 존재한다고 판단할 수 있다. 또한, 항원 항체 반응의 정도에 따라서 3,4-DGE의 함유량도 정량할 수 있다.
상기 시료와 반응시키는 단백질로서는, 특별히 제한되지 않고, 혈청 알부민이나 헤모글로빈 등을 들 수 있는데, 예컨대, 시료인 점적액 등이 투여된 경우에, 상기 점적액과 접촉할 가능성이 높은 조직의 단백질을 사용하는 것도 바람직하다. 이로써, 나아가 생체에 투여했을 때의 AGE화를 충분히 예측하는 것이 가능하게 된다.
또한, 본 발명의 면역 시약은, AGE에 대한 항AGE 항체를 포함하는 면역 시약으로서, 상기 AGE가 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물이며, 상기 항AGE 항체가 상기 본 발명의 항AGE 항체인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 면역 시약은 전술한 본 발명의 AGE 검출 방법이나 3,4-DGE의 검출 방법에 사용할 수 있고, 그 사용 방법은 본 발명의 항AGE 항체와 마찬가지이다.
또한, 본 발명의 면역 시약에 있어서, 항AGE 항체는, 예컨대 항원 항체 반응의 검출 방법에 따라서, 각종 표지 물질에 의해 표지화되더라도 좋다. 또한, 본 발명의 면역 시약은 본 발명의 항AGE 항체를 포함하고 있으면 되며, 그 밖의 구성은 하등 제한되지 않는다.
이하, 실시예 및 비교예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 한편, 특별히 기재하지 않는 한, 「%」는 질량%를 나타낸다.
실시예 1
항3,4-DGE 유래의 AGE 폴리클로날 항체의 조제
(1) AGE 항원(3,4-DGE 유래 AGE)의 조제
우선, 500 mM의 3,4-DGE 수용액을 조제하였다. 한편, 0.2 M 인산나트륨 완충액(PB: pH 7.4)에, RSA(10 mg/ml)와 DTPA(5 mM)를 용해하고, 또한, 3,4-DGE량이 RSA 중의 NH2기의 2.5 등량이 되도록 상기 3,4-DGE 수용액을 혼합하였다. 이 혼합액을 0.2 ㎛ 필터로 여과 멸균하고 나서, 37℃에서 3 일간 항온처리하고, 또한 3,4-DGE량이 RSA 중의 NH2기의 2.5 등량이 되도록 상기 3,4-DGE 수용액을 다시 첨가하여, 37℃에서 4 일간 항온처리하였다. 그리고, 이 반응액을 탈염 컬럼(상품명 PD-10, Amersham Biosciences사 제조)에 사용하여, 그 회수액을 PBS(-)로 하루 밤낮 투석함으로써 탈염과 저분자 화합물을 제거하였다. 상기 PBS는 0.15 M 염화나트륨 함유 10 mM 인산 완충액이다. 이 투석 후의 용액을 0.2 ㎛ 필터로 여과 멸균하여, 항원(3,4-DGE 유래의 AGE) 용액으로 하였다. 한편, 이 항원 용액의 농도는 단백질 농도 7 mg/ml로 하였다.
(2) 토끼에의 면역
상기 항원 용액(단백질 농도: 7 mg/ml)을, 등량의 프로인트 완전 보조제(adjuvant)와 혼합하여 에멀션화시키고, 이 에멀션을 토끼의 등부 피하 여러 곳에 격주 투여하였다. 한편, 1 회의 투여량은 단백질량으로 5 mg/마리로 하였다. 면역 시작부터 경시적으로 채혈을 하여, 간접 ELISA법에 의해 항체가를 확인한 결과, 합계 5 회의 등부 피하 면역으로 항체가의 상승이 충분하다고 판단할 수 있었다. 이 때문에, 최종회(6 회째)의 투여는 상기 항원 용액을 그대로 토끼의 귀 정맥에 투여하고, 그로부터 10 일 후에, 마취를 한 상태에서, 면역한 토끼로부터 전체 채혈을 하였다.
(3) 항3,4-DGE 유래 AGE 폴리클로날 항체의 정제
(3-1) 항혈청의 분리
얻어진 토끼 혈액을 실온에서 약 3 시간 정치시켜, 혈병과 혈청을 자연 분리시킨 후, 이들을 원심 분리(3500 rpm, 10 분)하고, 회수한 상청을 다시 원심 분리(3500 rpm, 10 분)하였다. 이렇게 해서 얻어진 상청(항혈청)을 10 ml씩으로 작게 나눠 56℃에서 30 분간 비동화 처리하여, 사용할 때까지 -80℃에서 동결 보존하였다.
(3-2) 폴리클로날 항체의 정제
상기 처리를 한 항혈청 10 ml를, 등량의 0.02 M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)과 혼합한 후, 0.45 ㎛ 필터로 여과하여, 이하에 나타내는 조건으로, IgG 친화성 크로마토그래피를 실시하여 폴리클로날 항체의 정제를 행하였다.
컬럼: IgG 정제를 위한 Affi-Gel 단백질 A 아가로스(Bio-Rad사 제조)
컬럼 사이즈: 10 ml(φ10×100 mm)
용출액: (A) 0.02 M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)
(B) 0.1 M 글리신-염산 완충액(pH 2.7)
용출 조건: 용출액 (A)에서 (B)로의 단계 구배
유속: 1 ml/분
우선, 용출액(A)로 평형화한 상기 컬럼에 상기 항혈청을 로딩하여, 상기 용출액(A)에 의해 용출을 행하였다. 그리고, 용출 획분의 파장 280 nm의 흡광도를 순차 측정하여, 상기 용출 획분의 흡광도가 거의 0이 된 시점에서 용출액을 용출액(B)로 치환하였다. 용출액(B)에 의한 용출 획분(단백질 획분)을 회수하고, 이 회 수 획분에 1 M Tris-HCl 완충액(pH 9.0)을 가하여 중화한 후, 약 10 ml가 될 때까지 원심 농축하여, 이것을 정제 항3,4-DGE 유래의 AGE 폴리클로날 항체 용액으로 하였다(단백질 농도 9.7 mg/ml). 한편, 상기 항체는 1 ml씩으로 작게 나눠 사용할 때까지 -80℃에서 동결 보존하였다. 얻어진 항3,4-DGE 유래의 AGE 폴리클로날 항체에 관해서, 실시예 2∼5에서 그 성질 등을 확인하였다. 한편, 본 실시예 1의 방법에 기초하여 여러 번 폴리클로날 항체를 조제한 결과, 같은 항체가 재현성을 가지고 얻어졌다.
실시예 2
실시예 1에서 얻어진 항3,4-DGE 유래의 AGE 폴리클로날 항체에 관해서, 그 결합 상수를 확인하였다.
결합 상수는 경합 ELISA법에 의해 결정하였다. 우선, 실시예 1에서 조제한 항원 용액을 1 ㎍/ml가 되도록 50 mM 탄산나트륨 완충액으로 희석하였다. 이것을 96 웰 이뮤노플레이트에 1 웰당 100 ㎕ 가해, 실온에서 2 시간 항온처리하여 항원을 고상화하였다. 2 시간 후, 항원 용액을 제거하고, 각 웰을 0.05% Tween 20 함유 PBS(TPBS)로 세정한 후, 0.5% 탈지유 함유 PBS를 1 웰당 300 ㎕ 가하고, 실온에서 2 시간 항온처리하여 항원이 고정되어 있지 않은 부분을 블로킹하였다. 2 시간 후, 블로킹 용액을 제거하여 TPBS로 세정한 후, 여기에, 0.1% 글리세린 및 0.1% Tween 20 함유 50 ml 트리스-HCl 완충액(pH 7.4: TB)으로 희석한 여러 가지 농도의 항원 용액 50 ㎕와, 0.1% 탈지유 함유 TB로 2500 배 희석한 실시예 1의 항체(일차 항체) 용액 50 ㎕를 가하여, 실온에서 2 시간 항온처리하였다. 2 시간 후, 반응액을 제거 하여, TPBS로 세정하고 나서, 0.3% 탈지유 함유 TB로 2250 배 희석한 상기 일차 항체에 대한 알칼리 포스파타제 표지 양 항토끼 IgG 항체 용액(동결 건조품(CHEMICON사 제조)에 물 1 ml와 글리세린 1 ml를 가하여 용해한 용액) 100 ㎕를 가하여, 37℃에서 1 시간 항온처리하였다. 1 시간 후, 반응액을 제거하여, TPBS로 세정하고 나서, 발색 시약(물 9 ml에 상품명 Diethanolamine Substrate Buffer(5x)(PIERCE사 제조) 2 ml과 상품명 ImmunoPure PNPP Tablets(PIERCE사 제조) 2 정을 용해한 것)을 1 웰당 100 ㎕ 가하여, 실온에서 30 분간 항온처리하였다. 항온처리 후, 1 웰당 2 M 수산화나트륨 수용액 50 ㎕를 가하여 알칼리 포스파타제의 반응을 정지시켜, 405 nm에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 그리고, 이하의 식으로부터 도 1의 그래프를 작성하여, 해리 상수 Kd를 산출하였다.
Kd=k2/k1=[Agf][Abf]/[AgAb]
[Agf] : 유리 항원 농도
[Abf] : 유리 항체 농도
[AgAb] : 항원 항체 복합체의 농도
상기 도 1로부터 구한 해리 상수 Kd는 5.7×10-9 (M)이었다. 또한, 결합 상수 Ka는, 해리 상수 Kd의 역수이므로, 1.8×108 (M-1)로 산출되었다. 일반적인 폴리클로날 항체의 결합 상수는 107∼1O9 (M-1)이기 때문에, 실시예 1에서 얻어진 항체는 항원과의 결합력이 충분하다고 말할 수가 있다.
실시예 3
실시예 1에서 얻어진 항3,4-DGE 유래 AGE 폴리클로날 항체에 관해서, 그 반응 특이성을 확인하였다.
결합 상수의 측정과 같은 경합 ELISA법 및 웨스턴 블로팅법에 의해서, 3,4-DGE 유래 AGE 단백질에 대한 특이성을 확인하였다. 이하에 나타내는 각종 AGE화 단백질은 상기 실시예 1에 있어서의 「(1) 항원의 조제」와 같은 식으로 조제하였다. 한편, Glu-BSA는 0.2 M PB(pH 7.4)에 BSA(10 mg/ml)와 DTPA(5 mM)를 용해하고, 이것에 100 mM가 되도록 Glu를 첨가하여, 37℃에서 8 주간 항온처리하여 조제하였다.
(1) 경합 ELISA법
경합 저해 물질로서, 3,4-DGE로 AGE화한 단백질「3,4-DGE-RSA」, 네이티브(native) 단백질「RSA, BSA, HSA」, 3,4-DGE 이외의 카르보닐 화합물(MGO, GO, 3-DG)로 AGE화한 단백질「MGO-BSA, GO-BSA, 3-DG-BSA」 및 당화 단백질「당화 HSA(SIGMA사 제조: 상품명 A-8301)」을 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 2와 같은 식으로 하여 ELISA법에 의해 반응 특이성을 평가하였다. 이 결과를 도 2의 (A), (B)에 도시한다. 도 2에 있어서 (A)는 3,4-DGE-RSA, 네이티브 단백질 및 당화 HSA의 결과를 나타내는 그래프, (B)는 3,4-DGE-RSA 및 다른 AGE화 단백질의 결과를 나타내는 그래프이다. 또한, 도 2에 있어서의 「B」는 경합 저해 물질을 웰에 가한 경우의 405 nm에 있어서의 흡광도를, 「BO」는 경합 저해 물질을 웰에 가하지 않는 경우의 405 nm에 있어서의 흡광도를 나타내고, 경합 물질의 단위(㎍/ml)는 웰에 첨가한 경합 저해 물질의 농도를 나타낸다.
도 2(A)에 도시한 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 폴리클로날 항체는, 네이 티브 단백질 및 당화 HSA와는 교차 반응을 보이지 않고, 또한, 도 2(B)에 도시한 바와 같이, 다른 AGE화 단백질과도 교차 반응을 보이지 않았다.
(2) 웨스턴 블로팅법
3,4-DGE로 AGE화한 단백질「3,4-DGE-RSA, 3,4-DGE-BSA, 3,4-DGE-HSA」, 네이티브 단백질「RSA, BSA, HSA」, 3,4-DGE 이외의 카르보닐 화합물(MGO, GO, 3-DG, 5-HMF, Fur, AA, FA, glycer, glycol) 및 Glu로 AGE화시킨 단백질「MGO-BSA, GO-BSA, 3-DG-BSA, 5-HMF-BSA, Fur-BSA, AA-BSA, FA-BSA, glycer-BSA, glycol-BSA, Glu-BSA」를 시료로서 사용하였다. 이들 시료(각 1 ㎍)로 SDS-PAGE를 실시하여, 단백질 밴드를 PVDF(폴리비닐리덴플루오라이드) 멤브레인으로 블로팅하였다. 이 멤브레인을 0.3% 탈지유 함유 TTBS[0.15 M 염화나트륨 및 0.1% Tween 20 함유 25 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.4)]에 침지하고, 실온에서 1 시간 항온처리하여 블로킹하였다. 항온처리 후, 블로킹 용액을 제거하고, TTBS로 세정하고 나서, 블로킹 용액으로 12000 배 희석한 실시예 1의 항체(일차 항체) 용액에 침지하여 실온에서 1 시간 항온처리하였다. 항온처리 후, 일차 항체 용액을 제거하고, TTBS로 세정하고 나서, 블로킹 용액으로 12000 배 희석한 상기 일차 항체에 대한 알칼리 포스파타제 표지 양 항토끼 IgG 항체 용액(CHEMICON사 제조)에 침지하여, 실온에서 1 시간 항온처리하였다. 항온처리 후, 반응액을 제거하고, TTBS로 세정하고 나서, 사용 설명서에 따라서 조제한 발색 시약(BCIP/NBT(니트로블루테트라졸륨)/5-브로모-4-클로로-인돌릴인산); 프로메가사 제조)으로 발색시켰다. 이 결과를 도 3의 사진에 나타낸다. 한편, 상기 5-HMF는 5-히드록시메틸-푸르푸랄을, 상기 Fur는 푸르푸랄을, 상기 AA 는 아세트알데히드를, 상기 FA는 포름알데히드를, 상기 glycer는 글리세르알데히드를, 상기 glycol은 글리콜알데히드를 각각 나타낸다.
도 3에 도시한 바와 같이, 3,4-DGE로 AGE화된 3,4-DGE-BSA(레인 1번), 3,4-DGE-RSA(레인 3번), 3,4-DGE-HSA(레인 5번)에만 발색이 확인되고, 네이티브 단백질이나 다른 카르보닐 화합물로 AGE화한 단백질과는 교차 반응을 보이지 않았다.
이상의 경합 ELISA법 및 웨스턴 블로팅법의 결과로부터, 실시예 1의 폴리클로날 항체는 3,4-DGE로 AGE화된 단백질만을 특이적으로 인식하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4
3,4-DGE에 의한 세포내 단백질의 AGE화를 행하여, 실시예 1의 폴리클로날 항체에 의한 AGE의 검출을 행하였다.
20% FBS(소 태아 혈청)을 포함하는 M199 배지(이하 「FBS-M199 배지」라 함)에 현탁한 인간 복막 중피 세포(HPMC)를 8 웰 슬라이드 챔버에 파종하여, 융합될 때까지 배양하였다(37℃). 배양 후, 상기 슬라이드 챔버로부터 배지를 제거하여, M199 배지로 30 μM, 250 μM이 되도록 희석한 3,4-DGE 용액을 HPMC에 폭로시켰다. 한편, 대조군은 M199 배지를 폭로시켰다. 2 시간 배양 후, 상기 M199 배지를 제거하고 나서, HPMC를 PBS로 세정하고, 또한, -30℃의 냉메탄올을 부어 -30℃에서 5 분간 고정하였다. 계속해서, PBS로 세정한 후, 0.2% TritonX-100 함유 PBS를 적하하여, 실온에서 5 분간 두어 침투화 처리를 하였다. 침투화 용액을 제거하여 PBS로 세정한 후, 5% 정상 돼지 혈청(DAKO사 제조) 함유 PBS를 적하하여 실온에서 5 분간 두고, 블로킹을 실시하였다. 블로킹 용액을 제거하고 5% 정상 돼지 혈청 함유 PBS로 500 배 희석한 실시예 1의 항체(일차 항체) 용액을 적하하여, 실온에서 1 시간 항온처리하였다. 항온처리 후, 일차 항체 용액을 제거하고, PBS로 세정하고 나서, 5% 정상 돼지 혈청 함유 PBS로 30 배 희석한 상기 일차 항체에 대한 FITC 표지 돼지 항 토끼 IgG 항체 용액(DAKO사 제조)을 적하하여, 암소에서 실온에서 1 시간 항온처리하였다. 항온처리 후, 반응액을 제거하고, PBS로 세정하고 나서, 형광 현미경으로 관찰하였다. 이 결과를 도 4의 현미경 사진에 나타낸다. 도 4에 있어서 (a)는 3,4-DGE로 폭로하지 않은 대조군, (b)는 3,4-DGE 농도가 30 μM인 결과, (c) 는 3,4-DGE 농도가 250 μM인 결과이며, 좌열이 밝은 시야에서의 사진, 우열이 형광현미경 사진이다.
도 4의 (b) 및 (c)에 나타내는 바와 같이, 3,4-DGE로 폭로한 HPMC에만 형광이 관찰되고, 도 4(a)의 대조군에서는 형광은 검출되지 않았다. 이로부터, 실시예 1의 폴리클로날 항체가, 인간 세포에 있어서, 폭로한 3,4-DGE로 AGE화된 단백질에만 특이적으로 결합하고, 또한, 인간 세포의 항체 염색에 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5
복막 투석의 모델 래트에 대해서, 복막에 있어서의 3,4-DGE 유래 AGE의 축적을 확인하였다.
2 군의 래트 복강에, 각각 3,4-DGE 농도가 2 μM, 58 μM인 투석액을 30 일간에 걸쳐 투여하였다(2 회/일: 각 군 7 마리). 한편, 대조군(7 마리)은, 투석액을 투여하지 않고 바늘로 찌르기만 하였다. 각 래트로부터 벽측 복막을 채취하여 동결 포매하여, 얇게 자른 절편을 제작하였다. 이 절편을 파라포름알데히드 고정하고, 0.5% 탈지유 함유 PBS로 500 배 희석한 실시예 1의 항체(일차 항체) 용액을 적하하여, 실온에서 1 시간 항온처리하였다. 항온처리 후, 일차 항체 용액을 제거하고, TTBS로 세정하고 나서, 사용 설명서에 따라서 상기 일차 항체에 대한 알칼리 포스파타제 표지 이차 항체 키트(상품명 DAKOLSAB 2 System Alkaline Phosphatase; DAKO사 제조)로 처리하였다. 반응액을 제거하여 TTBS로 세정한 후, 사용 설명서에 따라서 조제한 발색 시약(상품명 New Fuchsin; DAKO사 제조)으로 발색시켰다. 이 결과를 도 5의 사진에 나타낸다. 도 5에 있어서 (A)는 대조군이며, (B)는 2 μM 3,4-DGE 함유 투석액으로 투석한 래트의 결과를 나타내는 사진이고, (C)는 58 μM 3,4-DGE 함유 투석액으로 투석한 래트의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5에 도시한 바와 같이, 대조군(도 5(A))에 비해서, 상기 3,4-DGE 함유 투석액으로 투석한 래트[도 5의 (B), (C)]에 있어서 발색이 확인되고, 특히 3,4-DGE 함유량이 많은 래트에게 있어서 강한 발색이 보였다[도 5(C)]. 이로부터, 투석액에 포함되는 3,4-DGE에 의해서, 복막 조직이 AGE화되고 있음을 추측할 수 있다. 또한, 이 실험으로부터, 실시예 1의 폴리클로날 항체에 따르면, 생체 조직의 항체 염색도 가능하다고 말할 수 있다.
실시예 6
상기 실시예 1과 같은 방법에 의해서 항3,4-DGE 유래 AGE 폴리클로날 항체를 조제하여, 반응 특이성 및 결합 상수에 의해, 상기 실시예 1의 항체와 비교를 행하 였다.
반응 특이성은 상기 실시예 3과 마찬가지로 경합 ELISA법에 의해 확인하였다. 이 결과를 도 6의 (A), (B)에 도시한다. 도 6에 있어서 (A)는 3,4-DGE-RSA, 네이티브 단백질 및 당화 HSA의 결과를 나타내는 그래프, (B)는 3,4-DGE-RSA 및 다른 AGE화 단백질의 결과를 나타내는 그래프이다. 또한, 도 6에 있어서의 「B」 및 「BO」는 전술한 것과 마찬가지다.
이 결과를 상기 실시예 1에서 조제한 항체의 결과(도 2와 (A), (B))와 비교하면, 실시예 6의 폴리클로날 항체는, 네이티브 단백질 및 당화 HSA와는 교차 반응을 보이지 않고, 또한, 도 6(B)에 도시한 바와 같이, 다른 AGE화 단백질과도 교차 반응을 보이지 않고, 실시예 1의 항체와 같은 거동을 보였다.
결합 상수는, 상기 실시예 2와 마찬가지로 경합 ELISA법에 의해 결정하고, 같은 식으로 하여, 도 7에 나타내는 그래프로부터 결합 상수를 산출하였다. 이 결과, 상기 도 7로부터 구한 결합 상수는 1.9×108 (M-1)로 산출되어, 상기 실시예 2에 있어서의 실시예 1의 폴리클로날 항체의 결합 상수와 같은 정도임이 증명되었다. 이상의 결과로부터, 상기 실시예 1의 방법에 기초하여, 재현성 좋게 같은 항체를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7
반응 시간이 다른 AGE 항원(3,4-DGE 유래 AGE)을 조제하여, 반응 시간에 상관없이, 상기 실시예 1의 항3,4-DGE 유래의 AGE 폴리클로날 항체에 의한 검출이 가 능한지 여부를 확인하였다.
PBS(pH 7.4)에 BSA(5 mg/ml)를 용해하고, 또한, 3,4-DGE량이 BSA 중의 NH2기의 4 등량이 되도록 상기 3,4-DGE 수용액을 혼합하여, 37℃에서 소정 시간(2, 4, 8, 24, 72, 168 시간) 항온처리한 것 이외에는, 상기 실시예 1과 같은 식으로 하여 항원(3,4-DGE 유래 AGE)을 조제하였다. 그리고, 얻어진 각 항원과, 실시예 1의 폴리클로날 항체와의 반응성을 상기 실시예 3과 같은 경합 ELISA법에 의해 평가하였다. 이 결과를 도 8의 그래프에 나타낸다. 한편, 도 8에 있어서의 「B」 및 「BO」는 상술한 바와 같다.
도 8에 도시한 바와 같이, 각 항원에 대한 결과는 전부 유사하게 오른쪽으로 내려가는 거동을 보이고, 그 반응성은 경합 농도에 의존적인 것을 알 수 있다. 이 결과로부터, 단백질과 3,4-DGE와의 반응 시간에 상관없이, 같은 AGE가 생성되고 있다고 할 수 있다. 한편, 반응 시간에 의존하여 B/BO치가 감소하고 있으므로, 반응 시간에 따라 AGE화의 정도가 다르다고 말할 수 있으며, 단백질의 완전한 AGE화에는, 예컨대 72 시간 정도의 항온처리를 요한다고 추측된다.
(참고예 1)
3,4-DGE에 의한 단백질의 AGE화를 행하여, 얻어진 AGE의 반응성이나 물성을 확인하였다.
1. 단백질과의 반응성
(외관)
카르보닐 화합물(3,4-DGE, MGO, GO, 3-DG, Glu)을 이용하여, 단백질 BSA의 AGE화를 행하였다. 우선, BSA(시그마사 제조; 상품명 A-0281)를 농도 5 mg/ml(염기성 아미노산 잔기 6.2 mM)가 되도록, PBS(pH 7.4)에 용해하여 BSA 용액을 조제하였다. 상기 BSA 용액에, 카르보닐 화합물을 농도 25 mM(BSA 중의 염기성 아미노산 잔기의 4 당량)이 되도록 첨가하여, 37℃에서 소정 시간(2, 4, 8, 24, 72, 168 시간) 항온처리하였다. 한편, 각종 카르보닐 화합물은 500 mM 3,4-DGE 수용액(자사 조제), 40% MGO 수용액(시그마사 제조), 40% GO 수용액(와코쥰야쿠고교사 제조), 3-DG(도진가가쿠사 제조), Glu(국방, 산에이도카사 제조)를 이용하였다. 한편, 카르보닐 화합물 무첨가인 것을 같은 식으로 항온처리한 것을 대조군으로 하였다. 항온처리 168 시간 후의 반응액의 외관을 도 9의 사진에 나타낸다. 도 9에 있어서, 좌측부터 3,4-DGE(DGE), MGO, GO, 3-DG(3DG), Glu, 블랭크(대조군)의 결과이다.
3,4-DGE를 이용한 경우, 반응액은 약 2 시간에 착색되고, 그 후 경시적으로 갈색 기운이 강하게 되어, 168 시간 후에는 도시한 것과 같이 짙은 갈색이 확인되었다. 한편, 도시한 것과 같이, Glu와의 반응액에서는 갈색화가 확인되지 않고, AGE화의 매개체로서 알려진 MGO, GO, 3-DG에 대해서는 갈색화가 보이므로, 3,4-DGE에 대해서, MGO, GO, 3-DG와 마찬가지로, 메일라드 반응 후기의 AGE화가 일어나고 있다고 말할 수 있다. 또한, 갈색이 짙으므로, 3,4-DGE의 단백질에 대한 반응성이 강력하다는 것도 알 수 있다.
(형광 강도)
상술한 바와 같은 식으로 항온처리한 반응액을 샘플링하여, 이들 샘플링 반 응액을, 탈염 컬럼(상품명 PD-10, amersham pharmacia biotech사 제조)에 적용하여 탈염하였다. 탈염 후의 반응액에 대해서, BCA 단백질 분석 키트(Pierce사 제조)를 이용하여 BSA 농도를 측정하고, 그 농도가 1.0 mg/ml가 되도록 물로 희석한 것을 시료 용액으로 하였다. 한편, 이들 시료 용액은 사용할 때까지 -30℃에서 동결 보존하였다. 이들 시료 용액을 96 웰 백색 플레이트에 분주하여, 여기 파장 360 nm, 형광 파장 430 nm에서 형광 강도를 측정하였다(측정 장치: 상품명 SPECTRAFLUOR PLUS, TECAN사 제조)하였다. 이들 결과를 도 10에 도시한다. 한편, 도 10에 있어서 「BSA」란, 카르보닐 화합물을 첨가하지 않은 대조군을 나타낸다.
도시한 것과 같이, 3,4-DGE를 이용한 시료는 다른 카르보닐 화합물에 비하여 형광 강도가 매우 강해, 24 시간의 반응으로 거의 평형에 달하였다.
2. 반응물의 평가
카르보닐 화합물(3,4-DGE, 3-DG, GO, MGO)에 관한 상기 시료 용액에 대해서, 기지의 AGE인 펜토시딘, 카르복시메틸리신(CML), 메일라드 반응 생성물(MRX: 8-히드록시-5-메틸디히드로티아졸로[3,2-α])의 생성 유무를 ELISA법에 의해 확인하였다. 그 결과, GO를 이용한 반응액은 24 시간 항온처리한 단계에서, 이미 BSA 1 분자당 3.025 분자의 CML 생성이, 168 시간 후에, BSA 1 분자당 3.7 분자의 CML의 생성이 확인되었다. 또한, MGO를 이용한 반응액은, 168 시간 경과에, BSA 1 분자당 0.0028 분자의 펜토시딘이 확인되었다. 이에 대하여, 3,4-DGE를 이용한 반응액으로부터는 CML, 펜토시딘, MRX 전부에 관해서 생성은 확인되지 않았다. 이로부터, 3,4-DGE에 의해 생성되는 AGE는 종래 공지의 AGE와는 다른 것은 분명하다고 말할 수 있다.
3. 아미노산 분석
전술한 시료 용액을 동결 건조한 후, 6 N 염산 중에서 산 가수분해하였다(120℃, 24 시간). 이것을 종래 공지의 방법에 따라서, 단실 클로라이드로 유도체화하고, HPLC로 분리하여, 시료 중의 아르기닌(Arg) 및 리신(Lys) 잔기량을 조사하였다(n=3). 이 결과를 도 11의 (A), (B)에 도시한다. 도 11(A)는 Arg 잔기의 잔존율을 나타내는 그래프이며, (B)는 Lys 잔기의 잔존율을 나타내는 그래프이다. 한편, 이 잔존율은 미처리의 네이티브 BSA 중의 잔기량을 100%로 했을 때의 잔존율을 나타낸다.
도 11(A)에 도시한 바와 같이, 다른 카르보닐 화합물에 의한 AGE와 마찬가지로, 유리 Arg 및 Lys가 감소하였다. 이로부터, 종래 공지의 AGE와 마찬가지로, Arg 잔기, Lys 잔기에, 3,4-DGE가 반응하였다고 추측된다.
4. 등전점 전기영동
미리, 등전점 마커를 전기영동에 걸어, pI와 이동도와의 검량선을 작성하였다. 그리고, 상기 시료 용액에 관해서도 전기영동을 행하여, 각 시료에 대해서 가장 짙게 염색된 부분을 밴드의 중심으로 하여, 등전점을 상기 검량선을 이용하여 산출하였다. 한편, 각 시료에 관한 등전점의 변화를 도 12에 도시한다.
도 12에 도시한 바와 같이, 3,4-DGE를 사용한 시료는 반응 24 시간 후에 있어서 산성 측으로의 이동이 확인되었다. 이로부터, 24 시간 반응시킨 시점에서, 이미 단백질의 AGE화가 시작되고 있음을 알 수 있다.
5. SDS-PAGE
3,4-DGE 및 MGO를 사용한 시료에 관해서 각각 SDS-PAGE를 행하였다. 이들 결과를 도 13의 전기영동 사진에 나타낸다. 한편, 도 13(A)가 3,4-DGE의 결과, 도 13(B)가 MGO의 결과, 레인은 좌측부터 순차적으로, 분자량 마커, 네이티브 BSA, 시료(2, 4, 8, 24, 72, 168 시간)의 결과를 나타낸다.
도시한 것과 같이, 반응 2∼4 시간에 있어서 밴드에 혼란이 관찰되므로, 단백질 구조가 크게 변화되어 AGE화가 발생하였다고 생각된다. 한편, 공지의 AGE화를 일으키는 카르보닐 화합물인 MGO에 관해서도 마찬가지로 밴드의 변화가 보였다.
(참고예 2)
3,4-DGE를 비롯한 카르보닐 화합물에 관해서 단백질과의 반응성을 확인하였다. 카르보닐 화합물로서는, 3,4-DGE, MGO, GO, 3-DG, AA, FA, Fur, 5-HMF, Glu를 사용하였다.
BSA를 10 mg/mL가 되도록 PBS(pH 7.4)에 용해하여, 이것에 각종 카르보닐 화합물을 농도 30 mmol/L가 되도록 첨가하여 37℃에서 24 시간 반응시켰다. 반응 후, BSA의 변성(AGE화)은 반응액의 형광 강도(여기 파장 360 nm, 형광 파장 430 nm)로 평가하였다. 이 결과를 도 14에 도시한다.
도 14에 도시한 바와 같이, 3,4-DGE를 첨가한 BSA 용액은 다른 카르보닐 화합물에 비해서 매우 강한 형광을 보였다. 이 결과로부터, 3,4-DGE는 단백질과의 반응성이 풍부한, 강력한 AGE의 매개체임이 확인되었다.
(참고예 3)
3,4-DGE에서 유래하는 AGE화 단백질의 세포 독성을 확인하였다.
각종 카르보닐 화합물에서 유래하는 AGE화 단백질의 생물 활성을 검토하기 위해서, 세포 독성 시험을 실시하였다. 한편, AGE화 단백질로서는, 실시예 3과 같은 식으로 조제한 3,4-DGE-BSA, MGO-BSA, GO-BSA, AA-BSA를 사용하였다.
FBS-M199 배지에 현탁한 인간 복막 중피 세포(HPMC)를, 96 웰 플레이트(Iwaki사 제조)에 웰당 3400 세포씩 파종하여 하룻밤 배양하였다. 웰 중의 접착 세포를, 1 mg/mL가 되도록 AGE화 단백질을 용해시킨 8.4% FBS를 함유하는 M199 배지(0.1 mL/웰)에 폭로하여, 4 일간 배양을 하였다. 폭로 종류 후, 상기 배지를 제거하여, 10%의 발색 기질(상품명 WST-1; 타카라바이오사 제조)을 포함하는 M199 배지에서 배양하여, 40 분 후에 있어서의 파장 450 nm의 흡광도를 측정하여 생세포수를 구하였다. 이 결과를 도 15의 그래프에 나타낸다. 한편, 도면에 있어서 DGE-BSA는 3,4-DGE-BSA를 나타낸다.
도시한 것과 같이, 다른 단백질은 세포 활성에 영향을 주지 않았는데 반해, 3,4-DGE로 AGE화한 BSA 용액에 폭로한 세포는 그 활성이 약 25%까지 저하하고 있었다. 이 결과로부터, 3,4-DGE로부터 생성된 AGE화 단백질은 매우 강한 세포 독성을 보이는 것이 확인되었다.
실시예 8
복막 투석액에 포함되는 3,4-DGE로부터 AGE가 형성되는 것을 상기 실시예 1에서 조제한 항체를 이용하여 검출하였다.
복막 투석액으로서, 3,4-DGE를 포함하지 않는 투석액 A, 3,4-DGE 농도가 15 μM인 투석액 B, 3,4-DGE 농도가 6 μM인 투석액 C를 각각 사용하였다. 우선, 각 투석액과 200 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)을 체적비 9:1(v/v)로 혼합하고, pH를 7.15∼7.27로 조정한 후, 2 mg/ml가 되도록 HSA(인간 혈청 알부민)을 용해하였다. 이 용액을 37℃에서 4 주간 항온처리한 것을 분석 시료로 하였다. 이들 각 시료 3 ㎍으로 SDS-PAGE를 실시하고, 상기 실시예 1에서 제작한 항체를 이용하여, 상기 실시예 3과 같은 식으로 하여 웨스턴 블로팅을 행하였다. 또한, 음성 대조군으로서, HSA, 양성 대조군으로서 3,4-DGE-HSA에 대해서, 마찬가지로 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅을 행하였다. 한편, 양성 대조군인 3,4-DGE-HSA는 상기 실시예 3과 같은 식으로 조제하였다. 이 결과를 도 16에 도시한다. 도 16에 도시한 바와 같이, 3,4-DGE를 포함하는 투석액 A, B, C와 HSA를 항온처리하여 얻어진 분석 시료에서는, 116 kDa, 200 kDa 부근에서, 항체와의 반응을 보이는 밴드가 확인되었다. 이들 116 kDa, 200 kDa 부근의 밴드는 HSA의 분자량이 66 kDa이므로, 3,4-DGE와의 반응에 의해 가교한 HSA의 이량체 및 삼량체라고 생각된다. 이와 같이, 3,4-DGE를 함유하는 투석액을 사용하면, 이것과 단백질이 반응하여 3,4-DGE에서 유래하는 AGE가 형성되는 것이 확인되었다. 또한, 상기 실시예 1에서 제작한 항체에 의해 이들 AGE를 검출할 수 있으므로, 밴드의 농도를 비교함으로써, 생성된 AGE의 정량도 가능하다고 생각된다.
실시예 9
신부전 환자의 결성 단백질을 분석 시료로 하고, 상기 실시예 1에서 제작한 항체를 이용하여 3,4-DGE 유래의 AGE의 유무를 확인하였다.
9 명의 신부전 환자의 혈청 단백질(알부민 풍부 총 단백질)을 시료로 하여, 각각 8 ㎍으로 SDS-PAGE를 실시하고, 상기 실시예 1에서 제작한 항체를 이용하여, 실시예 3과 같은 식으로 웨스턴 블로팅을 행하였다. 또한, 아울러 건강한 사람의 혈청 단백질도 시료로 하였다. 양성 대조군은 상기 실시예 8과 같은 3,4-DGE-HSA를 사용하였다. 이 결과를 도 17에 도시한다. 한편, 도 17에 있어서는, 9 명의 환자 중 2 명(환자 A 및 환자 B)의 결과를 나타낸다. 도 17에 도시한 바와 같이, 환자 A 및 환자 B의 시료에서는, 116 kDa 부근에서 항체와의 반응을 보이는 밴드가 확인되었다. 또한, 나머지 7 명의 환자에 있어서도 도 17과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 이에 반해 건강한 사람에게 있어서는 거의 밴드가 확인되지 않았다. 이 결과로부터, 신부전 환자의 혈청에는 3,4-DGE에서 유래하는 AGE가 존재하는 것이 확인되었다.
이상과 같이, 본 발명의 항AGE 항체에 따르면, 예컨대, 3,4-DGE 유래의 AGE를 검출할 수 있다. 이 때문에, 본 발명은, 상기 3,4-DGE 유래 AGE의 한층 나아간 연구나, 또한 상기 3,4-DGE 유래 AGE가 관여한다고 생각되는 각종 질환의 진단 등에 유용하다고 말할 수 있다.

Claims (26)

  1. 후기 당화 반응 생성물(AGE: advanced glycation endproduct)에 대한 항체로서, 상기 AGE가 3,4-디데옥시글루코손-3-엔(3,4-DGE)과 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물인 것을 특징으로 하는 항AGE 항체.
  2. 제1항에 있어서, 메틸글리옥살(MGO), 글리옥살(GO), 3-데옥시글루코손(3-DG), 5-히드록시메틸-푸르푸랄(5-HMF), 푸르푸랄(Fur), 포름알데히드(FA), 글루코스(Glu) 및 아세트알데히드(AA)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 카르보닐 화합물과 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물에 반응하지 않는 항AGE 항체.
  3. 제1항에 있어서, 펜토시딘 잔기 및 카르복시메틸리신(CML) 잔기 중 적어도 한 쪽을 갖는 단백질 또는 펩티드에 반응하지 않는 항AGE 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 AGE가 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드를 25∼50℃에서 항온처리함으로써 얻어지는 반응 생성물인 항AGE 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 혈청 알부민인 항AGE 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 혈청 알부민이 토끼 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 및 인간 혈청 알부민으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 알부민인 항AGE 항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 AGE가, 단백질에 대하여, 상기 단백질의 아미노기의 2.5 등량이 되도록 3,4-DGE를 첨가하여 37℃에서 3 일간 항온처리한 후, 또한 상기 단백질의 아미노기의 2.5 등량이 되도록 3,4-DGE를 첨가하여 37℃에서 4 일간 항온처리함으로써 얻어진 반응 생성물인 항AGE 항체.
  8. 제1항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체인 항AGE 항체.
  9. 제1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 항AGE 항체.
  10. 제1항에 있어서, 항체가 상기 AGE를 항원으로 하여 숙주 동물을 면역 감작한 후, 상기 동물의 혈액 또는 복수로부터 단리함으로써 얻어진 항체인 항AGE 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 숙주 동물이 토끼인 항AGE 항체.
  12. 시료와 AGE에 대한 항AGE 항체를 반응시켜 상기 시료 중의 AGE와 항AGE 항체와의 항원 항체 반응에 의해 상기 시료 중의 AGE를 검출하는 방법으로서, 상기 AGE가 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물이며, 상기 항AGE 항체가 제1항 에 기재한 항AGE 항체인 것을 특징으로 하는 AGE 검출 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항원 항체 반응을 효소 면역 측정법, 방사선 면역 측정법, 라텍스 응집법 및 금 콜로이드 입자법으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 면역학적 방법에 의해 검출하는 것인 AGE 검출 방법.
  14. AGE에 대한 항AGE 항체를 이용하여 상기 AGE를 생성하는 시료 중의 카르보닐 화합물을 검출하는 방법으로서, 상기 카르보닐 화합물이 3,4-DGE이고, 상기 AGE가 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물이며, 상기 항AGE 항체가 제1항에 기재한 항AGE 항체이고, 상기 시료 중의 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드를 반응시키는 공정, 상기 반응에 의한 생성물과 상기 항AGE 항체를 반응시키는 공정, 상기 생성물과 상기 항AGE 항체와의 항원 항체 반응에 의해, 생성된 AGE를 검출하는 공정 및 상기 AGE의 유무 또는 양으로부터 시료 중의 3,4-DGE를 정성 또는 정량하는 공정을 포함하는 카르보닐 화합물의 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항원 항체 반응을 효소 면역 측정법, 방사선 면역 측정법, 라텍스 응집법 및 금 콜로이드 입자법으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 면역학적 방법에 의해 검출하는 것인 카르보닐 화합물의 검출 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 시료가 투석액, 점적액, 주사액, 식품 또는 체액인 카르보닐 화합물의 검출 방법.
  17. AGE에 대한 항AGE 항체를 포함하는 면역 시약으로서, 상기 AGE가 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물이며, 상기 항AGE 항체가 제1항에 기재한 항AGE 항체인 것을 특징으로 하는 면역 시약.
  18. 제17항에 있어서, 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물인 AGE를 검출하기 위한 시약인 면역 시약.
  19. 제17항에 있어서, 3,4-DGE를 검출하기 위한 시약인 면역 시약.
  20. 후기 당화 반응 생성물(AGE: advanced glycation endproduct)에 대한 항체의 제조 방법으로서, 상기 AGE가 3,4-디데옥시글루코손-3-엔(3,4-DGE)과 단백질 또는 펩티드와의 반응 생성물이며, 상기 AGE를 항원으로 하여, 인간을 제외한 숙주 동물을 면역 감작하는 공정과, 상기 면역 감작에 의하여 생성된 상기 AGE에 대한 항체를 회수하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 항AGE 항체의 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 3,4-DGE와 단백질 또는 펩티드를 25∼50℃에서 항온처리함으로써 상기 AGE를 생성하는 공정을 포함하는 항AGE 항체의 제조 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 단백질이 혈청 알부민인 항AGE 항체의 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 혈청 알부민이 토끼 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 및 인간 혈청 알부민으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 알부민인 항AGE 항체의 제조 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 AGE의 생성 공정이, 단백질에 대하여, 상기 단백질의 아미노기의 2.5 등량이 되도록 3,4-DGE를 첨가하여 37℃에서 3 일간 항온처리한 후, 또한, 상기 단백질의 아미노기의 2.5 등량이 되도록 3,4-DGE를 첨가하여 37℃에서 4 일간 항온처리함으로써 AGE를 생성하는 공정인 항AGE 항체의 제조 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 회수 공정이 면역 감작한 상기 숙주 동물의 혈액 또는 복수로부터 항체를 단리하는 공정인 항AGE 항체의 제조 방법.
  26. 제20항에 있어서, 상기 숙주 동물이 토끼인 항AGE 항체의 제조 방법.
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