JP5875190B2 - メチルグリオキサール−スカベンジング化合物ならびに疼痛および/または痛覚過敏の予防および治療のためのその使用 - Google Patents
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Description
ピルブアルデヒドまたは2−オキソ−プロパナール(CH3−CO−CH=O)とも呼ばれるメチルグリオキサール(MG)は、アルデヒド型のピルビン酸である。それは、2個のカルボニル基を有することから、α−ジカルボニル化合物である。生物において、メチルグリオキサールは、数個の代謝経路の副生成物として形成される。MGは、トレオニン異化の中間体である3−アミノアセトンから、ならびに脂質過酸化によって生成する可能性がある。しかしながら、最も重要な供給源は解糖であって、そこでメチルグリオキサールは、2種の解糖中間体であるグリセルアルデヒドリン酸およびジヒドロキシアセトンリン酸からの非酵素的リン酸脱離から生じる。メチルグリオキサールは高度に細胞毒性であるので、生体はいくつかの解毒メカニズムを発達させた。これらの一つはグリオキサラーゼ系である。メチルグリオキサールは、グルタチオンと反応してヘミチオアセタールを形成する。これは、グリオキサラーゼI(GLO−I)によってS−D−ラクトイル−グルタチオンに変換され、次にグリオキサラーゼII(GLO−II)によってさらにD−乳酸に代謝される。
本発明によると、この目的は、メチルグリオキサール(MG)および/または反応性カルボニル種(RCS)と、アルギニン−またはリシン−含有タンパク質との結合を阻害するかまたはそれと拮抗する化合物を提供することによって解決される。
(a)スクリーニングされるべき化合物を提供すること、
(b)本発明による化合物を提供すること、
(c)(a)のスクリーニングされるべき化合物が疼痛および/または痛覚過敏の発生および/または進行に及ぼす効果を判定すること
を含む。
下記に本発明をより詳細に説明する前に、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコールおよび試薬が異なりうることから、本発明がこれらに限定されないことを了解されたい。本明細書に使用された用語が、特定の態様のみを説明するためであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するつもりはないことも了解されたい。特に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明のために、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体で参照により組み入れられる。
上記に概要したように、本発明は、メチルグリオキサール(MG)および/または反応性カルボニル種(RCS)と、アルギニン−またはリシン−含有タンパク質との結合、すなわちメチルグリオキサール(MG)および/または反応性カルボニル種(RCS)と、これらのタンパク質のアルギニンまたはリシン残基との結合を阻害するかまたはそれと拮抗する化合物を提供する。
− in vivoおよびin vitroでメチルグリオキサールおよび他のRCSに結合およびスカベンジングする、
ならびに/または
− タンパク質、好ましくはアルギニン−もしくはリシン−含有(細胞性)タンパク質、ナトリウムイオンチャンネルNa(v)1.8などに結合するためにメチルグリオキサールおよび他のRCSと拮抗および/または競合する、
ならびに/または
− メチルグリオキサールおよび他のRCSによるタンパク質、好ましくはアルギニン−もしくはリシン−含有(細胞性)タンパク質、ナトリウムイオンチャンネルNa(v)1.8などの改変を防止する、
ならびに/または
− メチルグリオキサールおよび他のRCSによる終末糖化産物(AGE)の形成を阻害および/もしくは阻止する
ことができる。
本発明のスカベンジング化合物の好ましい一態様は、GEXPモチーフの数個および/または多数の繰り返しを含むペプチドである。
− in vivoおよびin vitroでメチルグリオキサールおよび他のRCSと結合およびそれをスカベンジングする
ならびに/または
− タンパク質、好ましくはアルギニン−もしくはリシン−含有(細胞性)タンパク質、ナトリウムイオンチャンネルNa(v)1.8などへの結合についてメチルグリオキサールおよび他のRCSと拮抗するかおよび/もしくは競合する
ならびに/または
− メチルグリオキサールおよび他のRCSによる、タンパク質、好ましくはアルギニン−もしくはリシン−含有(細胞性)タンパク質、ナトリウムイオンチャンネルNa(v)1.8などの修飾を防止する、
ならびに/または
− メチルグリオキサールおよび他のRCSによる終末糖化産物(AGE)の形成を阻害および/もしくは防止する
潜在能である。
− タグおよび/もしくはラベル、
ならびに/または
− リンカー、
ならびに/または
− メチルグリオキサール結合性ポケットを有する小分子などの薬物
を含む。
本発明の文脈内で、「タグ」または「ラベル」は、以下を表す(が、それだけに限定されない):
・ 親和性タグまたは精製タグ:
Hisタグまたはポリ(His)(例えば6×His)、キチン結合性タンパク質(CBP)、マルトース結合性タンパク質(MBP)、およびグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)など
・ 可溶化タグ
チオレドキシン(TRX)およびポリ(NANP)など
・ 細胞透過性タグ
・ クロマトグラフィータグ
FLAG−タグなど
・ エピトープタグ
V5−タグ、c−myc−タグ、およびHA−タグなど
・ 抗体または抗体フラグメントタグ
好ましくは、例えばGEXPモチーフのN−末端がスクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)およびN−スクシンイミジル(succinimdyl)3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)などのクロスリンカーを経由して関心が持たれる抗体のスルフヒドリル基に連結することによる
・ 蛍光タグまたはラベル
緑色蛍光タンパク質(GFP)およびその誘導体(EGFP、CFP、ECFP、YFP、EYFPなど)、zoanFPまたは赤色蛍光タンパク質drFP583およびそれらの誘導体など
ならびに蛍光色素、
Alexa色素、ロダミンおよびフルオレセインの誘導体、Cy−色素
・ 放射性同位体
in vivoイメージング用、18F、67Ga、81mKr、82Rb、99mTc、111In、123I、133Xe、および201TIなど;治療用、90Yおよび131Iなど
・ 造影剤
ガドリニウム(Gd)錯体、超常磁性(supramagnetic)鉄(Fe)の錯体および粒子、高原子番号の原子を含む化合物、すなわちコンピュータ断層撮影(CT)用ヨウ素、これらの造影剤を中に含むマイクロバブルおよびリポソームなどの担体など。
本発明の一態様では、特にその化合物がタグ、ラベル、薬物などのさらなる成分も含む場合、その化合物はリンカーまたはスペーサーを含む。
薬物は、好ましくは小分子であり、その小分子は、好ましくはメチルグリオキサールまたは他のRCSと結合するポケットを含む。
[式中、
Xは、ArgまたはLysであり、
mは、少なくとも1であって、好ましくは1であり、
nは、少なくとも2であって、好ましくは10であり、
N’は、N−末端を意味し、
C’は、C−末端を意味する]のペプチドである。
− N−末端Hisタグ(His)6;
− X=Argの場合のGEXPモチーフの10個の繰り返し(GERP)10;および
− HisタグとGEXPモチーフの間のリンカーまたはスペーサー(Gly)4;
を含み、すなわちそれは以下の一般式
− 複数のユニットのGERPが連結された場合、メチルグリオキサールと相互作用するアルギニン側鎖内の相互作用性アミノ基の両方のpKaを減少させるように、繰り返しモチーフ内の各アルギニンが相互に極めて近接するように(3残基の距離)、アルギニンを配置した、
− これを容易にするために、カルボキシレート側鎖がその後のメチルグリオキサールとの反応で触媒塩基として作用することができるように、アルギニンをグルタミン酸残基の隣に配置した
− アスパラギン酸残基は脱水に非常に感受性で環状イミド中間体を形成し、それがペプチド鎖の切断を招くおそれがあることから、複数のアスパラギン酸塩基を有するペプチドの安定性が低いという理由から、アスパラギン酸よりもグルタミン酸を選択した。
上に概略したように、本発明は、メチルグリオキサールおよび/または反応性カルボニル種(RCS)のスカベンジャーとしての本発明の化合物を提供する。
上に概要したように、本発明は、本明細書に規定された少なくとも1種の化合物、好ましくは本明細書に規定された少なくとも1種のGEXPモチーフ含有ペプチドと、場合により薬学的に許容されうる担体および/または賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。
小径線維遠位多発神経障害は、糖尿病を患うヒトの10%に持続性の痛覚過敏および疼痛を発生させる。代謝性痛覚過敏は、反応性解糖代謝物メチルグリオキサール(MG)に基づく。血漿中濃度が600nMを超えるMGは、疼痛を有する糖尿病患者と疼痛を有さない糖尿病患者を区別し、マウスにおいて熱痛覚過敏を誘発し、皮弁におけるCGRP放出を誘導する。MGで処置された培養感覚ニューロンは、ナトリウムチャンネルNav1.8におけるアルギニンの強いMG改変ならびに電気興奮性および膜抵抗の増加を示す。活動電位起動器に及ぼすMGの効果は、侵害受容ニューロンにおける発火を促進するが、Nav1.8の発現を欠如する自律神経系のニューロンを阻害する。実験的糖尿病においてMG結合性ペプチドが痛覚過敏を軽減可能であり、それゆえに有痛性糖尿病性神経障害のための最初の病原ベースの処置選択肢を提供するので、代謝的に推進される疼痛の理解は、治療的介入に有用である。
好ましくは、本発明の化合物(GEXPモチーフ含有ペプチドなど)または薬学的組成物の投与経路は、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入、坐剤によるより選択される。
本発明の化合物(GEXPモチーフ含有ペプチドなど)または薬学的組成物は、該薬学的組成物の治療有効量の該化合物(該GEXPモチーフ含有ペプチドなど)を含むように提供される。
本発明は、さらに、スクリーニング法、特に疼痛および/または痛覚過敏、特にメチルグリオキサールおよび/または反応性カルボニル種(RCS)によって発生するまたはそれに関連する疼痛および/または痛覚過敏に影響する化合物を同定/スクリーニングするための方法を提供する。
(a) スクリーニングされるべき化合物を提供すること
(b) 本発明による化合物(本明細書において同義のGEXPモチーフ含有ペプチドなど)を提供すること、
(c) 適切な試験モデルにおいて疼痛および/または痛覚過敏の発生および/または進行に及ぼす、(a)のスクリーニングされるべき化合物の効果を判定すること。
を含む。
− アルギニン含有タンパク質、好ましくはアルギニン含有細胞性タンパク質、より好ましくはナトリウムイオンチャンネルNa(v)1.8、ならびに/または
− メチルグリオキサールおよび/もしくは反応性カルボニル種(RCS)
の一つまたは複数を含みうる。
方法
マウスモデル
マウスは、12時間/12時間の明暗サイクルで、餌および水を自由摂取させて個別に飼育した。この研究の手順は、ドイツのチュービンゲンおよびカールスルーエ行政管区庁の動物実験委員会によって承認された。
糖尿病は、無菌クエン酸ナトリウム(0.05M、pH4.5)に新鮮溶解された60mg/kgのSTZの連続6日間i.p.投与によって誘導した。対照動物には、クエン酸ナトリウムのみを与えた。糖尿病は、16〜25日後に尾静脈からの試料の血中グルコースレベルを、ACCU-CHEKグルコーススティックおよび従来のAccutrendグルコメーターを用いて測定することによって検証した。糖尿病の発症から最初の2週間に、血中グルコースを毎日測定した。ときとしてグルコースレベルが回復した場合、追加的なSTZ注射を25〜27日目に行った。90%を超えるマウスが最初の4週間以内に糖尿病になり、それを実験全体にわたり使用した。血中グルコースが300mg/dlを超えて増加するやいなや、1〜2UのインスリンSemilenta(40U/ml)の個別の補給を開始した。ひとたびグルコースレベルが安定になったならば、最初の2か月間は少なくとも週に1回、その後は2週間毎に血中グルコースを決定した。厳しい血中グルコースのコントロールは、実験全体にわたり個別の血中グルコースレベルを安定に保った。実験の終わりにマウスをCO2で屠殺し、両方の坐骨神経を解剖し、秤量し、液体窒素中で急速凍結させた。
L1−L6後根神経節(DRG)ニューロンの単離および培養は、StuckyおよびLewin[39]によって記載されたように行った。簡潔には、DRGを切除し、根および膜を取り出し、カルシウムおよびマグネシウム不含の無菌PBS中に入れた。神経節を収集し、10%ウマ血清、2%ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、1% L−グルタミンおよび0.8% D−グルコース(w/v)を含有するDMEM/F12(1:1、v/v)中に再懸濁した。0.1%コラゲナーゼを添加し、組織を37℃で45分間インキュベーションした。0.05%トリプシンを含有する成長培地中で組織を37℃でさらに45分間インキュベーションした。次に、先端熱加工したパスツールピペットを通過させるトリチュレーションによって個別の細胞を解離させた。250gで5分間遠心分離後に、結果として生じたペレットを成長培地中で2回洗浄した。最終的に、マウス神経成長因子(100ng/ml)を補充したポリ−L−オルニチン(1μg/ml)およびラミニン(25μg/ml)を予めコーティングしておいた6ウェルプレートまたはカバーガラスのいずれかの上に、細胞を直ちに蒔いた。5% CO2を有する37℃のインキュベーター中で細胞を維持した。24時間のインキュベーション後に、培地にシトシンアラビノシド(10μM)を補充し、さらに12時間インキュベーションし、その後70〜80%の集密度に達するまで2日毎に培地を交換した。
痛覚過敏は、電子コントロールされたホットプレート痛覚消失測定装置(Columbus Instructments, Columbus, Ohio)を用いたホットプレートアッセイで50℃で検討した[40,41]。ジャンプ逃避応答が起こったときもしくは後足を舐めたとき、または60秒の最大カットオフ時間が経過後に、各マウスをホットプレートから出した。マウスが最初の不快の徴候(後ろ足を上げる、舐める、または振り回す、およびジャンプする)を示すまでの潜時を二人の研究者が記録した。特定時点のそれぞれで動物毎に三つの測定値を採用し、平均した。対照と処置動物の間の潜時の差を痛覚過敏の尺度として計算した。
総RNAは、坐骨神経からTrizol(Invitrogen)を使用して、そして培養DRGからRNeasyミニキット(Qiagen, Hilden, Germany)を使用して製造業者の説明書に従って抽出した。坐骨神経またはDRGのいずれかからの合計2μgの総RNAを1μgのオリゴd(T)(Promega, Heidelberg, Germany)と65℃で10分間アニーリングさせ、次に、15ユニットのトリ骨髄芽球症逆転写酵素(Promega, Heidelberg, Germany)を用いて42℃で1時間逆転写のために使用した。cDNAを直ちに使用するか、または−80℃で保存した。リアルタイムPCRをLightCycler(Roche, Mannhiem, Germany)で行った。2μlのcDNAを適切なプライマー(5pmol)およびSYBR Green試薬(Roche, Mannhiem, Germany)と混合し、最終体積を20μlとした。使用したプライマーを表1にまとめる。サイクリング条件は、(95℃、10分);(95℃、10秒;57℃、5秒;72℃、5秒)×45回;(65℃、15分)であった。予想されるPCR産物は約180bpであった。
坐骨神経について、液体窒素を使用して凍結組織試料を微粉末になるまで粉砕した。氷冷した溶解緩衝液(10mM HEPES;10mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、0.6% NP40、0.5mM DTT、0.2mM PMSF;pH7.9)中でホモジェネートを再懸濁し、氷上で20分間インキュベーションした。次に組織ホモジェネートをボルテックスで撹拌し、遠心分離(14000rpm;10分;4℃)し、分析のために上清を確保した。
グリオキサラーゼI活性は、S−D−ラクトグルタチオンの形成によって発生する240nmでの吸光度の変化初速度をモニターする分光測定法を使用することによって決定した[44]。ヘミチオアセタールからS−D−ラクトイルグルタチオンへの変換について、モル吸光係数の変化は、Δε240=2.86mM-1cm-1である。標準アッセイ混合物は、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH6.6、37℃)中に2mMメチルグリオキサールおよび2mM GSHを含有した。反応混合物を10分間放置させてから、細胞内可溶質タンパク質画分(20μg)を添加してヘミチオアセタール形成が確実に平衡になるようにした。
マウス血漿試料中のメチルグリオキサール濃度は、以前に記載された方法を使用して1,2−ジアミノ−4,5−ジメトキシベンゼンを用いた誘導体化によって決定した[45−47]。屠殺時に球後血管から血液試料を抜き取り、EDTAが入ったチューブに入れ、遠心分離(2000g;5分)した。血漿を取り出し、10%TCA(0.1ml)で酸性化した、試料を直ちに分析するか−80℃で保存するかのいずれかとした。
坐骨神経または培養DRGからの総タンパク質抽出物(20μg)をLaemmliローディングバッファー中、95℃で5分間インキュベーションし、10%トリス−グリシンアクリルアミドゲル上にて変性条件下で分離し、ニトロセルロースメンブランに移行させ、5%脱脂粉乳を用いて室温で1時間ブロッキングした。次に、メンブランを、PBS含有0.05% Tween20(PBS−T)に入れた5%脱脂粉乳中でヤギポリクローナル抗グリオキサラーゼIgG抗体(1:500希釈)(Santa Cruz, Santa Cruz, USA)と共にさらに1時間インキュベーションした。PBS−Tで洗浄後、メンブランを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合型ロバ抗ヤギIgG二次抗体(1:1000)(Santa Cruz, Santa Cruz, USA)と共に45分間インキュベーションした。ECL検出試薬を製造業者の説明書に従って使用して、約10分の照射時間で免疫反応性タンパク質をX線フィルム上に視覚化した。
抽出および単離後に、DRGを高血糖条件(30mMグルコース)下、カバーガラップ上で3日間培養し、グリオキサラーゼIに関して染色した。培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、その後4%パラホルムアルデヒド中で固定した。スライドを3%過酸化水素のメタノール溶液中、室温で5分間処理した。ブロッキングは、3%正常ウマ血清を用いて室温で30分間行ってから、マウス抗グリオキサラーゼモノクローナル抗体(SouthWestern Med. School, Dallas, USA)を一次抗体(1:150)として使用した。スライドをPBSで3回2分間洗浄し、シグナルの検出は、マウスIgG用Vectastain ABCキット(Vector Laboratories Inc., Burlingham, CA, USA)を製造業者の説明書に従って使用して行った。ペルオキシダーゼ活性は、0.05% 3,3−ジアミノベンジジン−四塩酸(Vector Laboratories Inc.)を用いて視覚化してから、スライドをMayerのヘマトキシリン(Vector Laboratories Inc.)で対比染色した。坐骨神経組織もグリオキサラーゼIについて染色した。組織を4%パラホルムアルデヒド中、室温で15分間固定した。凍結切片(4μm)を作製し、それに続くスライドを上記のように処理したが、例外として、使用した一次抗体は、ヤギ抗グリオキサラーゼポリクローナル抗体(Santa Cruz, Santa Cruz, USA)であり、シグナルの検出は、ヤギIgG用Vectastain ABCキット(Vector Laboratories Inc.)を使用して行った。一次抗体を省略し、それをPBSに置き換え、血清濃度を一致させることによって、免疫特異性についての対照を全ての実験に加入させた。染色強度は以下のスコアに従って求めた:0、染色陰性;1、弱い染色強度;2、中等度の染色強度;3、強い染色強度。
様々な濃度のメチルグリオキサール(0.7μM〜700μM)を0.9% NaCl溶液として静脈内注射することによって、健康な野生型マウス(雄;10〜12週)を処置した。対照群には0.9% NaCl溶液を注射した。3時間のインキュベーション時間の後に痛覚過敏を評価した。
全長マウスグリオキサラーゼI cDNAをサイトメガロウイルスプロモーターのコントロール下でpCMV6−Neo発現ベクターにクローニングした。pGL3−ルシフェラーゼベクターを対照として使用した。1.5μg/g濃度のベクターまたはGLO1プラスミドDNAを150μlのリポソームトランスフェクション試薬(DOTAP; Roche, Mannheim, Germany)中で懸濁し、室温で15分間インキュベーションしてから、野生型(雄;18〜20週)マウスに4日毎に合計10日間腹腔内注射することによって投与した。注射前に痛覚過敏を測定した。実験の終了時に、全てのマウスを屠殺し、メチルグリオキサール濃度の決定のために血漿を単離した。
健康な野生型マウス(雄;10〜12週)を50μg/g(i.p)の細胞透過性グリオキサラーゼI阻害剤S−p−ブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステルで48時間、前処置した。48時間後に痛覚過敏を評価した。次に、マウスを2日毎に15日間処置し、その間に痛覚過敏の継続評価を行った。選択された時点でマウスを屠殺し、メチルグリオキサール濃度の決定のために血漿を単離した。
健康な野生型マウス(12週;雄)に90分間静脈内注射することによってメチルグリオキサール(70μM)を投与し、その後に皮下注射によるテトロドトキシン(TTX;5〜7.5ng/g)または経口投与によるアンブロキソール(AMX;1%メチルセルロース中に500μg/g)のいずれかでマウスを処置した。追加的な90分後に、痛覚過敏を評価した。アンブロキソールが糖尿病誘導性疼痛に及ぼす効果を判定するために、前記のように糖尿病野生型マウス(18週、雄)にアンブロキソールを投与した。投与の前および後(3時間)に痛覚過敏を測定した。
マウス電位開口型ナトリウムチャンネル1.8、1.9(それぞれScn10aおよびScn11a)についての設計済みsiRNAであるTRPA1およびTRPV1は、Ambion(登録商標)(Applied Biosystems)から購入した。濃度1.5μg/gのsiRNAを150μlのリポソームトランスフェクション試薬(DOTAP; Roche, Mannheim, Germany)中に懸濁し、室温で15分間インキュベーションしてから、健康な野生型マウス(雄;10〜12週)に静脈内注射によって3日毎に10日間投与した。10日目に、マウスにメチルグリオキサール(70μM)または対照としてのPBSのいずれかを注射した。3時間後に、痛覚過敏を評価し、マウスを屠殺した。処置されたマウスのノックダウンを確認するために、坐骨神経およびDRGを取り出し、前記のように総RNAを抽出し、リアルタイムPCRを行った。
メチルグリオキサールの効果的なin vivoスカベンジャーとして作用する、1分子あたり10個のアルギニン残基を含有する合成ペプチドGERP001を研究室内で設計し、合成した(GenWay Biotech, Inc. San Diego, CA, USA)。健康な野生型マウス(雄;10〜12週)に、0.9% NaCl(対照)またはメチルグリオキサール(70μM)のいずれかを注射する30分前に1mgのGERP001または(アルギニン残基をアラニンに代えた)対照ペプチドGEAPのいずれかを腹腔内注射した。メチルグリオキサールを投与した3時間後に痛覚過敏を評価した。GERPが糖尿病誘導性痛覚過敏に及ぼす効果を判定するために、STZ誘導性糖尿病の野生型マウス(雄;18週)に1mgのGERP001またはGEAPのいずれかを腹腔内注射した。24時間後に、ホットプレートアッセイによって痛覚過敏を評価した。
PC12細胞を175cm2培養皿に蒔き、10%ウマ血清、5%ウシ胎児血清および1%ストレプトマイシン/ペニシリン溶液を補充されたRPMI1640培地中で成長させた。細胞をCO2インキュベーター中で37℃で培養し続けた。ひとたび細胞が集密状態(約20×106個)に達したならば、細胞を30mM D−グルコースまたはメチルグリオキサール(50〜500μM)で3時間またはグリオキサラーゼI阻害剤(4μM)で24〜72時間処理した。
ヒト、ラットおよびマウス由来のNav1.8におけるメチルグリオキサール改変の有望な部位を決定するためのレセプター結合ドメイン(RBD)分析。簡潔には、Nav1.8についてのアミノ酸配列(アクセッション番号Q9Y5Y9、ヒト;アクセッション番号Q62968、ラット;アクセッション番号Q6QIY3、マウス)をUniProtKB/Swiss-Protデータベース(http://www.expasy.org)から得た。残基の疎水性をProtscale(http://us.expasy.org/tools/protscale.html)を使用して計算し、Embosswin(http://perso.wanadoo.fr/ablavier/embosswin/embosswin.html)を使用して平均疎水性モーメントを計算した。疎水性および平均疎水性モーメントの値の両方を配列番号と共にアライメントし、疎水性対平均疎水性モーメントのプロットを生成させ、Galletら[48]によって記載されたように区分した。次に、RBD内に見出されたアルギニンおよびリシン残基をメチルグリオキサールによる改変についての潜在的ホットスポットとしてクローズアップした。残基のpKaにおける差に基づきより高い改変潜在能を有するアルギニンおよびリシン残基を同定する試みは、不可能であった。それは、Nav1.8についての結晶構造がたとえ入手可能であっても不完全であったからである。その代わりに、メチルグリオキサールと最も反応性のアルギニンおよびリシン残基は、双方の相互作用性アミノ基のpKaを減少させる近接したアルギニンおよびリシン残基を有する残基であって、配列のもう一方の側に塩基触媒として作用するグルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボキシレート側鎖を有するという基準に基づき、アミノ酸配列を参照して同定を行った[48,50]。この選択基準を使用して、糖化ホットスポットの合計数を確定した。ClustWが組み込まれているBioeditを使用して多配列アライメントを行った。
対照および処置についての平均潜時の間の有意差は、Studentのt検定を使用して判定し、Microsoft Excelの統計パッケージを使用して行った。
Claims (20)
- 左巻きヘリックスを形成する、請求項1記載のペプチド。
- 40〜500アミノ酸長を有する、請求項1又は2記載のペプチド。
- 40〜50アミノ酸長を有する、請求項3記載のペプチド。
- タグ、ラベル、リンカー、および/または薬物を含む、請求項1〜4のいずれか記載のペプチド。
- m=1でタグ、Hisタグと、
ポリグリシンリンカーと
を含み、
X=Argおよびn=10でGEXPモチーフ
を含む、請求項1〜6のいずれか記載のペプチド。 - 配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項7記載のペプチド。
- さらに、N−末端および/またはC−末端の修飾を含む、請求項1〜8のいずれか記載のペプチド。
- N−および/またはC−末端のアセチル化および/またはアミド化を含む、請求項7記載のペプチド。
- 医薬に使用するための、請求項1〜10のいずれか記載のペプチド。
- メチルグリオキサールおよび/または反応性カルボニル種(RCS)のスカベンジャーとしての、請求項1〜10のいずれか記載のペプチド。
- アルギニン−含有タンパク質との結合に関するメチルグリオキサールのアンタゴニストとしての、請求項1〜10のいずれか記載のペプチド。
- タンパク質が、細胞性ナトリウムイオンチャンネルタンパク質である、請求項13記載のペプチド。
- メチルグリオキサールおよび/または反応性カルボニル種(RCS)によって発生するかまたはそれに関連する疼痛および/または痛覚過敏の予防および/または治療のための、請求項1〜10のいずれか記載のペプチド。
- 予防および/または治療されるべき疼痛および/または痛覚過敏が、疾患と関連および/または疾患の経過中に発生し、該疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、白内障発生、慢性腎不全および慢性または急性尿毒症、嚢胞性線維症、レビー小体型認知症、糖尿病およびその合併症、虚血−再潅流、子癇前症、乾癬、リウマチ様関節炎および若年性慢性関節炎、重症敗血症、全身性アミロイドーシス、パーキンソン病、有痛性腸疾患、化学療法誘導疼痛、重症虚血肢、高血圧、骨痛、腫瘍疼痛より選択される、請求項15記載のペプチド。
- 予防および/または治療されるべき疼痛が、異痛症である、請求項16記載のペプチド。
- 請求項1〜10のいずれか記載の少なくとも1種のペプチドを含む薬学的組成物。
- さらに薬学的に許容されうる担体および/または賦形剤を含む、請求項18記載の薬学的組成物。
- (a)スクリーニングされるべき化合物を提供すること、
(b)請求項1〜10のいずれか記載のペプチドを提供すること、
(c)(a)及び(b)の両者に対するメチルグリオキサールおよび/または反応性カルボニル種(RCS)を提供すること、及び
(d)(a)の化合物がメチルグリオキサールおよび/または反応性カルボニル種(RCS)に結合し、(a)の化合物が疼痛および/または痛覚過敏に影響するか否かを評価すること
を含む、メチルグリオキサールおよび/または反応性カルボニル種(RCS)によって発生またはそれに関連する疼痛および/または痛覚過敏に影響する化合物を同定するための方法。
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