KR20020072557A

KR20020072557A - 카르보닐 스트레스 개선제

Info

Publication number: KR20020072557A
Application number: KR1020027007919A
Authority: KR
Inventors: 도시오 미야타
Original assignee: 구로카와 기요시; 미야타 도시오
Priority date: 1999-12-20
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2002-09-16
Also published as: US20030143215A1; WO2001045733A1; EP1240902A1; CA2394938C; CN100355452C; US7029906B2; JP4812996B2; AU1891901A; CN1433320A; CA2394938A1; JP2011173904A; AU780067B2; EP1240902B1; EP1240902A4

Abstract

글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소 및 카르보닐 화합물 환원제를 유효성분으로 하는 카르보닐 스트레스 개선제가 제공된다. 본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제는 카르보닐 화합물을 신속하게 소거하여 카르보닐 스트레스 상태를 개선한다.

Description

카르보닐 스트레스 개선제{Carbonyl Stress-Ameliorating Agents}

생체내에서 당·지질유래의 여러가지 카르보닐 화합물이 비효소적 생화학반응에 의해 생성이 항진되어 그 결과 단백수식(protein modification)이 항진된 상태를 카르보닐 스트레스라 부른다(Miyata et al. Kidney Int. 55: 389-399, 1999;Miyata et al. J.Am.Soc.Nephrol., 11: 1744-1752, 2000). 카르보닐 화합물은 메일라드 반응(Maillard Reaction)을 통하여 노화, 당뇨병 혹은 동맥경화 등의 성인병과의 관련성이 보고되고 있다. 메일라드 반응이라는 것은 글루코스 등의 환원당과 아미노산이나 단백질과의 사이에 발생하는 비효소적인 당화반응이다. 1912년에 메일라드(Maillard)가 아미노산과 환원당의 혼합물을 가열하면 갈색으로 착색하는 현상에 주목하여 보고했다(Maillard, L. C., Compt. Rend. Soc. Biol., 72: 599, 1912). 메일라드 반응은 식품의 가열처리나 저장 동안에 생기는 갈변화, 방향성분의 생성, 정미(taste), 단백질 변성 등에 관여하고 있기 때문에 식품화학의 분야에서 연구가 진행되어져 왔다.

그러나, 1968년 헤모글로빈의 미소획분인 글리코실 헤모글로빈(Hb Alc)이 생체내에서 동정되었고 특히, 이것이 당뇨병 환자에 있어서 증가하는 것이 밝혀졌다(Rahbar. S., Clin. Chim. Acta, 22: 296, 1968). 이런 보고를 계기로 생체내에서 메일라드 반응의 의의 및 당뇨병 합병증, 동맥경화 등의 성인병의 발병이나 노화의 진행과의 관계가 주목되게 되었다. 예를들어, 아마도리 화합물(Amadori compound) 이후의 반응에서 생성되는 필라린(pyrraline)이나 펜토시딘(pentosidine)으로 대표되는 후기단계 생성물(Advanced glycation end products, 이하 AGEs라고 약칭함)은 노화나 당뇨병의 지표로 될 수 있다고 생각되고 있다. 실제로 만성신부전의 환자에 있어서는 고혈당의 유무에 관계없이 혈중이나 조직중에 반응성이 높은 카르보닐 화합물이나 AGEs가 현저하게 축적되고 있다(Miyata, T. et al., Kidney Int., 51: 1170-1181, 1997, Miyata, T.et al.,J.Am.Soc.Nephrol., 7: 1198-1206, 1996, Miyata, T.et al., Kidney Int. 55: 389-399, 1999, Miyata, T. et al., J.Am.Soc.Nephrol. 9: 2349-2356, 1998). 이것은 신부전에 있어서는 카르보닐 스트레스가 존재하고 있어, 당이나 지질에서 유래하는 카르보닐 화합물이 아미노기와 메일라드 반응을 일으켜 단백질을 수식하기 때문이라고 생각된다(Miyata, T. et al., Kidney Int. 55: 389-399, (1999)). 최근, 신부전의 합병증인 투석 아미로이도시스(amyroidosis), 동맥경화의 발병 진전에 있어서 카르보닐 스트레스의 관여가 보고되었고(Miyata et al. J.Clin.Invest., 92: 1243-1252, 1993, Miyata et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93, 2353-2358, 1996, Miyata et al. FEBS Lett., 437, 24-28, 1998, Miyata et al. FEBS Lett.,445, 202-206, 1999) 신부전에 있어서 카르보닐 스트레스의 병태생리학적 의의가 주목되고 있다.

따라서, 생체내에서 생성되는 카르보닐 화합물을 제거하는 것에 의해 카르보닐 스트레스 상태를 개선하는 것은 신부전에 있어서 AGEs의 생성을 억제하여 조직장해의 경감 또한 합병증의 진전의 억제로 이어진다고 생각된다. 또, 복막투석의 경우, 혈중의 노폐물은 복막을 통해서 복막투석액 중으로 배설된다. 고침투압의 복막투석액(글루코스, 이코덱스트린 또는 아미노산 등을 함유함)은 신부전환자의 혈중에 축적된 반응성이 높은 카르보닐 화합물을 복막을 매개로 하여 복강내의 복막투석액 중에 모으는 작용이 있다. 그 때문에 복막투석액 중의 카르보닐 화합물 농도는 상승하여 카르보닐 스트레스의 상태가 야기된다. 그 결과, 복강내의 단백질이 카르보닐 수식을 받아서 복막의 기능이 저하되어 제수능(water-removing ability)의 저하나 복막경화증의 진전에 관여한다고 생각된다(Miyata, T. et al., Kidny Int., 58: 425-435, 2000; Inagi R., et al., FEBS Lett., 463: 260-264, 1999; Ueda, Y., et al., Kidny Int. (in press),Combet, S., et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11: 717-728, 2000).

또, 복막투석 환자에 있어서는 복막투석액 중에 포함되는 글루코스에 의하여 복강내가 카르보닐 스트레스 상태로 되는 것이 내피 및 중피의 면역조직학적 검토로부터 증명되었다(Yamada, K. et al., Clin.Nephrol., 42: 354-361, 1994; Nakayama,M. et al., Kidney Int., 51: 182-186, 1997; Miyata, T. et al., Kidny Int., 58: 425-435, 2000; Inagi R., et al., FEBS Lett., 463: 260-264, 1999;Combet, S., et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11: 717-728, 2000). 또한, 복막투석액 중에 포함되는 메틸글리옥살(methylglyoxal)이 내피 및 중피세포에 작용하여 복막기능의 저하에 중요한 역할을 행한다고 생각되는 혈관내피 유래 증식인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)의 생산을 항진하는 것도 명백해졌다(Combet et al. J.Am.Soc.Nephrol., 11: 717-728, 2000; Inagi et al. FEBS Let, 463: 260-264, 1999). 이와 같이, 투석환자에 있어서도 카르보닐 스트레스가 복막의 형태학적 변화 및 이에 수반하는 기능(제수능)의 저하의 원인으로 되고 있는 것이 추측되고 있고, 그 개선방법의 제공이 요구되고 있다.

최근, 생체내에 있어서 카르보닐 화합물의 제거, 대사계의 구조가 명확해졌다. 카르보닐 화합물의 소거에는 몇가지의 효소나 효소 경로의 관여가 보고되어져 있다. 알도스환원효소(aldose reductase), 알데히드디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase) 혹은 글리옥살라제(glyoxalase) 경로 등은 이에 포함된다. 이러한 카르보닐 화합물 소거계의 활성저하는 동시에 다수의 카르보닐 화합물의 상승으로 이어진다. 글루타치온(GSH) 및 NAD(P)H 등의 레독스 보효소(redox coenzyme)는 이러한 경로의 활성에 있어서 중요한 요소이다(Thornalley P. J. Endocrinol Metab 3: 149-166, 1996). 메틸글리옥살, 글리옥살 등의 카르보닐 화합물은 GSH의 치올기(thiol group)와 비효소적으로 반응하여 결과적으로 글리옥살라제에 의해 대사된다. NAD(P)H는 글루타치온 환원효소를 활성화하여 GSH 레벨을 상승시킨다. 즉, 세포내 레독스기구의 불균형에 의해 GSH 및 NAD(P)H의 저하에 의한 카르보닐 화합물 소거계가 저해되어 AGEs의 축적으로 이어진다. 실제로 당뇨병 환자의 혈중액GSH 레벨은 저하되고 있고, 카르보닐 화합물인 메틸글리옥살의 레벨은 상승하고 있는 것이 보고되어져 있다.

이러한 GSH 및 NAD(P) 등의 레독스 보효소 농도의 저하가 카르보닐 화합물의 소거기능의 저하로 이어진 결과, AGEs 형성의 원인으로 되고 있다고 생각된다. 따라서, 치올 레벨을 상승시키는 것에 의해 카르보닐 스트레스의 경감할 수 있을 것으로 추정된다. 이 추정을 기초로 GSH 및 시스테인 등의 치올 화합물을 직접투여하는 시도가 행해졌다. 실제, 이들 물질을 정상 및 당뇨병의 혈청에 가해서 인큐베이션한 결과, AGEs의 생성이 억제되었다. 그러나, 이 억제효과가 나타날때까지는 장기간의 인큐베이션이 필요하고 실용적인 면에서 문제가 있다.

또한, AGEs는 카르보닐 화합물과 단백질의 카르보닐-아미노 화학반응(carbonyl amino chemical reaction)에 의해 생성되는 것이 알려져 있다. 따라서, 화학적으로 이들을 포착(trap)하는 화합물을 이용함으로써 카르보닐 스트레스를 경감할 수 있는 가능성이 고려되었다. 이러한 화합물에는 히드라진기를 지니는 아미노구아니딘(aminoguanidine, Brownlee M. et al. Science 232: 1629-1632, 1986) 및 2-이소프로필리덴히드라조노-4-옥소-치아졸리딘-5-일아세트아닐리드(2-isopropylidenehydrazono-4-oxo-thiazolidin-5-ylacetanilide, Nakamura S. et al. Diabetes 46: 895-899, 1997)을 들 수 있다. 이들 이외에도 메트포르민(metformin) 및 부포르민(buformin) 등의 비구아나이드(biguanide)도 카르보닐 화합물을 포착할 수 있다. 생체외(In vitro)의 실험에는 이들 화합물의 어느것이든 카르보닐 화합물인 메틸글리옥살 및 글리옥살을 효율좋게포착하였다(Miyata T. J. Am. Soc. Nephrol. 11: 1719-1725, 2000). 그러나 이들 화합물은 효율좋게 AGEs의 형성은 저해하지만, 카르보닐 화합물에 대한 특이성은 낮아 모든 카르보닐 화합물에 반응하기 때문에 생체에 있어서 유해한 당이나 지질유래 카르보닐 화합물뿐만 아니라 생체에 있어서 필요한 피리독살(pyridoxal) 등의 카르보닐기도 포착해 버릴 가능성이 예측되었다.

이러한 상황으로부터 카르보닐 스트레스에 대하여 단시간에 개선효과를 보이고 동시에 유해한 당과 지질유래의 카르보닐 화합물에 특이적인 카르보닐 스트레스 개선제의 개발이 강하게 요구되고 있다.

유해한 카르보닐 화합물의 한가지인 메틸글리옥살이 생체내에서 유산(lactic acid)으로 변환되는 시스템이 밝혀져 있다. GSH 및 글리옥살Ⅰ과 글리옥살Ⅱ로 구성되는 글리옥살계는 메틸글리옥살을 유산으로 변환시킨다. 글리옥살라제Ⅰ은 메틸글리옥살 이외의 케토알데히드 화합물에도 작용하는 것이 알려져 있다. 그러나 이 시스템의 생리적인 역할은 아직도 명백하지 않다. 또한, 생체의 카르보닐 스트레스 상태의 개선에 응용되는 보고도 없다.

본 발명은 카르보닐 스트레스의 개선제에 관한 것이다.

도1는 메틸글리옥살의 글루타치온에 의한 트랩효과를 나타내는 그래프로서, 횡축은 반응시간(시간), 종축은 반응전(0시간)을 100으로 한 때의 메틸글리옥살의잔존률(%)을 나타내고,

도2는 글리옥살라제Ⅰ 첨가에 의한 메틸글리옥살의 소실효과를 나타내는 그래프로서, 횡축은 글리옥살라제Ⅰ의 농도(unit/ml)를, 종축은 글리옥살라제Ⅰ을 첨가하지 않은 경우를 100으로 한 때의 메틸글리옥살의 잔존률(%)을 나타내고,

도3는 글리옥살라제Ⅰ 첨가에 의한 디카르보닐 화합물의 소실효과를 나타내고,

도4는 3종의 디카르보닐 화합물 혼합액중의 글루타치온에 의한 트랩작용을 나타내는 그래프로서, 위로부터 순서대로 글리옥살, 메틸글리옥살, 3-데옥시글리코손의 경우를 나타내고,

도5는 개별의 디카르보닐 화합물 용액중의 글루타치온에 의한 트랩작용을 나타내는 그래프로서, 위로부터 순서대로 글리옥살, 메틸글리옥살, 3-데옥시글리코손의 경우를 나타내고,

도6는 글리옥살라제Ⅰ 첨가에 의한 3종의 디카르보닐 화합물의 소실효과을 나타내는 그래프로서, 횡축은 글리옥살라제Ⅰ의 농도(unit/ml)를, 종축은 글리옥살라제Ⅰ을 첨가하지 않을 경우를 100으로 한 때의 디카르보닐 화합물의 잔존률(%)을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 실시예에 근거하여 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.

발명의 개시

본 발명은 카르보닐 화합물을 신속하게 소거할 수 있는 카르보닐 스트레스 개선제의 제공에 관한 것이다.

본 발명자들은 용액중의 카르보닐 화합물을 효과적으로 소실, 무독화시키는방법에 대하여 열심히 연구를 수행하였다. 그리고, 카르보닐 화합물의 해독반응에 있어서, 글리옥살라제계(glyoxalase system)라 불리우는 해독반응계에 착안하였다. 글리옥살라제계는 글리옥살라제Ⅰ(락토일GSH리아제) 및 글리옥살라제Ⅱ(히드록시아실GSH히드라제)의 두가지 효소로 이루어지는 해독반응계이다. 이 해독반응에 의해 카르보닐 화합물인 메틸글리옥살이 GSH의 존재하에 유산으로 전환되는 것이 알려져 있다.

본 발명자는 메틸글리옥살 용액중의 글루타치온에 의한 메틸글리옥살의 트랩작용에 있어서, 새롭게 반응용액 중에 글리옥살라제Ⅰ을 첨가함으로써 신속하게 메틸글리옥살이 소실하는 것을 발견하였다. 또, 글루타치온 및 글리옥살라제Ⅰ 존재하에서는 복막투석액 중의 메틸글리옥살 이외의 카르보닐 화합물에 있어서도 신속하게 소실되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 다음의 카르보닐 스트레스 개선제 및 이를 이용한 복막투석액에 관한 것이다.

[1] 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소 및 카르보닐 화합물 환원제를 유효성분으로 하는 카르보닐 스트레스 개선제.

[2] [1]에 있어서, 유효성분으로서 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소를 더 포함하는 카르보닐 스트레스 개선제.

[3] [1]에 있어서, 카르보닐 화합물 환원제가 환원형 글루타치온 및/또는 그 유도체인 카르보닐 스트레스 개선제.

[4] [3]에 있어서, 카르보닐 화합물을 소거해야 할 매체(medium)에서 환원형글루타치온의 최종농도가 0.1∼50mM이 되도록 배합된 카르보닐 스트레스 개선제.

[5] [1]에 있어서, 2-옥소알데히드(2-oxoaldehyde)의 소거에 의해 카르보닐 스트레스를 개선하는 카르보닐 스트레스 개선제.

[6] [5]에 있어서, 2-옥소알데히드가 글리옥살(glyoxal), 메틸글리옥살(methylglyoxal) 및 3-데옥시글루코손(3-deoxyglucosone)으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나의 화합물인 카르보닐 스트레스 개선제.

[7] [1]에 있어서, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소가 담체에 고정화되어 있는 카르보닐 스트레스 개선제.

[8] [7]의 담체를 카르보닐 화합물 환원제의 존재하에서 환자혈액 또는 복막투석액과 접촉시키는 공정을 포함하는 카르보닐 화합물의 소거방법.

[9] [1]의 카르보닐 스트레스 개선제를 포함하는 복막투석액.

[10] 카르보닐 화합물 환원제의 존재하에서 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 복막투석액과 접촉시키는 공정을 포함하는 복막투석액에서 카르보닐 스트레스의 개선방법.

또는 본 발명은 카르보닐 스트레스 개선제의 제조에서 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소 및 카르보닐 화합물 환원제의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 카르보닐 화합물의 흡착제의 제조에서 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 담체의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 의한 카르보닐 스트레스 개선제는 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소 및 카르보닐 화합물 환원제를 유효성분으로 함유한다. 본 발명에 있어서 "카르보닐 스트레스의 개선"이라 함은 생체에 접촉하는 매체중에서 카르보닐 화합물을 소거하여 단백질의 수식작용을 감소시키는 작용을 말한다. "카르보닐 화합물의 소거"라 함은 카르보닐기의 반응성을 불가역적으로 소실시키는 것을 의미한다. "생체에 접촉하는 매체"라 함은 구체적으로는 복막투석액(이하 CAPD액이라 약칭함)이나 혈액 및 다른체액을 말한다.

본 발명에 이용할 수 있는 "카르보닐 화합물 환원제"라 함은 카르보닐 화합물을 환원하여 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소의 기질로 되는 화합물을 생성하는 화합물을 의미한다. 이런 조건을 충족시키는 화합물이라면 임의의 화합물을 카르보닐 화합물 환원제로 하여 이용할 수 있다. 이러한 화합물로는 예를들어 환원형 글루타치온(GSH)이나 그 유도체를 포함한다. 이들 화합물은 약리학적으로 허용가능한 염이어도 좋다. 예를들어, 환원형 GSH는 카르보닐 화합물인 메틸글리옥살에 결합하여 헤미치오아세탈(hemithioacetal)을 생성한다. 이 반응은 비효소적인 반응이다. 생성되는 헤미치오아세탈은 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소의 기질로 된다. 또한, 본 발명에 있어서 글루타치온 유도체는 카르보닐 화합물을 환원하여 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소의 기질로 될 수 있는 화합물을 생성하는 기능을 지니고 있다면 어떠한 유도체라도 이용할 수 있다. 보다 바람직하게는 카르보닐 화합물과 반응하여 치올에스테르 화합물을 생성하기 위한 치올기를 가지는 글루타치온 유도체이다. 구체적으로는 아세틸글루타치온(acetyl glutathione), 아스팔타치온(aspartathione) 및 이소글루타치온(isoglutathione) 등을 예시할 수 있다.

카르보닐 화합물 환원제는 소거해야 할 카르보닐 화합물과의 반응을 확실하게 행하는 양으로 사용한다. 구체적으로는 예를 들어 GSH를 CAPD액중의 카르보닐 화합물의 소거를 목적으로 하여 이용하는 경우에는 카르보닐 화합물을 소거해야 할 매체(이 예에서는 CAPD액)중에 있어서 GSH의 최종농도를 0.1∼50mM, 보다 바람직하게는 1∼10mM로 할 수 있다. 이 정도의 농도범위에서 GSH를 이용함으로써 일반적인 CAPD액중에 존재하는 카르보닐 화합물의 대부분을 신속하게 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소의 기질로 전환할 수 있다. 그러나, 투석중의 CAPD액에 존재하는 카르보닐 화합물의 양을 미리 예측하는 것은 어렵다. 따라서, 카르보닐 스트레스 상태의 항진이 걱정되는 환자에 있어서는 보다 충분한 농도로 GSH를 사용할 수도 있다.

다음으로, 본 발명에 있어서 "글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소"는 글리옥살라제Ⅰ와 기능적으로 동등한 촉매작용을 가지는 효소를 의미한다. 글리옥살라제Ⅰ는 락토일GSH리아제(EC.4.4.1.5)라고도 불리우는 효소이다. 글리옥살라제Ⅰ는 케토알데히드(2-옥소알데히드) 화합물에 있어서 알데히드기에, 환원형 글루타치온과 같은 카르보닐 화합물 환원제가 결합한 화합물을 기질로 한다. 예를들어, 메틸글리옥살에 환원형 글루타치온이 결합한 헤미메르캅프탈(hemimercaptal)(헤미치오아세탈, hemithioacetal)은 글리옥살라제Ⅰ의 대표적인 기질화합물이다. 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소는 이러한 화합물을 기질로 하여 치올에스테르 화합물로 전환시키는 반응을 촉매한다. 본 발명에 있어서는 케토알데히드 화합물의 알데히드를, 카르보닐 화합물 환원제의 존재하에 치올에스테르로 전환할 수 있는 것이라면 임의의 효소 및 환원제를 이용할 수 있다. 이 효소반응을 다음과 같다.

이 반응식에는 카르보닐 화합물인 메틸글리옥살과 GSH가 결합하여 생성하는 헤미치오아세탈이 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소에 의해 S-락토일글루타치온으로 되어 무해화되는 것을 나타내고 있다. 이 반응은 불가역적인 반응이다. 따라서, 일단 무해화된 S-락토일글루타치온은 안정하여 다시 메틸글리옥살로 되는 역반응은 실질적으로 발생하지 않는다.

본 발명자는 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 GSH와 조합함으로써 메틸글리옥살라제 뿐만 아니라 생체내에서 카르보닐 스트레스 상태를 생기게 하는 원인으로 되는 광범위한 물질에 대해서도 신속하게 소거할 수 있는 점을 발견하여 카르보닐 스트레스의 개선제로서의 유효성을 발견하였다.

글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소로는 다음과 같은 유래의 효소가 공지되어 있다.

포유동물의 조직(Methods Enzymol. 90, 536-541, 1982; Methods Enzymol. 90, 542-546, 1982); 효모(FEBS Lett. 85, 275-276, 1978, Biochem.J. 183, 23-30, 1979); 세균(Biochem.Biophys.Res.Commun., 141, 993-999, 1986); 및 사람(J.Biol.chem. 268, 11217-11221, 1993)

이 중에서도 사람에서 유래하는 글리옥살라제Ⅰ은 사람에게 투여하는 경우에 높은 안정성이 기대된다. 이들 글리옥살라제Ⅰ을 정제하는 방법도 공지되어 있다.본 발명에 이용되는 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소는 천연의 것인 것도 가능하고, 유전자 재조합에 의하여 얻어진 것이어도 좋다. 예를들어, 사람 글리옥살라제Ⅰ의 유전자의 구조는 이미 밝혀져 있다(J.Biol.chem. 268, 11217-11221, 1993). 따라서, 이 유전자를 이용하여 재조합체를 얻을 수 있는 것은 자명한 일이다. 또한, 본 발명의 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소는 천연의 효소와 동일한 아미노산 배열을 가지는 것뿐만 아니라 안정성이나 활성 등의 개선을 목적으로 하여 아미노산 서열에 변이를 도입한 것도 가능하다. 아미노산 서열에 인위적인 변이를 도입하는 방법은 공지되어 있다. 예를들어, 목적으로 하는 변이를 코드하는 합성 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머를 이용한 부위 특이적 변이 도입방법(site specific mutagenesis)[Mark, D.F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5662 (1984)] 등에 따라서 이러한 핵산 서열의 코드를 일부 변화시킬 수 있다.

본 발명에 있어서 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소는 아미노산 서열의 변이체에 더해 화학적인 수식을 행할 수 있다. 예를들어, 폴리에틸렌글리콜 등과의 결합에 의해 효소의 안정성이 개선되는 경우는 공지되어 있다. 또, 효소 단백질의 회수를 용이하게 하기 위하여 고상 담체(solid-phase carriers)에 효소 단백질을 고정화하는 방법도 널리 행해지고 있다. 이처럼, 화학적인 수식을 본 발명에서 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소에 응용할 수 있다.

글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소는 카르보닐 화합물과 카르보닐 화합물 환원제와의 반응에 의하여 생성하는 기질화합물을 신속하게 소거할 수 있는 농도에서 이용한다. 예를들어, CAPD액에서 카르보닐 화합물의 소거를 목적으로 하는 경우에는 CAPD액 1L당 10∼10⁴U, 바람직하게는 10∼10³U의 글리옥살라제Ⅰ을 이용함으로써 카르보닐 화합물의 신속한 소거가 달성된다. 즉, 글리옥살라제I의 1U는 메틸글리옥살과 환원형 글루타치온에서 S-락토일글루타치온을 1분간 1μmol 생성시키기 위해 필요한 효소의 양이다.

본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제에는 또한, 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소를 추가할 수 있다. 글리옥살라제Ⅱ는 히드록시아실GSH히드라제(EC.3.1.2.6)라고도 불리는 가수분해효소이다. 생체내에서는 글리옥살라제Ⅰ의 작용에 의하여 생성하는 S-D-락토일글루타치온을 가수분해하여 유산을 발생하는 것과 동시에 환원형 글루타치온을 재생시키는 반응을 촉매한다. 글리옥살라제Ⅰ, 글루타치온(GSH) 및 글리옥살라제Ⅱ로 구성되는 글리옥살라제계는 다음과 같다.

글리옥살라제Ⅱ에 대해서도 사람에서 유래하는 효소(J.Biol.Chem. 271, 319-323, 1996) 등이 이미 단리되어져 있다. 이러한 공지의 글리옥살라제Ⅱ는 어느 것이든 본 발명에 이용할 수 있다. 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소와 마찬가지로 천연의 것에 더해 유전자 재조합체를 이용할 수 있다. 또한, 아미노산 서열에 변이를 포함하는 것도 이용할 수 있다.

글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소를 본 발명에 의한 카르보닐 스트레스 개선제에 조합시키는 것은 미리 양자를 배합해 버리는 방법 이외, 사용시에 양자를 접촉시킴으로써 조합할 수도 있다. 또한, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를고정화 효소로 하여 사용하는 경우에는 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소를 또한 고정화 효소로 할 수 있다. 효소의 고정화는 양자를 혼합하여 고정화하는 방법 혹은 별개로 고정화한 후에 혼합하는 방법, 어느 것이라도 채용할 수 있다. 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소는 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소의 반응생성물을 신속하게 제거할 수 있는 효소량으로 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 1U의 글리옥살라제Ⅰ에 대하여 0.5∼10U, 보다 바람직하게는 1∼5U로 사용하는 것이 바람직하다. 글리옥살라제Ⅱ의 1U는 1분간 S-D-락토일글루타치온에서 1μmol의 유산을 생성하기에 필요한 효소량이라고 정의된다.

본 발명에 있어서, 소거의 대상으로 되는 카르보닐 화합물이라 함은 기본구조로는 옥소알데히드(R-CO-CHO)를 포함하고 생체에 카르보닐 스트레스를 초래하는 화합물이다. 이러한 화합물에는 예를들어, 신부전환자의 혈중에 산화 스트레스와 함께 축적되는 다음과 같은 화합물이 포함된다.

탄수화물에서 유래하는 카르보닐 화합물:

·글리옥살

·메틸글리옥살

·3-데옥시글루코손

본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제는 카르보닐 스트레스를 발생시키고 있는 생체에 적용할 수 있다. 구체적으로는 예를들어, 비경구적으로 혹은 혈액투석이나 복막투석에 있어서 순환경로 중으로 투여할 수 있다. 또한, CAPD액 중에 미리 본 발명에 의한 카르보닐 스트레스 개선제를 첨가하여 두는 것도 가능하다. 이경우, 본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제는 가열멸균된 CAPD액에 무균적으로 첨가된다. 본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제는 사용시에 첨가할 수도 있다.

카르보닐 스트레스 개선제를 무균적으로 첨가하기에는, 공지의 복실용기(multi-compartment container)나 프리필드시린지(pre-filled syringe)에 카르보닐 스트레스 개선제를 무균적으로 충진하여 사용시에 혼합하면 좋다. 복실용기의 예로서는, 연결가능한 격벽으로 구분되어진 분획백 용기(fractionated-bag container)나 양두침(double-ended needle) 등의 연결수단을 장치한 키트용기 등을 들 수 있다. 복실용기의 한쪽의 공간에 복막투석액을 충진하고, 다른 공간에는 본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제를 수용하여 사용시에 연결시킨다.

고정화한 본 발명의 글라옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소와 환원형 GSH와 같은 카르보닐 화합물 환원제를 가한 CAPD액(이하 본 발명에 있어서, 단순히 CAPD액이라고 기재할 때는 미리 카르보닐 화합물 환원제를 가한 것임을 의미함)을 접촉시키는 방법도 카르보닐 스트레스 상태의 개선에 있어서는 유효하다. 예를들어, 복막투석에 있어서는, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소을 내부에 고정화한 용기 혹은 입자나 섬유와 같은 담체에 고정한 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소가 들어있는 용기에 CAPD액을 수용하여, 보존중에 생성·축적하는 카르보닐 화합물을 소거할 수 있다. 후자에 있어서는, 불용성 담체를 여과 등에 의하여 복막투석액으로부터 분리할 수 있다.

또한, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 비드상(bead-shaped) 또는 섬유상 등의 담체를 컬럼에 충진하여 카르보닐 화합물 소거용카트리지(cartridge)로 하며 이 카트리지에 CAPD액을 접촉시킨 후에 복강내에 도입할 수 있다. 카르보닐 화합물의 소거에 필요한 카르보닐 화합물 환원제는 미리 CAPD액에 첨가하여 둘 수 있다. 복강 도입시에 카르보닐 화합물 소거용 카드리지에 접촉시키는 경우, 투석중에 축적되는 환자유래의 카르보닐 화합물을 제거할 수는 없지만, 투석중에 존재하는 카르보닐 화합물의 제거는 가능하다. 또, 복막투석액을 소형의 순환펌프를 사용하여 폐쇄 순환계내에서 순환시키는 것과 같은 복막투석법의 경우에도 순환경로중에 카르보닐 스트레스 개선제를 고정화한 상기 카르보닐 화합물 소거용 카트리지를 설치함으로써 복막투석액뿐만 아니라, 투석중에 복강내에서 축적되는 카르보닐 화합물의 제거도 달성할 수 있다.

본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제에 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소를 조합하는 경우에는, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소와 동시에 미리 배합할 수 있다. 또, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화 효소로서 이용하는 경우에는, 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소도 고정화한 상태에서 이용할 수 있다. 즉, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소와 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소와의 혼합컬럼 및 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소의 하류에 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소를 배치할 수도 있다. 그 이외, 어느 한쪽의 효소만을 고정화 효소로 하여 다른 쪽을 유리의 상태로 사용하여 카르보닐 화합물의 소거를 행할 수도 있다.

본 발명에 의한 카르보닐 화합물의 제거방법은 생체외에 있어서 혈액이나 투석액 등과의 접촉을 통하여 카르보닐 스트레스를 개선하는 방법에 적용할 수도 있다. 이러한 이용형태에 있어서도 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 담체로 고정화하여 사용하는 것이 유리하다.

본 발명에 있어서 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화하기 위한 담체로서는 인체에 대해 무해한 것, 혈액이나 투석액에 직접접촉하는 재료로서 안전성 및 안정성을 지니는 것이라면, 그 재료는 제한되지 않는다. 예를들어, 합성 또는 천연의 유기고분자 화합물이나 글라스비즈(glass bead), 실리카겔, 알루미나(alumina), 활성탄 등의 무기재료 및 이들의 표면에 다당류, 합성고분자 등을 코팅한 것 등을 들 수 있다.

고분자 화합물로 이루어지는 담체로서는 예를들어, 폴리메틸메타크릴레이트계 중합체(polymethylmethacrylate polymer), 폴리아크릴로니트릴계 중합체(polyacrylonitrile polymer), 폴리설폰계 중합체(polysulfone polymer), 비닐계 중합체, 폴리올레핀계 중합체, 불소계폴리머계 중합체, 폴리에스테르계 중합체, 폴리아미드계 중합체, 폴리이미드계 중합체, 폴리우레탄계 중합체, 폴리아크릴계 중합체, 폴리스틸렌계 중합체, 폴리케톤계 중합체, 실리콘계 중합체, 셀룰로스계 중합체, 키토산계 중합체 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 아가로스, 셀룰로스, 키틴, 키토산, 세파로스, 덱스트란 등의 다당류 및 이들의 유도체, 폴리에스테르, 폴리염화비닐, 폴리스틸렌, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리프로필렌, 폴리비닐알콜, 폴리알릴에테르설폰, 폴리아크릴산에스테르, 폴리메타크릴산에스테르, 폴리카르보네이트, 아세틸화셀룰로스, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리아미드, 실리콘수지, 불소수지, 폴리우레탄, 폴리에테르우레탄, 폴리아크릴아미드, 그들의 유도체 등을 들 수 있다. 그러한 고분자재료는 단독 혹은 2종류 이상을 조합하여 사용될 수 있다. 2종 이상 조합하는 경우는 그 가운데 적어도 1종에 본 발명의 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소가 고정된다. 고정화되는 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소는 단독으로 고정화되는 외에 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소와 함께 고정화할 수도 있다는 것은 이미 서술한 바이다.

담체의 형상에 제한은 없어 예를들어, 막상, 섬유상, 과립상, 중공계상(hollow fiber-like), 부직포상(non-woven fabric-like), 다공형상, 하니캄형상(honey comb-shaped) 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 두께, 표면적, 직경, 길이, 형성 및/또는 크기를 여러가지로 변화시킴으로써 혈액이나 투석액과의 접촉면적을 제어할 수 있다.

상기 담체에 본 발명의 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화하는 데에는, 공지의 방법 예를들어, 물리적흡착법, 생화학적 특이결합법, 이온결합법, 공유결합법, 이식법(grafting) 등이 이용되면 좋다. 또한, 필요에 따라 스페이서(spacer)를 담체와 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소의 사이에 도입하여도 좋다. 양자를 공유결합에 의해 결합한다면 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소의 용출량을 가능한 적게 할 수 있기 때문에 바람직하다. 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 담체에 공유결합하는 데에는, 담체에 존재하는 관능기를 사용할 수 있다. 관능기로서는 예를들어, 수산기, 아미노기, 알데히드기, 카르복실기, 치올기, 히드록실기, 실라놀기, 아미드기, 에폭시기, 석시닐아미드기(succinylamide) 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지는 않는다. 공유결합의 예로서는 에스테르결합, 에테르결합, 아미노결합, 아미드결합, 설파이드결합, 이미노결합, 디설파이드결합 등을 들 수 있다.

본 발명의 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 담체는 공지의 방법에 의해 멸균할 수 있다. 구체적으로는, 감마선조사멸균이나 가스멸균 등을 들 수 있다.

본 발명의 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 담체와 혈액과의 접촉에는 여러가지 형태가 고려될 수 있다. 예를들어, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 담체로 충진된 혈액백(blood bag)에 카르보닐 화합물 환원제와 함께 채혈한 환자의 혈액을 넣어 이 가운데 환자혈액의 카르보닐 화합물을 소거하는 방법, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 비드상 또는 섬유상 등의 담체를 컬럼에 충진하여 카드리지로 하고 이에 카르보닐 화합물 환원제와 함께 혈액을 순환시키는 방법 등을 들 수 있다. 혈액은 전혈을 이용할 수도 있고 혈장을 처리하여도 좋다. 처리된 혈액은 환자에 돌려주거나 필요에 따라서 혈액백 안 등에서 보존할 수도 있다. 혈액백내에 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 담체를 함유하게 함으로써 보존중에 생성·축적되는 카르보닐 화합물을 소거할 수도 있다.

본 발명의 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 담체, 혈액 그리고 카르보닐 화합물 환원제와의 접촉은 혈액투석이나 혈액여과, 혈액여과투석, 혈액흡착, 혈액분리를 포함하는 혈액정화의 과정에서 행할 수 있다.

예를들어, 혈액투석환자에 대해서는, 혈액투석 순회내에 본 발명의 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 담체를 배치시킨 카르보닐 화합물 환원제의 존재하에서 투석을 실시함으로써 혈액투석과 카르보닐 화합물의 소거를 동시에 행할 수 있다. 이 경우에는, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 혈액투석막에 고정시켜 두는 것이 바람직하다. 담체로서 이용되는 투석막의 종류는 공지의 것을 사용할 수 있다. 예를들어, 재생셀룰로스, 셀룰로스트리아세테이트 등의 셀룰로스유도체, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리올레핀, 폴리설폰, 폴리아크리로니트릴(PAN), 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리에테르나일론, 실리콘, 폴리에스테르계 공중합체 등을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 물론 투석막을 담체로 하지 않고, 상기와 같이 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 담체를 충진한 컬럼을 혈액투석 순회중에 배치시켜도 좋다. 이러한 환자혈액을 카르보닐 화합물 환원제의 존재하에 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 고정화한 담체에 접촉시킴으로써 혈중유래의 카르보닐 화합물이 소거되고, 그 생체에 대한 장해활성을 빼앗아 무해화된다. 체외순환시에 혈액의 응고를 방지하기 위해 항응고제를 병용할 수도 있다. 항응고제로서는 예를들어, 헤파린, 저분자헤파린, 푸탄(메실산나파모스타트(Nafamostate mesilate)) 등을 들 수 있다. 이들은 담체에 고정화되어 있어도 좋다. 혈액이나 투석액과의 접촉시에 이용되는 본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제가 적으면 투석시에 환자혈중의 일부의 카르보닐 화합물을 처리할 수 없게 되는 경우가 예상된다. 특히, 환자혈액중의 카르보닐 화합물의 양을 미리 예측하는 것은 곤란하기 때문에 환자에 대한 안전성을 보장가능한 범위내에서 가능한 한 다량의 카르보닐 스트레스 개선제가 활성을 유지할 수 있도록 하는 것이효과적이다. 카르보닐 스트레스 개선제의 용량은 담체로의 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소의 고정화량 또는 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소가 고정화된 담체의 사용량을 변경하여 조정할 수 있다.

본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제는 생리학적으로 허용할 수 있는 담체, 부형제 혹은 희석제 등과 혼합하여 의약조성물로서 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구제로서는 주사제와 점적제 등의 제형을 선택할 수 있다. 주사제로는 피하주사제, 근육주사제 혹은 복강내주사제 등을 포함한다.

주사제는 주성분인 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소 및 카르보닐 화합물 환원제를 적당한 분산제와 함께 용해, 분산매에 용해 혹은 분산시킴으로써 얻을 수 있다. 분산매의 선택에 의해 수성용액와 유성용제의 어느쪽의 제형으로 하는 것도 가능하다. 수성용제로 하는 데에는 증류수, 생리식염수 혹은 링겔액 등을 분산매에 이용한다. 유기용제로는 각종 식물유나 프로필렌 글리콜 등을 분산매로 이용한다. 이때, 필요에 따라서 파라벤 등의 보존제를 첨가할 수도 있다. 또한, 주사제중에는 염화나트륨이나 포도당 등의 공지의 등장화제를 첨가할 수 있다. 또, 염화벤잘코늄과 염산프로카인과 같은 무통화제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제의 투여량은 투여방법(제형)이나 투여대상의 상태(체격, 연령, 성별, 증상)에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 일반적으로는, 경구투여에서 통상 성인 1일 용량으로서 체중 1kg당 0.001∼10mg, 보다 바람직하게는 0.01∼1mg으로 함으로써 카르보닐 스트레스의 개선효과를 얻을 수 있다. 또한, 투여회수는 예를들어, 1일 1∼5회의 범위에서 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제의 효과는 혈중의 카르보닐 화합물 농도나 AGEs 농도를 추적함으로써 확인할 수 있다. 생체내에서 효과를 보는 데에는 본 발명에 의한 카르보닐 스트레스 개선제를 투여한 군과 대조군의 사이에서 혈중의 AGEs 농도를 비교한다. 대조군에는 무처리군 혹은 이 개선제로부터 주성분인 카르보닐 스트레스 개선제만을 제거한 대조약제나 생리식염수를 투여한 군을 두면 좋다. 카르보닐 화합물로는 글리옥살(GO), 메틸글리옥살(MGO) 및 3-데옥시글리코손(3DG) 등을 지표로 할 수 있다. 이러한 카르보닐 화합물은 실시예에 나타난 것처럼 HPLC 등을 이용하여 용이하게 측정할 수 있다(Ohmori S. et al. J.Chromatogr. 414: 149-155, 1987; Yamada H., J.Biol.Chem. 269: 20275-20280, 1994) 또는 2,4-디니트로페닐히드라진(2,4-DNPH)을 산성하에서 카르보닐 화합물과 반응시켜서 생성되는 발색생성물을 360nm에서 흡광도로 측정할 수도 있다. 또한, AGEs로는 펜토시딘(pentosidine) 등을 지표로서 이용할 수 있다. 펜토시딘의 역상 HPLC에 의한 정량방법은 공지되어 있다(Miyata T, et al. J Am Soc Nephrol 7: 1198-1206, 1996). 생체외에 있어서 본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제의 작용을 확인하는 데에는 혈액이나 투석액중에서 카르보닐 화합물이나 AGEs의 농도를 확인하면 좋다.

<실시예1. 글루타치온에 의한 메틸글리옥살 용액중의 메틸글리옥살의 트랩작용>

(1) 실험방법

메틸글리옥살의 PBS(-)용액과 글루타치온의 PBS(-)용액(pH 7.4)을 혼합하여 메틸글리옥살 농도가 400μM, 글루타치온 농도가 0, 1, 2, 4, 8mM의 용액을 조제하고 37℃에서 인큐베이트하였다. 0, 2, 4, 8, 24시간 후에 샘플링하여 각각의 샘플 100μl에 2M 과염소산 40μl, 1% o-페닐렌디아민 40μl, 200μM 글리옥살 100μl를 가해 교반후, 25℃에서 1시간 반응시켰다. 오모리 등의 방법(Ohmori S. et at. J. Chromatogr. 414: 149-155, 1987)에 의해 메틸글리옥살과 o-페닐렌디아민과의 반응에서 생성하는 퀴녹살린(Quinoxaline) 유도체를 역상컬럼을 이용한 HPLC에 의해 분리하여 정량하였다.

(2) 실험결과

글루타치온 농도 및 37℃에서 인큐베이트 시간에 따라 글루타치온에 의한 메틸글리옥살이 트랩되었다(도1).

<실시예2. 글루타치온, 글리옥살Ⅰ 존재하에서 메틸글리옥살 용액중의 메틸글리옥살의 소거작용>

(1) 실험방법

메틸글리옥살 농도가 400μM, 글루타치온 농도가 4mM, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소농도가 8, 16, 40, 80 unit/ml의 PBS(-)용액을 조제하여 37℃에서 인큐베이트하였다. 글리옥살라제Ⅰ으로서 효모에서 유래하는 시판의 효소(시그마제)를 이용하였다. 1시간후에 샘프링하여 실시예1과 같은 방법으로 메틸글리옥살을 정량했다.

(2) 실험결과

글리옥살라제Ⅰ의 첨가에 의해 약 99%의 메틸글리옥살이 소실되었다(도2). 이로부터 글리옥살라제Ⅰ을 첨가함으로써 메틸글리옥살의 소실이 촉진되는 것을 알았다.

<실험예3. 글루타치온, 글리옥살라제Ⅰ 존재하에서 CAPD액중의 디카르보닐 화합물의 소거작용>

(1) 실험방법

CAPD액(박스터제, PD-4, 1.5)에 글루타치온, 글리옥살라제Ⅰ(실험예2와 동일한 것)을 첨가하여 글루타치온 농도가 0, 1, 4mM, 글리옥살라제Ⅰ 농도가 0, 1.3, 5.2 unit/ml의 용액을 조제하여 37℃에서 인큐베이트하였다. 1시간 후에 샘플링하여 각각의 샘플 100μl에 2M 과염소산 40μl, 1% o-페닐렌디아민 40μl, 20μM의 2,3-부탄디온 100μl를 가해 교반후, 25℃에서 1시간 반응시켰다. 오모리 등의 방법(Ohmori S. et at. J. Chromatogr. 414: 149-155, 1987)에 의해 3-데옥시글루코손, 글리옥살, 메틸글리옥살과 o-페닐렌디아민과의 반응에서 생성하는 퀴녹살린 유도체를 역상컬럼을 이용한 HPLC에 의해 분리하여 정량하였다.

(2) 실험결과

글리옥살라제Ⅰ 및 글루타치온의 첨가에 의해 CAPD액중의 3-데옥시글루코손, 글리옥살, 메틸글리옥살 등의 디카르보닐 화합물의 소거가 확인되었다(도3). 이상으로부터 CAPD액중의 글리옥살라제Ⅰ 및 글루타치온의 첨가에 의해 효율적으로 디카르보닐 화합물을 제거할 수 있다고 말할 수 있다.

<실시예4. 글루타치온에 의한 디카르보닐 화합물 혼합용액중의 디카르보닐 화합물의 트랩작용>

(1) 실험방법

글리옥살, 메틸글리옥살, 3-데옥시글루코손의 각 농도가 200μM, 글루타치온 농도가 0, 0.5, 1, 5mM, 글리옥살라제Ⅰ의 농도가 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2 unit/ml의 PBS(-)(pH 7.4)용액을 조제하여 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 각각의 샘플 100μl에 2M 과염소산 40μl, 1% o-페닐렌디아민 40μl, 내부표준으로서 50μM의 2,3-부탄디온 100μl을 가해 교반후, 25℃에서 1시간 반응시켰다. 오모리 등의 방법(Ohmori S. et at. J. Chromatogr. 414: 149-155, 1987)에 의해 글리옥살과 o-페닐렌디아민과의 반응에서 생성하는 퀴녹살린 유도체를 역상컬럼을 이용한 HPLC에 의해 분리하여 정량하였다.

(2) 실험결과

글리옥살, 메틸글리옥살, 3-데옥시글루코손을 포함하는 디카르보닐 화합물 혼합용액과 글루타치온을 포함하는 용액에 글리옥살라제Ⅰ의 첨가에 의해 디카르보닐 화합물 농도의 감소가 확인되었다. 또한, 글루타치온 농도 및 글리옥살라제Ⅰ의 증가와 함께 디카르보닐 화합물의 소거율의 증가가 확인되었다(도4). 3종의 혼합액중에는 반응성이 낮은 3-데옥시글루코손의 소실이 저하되었다. 이 이유로서는 반응성이 높은 다른 디카르보닐인 메틸글리옥살이 존재하기 때문이라고 생각된다. 따라서, 개별의 디카르보닐 화합물용액에 대해서 실험을 행했다.

<실험예5. 글루타치온에 의한 각 디카르보닐 화합물 용액중의 디카르보닐 화합물의 트랩작용>

(1) 실험방법

글리옥살의 농도가 100μM, 글루타치온 농도가 0, 0.1, 1, 10mM, 글리옥살라제Ⅰ의 농도가 0, 0.01, 0.1, 1, 10 unit/ml의 PBS(-)(pH 7.4)용액을 조제하여 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 각각의 샘플 100μl에 2M 과염소산 40μl, 1% o-페닐렌디아민 40μl, 내부표준으로서 50μM의 2,3-부탄디온 100μl을 가해 교반후, 25℃에서 1시간 반응시켰다. 오모리 등의 방법(Ohmori S. et at. J. Chromatogr. 414: 149-155, 1987)에 의해 글리옥살과 o-페닐렌디아민과의 반응에서 생성하는 퀴녹살린 유도체를 역상컬럼을 이용한 HPLC에 의해 분리하여 정량하였다. 메틸글리옥살, 3-데옥시글루코손에 대해서도 마찬가지로 행했다.

(2) 실험방법

글리옥살, 메틸글리옥살 또는 3-데옥시글루코손을 포함하는 용액과 글루타치온을 포함하는 용액에 글리옥살라제Ⅰ의 첨가에 의해 디카르보닐 화합물 농도의 감소가 확인되었다. 또한, 글루타치온 농도 및 글리옥살라제Ⅰ의 증가에 따라 디카르보닐 화합물의 소거율의 증가가 확인되었다(도5). 각 카르보닐 화합물의 소거는 혼합상태에서 인큐베이트한 경우보다도 단독으로 반응시킨 경우가 보다 신속하게 진행하는 경향을 보였다. 이로부터 카르보닐 화합물이 혼합된 상태에는 우선 반응성이 높은(즉, 독성이 높다) 메틸글리옥살이 우선적으로 소거되고 이어서 반응성이 높은 순으로 소거가 진행되는 것이라고 생각된다.

<실험예6. 글루타치온에서 CAPD 배액중의 디카르보닐 화합물의 트랩작용>

(1) 실험방법

동의를 얻은 복막투석 환자로부터 채취한 CAPD 배액(박스터제, PD-4, 1.5사용, 복강내 저류시간 1시간)에 글루타치온, 글리옥살라제Ⅰ을 첨가하여 글루타치온 농도가 5mM, 글리옥살라제Ⅰ 농도가 0, 5, 10, 20 unit/ml의 용액을 조제하여 37℃에서 인큐베이트하였다. 1시간후에 샘플링하여, 각각의 샘플 100μl에 2M 과염소산 40μl, 1% o-페닐렌디아민 40μl, 내부표준으로서 20μM의 2,3-부탄디온 100μl을 가해 교반후, 25℃에서 1시간 반응시켰다. 오모리 등의 방법(Ohmori S. et at. J. Chromatogr. 414: 149-155, 1987)에 의해 3-데옥시글루코손, 글리옥살, 메틸글리옥살과 o-페닐렌디아민과의 반응에서 생성되는 퀴녹살린 유도체를 역상컬럼을 이용한 HPLC에 의해 분리하여 정량하였다.

(2) 실험결과

글리옥살라제Ⅰ 및 글루타치온의 첨가에 의해 CAPD 배액중의 3-데옥시글루코손, 글리옥살, 메틸글리옥살 등의 디카르보닐 화합물 농도의 감소가 확인되었다(도6). 이로부터 글리옥살라제Ⅰ 및 글루타치온의 첨가에 의해 CAPD 환자 복강내의 CAPD액중의 디카르보닐 화합물의 소거가 가능하다고 확인되었다.

본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제에 의해 카르보닐 화합물의 신속한 소거를 달성할 수 있다. 더구나, 그 작용은 메틸글리옥살 뿐만 아니라 그 이외 주요한 카르보닐 화합물인 3-데옥시글루코손이나 글리옥살에도 미친다. 즉, 생체에 카르보닐 스트레스를 초래하는 주요한 카르보닐 화합물의 신속한 소거가 가능하다는 것을 확인하고, 카르보닐 스트레스의 개선제로서 응용한 점에서 본 발명의 커다란 의의가 있다. 본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제는 원래 생체내에서 기능하고 있는 효소반응을 이용하고 있기 때문에 CAPD액과 같은 생체에 직접 도입하는 경우에도 고도의 안전성을 기대할 수 있다.

또한, 효소반응을 이용하기 때문에 그 작용이 특이적인 것도 본 발명의 특징이다. 공지의 카르보닐 스트레스 개선제에 이용되는 화합물은 화학적인 반응에 근거하고 있기 때문에 특이성이 낮고 모든 카르보닐 화합물에 반응하게 된다. 그 때문에 생체에 유해한 당이나 지질유래 카르보닐 화합물뿐만 아니라, 생체에 필요한 피리독살 등의 카르보닐기도 포착해 버릴 가능성이 예측되었다. 본 발명에서는 효소반응을 이용하기 때문에 생체에 유해한 카르보닐 화합물에 대해 고도의 특이성을 기대할 수 있다.

또한, 실시예에서 확인된 바와 같이 본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제는 카르보닐 화합물 중에서도 반응성이 높다고 일컬어지는 화합물을 우선적으로 소거한다. 즉, 메틸글리옥살에 3-데옥시글리코손이나 글리옥살이 공존할 때는 우선 생체에 대한 영향이 큰 메틸글리옥살을 소거한 후에 다른 화합물의 소거가 진행된다. 따라서, 본 발명의 카르보닐 스트레스 개선제는 단지 카르보닐 화합물의 소거속도가 뛰어날 뿐만 아니라, 카르보닐 스트레스 상태를 개선하고자 하는 목적에 대하여 합리적인 반응을 진행하고 있다고 할 수 있다.

Claims

글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소 및 카르보닐 화합물 환원제를 유효성분으로 하는 카르보닐 스트레스 개선제.
제1항에 있어서, 유효성분으로서 글리옥살라제Ⅱ 활성을 가지는 효소를 더 포함하는 카르보닐 스트레스 개선제.
제1항에 있어서, 카르보닐 화합물 환원제가 환원형 글루타치온 및/또는 그 유도체인 카르보닐 스트레스 개선제.
제3항에 있어서, 카르보닐 화합물을 소거해야 할 매체중에서 환원형 글루타치온의 최종농도가 0.1∼50mM이 되도록 배합된 카르보닐 스트레스 개선제.
제1항에 있어서, 2-옥소알데히드의 소거에 의해 카르보닐 스트레스를 개선하는 카르보닐 스트레스 개선제.
제5항에 있어서, 2-옥소알데히드가 글리옥살, 메틸글리옥살 및 3-데옥시글루코손으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나의 화합물인 카르보닐 스트레스 개선제.
제1항에 있어서, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소가 담체에 고정화되어 있는 카르보닐 스트레스 개선제.
제7항의 담체를 카르보닐 화합물 환원제의 존재하에서 환자혈액 또는 복막투석액과 접촉시키는 공정을 포함하는 카르보닐 화합물의 제거방법.
제1항의 카르보닐 스트레스 개선제를 포함하는 복막투석액.
카르보닐 화합물 환원제의 존재하에서, 글리옥살라제Ⅰ 활성을 가지는 효소를 복막투석액과 접촉시키는 공정을 포함하는 복막투석액에 있어서 카르보닐 스트레스의 개선방법.