RU2612092C1 - Способ диагностики сахарного диабета по уровню метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности с использованием моноклональных антител - Google Patents
Способ диагностики сахарного диабета по уровню метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности с использованием моноклональных антител Download PDFInfo
- Publication number
- RU2612092C1 RU2612092C1 RU2015152496A RU2015152496A RU2612092C1 RU 2612092 C1 RU2612092 C1 RU 2612092C1 RU 2015152496 A RU2015152496 A RU 2015152496A RU 2015152496 A RU2015152496 A RU 2015152496A RU 2612092 C1 RU2612092 C1 RU 2612092C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- methylglyoxal
- level
- density
- diabetes mellitus
- sample
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторным методам исследования, и может быть использовано для диагностики сахарного диабета. Способ включает биохимическое исследование крови у пациентов, где в плазме / сыворотке крови определяют уровень метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности путем иммунометрического сэндвич-метода иммуноферментного анализа. Затем уровень метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности в определяемом образце рассчитывают в условных единицах относительно контрольного образца (cut-off): OD450 образца/OD450 cut-off . При значении ≥1 судят о наличии сахарного диабета. Изобретение обеспечивает повышение эффективности и точности диагностики сахарного диабета и осуществление контроля за эффективностью проводимой терапии данного заболевания. 3 пр., 2 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторным методам исследования.
В настоящее время в клинике широко используются способы диагностики и мониторинга сахарного диабета путем оценки содержания гликозилированного гемоглобина в образце, в частности один из запатентованных способов включает стадии: (а) гемолиза образца с целью высвобождения клеточного гемоглобина; (b) контактирования гемоглобина, выделенного из указанного образца согласно стадии (с), описанной ниже, с помощью сигналобразующих молекул, включающих конъюгат из одного или более дигидроксиборильных остатков или их солей, связанных с сигналобразующей меткой; (с) выделения гликозилированного и негликозилированного гемоглобина и любых связанных с ним молекул из образца и их определение электрофоретическим методом.
(Патент РФ №2111494, МПК G01N 33/66, опубл. 20.05.1998)
Недостатком данного способа является сложность проведения исследования и использование дорогостоящего оборудования, кроме того, образцы крови для исследования данным способом не могут храниться длительное время в замороженном виде.
Задачей изобретения является создание альтернативного и эффективного способа диагностики сахарного диабета, повышающего качество и достоверность иммунохимических анализов, точность определения, а также позволяющего осуществлять объективный контроль за эффективностью проводимой лекарственной терапии этого заболевания.
Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности и точности диагностики сахарного диабета и осуществлении контроля за эффективностью проводимой терапии данного заболевания.
Это достигается тем, что в заявляемом способе диагностики сахарного диабета, включающем биохимическое исследование крови, согласно изобретению у пациентов в плазме (сыворотке) крови определяют уровень метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности путем иммунометрического сэндвич-метода иммуноферментного анализа, затем уровень метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности в определяемом образце рассчитывают в условных единицах относительно контрольного образца (cut-off): OD450 образца/OD450 cut-off и при значении ≥1 судят о наличии сахарного диабета.
Липопротеиды низкой плотности (ЛНП) представляют собой липид-транспортирующие наночастицы плазмы крови. Окислительные превращения глюкозы при диабетической гипергликемии сопровождается накоплением α-оксоальдегида метилглиоксаля. Дикарбонилы, подобные метилглиоксалю, способны вызывать химическую модификацию апопротеина В-100 частиц ЛНП, которая опознается скэвинджер-рецепторами клеток стенки сосуда, что сопровождается усиленным поглощением частиц ЛНП и развитием повреждений сосудистой стенки при сахарном диабете.
Осуществление способа:
У пациента берут кровь для проведения анализа. Для определения содержания метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в плазме (сыворотке) крови используют иммунометрический сэндвич-метод иммуноферментного анализа. Лунки планшета для иммуноферментного анализа покрывают моноклональными антителами к апо-В100. При внесении в лунки образцов плазмы (сыворотки) крови или соответствующих контролей происходит связывание иммобилизованных антител с содержащимися в образцах частицами ЛНП, в том числе с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП. Не связавшийся материал удаляют из лунок путем отмывки. На следующем этапе реакции моноклональные антитела 6D8 к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП, меченые биотином (реагент для анализа), соединяют только с иммобилизованными метилглиоксаль-модифицированными ЛНП. После удаления не связавшегося материала из лунок путем отмывки образовавшийся комплекс выявляют с помощью конъюгата стрептавидина с пероксидазой. Ферментативная активность пероксидазы, определяемая в колориметрической реакции по изменению окраски субстратной смеси с хромогеном тетраметилбензидин, прямо пропорциональна количеству определяемых в образце метилглиоксаль-модифицированных ЛНП. Оптическую плотность OD450 субстратной смеси после остановки реакции регистрируют на планшетном спектрофотометре при 450 нм.
Уровень метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в определяемом образце рассчитывают в условных единицах относительно контрольного образца (cut-off): OD450 образца/OD450 cut-off. При отношении ≥1 судят о наличии сахарного диабета.
Уровень нормальных значений содержания метилглиоксаль-модифицированных ЛНП (OD450 cut-off) определяли следующим образом.
В образцах плазмы клинически здоровых доноров вышеописанным способом определяли уровень OD450. Всего было проанализировано 370 образцов. После этого рассчитывали среднее значение OD450 (М) и стандартное отклонение (SD) для определяемой выборки. Значение D450 cutoff рассчитывали по формуле: OD450 cut-off=M2+SD.
Клинический пример 1.
Пробанд З., 58 лет, участвовала в эпидемиологическом обследовании в ЗАО г. Москвы, проводившемся в ФГБУ «РКНПК» Минздрава РФ. В процессе обследования на основании биохимических и клинических данных были исключены заболевания печени, почек, онкология и значимые заболевания сердечно-сосудистой системы (гипертония, сердечная недостаточность, перенесенный инфаркт миокарда). Гиперлипидемия не выявлена (уровень общего холестерина 4,39 ммоль/л). Провели исследование по заявляемому способу. Содержание метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в плазме крови составило 0,56 (в пределах нормальных значений). Для подтверждения данных исследования был определен уровень гликированного гемоглобина, который составил 5,2%. На основании клинических, анамнестических и лабораторных методов исследования диагноз сахарного диабета был исключен.
Клинический пример 2.
Пробанд И., 46 лет, участвовал в эпидемиологическом обследовании в ЗАО г. Москвы, проводимом в ФГБУ «РКНПК» Минздрава РФ. В процессе обследования на основании биохимических и клинических данных были исключены заболевания печени, почек, онкология и значимые заболевания сердечно-сосудистой системы (гипертония, сердечная недостаточность, перенесенный инфаркт миокарда). Содержание метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в плазме крови, определенное предлагаемым способом, составило 3,82 (превышение нормальных значений почти в 4 раза), что указывает на наличие сахарного диабета. Для подтверждения этих данных определили уровень гликированного гемоглобина, который составил 8,87%. На основании клинических, анамнестических и лабораторных методов исследования был поставлен диагноз: впервые выявленный сахарный диабет 2 типа.
Пример 3 на основе экспериментальных исследований.
Пример поясняется графическими материалами, где показана специфичность антител к нативным ЛНП, МДА- и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП:
Фиг. 1 - специфичность антител по заявляемому способу.
Фиг. 2 - специфичность антител известного тест-набора.
Для получения моноклональных антител к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП мышей линии BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно 4 раза с интервалом в 2 недели, используя в качестве антигена метилглиоксаль-модифицированные ЛНП плазмы крови здоровых доноров (по 100 мкг антигена/ мышь при каждом введении). Для первой инъекции использовали полный адъювант Фрейнда, с которым смешивали раствор антигена до получения устойчивой эмульсии, для второй - неполный адъювант Фрейнда (оба адъюванта - производства фирмы Calbiochem, США). Третья и четвертая иммунизации проводились в фосфатно-солевом буфере без адъюванта. Через неделю после последней иммунизации у мышей брали кровь из хвостовой вены и в сыворотках проверяли иммунный ответ. Для гибридизации была отобрана мышь с наилучшим иммунным ответом. За 3 дня до гибридизации проводили бустирование отобранной мыши путем введения раствора антигена в ФСБ в хвостовую вену (10 мкг). Слияние проводили с использованием миеломной линии X.63.Ag8.653 (субклон Р301) и клеток селезенки, выделенных из иммунизированной мыши. Отбор клеток - продуцентов моноклональных антител нужной специфичности вели с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Тестирование культуральных сред от выросших популяций проводилось одновременно на 3-х антигенах: ЛНП, МДА-модифицированные ЛНП и метилглиоксаль-модифицированные ЛНП для проверки специфичности связывания получаемых моноклональных антител исключительно с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП. Из 700 выросших гибридных популяций при тестировании с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП было выявлено 3 популяции с положительным ответом+, но после клонирования и реклонирования одна популяция перестала секретировать антитела. Два оставшихся клона 6D8 и 1D3 были выращены в культуре в количествах, достаточных для получения асцитной жидкости, после чего они были введены мышам линии BALB/c. Получение асцитной жидкости, содержащей моноклональные антитела, проводили с соответствии со стандартной производственной процедурой ООО фирмы «Мона». Моноклональные антитела были выделены из асцитной жидкости с помощью осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии на колонке с носителем DEAE-Toyopearl 650М производства фирмы TosoHaas, Япония.
Анализ качества полученных 2 препаратов моноклональных антител был проведен в сертифицированной лаборатории контроля качества ЗАО «Фрамон» - компании, производящей препарат Монафрам, разработанный на основе соответствующих моноклональных антител в ООО фирмы «Мона». Во всех препаратах содержание мышиных моноклональных антител было не менее 95%.
Исследование специфичности связывания полученных моноклональных антител к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП проводили с использованием нативных ЛНП, МДА-модифицированных ЛНП и метилглиоксаль-модифицированных ЛНП. Было показано, что полученные моноклональные антитела активно связываются с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП, тогда как их связывания с нативными ЛНП и МДА-модифицированными ЛНП не наблюдалось (Фиг. 1). При проведении аналогичного испытания тест-наборов для определения уровня окисленных ЛНП производства фирмы Mercodia (Швеция) было установлено, что наибольшее связывание содержащихся в этом тест-наборе антител происходит с МДА-модифицированными ЛНП, однако при сравнительно высоких уровнях антигенов (1,5-6,5 мкг/мл) было выявлено заметное связывание с нативными ЛНП и в меньшей степени с метилглиоксаль-модифицированными ЛНП (Фиг. 2).
Данные проведенного исследования показали, что полученные моноклональные антитела обладают значительно большей специфичностью, чем подобного рода антитела, входящие в состав широко распространенных коммерческих иммунохимических тест-наборов. Тест-наборы, созданные на основе полученных моноклональных антител, позволят снизить себестоимость и повысить качество иммунохимических анализов, способствующих уточнению диагноза и тяжести течения сахарного диабета, а также позволят осуществлять объективный контроль за эффективностью проводимой лекарственной терапии этого заболевания.
Таким образом, определение уровня метилглиоксаль-модифицированных ЛНП в плазме крови может быть альтернативным способом выявления сахарного диабета, при этом заявляемый способ отличается простотой при минимальных затратах времени проведения анализов, возможностью длительной сохранности образцов для исследования, а также возможностью автоматизации процесса.
Claims (1)
- Способ диагностики сахарного диабета, включающий биохимическое исследование крови, отличающийся тем, что у пациентов в плазме (сыворотке) крови определяют уровень метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности путем иммунометрического сэндвич-метода иммуноферментного анализа, затем уровень метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности в определяемом образце рассчитывают в условных единицах относительно контрольного образца (cut-off): OD450 образца/OD450 cut-off и при значении ≥1 судят о наличии сахарного диабета.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015152496A RU2612092C1 (ru) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | Способ диагностики сахарного диабета по уровню метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности с использованием моноклональных антител |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015152496A RU2612092C1 (ru) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | Способ диагностики сахарного диабета по уровню метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности с использованием моноклональных антител |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2612092C1 true RU2612092C1 (ru) | 2017-03-02 |
Family
ID=58459401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015152496A RU2612092C1 (ru) | 2015-12-08 | 2015-12-08 | Способ диагностики сахарного диабета по уровню метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности с использованием моноклональных антител |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2612092C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2111494C1 (ru) * | 1989-05-11 | 1998-05-20 | Эксиз Рисерч АС | Способ определения гликолизированного гемоглобина в присутствии негликолизированного гемоглобина, аналитический тестовый набор |
| RU2473091C1 (ru) * | 2011-09-07 | 2013-01-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якутов |
-
2015
- 2015-12-08 RU RU2015152496A patent/RU2612092C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2111494C1 (ru) * | 1989-05-11 | 1998-05-20 | Эксиз Рисерч АС | Способ определения гликолизированного гемоглобина в присутствии негликолизированного гемоглобина, аналитический тестовый набор |
| RU2473091C1 (ru) * | 2011-09-07 | 2013-01-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якутов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Orekhov AN et al. Modified low density lipoprotein and lipoprotein-containing circulating immune complexes as diagnostic and prognostic biomarkers of atherosclerosis and type 1 diabetes macrovascular disease. Int J Mol Sci. 2014 Jul 21;15(7):12807-41. PMID: 25050779;. Shigematsu S et al. Increased incidence of coronary in-stent restenosis in type 2 diabetic patients is related to elevated serum malondialdehyde-modified low-density lipoprotein. Circ J. 2007 Nov;71(11):1697-702. PMID: 1796548Кумскова Е. М. МЕХАНИЗМЫ АТЕРОГЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ КАРБОНИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ. Автореф. дисс. к.б.н. Москва, 2012.. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2554990B1 (en) | Measurement method using immunochromatography, test strip for immunochromatography, and measurement reagent kit for immunochromatography | |
| EP2322562B1 (en) | Monoclonal antibody, and immunoassay using same | |
| EP1867659A1 (en) | Antibody reactive specifically to age derived from 3,4-dge | |
| US20220113322A1 (en) | Rapid measurement of total vitamin d in blood | |
| EP2631649A1 (en) | Method and device for the rapid diagnosis of diseases in faecal samples | |
| EP2693213B1 (en) | Detection method using immunochromatography capable of determining sample without addition of specimen as operation-failure sample, and test strip for use in same | |
| WO1994004563A1 (en) | PEPTIDES CONTAINING RESPECTIVE AMINO ACID SEQUENCES SELECTED FROM AMONG THOSE OF LIPOPROTEIN(a) AND APOLIPOPROTEIN(a), ANTIBODIES RESPECTIVELY RECOGNIZING THESE AMINO ACID SEQUENCES, AND METHOD OF ASSAYING WITH THESE ANTIBODIES | |
| JP5709425B2 (ja) | Ｄダイマー測定用試薬 | |
| WO2013078122A1 (en) | Diabetes diagnosis through the detection of glycated proteins in urine | |
| JP2007277263A (ja) | カルボキシメチル化タンパク質に対する抗体 | |
| JP2008175814A (ja) | 尿中タンパク質分子の検出・定量による糖尿病性腎症の検査方法及びそれに使用するキット | |
| EP2599865B1 (en) | Anti-fdp monoclonal antibody, fdp measurement reagent and reagent kit using same, and fdp measurement method | |
| EP3640644B1 (en) | Target marker gp73 for detecting steatohepatitis and detection application method | |
| JP2020526745A (ja) | 血液中のユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼｌ１レベルを測定するための、改善された方法 | |
| RU2612092C1 (ru) | Способ диагностики сахарного диабета по уровню метилглиоксаль-модифицированных липопротеидов низкой плотности с использованием моноклональных антител | |
| KR101309576B1 (ko) | 대사물질을 이용한 심부전 바이오마커 | |
| EP3438669A1 (en) | Method for determining susceptibility to diabetes | |
| JP2011038858A (ja) | 血栓症の早期診断のための検査方法と検査試薬およびキット | |
| CN103376322A (zh) | 载脂蛋白b 100作为肥胖型糖尿病标志物的应用 | |
| JP5231954B2 (ja) | アルブミン測定試薬 | |
| JP4762135B2 (ja) | 全身性動脈硬化症の検査方法、及び検査試薬 | |
| WO2009099228A1 (ja) | 心不全の予知および検査方法と検査試薬およびキット | |
| JP5182684B2 (ja) | カルボキシエチルアルギニンに対する抗体 | |
| JP2775445B2 (ja) | 抗フェニトインモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ | |
| KR20210130049A (ko) | 라싸 바이러스 핵단백질에 특이적인 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이를 이용한 라싸 바이러스 검출 키트 |