CN103073633A - 一种抗5-羟甲基糠醛的抗体 - Google Patents

Abstract

5-羟甲基糠醛的人工抗原和抗体的制备涉及具有5-羟甲基糠醛基本结构的半抗原、人工抗原和抗体的制备。本发明以简便的方法制备了特异性良好的5-羟甲基糠醛的抗体。该抗体是以5-羟甲基糠醛与琥珀酸酐合成半抗原，然后分别与KLH和HRP连接合成人工抗原和酶标抗原。人工抗原再经动物免疫，取血，分出抗血清，纯化制的抗体。该抗体稳定，具有良好的特异性和灵敏度，且合成方法简单，可用于食品中5-羟甲基糠醛的快速免疫检测，具有良好的应用前景。

Description

一种抗5-羟甲基糠醛的抗体

技术领域

本发明涉及选择一种具有-COOH的、又最大可能包含5-羟甲基糠醛原有结构的化合物作为5-羟甲基糠醛半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗体制备方法。本发明属于生物技术领域。 

背景技术

近年来，随着生活水平的提高，油炸食品中的有害致癌物质已经引起人们的广泛关注。5-羟甲基糠醛是油炸食品中的一种普遍存在的物质。它是具有一个呋喃环结构的糠醛化合物，主要是由己糖在酸和加热条件下分解而产生的。它广泛存在于含有糖类物质的食品中，如面包、薯片、苹果汁、速溶咖啡、婴儿乳制品、蜂蜜、牛奶等。有关研究表明5-HMF可能会引发并促进结肠小囊异常生长(ACF)，具有一定程度的基因毒性，并且对眼、粘膜或皮肤有刺激性，食之过多会引起中毒，造成动物横纹肌麻痹和内脏损害。尽管关于5-羟甲基糠醛的毒副作用还存在着一定争议，但是它的研究及检测对医学领域同样有着重要的参考依据。按照GB18796-2005中规定蜂蜜中5-羟甲基糠醛最大含量不得超过40ug/g，国际果汁加工联合会(IFFJP)建议果汁中5-羟甲基糠醛的最大残留限量为5～10ug/ml，浓缩果汁中最大残留限量为25ug/ml。 

然而，由于5-羟甲基糠醛的分子量为126.1，小于1000dolton(道尔顿)，一般传统上采用液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)或质谱等物化方法对其残留进行检测。虽然这些传统的理化分析方法灵敏度较高，而且较为准确，但由于它们普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以难以满足实际分析的需要，因此迫切需要发展一种简单、快速、灵敏的分析技术。 

而免疫分析技术正是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术。其基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为5-羟甲基糠醛残留研究提供了一条新的分析检测途径。 

发明内容

本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测 识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。 

本发明为达到以上目的，所设计的技术方案是合成分子结构式如下图所示的5-羟甲基糠醛半抗原，然后将半抗原与载体蛋白联接合成人工抗原，免疫动物，获得抗体。 

(1)将5-羟甲基糠醛加入少量新制的四氢呋喃溶液中使其溶解，再依次加入4-二甲基吡啶，三乙胺，琥珀酸酐，投料比为：1∶1∶2～5∶2～5，在60℃油浴中搅拌反应9h。反应完毕后，在减压条件下除去溶剂得到初级半抗原产物，再经200～300目的硅胶柱纯化并减压蒸发溶剂后得到较纯的目标产物。 

通过配制适宜极性展开剂进行柱层析来进行纯化。其中展开剂配比为：甲醇∶二氯甲烷＝1∶8～10，再加入约5％冰乙酸。 

(2)称取半抗原溶于适量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，溶解后再加入DCC和N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)，投料比例为：1∶5～10∶2～5，混合后于室温避光条件下反应24～48h，取反应液于4000r/min，4℃条件下离心10～20min，取上清液作为含有活化酯的溶液1. 

本发明还提供了上述5-羟甲基糠醛半抗原的用途，是用作动物免疫的抗原体系的原料。 

(3)人工抗原的合成：将载体蛋白BSA溶于磷酸盐缓冲液中(溶液2)，然后在冰浴条件下将含有活化酯的溶液1缓慢加入到溶液2中。滴加完毕后3～5℃下搅拌反应过夜，然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/L PBS溶液充分透析，得到5-羟甲基糠醛免疫原。 

(4)包被原的制备 

用5-羟甲基糠醛活化酯与卵清白蛋白(OVA)连接即制成包被抗原，用于包被反应。 

(5)抗体的制备及纯化： 

免疫动物选择新西兰大白兔2只，月龄3个月，体重1.5公斤左右，分别编号为1号、2号。免疫采取皮下和肌肉注射法共同进行。 

免疫程序：初次免疫：为提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐剂乳化的免疫原，剂量为1mg，溶于1mL 0.9％的NaCl，再与1mL的弗氏完全佐剂混合进行乳化。加强免疫：初次免疫后第14天和28天进行加强免疫，剂量为1.0mg，溶于1mL 0.9％的NaCl，再与1mL的弗氏不完全佐剂混合进行乳化。以后每隔14天加强免疫一次，共免疫6次。从第3次加强 免疫开始，每次免疫10天后对动物试采血进行血清效价测定和亲和力测定。末次免疫后采用股动脉采血法对动物采全血，经离心处理后收集全部血清，采取免疫亲合层析法进行抗体纯化，所得抗体添加0.1％(W/V)的叠氮钠后于4℃储存备用。 

血清效价检测方法的步骤： 

1)将制备好的5-羟甲基糠醛包被原溶于pH 9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液中，将5-羟甲基糠醛包被原稀释为1.0μg/100μL作为包被液，96孔微孔板每孔各加入100μL，室温(或4℃)放置过夜或者37℃恒温温育2～3小时，用PBST即磷酸盐缓冲液0.05％(V/V)，Tween20洗液洗涤三次； 

2)每孔加入200μL 0.5％脱脂乳粉/PBS封闭液，室温封闭1小时，用洗液洗涤四次； 

3)将各种稀释倍数的5-羟甲基糠醛抗血清加入到各自的微孔中，要三孔平行加样，震荡混匀5～10min，室温反应1小时； 

4)用洗液洗微孔板3～4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，向每微孔加100微升羊抗兔酶标二抗，室温反应30分钟； 

5)用洗液洗微孔板3～4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，加入底物A和底物B的混合液，该底物A和底物B的混合液的配比为14.6∶0.45，室温下反应0.5小时； 

6)向各微孔中加入终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光度值，根据吸光值为1时的血清稀释度为效价，绘制从免疫24天到第120天的5-羟甲基糠醛抗体效价曲线。 

本发明的优点和积极效果是： 

1.本发明最大程度地保留了5-羟甲基糠醛的化学结构，为国内外首创的新化合物，用此半抗原制备的免疫抗原去免疫动物最大可能保留了原来5-羟甲基糠醛的分子结构，这为获得对5-羟甲基糠醛有高度特异性的抗体提供了保证。 

2.在合成5-羟甲基糠醛半抗原的基础上，合成其活化酯能大大提高半抗原与大分子蛋白的联结率。 

3.本发明，具有特异、灵敏、准确、快速、廉价等特点，所设计、合成的半抗原为制备特异性良好的抗体奠定了基础。 

4.经试验验证，上述半抗原，其合成方法简单，且所用主要原料如5-羟甲基糠醛，四氢呋喃价格低廉、容易获得，在一般化学试剂公司均可购得。 

5.本发明经试验验证上述半抗原，其合成方法简便，合成效率高，反应步骤少，提高了反应的可控性；另外，合成产物的提取、纯化方法简便，易于推广普及。 

具体实施方式

下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 

实施例1： 

1.半抗原的合成 

本发明的半抗原分子量为226，分子结构式为： 

具体制备方法是：将144.9mg(1.15mmol)5-羟甲基糠醛加入少量新制的四氢呋喃溶液中使其溶解，再依次加入4-二甲基吡啶140.3mg(1.15mmol)，三乙胺(2.3mmol)0.317ml，琥珀酸酐(2.3mmol)230mg，在60℃油浴中搅拌反应过夜(约9个小时)。溶剂在减压条件下被除去，而残留物用甲醇/二氯甲烷/冰乙酸(1∶9.5∶0.05V/V/V)溶解。初级产物通过色谱柱用甲醇/二氯甲烷/冰乙酸(1∶9.5∶0.05V/V/V)纯化。所得到的产物经过收集，真空条件下旋转蒸发而得到相对纯净的淡黄色半抗原。 

装柱采用10g，200～300目硅胶，并在办半抗原产物中加入1.0g同样规格硅胶后旋蒸至干，以进行干法加样。目标产物分子量为226，经质谱图分析，有该物质单体加钠峰及其二倍体加钠峰，证明已合成该物质。 

2.半抗原活化酯的合成 

具体制备方法是：精确称取半抗原3.42mg溶于200μl N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，溶解后再加入31.21mg的DCC和8.71mgNHS，混合后于室温避光条件下反应24h，取反应液于4000r/min，4℃条件下离心10min，取上清液作为含有活化酯的溶液1。 

3、人工抗原的合成 

采用半抗原活化酯通过活化酯法连接到牛血清白蛋白(BSA)上，合成人工抗原，其分子结构式为： 

具体制备方法是：载体蛋白BSA 20mg溶于4ml pH值为7.4的0.01mol/ml的PBS中(溶 液2)，然后在冰浴条件下将活化酯溶液1缓慢逐滴加入到溶液2中。然后放于4℃冰箱内反应过夜，将反应液装入透析袋，4℃下pH＝7.4的0.01mol/mL的PBS中透析3天，每天换透析液3-4次，透析完后，精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存。 

人工抗原的鉴定： 

按合成5-羟甲基糠醛免疫抗原反应所用载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定。偶联物在215nm处出现最大吸收峰，而BSA的最大吸收峰为210，两者存在明显的变化，表明人工抗原的合成成功。 

4、包被抗原的合成 

用半抗原活化酯与卵清白蛋白连接即制成包被抗原，用于包被酶标板。其具体做法同人工抗原的合成。 

5、抗体的制备及纯化： 

免疫动物选择新西兰大白兔2只，月龄3个月，体重1.5公斤左右，饲养于标准试验动物房中，连续观察7天，确定身体状况正常后进行免疫。免疫采取皮下和肌肉注射法共同进行。 

初次免疫：称取剂量为1mg，溶于1mL 0.9％的NaCl，再与1mL的弗氏完全佐剂混合进行乳化，乳化液用于免疫。 

加强免疫：初次免疫后第14天和28天进行加强免疫，剂量为1.0mg，溶于1mL 0.9％的NaCl，再与1mL的弗氏不完全佐剂混合进行乳化。以后每隔14天加强免疫一次，共免疫6次。从第3次加强免疫开始，每次免疫10天后对动物试采血进行血清效价测定。末次免疫后采用股动脉采血法对动物采全血，经离心处理后收集全部血清，采取proteinA-SepharoseCL-4B免疫亲合层析柱进行抗体纯化，所得抗体添加0.1％(W/V)的叠氮钠后于4℃储存备用。 

6、血清效价检测方法的步骤： 

包被：将制备好的5-羟甲基糠醛包被原溶于pH 9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液中，将5-羟甲基糠醛包被原稀释为1.0μg/100μL作为包被液，96孔微孔板每孔各加入100μL，室温(或4℃)放置过夜或者37℃恒温温育2～3小时，用PBST即磷酸盐缓冲液0.05％(V/V)，Tween20洗液洗涤三次； 

封闭：每孔加入200μL 0.5％脱脂乳粉/PBS封闭液，室温封闭1小时，用洗液洗涤四次； 

加样：将各种稀释倍数的5-羟甲基糠醛抗血清加入到各自的微孔中，要三孔平行加样， 震荡混匀5～10min，室温反应1小时； 

加酶标二抗：用洗液洗微孔板3～4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，向每微孔加100微升羊抗兔酶标二抗，室温反应30分钟； 

加底物：用洗液洗微孔板3～4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，显色底物使用四甲基联苯胺(TMB)。每孔加入100微升四甲基联苯胺-双氧水溶液(5mg四甲基联苯胺溶于1ml底物缓冲液)，室温下反应0.5小时； 

终止：向各微孔中加入终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光度值，根据吸光值为1时的血清稀释度为效价。 

Claims (4)

1.5-羟甲基糠醛的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为

的半抗原与牛血清白蛋白连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大白兔，取血，分离出抗血清纯化制得抗体；

2.权利要求1所述的5-羟甲基糠醛人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

(1)半抗原的合成

将144.9mg 5-羟甲基糠醛加入少量新制的四氢呋喃溶液中使其溶解，再依次加入4-二甲基吡啶140.3mg，三乙胺0.317ml，琥珀酸酐230mg，在60℃油浴中搅拌反应9个小时，溶剂在减压条件下被除去，而残留物用体积比为1∶9.5∶0.05的甲醇/二氯甲烷/冰乙酸溶解，初级产物通过色谱柱用体积比为1∶9.5∶0.05的甲醇/二氯甲烷/冰乙酸纯化，所得到的产物经过收集，真空条件下旋转蒸发而得到相对纯净的淡黄色半抗原；

(2)半抗原活化酯的合成

精确称取半抗原3.42mg溶于200μl N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，溶解后再加入31.21mg的：N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和8.71mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混合后于室温避光条件下反应24h，取反应液于4000r/min，4℃条件下离心10min，取上清液作为含有活化酯的溶液1；

(3)人工抗原的合成

载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)20mg溶于4ml pH值为7.4的0.01mol/ml的磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后在冰浴条件下将含有活化酯的溶液1缓慢逐滴加入到BSA中，滴加完毕后放于4℃冰箱内过夜，将反应液装入透析袋后，4℃下pH＝7.4的0.01mol/mL的PBS中透析3天，每天换透析液3-4次，透析完后，精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存；

3.权利要求1所述的5-羟甲基糠醛酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

取5-羟甲基糠醛半抗原1.03mg溶于200ul DMF中，再加入9.4mg DCC和2.62mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，磁力搅拌避光反应24h合成活化酯。采用上述合成的活化酯4℃，4000r/min离心后取上清液作为溶液A，冰浴条件下将溶液A逐滴加入含5mg辣根过氧化酶(HRP)的浓度为130mmol/L，pH＝8.1的2ml碳酸氢钠缓冲液中，4℃反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，再在4℃下pH＝7.4的0.01mol/ml PBS中透析3天，每天换透析液3-4次，透析完后即可得到酶标抗原，用于显色反应；

4.权利要求1所述的5-羟甲基糠醛抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

免疫动物选用雄性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周、6周和8周后免疫四次，免疫后10天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：

初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；

加强免疫：用1.0mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗5-羟甲基糠醛的特异性抗体。