CN107090037A - 一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫学技术领域，公开了一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法。本发明所述制备方法利用碳二亚胺法将胰高血糖素与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；将免疫抗原免疫兔子，取血离心，所得抗血清为胰高血糖素多克隆抗体。本发明通过胰高血糖素与牛血清蛋白偶联形成免疫抗原，同时优化免疫抗原免疫、提取抗体等工艺步骤，获得效价较高、抗体量较多的胰高血糖素多克隆抗体。

Description

一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法。
背景技术
胰高血糖素(升糖素)是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素，是由29个氨基酸组成直链多肽，分子量为3485道尔顿。胰高血糖素是一种促进分解代谢的激素，它具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高，1mol/L的激素可使3×106mol/L的葡萄糖迅速从糖原分解出来。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化，使酮体生成增多。
胰高血糖素分泌过多会使血糖浓度增大，所以2型糖尿病的发生与发展中不仅是胰岛素功能和分泌异常所致，胰高血糖素也在发挥重要作用，而且也可能是糖尿病发病的一个独立因素。胰高血糖素异常升高是导致2型糖尿病患者血糖偏高的重要因素，检测胰高血糖素水平有助于临床准确判断糖尿病患者病情。目前已知检测胰高血糖素的方法主要是放射性免疫法(RIA)，也有报道采用胰高血糖素单抗依据免疫学原理进行检测的方法，如专利CN105116140A。
单克隆抗体虽然在特异性上要好于多克隆抗体，但是如果所识别的抗原表位被破坏，实验的结果将会受到很大的影响，这是单抗的缺点之一；而多抗可以识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。在相同条件下，使用多抗可以提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。一般的多抗的制备方法是将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体，一般有兔多抗，鼠多抗等。然而这种一般的制备方法用来制备胰高血糖素多抗，其抗体量较少。目前，尚没有关于制备胰高血糖素多抗的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法，使得所述制备方法能够提高多克隆抗体的抗体量，并且具备较高的效价。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法，包括：
步骤1、利用碳二亚胺法将胰高血糖素与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；
步骤2、将免疫抗原免疫兔子，取血离心，所得抗血清为胰高血糖素多克隆抗体。
针对现有工艺中缺少胰高血糖素多克隆抗体的制备方法的问题，本发明通过胰高血糖素与牛血清蛋白偶联形成免疫抗原，同时优化免疫抗原免疫、提取抗体等工艺步骤，获得效价较高、抗体量较多的胰高血糖素多克隆抗体。
作为优选，步骤1为：
称取胰高血糖素和N-羟基琥珀酰亚胺完全溶于DMF中，再加入DCC反应，反应液离心后收取上清液，将上清液滴加到溶有BSA的缓冲液中进行反应，然后将所得反应液透析，得到免疫抗原。
在本发明具体实施过程中，步骤1为：
取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺完全溶于1ml的DMF中，再加入0.12mmol的DCC，置于4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液10000r/min离心10min，离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有2mmol BSA的PBS(0.01mol/L、PH7.4)中，4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液放入透析袋中，在4℃条件下用PBS(0.01mol/L、PH7.4)透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。
作为优选，步骤2为：
用磷酸缓冲盐溶液将步骤(1)所得免疫抗原配制成免疫抗原溶液免疫兔子，第一次免疫时取1ml的免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化，使其完全混为一相，采用皮下多点注射的方式对每只兔子免疫注射2ml；
首次免疫两周后进行加强免疫，加强免疫时用等体积的弗氏不完全佐剂与1ml免疫抗原溶液混合用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml，之后每隔两周进行加强免疫一次；对兔子进行加强免疫4次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃冰箱过夜，第二天离心分离取上清液，得到胰高血糖素多克隆抗体。
采用常规的多克隆抗体制备方法与本发明所述方法进行对比，结果显示，本发明所述制备方法能够获得较多的胰高血糖素多克隆抗体，并具备较高的效价。同时，和其他蛋白偶联形成的免疫抗原相比，本发明胰高血糖素和牛血清蛋白偶联形成免疫抗原更适合制备高效价、高抗体量的多克隆抗体。
由以上技术方案可知，本发明通过胰高血糖素与牛血清蛋白偶联形成免疫抗原，同时优化免疫抗原免疫、提取抗体等工艺步骤，获得效价较高、抗体量较多的胰高血糖素多克隆抗体。
附图说明
图1所示为本发明所述的免疫抗原与BSA电泳检测图；其中，1为免疫抗原，2为BSA；
图2所示为本发明制备的胰高血糖素多克隆抗体效价图；其中，纵坐标Abs表示吸光度，横坐标The dulition of antibody表示稀释比例；
图3所示为本发明制备的胰高血糖素多克隆抗体竞争抑制曲线图；其中，纵坐标mp/mp表示抑制率，横坐标Concentration表示抗体浓度。
具体实施方式
本发明公开了一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述制备方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法做进一步说明。
实施例1：本发明制备胰高血糖素多克隆抗体的方法
1、免疫抗原合成
称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)完全溶于1ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入0.12mmol的二环己基碳二亚胺(DCC),置于4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。第二天把反应液10000r/min,10min离心,离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有BSA(2mmol)的PBS(8ml,10mmol,PH7.4)中，4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。将所得反应液放入透析袋中，在4℃条件下用PBS透析(0.01mol/L PH7.4)三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。
免疫抗原电泳检测(图1)，结果显示，免疫抗原的电泳图与BSA相比发生了明显变化，说明半抗原与载体蛋白偶联成功。
2、多克隆抗体的提取
选取两只3个月左右的雌性新西兰大白兔，体重约1.5公斤左右；用新配制的磷酸缓冲盐溶液(PBS,0.01mol/L,PH7.4)将步骤(1)所得免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，第一次免疫时取1ml的免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化，使其完全混为一相，采用皮下多点注射的方式对每只兔子免疫注射2ml；首次免疫两周后进行加强免疫，加强免疫时用等体积的弗氏不完全佐剂与1ml免疫抗原溶液混合用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml，之后每隔两周进行加强免疫一次；对兔子进行加强免疫4次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃冰箱过夜，第二天以10000r/min，10min离心分离取上清液，得到胰高血糖素多克隆抗体，20mL/只兔子，于-20℃保存备用。
实施例2：本发明胰高血糖素多克隆抗体的效价检测
采用间接ELISA法检测兔血清中抗体的效价
1、包被抗原的制备
称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)完全溶于1ml的NN-二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入0.12mmol的二环己基碳二亚胺(DCC),置于4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。第二天把反应液10000r/min,10min离心,离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有OVA(2mmol)的PBS(8ml,10mmol,PH7.4)中，4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。将所得反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析(PBS，0.01mol/L PH7.4)三天，每天换三次透析液，得到包被抗原；
2、包被：将包被抗原用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至最佳包被浓度4ug/ml并充分混匀，使用移液枪以100μl/孔添加到微孔板中，置于37℃水浴锅温浴1小时后，再放置于4℃冰箱中包被过夜；
3、清洗：将孔中的液体甩干，用PBST洗涤液清洗3次，再将孔中剩余的液体在吸水纸上拍干；
5、封闭：用含浓度为30mg/ml的脱脂奶粉磷酸缓冲盐溶液，270μl/孔加入到微孔板中，37℃温浴1小时，重复步骤3；
6、竞争反应：将实施例1最后所得的胰高血糖素卵黄抗体用磷酸缓冲盐溶液，按体积倍比稀释成1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000的溶液，以100μl/孔加入到微孔板中，同时增加空白对照，37℃温浴1小时，重复步骤3；
7、加酶标二抗：加入用磷酸缓冲盐溶液稀释5000倍数的酶标二抗，按照100μl/孔添加到微孔板中，放置于37℃温浴1小时，重复步骤3；
8、显色：在已配制的10ml底物缓冲液中，加入10μl 30％过氧化氢并充分混匀(现配现用)，按照100μl/孔加到微孔板中，置于37℃下避光温育15分钟。
9、终止和读数：向酶标版的微孔中加入50μl/孔的2M硫酸终止反应。设定酶标仪测定波长参数为450nm，并测定其光密度(OD)值。阳性的判定原则：样品孔OD值大于空白处读数的2.1倍即可判定为阳性。
10、结果见图2，图2表示随着抗体稀释浓度的变化抗体的吸光度值，由图可知抗体效价可达1:32000。
实施例3：本发明胰高血糖素多克隆抗体的竞争抑制试验
采用间接ELISA法检测兔血清中抗体的效价
1、包被抗原的制备
称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)完全溶于1ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入0.12mmol的二环己基碳二亚胺(DCC),置于4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。第二天把反应液10000r/min,10min离心,离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有OVA(2mmol)的PBS(8ml,10mmol,PH7.4)中，4℃下反应搅拌过夜(或12小时)。将所得反应液放入透析袋中，在4℃条件下用磷酸缓冲盐溶液透析(PBS，0.01mol/L PH7.4)三天，每天换三次透析液，得到包被抗原；
2、包被：将包被抗原用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至最佳包被浓度4ug/ml并充分混匀，使用移液枪以100μl/孔添加到微孔板中，置于37℃水浴锅温浴1小时后，再放置于4℃冰箱中包被过夜；
3、清洗：将孔中的液体甩干，用PBST洗涤液清洗3次，再将孔中剩余的液体在吸水纸上拍干；
5、封闭：用含浓度为30mg/ml的脱脂奶粉磷酸缓冲盐溶液，270μl/孔加入到微孔板中，37℃温浴1小时，重复步骤3；
6、将胰高血糖素标准品用磷酸缓冲液稀释成1ng/ml、10ng/ml 100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml、100000ng/ml、1000000ng/ml的溶液，将实施例1最后所得的抗血清(即胰高血糖素多克隆抗体)用磷酸缓冲盐溶液，按体积倍比稀释成1：1000，将标准品的每个浓度各取50ul，再分别加入50ul 1：1000的抗血清，混匀，37度温育30min，分别以100μl/孔加入到微孔板中，同时增加空白对照，37℃温浴1小时，重复步骤3；
7、加酶标二抗：加入用磷酸缓冲盐溶液稀释5000倍数的酶标二抗，按照100μl/孔添加到微孔板中，放置于37℃温浴1小时，重复步骤3；
8、显色：在已配制的10ml底物缓冲液中，加入10μl30％过氧化氢并充分混匀(现配现用)，按照100μl/孔加到微孔板中，置于37℃下避光温育15分钟。
9、终止和读数：向酶标版的微孔中加入50μl/孔的2M硫酸终止反应。设定酶标仪测定波长参数为450nm，并测定其光密度值。做出竞争抑制曲线。
10、结果见图3，横坐标表示胰高血糖素浓度，纵坐标表示抑制率，由图3可知，抗体抑制浓度可达100ng/ml。
实施例4：不同抗体制备方法的对比
方法1：实施例1方法制备的多抗；
方法2：以KLH偶联胰高血糖素作为免疫抗原按照实施例1方法制备；
方法3：按照实施例1方法制备鼠多抗；
表1
抗体量 效价
方法1 25mg/只兔 1:32000
方法2 21mg/只兔 1:30000
方法3 0.5mg/只鼠 1:32000
依据现有文献的报道，在制备多抗时KLH作为载体蛋白偶联半抗原的免疫原性要好于BSA偶联半抗原，但是从上表可以看出，在制备胰高血糖素多抗时，与现有的常识并不一致，本发明方法所产生的抗体量是多于方法2，效价也略高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1、利用碳二亚胺法将胰高血糖素与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；
步骤2、将免疫抗原免疫兔子，取血离心，所得抗血清为胰高血糖素多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1为：
称取胰高血糖素和N-羟基琥珀酰亚胺完全溶于DMF中，再加入DCC反应，反应液离心后收取上清液，将上清液滴加到溶有BSA的缓冲液中进行反应，然后将所得反应液透析，得到免疫抗原。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1为：
称取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺完全溶于1ml的DMF中，再加入0.12mmol的DCC，置于4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液10000r/min离心10min，离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有2mmol BSA的PBS中，4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液放入透析袋中，在4℃条件下用PBS透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2为：
用磷酸缓冲盐溶液将步骤(1)所得免疫抗原配制成免疫抗原溶液免疫兔子，第一次免疫时取1ml的免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化，使其完全混为一相，采用皮下多点注射的方式对每只兔子免疫注射2ml；
首次免疫两周后进行加强免疫，加强免疫时用等体积的弗氏不完全佐剂与1ml免疫抗原溶液混合用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml，之后每隔两周进行加强免疫一次；对兔子进行加强免疫4次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃冰箱过夜，第二天离心分离取上清液，得到胰高血糖素多克隆抗体。
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