CN112898433B - 一种胰高血糖素免疫原及其制备方法 - Google Patents

一种胰高血糖素免疫原及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胰高血糖素免疫原及其制备方法，为一种将只具备反应原性的多肽半抗原转变为兼具免疫原性全抗原的制备方法，具体地说，提供了一种多肽与蛋白的联接方法，联接物免疫动物能够产生应用于体外诊断试剂的抗体。本发明提供的制备方法包括：(1)A液、B液、C液配制方法；(2)将B液加入A液中，充分混合后加入C液，室温震荡反应2小时；(3)加入1M甘氨酸溶液，室温震荡反应30分钟；(4)透析，检测Glu免疫原的总蛋白浓度和Glu活性；(5)用制备的Glu免疫原免疫豚鼠，收获抗血清，检测抗血清使用效价。(6)制备的抗血清应用于配制放免试剂盒抗体组分。

Description

一种胰高血糖素免疫原及其制备方法
技术领域
本发明为一种将只具备反应原性的多肽半抗原转变为兼具免疫原性全抗原的制备方法，具体地说，提供了一种多肽与蛋白的联接方法，联接物免疫动物能够产生应用于体外诊断试剂的抗体。
背景技术
胰高血糖素(Glucagon，简称Glu)由胰岛α细胞所分泌，是一个含29个氨基酸的直链肽，功能上，它和由胰岛β细胞分泌的胰岛素相拮抗，胰岛素可直接抑制Glu的分泌。Glu主要靶器官为肝脏和肾脏，可促进肝糖原分解，抑制肝糖原合成，促进葡萄糖异生和分解，并能促进脂肪分解。其分泌主要受血糖调控，高血糖时分泌减少，低血糖时分泌则增加。
糖尿病时，胰岛α细胞功能存在缺陷，分泌功能相对旺盛，出现Glu血症。有人认为Glu是一种强有力的致糖尿病因子，在胰岛素缺乏时，它相对或绝对地分泌增加，引起高血糖，诱发糖尿病的发生。Glu增加的程度和糖尿病的类型有关，1型患者血清Glu水平高于II型。在糖尿病病情得到控制，血糖基本正常时，Glu的高分泌状态可以得到抑制，甚至可以恢复到正常水平。因此Glu又可作为糖尿病疗效观察的一个辅助指标。
Glu偏高可能疾病：糖原贮积病II型、糖原贮积病V型、小儿糖原贮积病VI型、糖原贮积病I型、老年人低血糖症、胰高血糖素瘤、老年人嗜铬细胞瘤危象、妊娠期糖尿病、高泌乳素血症、胰腺异位。严重肝肾疾患时，由于Glu的摄取和降解下降，可出现血清Glu值升高和糖耐量异常。先天性胰腺缺如、胰腺切除术后以及严重的胰腺疾病，由于胰岛α细胞不足，可致血清Glu值下降。
鉴于上述原因，外周血中Glu水平的检测在临床上有助于判断糖尿病患者病情。建立抗原检测方法基本条件是有相应的抗原、抗体。Glu分子量为3482.8，属于半抗原，必须与大分子载体蛋白相结合制成免疫原，才能免疫动物诱发抗体的产生，继而利用产生的抗体建立检测Glu的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种将只具备反应原性的多肽半抗原转变为兼具免疫原性全抗原的制备方法，免疫动物后可获得与多肽半抗原特异结合的抗体。
优选的，本发明提供一种胰高血糖素免疫原，所述胰高血糖素免疫原结构为：OVA-[N＝CH(CH2)3CH＝N-Glu]n，其中OVA为鸡卵白蛋白，Glu为胰高血糖素，n为自然数，且1≤n≤20，通过戊二醛将鸡卵白蛋白与胰高血糖素偶联获得。
优选的，5≤n≤16。
优选的，所述n＝2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。
优选的，本发明提供一种胰高血糖素免疫原的制备方法，包括：
(1)材料选择：Glu，纯度95％以上；鸡卵白蛋白(OVA)，纯度95％以上；戊二醛，25％水溶液；甘氨酸，纯度＞99％；二甲基亚砜，纯度＞99％
(2)A液：鸡卵白蛋白用0.07M PH8.6硼酸缓冲液溶解后加入二甲基亚砜。
(3)B液：Glu用二甲基亚砜溶解后补入0.07M pH8.6硼酸缓冲液。
(4)C液：25％戊二醛用0.07M pH8.6硼酸缓冲液配为0.31％。
(5)将B液加入A液中，充分混合，边震荡边加入C液，室温震荡反应2小时。
(6)加入1M甘氨酸溶液，室温震荡反应30分钟。
(7)装透析袋用0.07M pH8.6硼酸缓冲液或0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液充分透析。
(8)用Glu放射免疫分析试剂盒检测Glu免疫原的Glu活性。
(9)用制备的Glu免疫原免疫豚鼠，收获抗血清，检测抗血清使用效价。
优选的，本发明提供一种胰高血糖素免疫原，采用上述方法制备得到。
优选的，本发明提供一种制备胰高血糖素抗血清的方法，包括如下步骤：
(1)采用上述方法制备得到胰高血糖素免疫原；
(2)将步骤(1)的免疫原多次免疫动物，制备获得抗血清。
优选的，所述动物为豚鼠。
优选的，本发明提供一种胰高血糖素抗血清，采用所述方法制备得到。
优选的，本发明提供一种检测试剂盒，其特征在于，含有胰高血糖素抗血清。
优选的，所述试剂盒中的胰高血糖素抗血清采用上述方法制备得到。
在上述本发明的制备方法中，充分研究了Glu的溶解度特性。Glu由29个氨基酸组成，氨基酸组成顺序是：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr
其氨基酸组成大部分是非极性R基氨基酸和不带电荷的极性R基氨基酸，有9个强疏水氨基酸，占29个氨基酸三分之一，导致水溶性不好，需使用有机助溶剂。遵循以下三个基本原则来选择合适的助溶剂溶解Glu。首先，所选助溶剂及助溶剂用量一定能充分溶解多肽；其次，所选助溶剂能与实验条件兼容；最后，所选助溶剂不能与肽反应，也不能使肽降解。基于此，助溶剂选择二甲基亚砜。
载体蛋白的选择基于免疫原性，与交联试剂交联的靶点以及与肽溶解体系的适配性。鸡卵白蛋白相比牛血清白蛋白(BSA)更疏水，虽然在水相中溶解度相比较低，却在高达70％的二甲基亚砜中仍具有一定的溶解度，此特性使其适用于与溶解需要二甲基亚砜的半抗原的交联，同时鸡卵白蛋白含有大量的伯胺和羧基基团可以成为与戊二醛，EDC以及其他交联试剂交联的靶点。考虑了助溶剂的因素，载体蛋白选择鸡卵白蛋白。
偶联剂、偶联条件的选择基于Glu的抗原决定簇和溶解特性。Glu的特异性抗原决定簇在C末端，因而设计采用同型双功能试剂戊二醛作为连接剂。Glu碱性氨基酸多于酸性氨基，酸性条件下水溶解性好，但戊二醛适宜偶联条件为碱性，故Glu溶解时采用有机助溶剂，偶联过程碱性缓冲液中亦保持一定比例的有机相防止析出沉淀。戊二醛的两个醛基分别与Glu和鸡卵白蛋白上的氨基形成schiff碱，中间以五碳键的桥连接起来。反应式如下：
OVA-NH2+HC(CH2)3CH+H2N-Glu→OVA-N＝CH(CH2)3CH＝N-Glu
结合到载体蛋白上的半抗原数目过多或过少均不利于诱导抗体产生。鸡卵白蛋白分子量为45000～46000，Glu分子量为3485，根据分子量，偶联时选择质量比1∶1，一个鸡卵白蛋白分子对应Glu分子约13个，这是较为适宜的比例。
在上述本发明的制备方法中，充分研究了水相与有机相的比例配合，即兼顾各自的溶解性，又保护各自天然构象及活性，保证了偶联物具备全抗原的反应原性和免疫原性，同时配合采用豚鼠作为免疫动物，获得了高效价高特异性的抗胰高血糖素豚鼠血清。
具体实施方式
本发明所述的制备方法(1)中，Glu纯度98.31％，鸡卵白蛋白纯度＞98％，甘氨酸纯度＞99％，二甲基亚砜纯度99.5％。
本发明所述的制备方法(2)中，称取鸡卵白蛋白，溶解于0.07M pH8.6硼酸缓冲液中，浓度为12.5mg/mL(M/V)；加入二甲基亚砜，最终鸡卵白蛋白浓度为10mg/mL(M/V)，二甲基亚砜浓度为20％(V/V)。
本发明所述的制备方法(3)中，称取Glu，溶解于二甲基亚砜中，Glu浓度为25mg/mL(M/V)；加入0.07M pH8.6硼酸缓冲液，最终Glu浓度为10mg/mL(M/V)，二甲基亚砜浓度为40％(V/V)。
本发明所述的制备方法(4)中，0.1mL25％戊二醛加入到7.9mL 0.07M pH8.6硼酸缓冲液中。
本发明所述的制备方法(5)中，先将方法(3)制备的Glu溶液加入到方法(2)制备的鸡卵白蛋白溶液中，体积比1∶1，充分混匀后，将方法(4)制备的0.31％戊二醛溶液逐滴加入混合液，加入体积为混合液的1/2，注意加入过程震荡混匀，之后室温震荡反应2小时。
本发明所述的制备方法(6)中，加入1/10体积的1M甘氨酸溶液，室温震荡反应30分钟，终止戊二醛偶联反应。
本发明所述的制备方法(7)中，通过充分透析去除戊二醛偶联剂等小分子物质，得到Glu免疫原，离心去除不溶物，用紫外分光光度计检测其总蛋白浓度。
本发明所述的制备方法(8)中，应用Millipore Corporation Glucagon RIA Kit检测获得的Glu免疫原的Glu活性。
本发明所述的制备方法(9)中，根据方法(7)和方法(8)检测结果确定免疫剂量，制定免疫方案。按照免疫方案免疫豚鼠，用Glu放射免疫分析试剂盒检测抗血清使用效价，决定免疫终止时间。
下面通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于此。
实施例1
称取鸡卵白蛋白10mg，加入0.07M pH8.6硼酸缓冲液0.8mL，溶解后加入二甲基亚砜0.2mL，此为A液。称取Glu 10mg，溶解于0.4mL二甲基亚砜中，加入0.07M pH8.6硼酸缓冲液0.6mL，此为B液。0.1mL25％戊二醛加入到7.9mL 0.07M pH8.6硼酸缓冲液中，此为C液。
将B液加入A液中，充分混匀后，边震荡边逐滴加入C液1mL，室温震荡反应2小时后，加入0.3mL 1M甘氨酸溶液，室温震荡反应30分钟。反应液装入透析袋，用0.07M pH8.6硼酸缓冲液充分透析。离心后上清用紫外分光光度计检测总蛋白浓度为10.18mg/mL。
实施例2
称取鸡卵白蛋白10mg，加入0.07M pH8.6硼酸缓冲液1.0mL溶解，此为A液。称取Glu10mg，加入0.2mL二甲基亚砜，Glu部分溶解，补加0.1mL二甲基亚砜，Glu仍有少量未溶解，再补加0.1mL二甲基亚砜，Glu全部溶解。加入0.07M pH8.6硼酸缓冲液0.6mL，此为B液。0.1mL25％戊二醛加入到7.9mL 0.07MpH8.6硼酸缓冲液中，此为C液。后续步骤同实施例1。离心后上清用紫外分光光度计检测总蛋白浓度为9.32mg/mL。
实施例3
按实施例1实施偶联过程，不同的是载体蛋白改用牛血清白蛋白。离心后上清用紫外分光光度计检测总蛋白浓度为9.03mg/mL。
实施例4
本发明应用Glu放射免疫分析试剂盒检测Glu免疫原的Glu活性。
1.主要材料
Millipore Corporation Glucagon RIA Kit；实施例1制备的Glu-OVA；实施例2制备的Glu-OVA；实施例3制备的Glu-BSA。
2.测定原理
采用非平衡法，标准或样品中的Glu与限量的抗体预先反应一段时间，然后加入125I-Glu竞争剩余的抗体结合位点。结合在抗体上的标记抗原与样品中Glu浓度成反比，即样品中Glu浓度越高，与抗体结合的标记抗原越少。用沉淀剂将125I-Glu结合部分(B)与游离部分(F)分离后，测定结合部分的放射性计数，计算相应结合率B/B0，并使用log-logit数据处理模式，计算待测样品中Glu的含量。
3.测定步骤
将Glu免疫原稀释不同滴度，用Glu放射免疫分析试剂盒检测。检测步骤按照说明书进行，使用12×75mm试管。具体操作如下：
表1 加样程序表(加样体积单位：μl)
Figure BSA0000196504810000071
4.测定结果
设总T管计数为T，非特异管计数为NSB，S0管计数为B0，各标准管或样品管计数为B，百分结合率计算如下：
非特异百分结合率＝NSB/T×100％
S0管百分结合率＝(B0-NSB)/T×100％
其余百分结合率B/B0＝(B-NSB)/(B0-NSB)×100％
表2 Glu免疫原的Glu活性 总T 15490 NSB 458
Figure BSA0000196504810000081
在20％二甲基亚砜中OVA溶解性不受影响，优于BSA。实施例2二甲基亚砜浓度低，影响Glu溶解性。检测结果实施例1Glu-OVA的Glu测值最高，说明免疫活性更好，是相对最优方案。
实施例5
本发明结合Glu免疫原蛋白浓度及Glu活性确定免疫剂量，制定免疫方案。将实施例1制备的Glu-OVA分别免疫兔和豚鼠，Glu-BSA免疫豚鼠。免疫三次时开始通过检测抗血清RIA使用效价观察抗体产生情况。
具体方法为，将待检抗血清稀释后作为抗体组分，代替Glu放射免疫分析试剂盒中抗体组分，试剂盒中抗体组分为对照，检测样本为试剂盒中校准品，按照说明书检测步骤进行。
Glu-OVA免疫兔5次后抗Glu血清检测结果见表3。
表3 Glu-OVA免疫兔5次后抗血清检测
Figure BSA0000196504810000091
S0最大结合率可以达到对照水平，但是检测不同浓度Glu无区分度，无法形成校准曲线，产生的兔抗血清无法用来配制RIA试剂盒中抗体组分。
Glu-OVA和Glu-BSA免疫豚鼠7次后抗Glu血清检测结果见表4。
表4 Glu-OVA和Glu-BSA免疫豚鼠7次后抗血清检测
Figure BSA0000196504810000101
Glu-OVA和Glu-BSA免疫豚鼠后产生的抗血清检测校准品，形成的校准曲线相关系数达0.998以上，可应用于Glu RIA试剂盒。Glu-OVA组产生更高效价的抗体。
实施例6
Glu-OVA免疫豚鼠7次后(约5个月)收获的抗血清应用于Glu放免试剂盒，用作配制试剂盒抗体组分。该试剂盒性能指标完全满足临床检测Glu的要求，部分结果见表5。
表5 Glu抗血清应用于放免试剂盒部分检测结果
Figure BSA0000196504810000111
实验类别说明：出厂检验指发货前的检验，跟踪1指产品室温放置5日模拟运输后2～8℃存放至月中的试剂盒实验，跟踪2指产品2～8℃存放至月底的试剂盒实验。
用本发明方法研制的Glu免疫原免疫豚鼠，收获了高效价的Glu抗血清，成功应用于配制放免试剂盒抗体组分，证明本发明所述方法能够成功制备Glu免疫原，产生的抗体使用效价高，实用效果好。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种胰高血糖素(Glu)免疫原制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)A液：鸡卵白蛋白用0.07M PH8.6硼酸缓冲液溶解为12.5mg/mL(M/V)，加入二甲基亚砜使其浓度为20％(V/V)，最终鸡卵白蛋白浓度为10mg/mL(M/V)；
(2)B液：Glu用二甲基亚砜溶解为25mg/mL(M/V)，加入0.07M pH8.6硼酸缓冲液，最终Glu浓度为10mg/mL(M/V)，二甲基亚砜浓度为40％(V/V)；
(3)C液：25％戊二醛用0.07M PH8.6硼酸缓冲液1∶80稀释，配成0.31％；
(4)将B液加入A液中，体积比1∶1，充分混合，边震荡边逐滴加入C液，C液加入体积为B加A混合液的1/2，室温震荡反应2小时；
(5)加入1M甘氨酸溶液，加入体积为上述(4)中B加A加C混合液的1/10，室温震荡反应30分钟；
(6)缓冲液透析，所述缓冲液为0.07M pH8.6硼酸缓冲液，透析过夜，获得胰高血糖素免疫原；应用Glu放射免疫分析试剂盒检测所述Glu免疫原的Glu活性。
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