DK167825B1 - Fremgangsmaade og reagenssystem til immunobestemmelse af glycoprotein-analyten hb alc. - Google Patents

Description

i DK 167825 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde og et reagenssystem til immunobestemmelse af den glycosyle-rede form af hæmoglobin, der er kendt som Hb Alc. Bestemmelsen af graden af glycosylering af hæmoglobin i en persons 5 blod giver et nyttigt indeks for glucoseniveaukontrollen hos diabetikere.

Der er et stadigt behov for at forbedre specificiteten af antistofbinding til proteiner, især proteiner med analytisk betydning. Den specifikke påvisning af bestem-10 te proteiner i biologiske prøver, såsom blod, er begrænset af muligheden for at tilvejebringe antistofreagenser, der er rettet mod helt bestemte bindingssteder eller epitoper på tilgængelige dele af proteinerne. Der er situationer, hvor den mest ønskelige epitop til specifik påvisning af 15 et bestemt protein er utilgængelig eller kun er begrænset tilgængelig for binding til et antistofreagens.

Et eksempel er bestemmelsen af den glycosylerede form af hæmoglobin, der er kendt som Hb Alc, i blodprøver fra diabetes-patienter. Hæmoglobin er en proteintetramer dan-20 net af fire kæder (underenheder) af aminosyrer, hver på ca.

143 enheder, og med en samlet molekylvægt på efa. 64.000.

Ved den ene ende af molekylet (NH2-enden af β-underenheden) er der en valinenhed, der kan reagere med glucose. Glycosyl-ringen af hæmoglobin sker ved en ikke-enzymatisk reaktion, • i 25 der involverer glucose og α-aminogruppen i valin. Efter en Schiff-basedannelse mellem reaktanterne undergår glucosen en Amadori-omlejring, hvorved der dannes 1-deoxyfructo-va-lin. Dette kompleks er covalent og i det væsentlige irreversibelt. Glycosyleringen styres af koncentrationen af reak-30 tanterne, f.eks. hæmoglobin og glucose. Hos en normal (ik-ke-diabetisk) person er ca. 3% af alt hæmoglobin glycosy-leret, Hæmoglobin-tetramere med en 1-deoxyfructo-valin ved N-terminussen af en β-kæde identificeres som værende glycosylerede eller A^-hæmoglobin.

35 Glucoseniveauerne hos diabetikere er tilstrækkelig høje til at forøge hastigheden af glycosyleringen i direk- 2 0

UK D I

te afhængighed af glucoseniveauet i blodet, hvilket afspejler sværhedsgraden af den diabetiske tilstand. Med hæmoglobin hæves niveauet af A^c til ca. 5 til 12%. Da hæmoglobins levetid i kredsløbet er ca. 120 dage, vil en måling af gluco-5 cosyleret hæmoglobin give en værdi, der afspejler et gen nemsnitligt glucoseniveau i denne periode. Især vil et glu-serigt måltid ikke afspejle sig i et højt niveau af glyco-syleret hæmoglobin eller serumalbumin. En måling af indholdet af glycosyleret hæmoglobin giver således et sandere 10 billede af de gennemsnitlige glucoseniveauer i kredsløbet og dermed et sandere billede af patientens tilstand o-ver et længere tidsrum.

I US-patentskrift nr. 4.247.533 beskrives en analysemetode, hvorved antistoffer mod Hb A^c angiveligt dan-15 nes hos et særligt får ved injektion af Hb A^c og absorberes med ikke-glycosyleret hæmoglobin til dannelse af poly-klonale antistoffer, som skelner mellem Hb A'lc og- ikke-glycosyleret Hb. Sådanne antistoffer danner derefter basis for en prøve til bestemmelse af andelen af glycosyleret hæmo-20 globin i en prøve. Prøven kræver imidlertid et passende immuniseret får og antistofabsorptioner til'.-opnåelse af den rette specificitet. Det er derfor kostbart og vanskeligt at producere specifikke polyklonale antistoffer. Antistofpræparaterne fremstillet ved denne absorptionsmeto-25 de angives at have lav titer og affinitet. Reproducerbarheden af denne metode er også et åbent spørgsmål, da der ikke er nye rapporter, der beskriver dens anvendelse til analyse af kliniske prøver af humant hæmoglobin.

Et andet forsøg på at tilvejebringe- antistoffer, on der er specifikke for Hb A^c er beskrevet i DS patentskrift nr. 4.478.744. Ifølge dette anvendes der som immuniserende middel et syntetisk peptid-immunogen i stedet for det normale hæmoglobinmolekyle. Dette materiale injiceres i et dyr, der normalt ikke har Hb A, i blodbanen, 35 · f.eks. får. Det syntetiske peptid-immunogen indeholder en glycosyleret peptidrest, der har en aminosyresekvens sva- 3 DK 167825 B1

O

rende til mellem de første 4 til 10 aminosyrer i den N- -terminale hæmoglobinsekvens. Senere undersøgelser, der er omtalt nedenfor, har vist, at det polyklonale antise- rym fra får mod det syntetiske peptid-immunogen ikke har 5 nogen påviselig specificitet for den glycosylerede form

Hb A, . lc

Der foreligger derfor et uopfyldt behov for at udvikle en metode til at udforme antistofreagenser og bindingsbetingelser, der muliggør specifik binding af anti-10 stofreagenser til Hb A^c til påvisning af dette ved im-munobestemmeIse.

Definitioner

Aminosyre Forkortelse 15 Arginin Arg

Asparaginsyre Asp

Glutaminsyre Glu.

Lysin Lys

Serin Ser 20 Asparagin Asn

Glutamin Gin'·'

Glycin Gly

Prolin Pro

Threonin Thr 25 Alanin Ala

Histidin His

Cystein Cys

Methionin Met

Valin Val* 30 Isoleucin Ile

Leucin Leu

Tyrosin Tyr

Phenylalanin Phe

Tryptophan Trp 35

Ulv 10/0^0 D I

4

Det har nu vist sig, at der kan opnås en særdeles specifik immunbinding til hæmoglobin-Alc ved dannelse af et antistofreagens mod en kulhydratmodificeret lineær peptidepitop i hæmoglobin og kontaktering af et sådant antistof-5 reagens med hæmoglobin-Alc efter tilstrækkelig denaturering af hæmoglobin-Alc til, at den lineære peptidepitop deri bliver tilgængelig eller mere tilgængelig.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til im-munobestemmelse af hæmoglobin-Alc-glycoprotein-analyten i 10 en vandig testprøve, hvorved testprøven bringes i kontakt med et antistofreagens, som er specifikt for binding af en kulhydratmodificeret lineær peptidepitop i hæmoglobin, og hvorved bindingen af antistof reagenset hertil .bestemmes, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at testprøven 15 først behandles til denaturering af en væsentlig mængde af eventuelt tilstedeværende hæmoglobin-Alc deri for at frilægge eller forøge frilæggelsen af den lineære peptidepitop til binding af antistofreagenset.

Opfindelsen angår også et reagenssystem til immuno-20 bestemmelse af hæmoglobin-Alc-glycoproteinanalyten i en vandigjtestprøve, hvilket system omfatter et antistofreagens, som ér specifikt for binding af en kulhydratmodificeret lineær peptidepitop i hæmoglobin-Alc, hvilket reagenssystem er ejendommeligt ved, at det yderligere omfatter et kemisk 25 middel, der ved kontakt med testprøven er i stand til at denaturere en væsentlig mængde af hæmoglobin-Alc deri til frilæggelse eller forøgelse af frilæggelsen af den lineære peptidepitop til binding af antistof reagenset..

Den lineære peptidepitop, som er målet, vil i prin-30 cippet omfatte mindst to, og sædvanligvis mindre end 15, aminosyreenheder. Epitopen kan forekomme ved en N- eller C--terminus i en peptidkæde eller kan forekomme langs med peptidkæden i proteinet og kan være modificeret med ikke--peptidiske grupper og sidekæder, såsom kulhydrater, herunder 35 mono-, oligo- og polysaccharidgrupper, phosphater, lipider, sulfater, carbamyl, sulfoxid og lignende, herunder andre 5 DK 167825 B1 kemiske grupper, der kan findes covalent bundet til protein--skelettet. Sådanne grupper omfatter de grupper, der tilføjes ved post-translationelle modifikationer, der kan være enzym-medierede eller være resultatet af ikke-enzymatisk reaktion, 5 og som derfor omfatter modifikationer, der forekommer naturligt i proteinet eller forårsages af miljøpåvirkning. Antistofreagenset vil normalt blive dannet mod et syntetisk peptid indeholdende den lineære peptidepitop bundet til et immunogent bæremateriale, sædvanligvis forskelligt fra pro-10 teinet, der har interesse. Det vil være særlig foretrukket at anvende somatiske cellehybridiseringsmetoder til opnåelse af antistoffer, der er monoklonale og udvalgt til høj specificitet for den lineære peptidepitop.

Denatureringen af proteinet kan gennemføres på i 15 det væsentlige enhver måde, således at den valgte peptidepitop gøres tilgængelig eller mere tilgængelig for antistofbinding, idet en væsentlig mængde af proteinet'bibeholdes i opløsning. Fysiske eller kemiske behandlinger, hvor sidstnævnte omfatter proteinnedbrydning, står til rå-20 dighed for udvælgelse af de optimale denatureringsbetingelser.,.. Graden eller omfanget af denatureringen, som er nødvendigt, bestemmes i det væsentlige empirisk afhængigt af betingelserne ved den ønskede immunobestemmelse. Virkningen af denatureringen er, at den i det væsentlige linearise-25 rer i det mindste det område af hæmoglobin-Alc, hvori den valgte peptidepitop forekommer, og gør det tilstrækkeligt tilgængeligt for det omgivende vandige medium til binding til antistofreagenset.

Den foreliggende opfindelse gør det mu-ligt at gen-30 nemføre immunobestemmelser og fremstille reagenssystemer til bestemmelse af hæmoglobin-Alc ved binding af antistofreagenset til en lineær peptidepitop, der er i.det væsentlige utilgængelig for eller har begrænset tilgængelighed for immunbinding, når hæmoglobin-Alc er i sin naturlige tilstand.

35 Der tilvejebringes herved en metode til særdeles specifik bestemmelse af Hb Alc i biologiske væsker, såsom blod. Mono-

I Ulv IO/O^LO D I

6 klonale antistoffer dannet mod de syntetiske glycosylerede N-terminale peptidrester, der forekommer i Hb Alc, har vist sig at blive bundet specifikt til sådanne rester i den glycosylerede /3-underenhed i hæmoglobin. Antistofferne kan frem-5 stilles på forskellige måder ifølge konventionelle mono-klonale metoder. I det væsentlige fremstilles antistofferne mod et syntetisk tilvejebragt immunogen omfattende den ønskede glycosylerede N-terminale peptidrest bundet kemisk til en immunogen bærer, hvor det glycosylerede peptid har mindst 10 2, og fortrinsvis fra ca. 5 til 15, aminosyreenheder svarende til Hb Aic. De resulterende antistoffer er specifikke for det glycosylerede syntetiske peptid og den tilsvarende frilagte epitop i hæmoglobin-Aic-molekylet.

Figurerne på tegningen viser grafisk resultater 15 af forsøg beskrevet i eksemplerne nedenfor vedrørende im-munopåvisning af Hb A^c·

Fig. 1 er en grafisk afbildning, der viser inhibe-ringen af Ab-3-binding til A^c med glycopeptid 1 (peptid 1). Antistoffet præinkuberes med glycopeptid før overføring til 20 en A^c~overtrukket mikrotiterplade. Det monoklonale antistof, _der binder til A^c, påvises ved anvendelse et sekundært antistof-enzym. Resultaterne er vist i fig. 1 som inhibering i procent, hvor 0% inhibering er den værdi, der fås uden kompetitor. 0 - O-linien er for et identisk 25 peptid, der mangler kulhydratet, hvilket viser, at kulhy-dratet er væsentligt for antistofbindingen. Alle punkter er middelværdier af tre målinger.

Fig. 2 er en grafisk afbildning, der viser inhi-beringen af Ab-3-binding til A^c med glycopeptid·3 (pep-30 tid 3) . Det kompetitive forsøg gennemføres som beskrevet ved fig. 1.

Fig. 3 er en grafisk afbildning, der viser inhi-beringen af Ab-3 og Ab-4 til A^c”binding med glycopeptid 4 (peptid 4). Det kompetitive forsøg gennemføres som be-35 skrevet ved fig. 1.

DK 167825 B1

O

7

Fig. 4 viser en typisk standardkurve ved anvendelse af optimale bestemmelsesbetingelser. Helblods-standarden fremstilles ved anvendelse af forskellige forhold mellem denatureret helblod fra en diabetiker med 12,66% 5 A^c som målt ved HPLC-ionbytning og helblod fra en normal donor (3,83% A^c). Alle punkter med tredobbelte målinger er anført.

Fig. 5 viser en standardkurve ved anvendelse af en syntetisk peptidstandard. Bestemmelsen gennemføres som be-10 skrevet ved fig. 4 bortset fra, at der i stedet for anvendelse af helblod anvendes forskellige mængder af syntetisk glycopeptid som kompetitor. Alle værdier af. tredobbelte bestemmelser er afsat.

Fig. 6 viser grafisk en sammenligning af immuno-15 bestemmelsesmetoden med boronataffinitetsmetoden for donorer. Middelværdierne af tredobbelte bestemmelser er afsat for immunobestemmelseskoordinaten.

Fig. 7 er en grafisk afbildning, der viser tilgængeligheden af Hb Alc-epitopen under varierende denaturerings-20 betingelser.

Fig. 8 er en grafisk afbildning, der viser resultaterne af at immunisere et får med det syntetiske glycopeptid ifølge eksempel lb).

Fig. 9 er en grafisk afbildning, der viser, at mo-25 noklonale antistoffer fra mus er specifikke for A-^-hæmo-globin.

Et polypeptid eller protein eksisterer som en lineær sekvens af aminosyrer, der i opløsning danner en tredimensional struktur. Faktorerne, som kontrollerer den 30 spontane antagelse af denne tredimensionale struktur af et protein, omfatter følgende: 1. Den plane struktur af peptidbindingen, der har begrænset rotation omkring Ca- og C'-carbonatomerne (‘p-bin-dingsrotation) og omkring N-Ca-nitrogen-carbon-bindingen 35 (ø-bindingsrotation). Denne begrænsede rotation begrænser bevægelse omkring peptidbindingen og nedsætter det totale antal mulige konformationer.

Ulv lO/Brf'O D I

0 8 2. Aminosyre-sidekæderne (R-grupper) har trans--orientering, da et polypeptid med kun cis-orientering ville have en alvorlig begrænsning af den til rådighed staen-de_konformationsplads for sidekædeatomerne.-5 3. Vekselvirkninger mellem forskellige funktionel le grupper på peptidskelettet og sidekæden er ansvarlige for den tredimensionale foldning af et polypeptid/ og slimmen af disse vekselvirkninger giver den energi, hvormed proteinet bibeholder sin konformation.

10 Disse vekselvirkninger omfatter: a) Dispersionskræfter - hvor oscillerende dipoler kobles mellem nærliggende atomer og danner en tiltrækningskraft mellem de to atomer. Disse kræfter modvirkes af frastødningen mellem elektronskallerne (dvs. to atomer kan 15 ikke optage den samme plads).

b) Hydrogenbinding - hvor hele elektronskallen af et hydrogenatom forskydes til atomet, hvortil hydrogenet er bundet (hydrogenacceptor).

c) Elektrostatiske kræfter - hvor forskellige ty-20 per af atomer har en asymmetrisk elektronfordeling og derved bærer en delladning, der kan vekselvirke med atomer, der bærer en modsat ladning. Denne vekselvirkning kan være en simpel dipol-vekselvirkning eller kan eksistere som en saltbro.

25 d) Disulfidbindinger - mellem SH-grupper i cystein- aminosyrer stabiliserer proteinkonformationen. Dannelsen af disulfidbindinger er sekundær i forhold til den tredimensionale foldning af proteinet, der bevirkes af de ovenfor beskrevne dispersionskræfter, hydrogenbindingen 30 og de elektrostatiske kræfter.

4. Vekselvirkning af proteinet med de vandige omgivelser har en kraftigt organiserende virkning på den måde, hvorpå vandopløselige proteiner "samler" sig. De polære vandmolekyler solvatiserer hydrofobe grupper på over-35 fladen af proteinet og fremmer termodynamisk sekvestrering af hydrofobe aminosyresidekæder i det indre af molekylet DK 167825 B1

O

9 (således at de har lignende hydrofobe omgivelser). Ifølge en ny undersøgelse af kendte proteiner har de hydrofobe aminosyrer Phe, Leu, Ile, Val, Trp og Tyr mere af deres overfladeareal vendt indad end neutrale eller polære ami-5 nosyrer (Science 229, 834-838 (1985)).

Det bør også bemærkes, at mange af grupperne på proteinoverfladen er hydrofobe, og at indadvendende grupper kan være polære eller endog ladede. De indadvendende polære grupper tilfredsstiller sædvanligvis hydrogenbindings-10 -behov i det indre af proteinet, og så mange som 90% af alle indre polære grupper er involveret i hydrogenbindinger. På lignende måde er ladede aminosyrer i det indre af proteinet mest sandsynligt involveret i saltbroer.

... Konformationen af et protein kan opdeles i et 15 struktur-hierarki på følgende måde: 1. Primær struktur er den lineære aminosyrese-kvens i polypeptidet.

2. Sekundær struktur refererer til den måde, hvorpå polypeptidkæden stabiliseres ved hydrogenbinding.

20 3. Tertiær struktur er foldningen af polypeptidkæ den ^tj.1 dens tredimensionale struktur. Denne" struktur stabiliseres af hydrogenbindinger, elektrostatiske vekselvirkninger, hydrofobiske vekselvirkninger og af disulfidbindinger.

25 4. Kvaternær struktur refererer til den struktur, der dannes, når to polypeptidkæder vekselvirker. Typerne af vekselvirkning er de samme som for den tertiære struktur.

De beskrevne vekselvirkninger af polypeptidet med 30 polypeptid og med de vandige omgivelser er ansvarlige for den komplekse foldning og den resulterende tredimensionale struktur af naturlige proteinmolekyler. Informationen for denne foldning er indkodet i polypeptidets aminosyresekvens (den primære struktur). I mange tilfælde kan naturlige pro-35 teiner denatureres totalt (hvilket viser sig ved manglende sekundær, tertiær og kvaternær struktur) ved behandling

Ulv MD/OZO D I

o 10 med fysiske eller kemiske denatureringsmidler og vil ved fjernelse af denatureringsmidlet igen foldes til et molekyle, der med hensyn til struktur og funktion ikke kan skelnes fra det naturlige protein (Adv. Prot. Chem. 29, 5 205-299 (1975), Journal of Biol. Chem. 251, 3154-3157 (1976).

Foldningsprocessen er energimæssigt begunstiget, og den resulterende naturlige tredimensionale konformation har (eller ligger nær) tilstanden med minimal fri energi.

10 Som følge af foldningen af polypeptidet til en tredimensional konformation er nogle aminosyrer på overfladen af molekylet frit tilgængelige for det suspenderende opløsningsmiddel, medens andre aminosyrer er skjulte og utilgængelige for opløsningsmiddel. Denne opfattelse under-15 støttes af en stor mængde biofysiske data og også af forskellene i kemiske reaktiviteter mellem aminosyrer på proteinoverfladen og aminosyrer i det indre af proteinet.

Den tredimensionale konformation er på ingen måde stiv struktur. De fleste af de ovenfor beskrevne veksel-20 virkninger er relativt svage og er under konstant bryd-ning^og gendannelse (dog er kun en lille procentdel af det samlede antal bindinger brudt på et givet tidspunkt).

Det kunne forventes, at peptidsegmenter med de færreste vekselvirkninger ville have større mobilitet end peptid-25 segmenter med et større antal vekselvirkninger. Segmenterne med større mobilitet kunne antage et større antal konformationer, hvoraf ån kunne være i stand til vekselvirkning med et antistof. Det er blevet foreslået, at disse mobile dele af naturlige proteiner er dem, der er 30 mest antigene (Nature 312, 127-134 (1984)) ..

Vekselvirkningerne mellem et antigen og et antistof er de samme som de, der stabiliserer proteinstruktur (dvs. hydrogenbindinger, elektrostatiske bindinger og hy-drofobiske bindinger). For at vekselvirkningen kan være 35 specifik og have tilstrækkelig affinitet, er det nødvendigt at opretholde komplementaritet mellem de to veksel- 11 DK 167825 B1 o virkende overflader og en passende overlejring af modsat ladede grupper, der danner saltbroer, hydrogenbindingsdonorer og -acceptorer og hydrofobe "lommer" (Ann. Rev. Immunol. 1, 87-117 (1983)). Hvis komplementariteten ændres 5 (f.eks. ved erstatning af aminosyrer) kan affiniteten af antistoffet til antigenet ændres dramatisk.

Kontaktstederne på antigenet kan deles i to grupper, 1) de lineære eller sekvensmæssige og 2) de konforma-tionelle (Ann. Rev. Immunol. 2, 67-101 (1984)).

10 Lineære eller sekvensmæssige determinanter er så danne, hvori hele den antigene determinant findes på et enkelt lineært segment af proteinsekvensen, der har fra ca. 2 til 15 aminosyrer og i almindelighed har mindre end lOUaminosyrer.

15 Konformationelle determinanter er sådanne, hvori dele af peptidet, der ligger fjernt fra hinanden i sekvensen, bringes i nær kontakt af den tredimensionale foldning af proteinantigenet. Derfor dannes den antigene determinant eller epitop ud fra mere end én del af proteinanti-20 genet. Por eksempel har røntgenstrålediffraktionsundersøgelser med lysozym og et monoklonalt antistof mod lyso-zym vist, at antistoffet kommer i kontakt med lysozym i positionerne 29-37 og 116-129. Selv om disse aminosyrer er adskilt i sekvensen, danner de et sammenhængende område 25 på ca. 20 x 25 Å på overfladen af lysozymmolekylet og vekselvirker med mange atomer på antistoffets kombineringssted (Nature 313, 156-158 (1985)). Det følger også heraf, at antistoffer, der genkender konformationelle determinanter, ikke vil genkende den denaturerede form af proteinet.

30

Ved den konventionelle immuniseringsprocedure til dannelse af et antistof mod et protein injiceres et naturligt eller delvis naturligt protein i et dyr, som derefter danner immunoglobuliner mod immunogenet. Et poly- klonalt antiserum indeholder mest sandsynligt antistoffer, 35 der genkender både sekvensmæssige og konformationelle antigene determinanter. Disse determinanter er· mest sand- 12 UK Ib/^O bl o synligt placeret på overfladen af det naturlige protein.

For eksempel har hæmagglutin-membran-glycoproteinet af influenzavirus fire væsentlige antigene determinanter, hvoraf tre er blevet lokaliseret til overfladen af glyco-5 proteinet (Nature 289, 366-373 og 373-378 (1981)).

Hvis et syntetisk peptid eller lille peptid fra det naturlige molekyle anvendes som immunogen, kan den resulterende reaktion kun være rettet mod de sekvensmæssige determinanter (og det begrænsede antal konformationer, som 10 peptidet kan antage). Ved forsøg på at anvende syntetiske peptider som immunogener til tilvejebringelse af en antistofreaktion, som vil bindes til det naturlige protein (der har samme sekvens som det syntetiske peptid), udformede forskere til at begynde med immunogener ved at af-15 søge sekvensen af det naturlige protein for områder, der har flere polære aminosyrer (Rev. Science 229, 932-940 (1985)). Disse sekvenser skulle statistisk have en større sandsynlighed for at være på overfladen af det naturlige protein og kunne være frie til at reagere med antistof-20 molekylerne. Man tænkte sig imidlertid også, at disse hydrofile rester ville være mindre immunogene'rend et hydrofobt peptid, så andre forskere syntetiserede immunogener baseret på hydrofobiteten i håbet om, at disse hydrofobe sekvenser ville være tilgængelige på overfladeantigenerne.

* 25 I begge tilfælde reagerer en høj andel af antistofferne produceret ved disse strategier med det tilsyneladende naturlige antigen, hvilket antyder, at så længe det syntetiske peptid svarer til en sekvens, der kan findes på overfladen af. et naturligt antigen, vil antistoffet dan-30 net mod det syntetiske peptid kunne reagere med det naturlige antigen (Nature 299, 592-596 (1982)). Der foreligger nogle rapporter om antistoffer dannet mod visse syntetiske peptider svarende til peptider, som antages at være skjult i proteinet, der vil reagere med det til-35 syneladende naturlige protein (PNAS 80, 4949-4953 (1983)).

Det er uklart, hvilken mekanisme der kan være ansvarlig for denne observation.

DK 167825 B1

O

13

Ifølge opfindelsen denatureres et naturligt protein, hæmoglobin-Alc, målrettet til optimal frilæggelse af sekvensmæssige eller lineære antigene determinanter, således. at de kan vekselvirke med antistoffer, der er pro-5 duceret mod sådanne determinanter. Især ved en bestemmelse, som kræver en frisk prøve indeholdende det virkeligt naturlige antigen, vil denaturering af antigenet være et absolut krav. Hvis epitopen af det naturlige protein er på eller nær overfladen og derfor er delvis tilgængelig for 10 antistofvekselvirkning, kan denaturering forøge dens mobilitet og medføre en forøgelse af det antal mulige konforma-tioner, som den kan antage, og dermed fremskynde antistof--antigen-vekselvirkningen.

Ved mange i øjeblikket anvendte immunobestemmel-15 ser anvendes lave koncentrationer af detergenter, f.eks. "Triton" og "Tween-20", for at forhindre ikke-specifik adsorption af reaktanterne ved den klassiske antistof-an-tigen-reaktion, for at skille proteiner fra lipoproteiner, så-braner eller for at skille lipider af lipoproteinter, så-20 ledes at der fås en homogen prøve af delipidiseret protein (Bipehem. Biophys. Acta 620, 447-453 (1980)', Clin. Chem.

28, 199-204 (1981)). Det er det udtrykkelige formål med den foreliggende opfindelse at frilægge protein- eller glycoprotein-determinanten af hæmoglobin-Alc ved at de-25 naturere den sekundære, tertiære og kvaternære struktur af det naturlige protein ved anvendelse affysiske og/eller kemiske denatureringsmidler. Den frilagte peptidepitop er derefter ikke underlagt begrænsninger og kan antage kon- formationerne af det syntetiske peptid, mod' hvilket anti-30 stofferne blev produceret.

Sterisk adgang af antistofreagenset til epitopen kan opnås på enhver effektiv måde. Frilæggelsen af epitopen i det intakte protein antages at ske ved en fysisk eller kemisk denaturering eller nedbrydning i i det mind- 35 ste epitopens område. En sådan denaturering eller nedbrydning kan lokaliseres til epitopens område eller kan invol- 0 14 ulv ΊΟ/ΰΖΟ b l vere en mere generel eller endog i det væsentlige fuldstændig denaturering af den tertiære, og desuden den sekundære, struktur af proteinet eller en delvis eller fuldstændig nedbrydning af proteinet.

5 Denaturering kan gennemføres på mange forskelli ge måder, herunder konventionel behandling af proteinet med fysiske midler, såsom varme, ultralyd, høj eller lav pH--værdi, og, som det foretrækkes, ved kemisk denaturering ved nedbrydning eller vekselvirkning med et chaotropt mid-10 del eller en chaotrop i opløsning. Anvendelige chaotrope midler omfatter f.eks. guanidin, urinstof og forskellige detergenter, såsom natriumdodecylsulfat (SDS) og andre, herunder deoxycholat og visse galdesalte, 3-(3-cholamido-propyl)-dimethyl-ammonio-l-propansulfonat, organiske op-15 løsningsmidler, såsom methanol, propanol, acetonitril og visse salte, såsom kaliumthiocyanat. Ikke-ioniske detergenter, såsom "Triton X", "Tween", Nonidet NP-40" og octyl--glucosider kan også fungere som protein-denaturerings-midler. Tilsætning af reagenser (f.eks. mercaptoethanol 20 eller dithiothreitol) , der reducerer disulfidbindinger, kan_.fremme denatureringsprocessen effektivt^ Proteindenatureringen kan gennemføres på den mest effektive måde, hvis der anvendes kombinationer af kemiske og/eller kemiske og fysiske midler (f.eks. guanidin og varme, guanidin og SDS, 25 eller guanidin og dithiothreitol). Særlig stærke chaotro-per, såsom guanidin, er mest foretrukne. Naturligvis undgås denatureringsbetingelser, der medfører, at proteinet aggregeres væsentligt, gøres uopløseligt eller udfældes, således at kun en ubetydelig mængde af den -frilagte epi-30 top er tilgængelig for opløsningen til antistofbinding. En tilstrækkelig mængde af det denaturerede protein skal forblive i opløsning eller suspension for at der kan opnås en anvendelig immunbinding. Det nødvendige omfang af solubi-lisering vil afhænge af omstændighederne ved den tilsigte-35 de eller ønskede binding.

15 DK 167825 B1

En væsentlig mængde af hæmoglobin-Alc-proteinet i en bestemt testprøve kan denatureres til frilæggelse af pep-tidepitopen til antistofbinding ved at kombinere prøven med en vandig opløsning af det tilstedeværende chaotrope middel 5 i en tilstrækkelig koncentration til at denaturere en væsentlig mængde af proteinet i den resulterende vandige blanding.

Når prøven er helblod, tjener det chaotrope middel, også til at lysere røde blodlegemer, frigøre Hb og inaktivere proteaser. Når der anvendes guanidin, vil koncentrationen i 10 blandingen fortrinsvis være med end ca. 1-molær, og en ca.

3-molær koncentration er særlig nyttig. Denatureringsprocessen fremskyndes væsentligt ved opvarmning af blandingen i et kort tidsrum. Det har vist sig, at denatureringen ved hjælp af det chaotrope middel kan tage fra en til flere 15 timer ved temperaturer under 37°C, medens der kan opnås en tilstrækkelig denaturering på et minut eller mindre ved temperaturer over 50°C. For at forhindre en væsentlig denaturering af antistoffet og andre protein-reagenser, som skal sættes til blandingen bagefter, bliver blan-20 dingen af prøve og chaotropt middel normalt fortyndet som et^ærskilt trin eller ved tilsætning af reagensopløsninger til et niveau, hvor det chaotrope middel i det væsentlige er uvirksomt til denaturering af sådanne reagenser, men vil opretholde frilæggelsen af epitopen ved at 25 forhindre en væsentlig renaturering af proteinet. Ved anvendelse af guanidin kræver dette fortrinsvis fortynding til en koncentration, der er under ca. 1,0-molær, 'idet en ca. 0,3-molær koncentration er særlig foretrukket.

Ikke-begrænsende eksempler på proteol-ytiske enzy-30 mer til anvendelse til nedbrydning ved den foreliggende opfindelse er trypsin, chymotrypsin, prolin-specifik endo-protease, pepsin og papain. Ved gennemførelsen af en immun-bestemmelse sættes der, således som det er kendt, inhibitorer for de proteolytiske enzymer til prøveblandingen i 35 tilstrækkelig mængde til at forhindre nedbrydning af proteinf ormige midler, der anvendes ved bestemmelsen.

LMV ΙΌ/ΟέΟ D I

16

Immunobestemmelsen af hæmoglobin-Alc-proteinanalyten ved anvendelse af det her omhandlede antistofreagens, som er specifikt for en lineær peptidepitop, med denaturering af proteinanalyten i testprøven eller bestemmelsesmediet 5 kan gennemføres ifølge i det væsentlige enhver konventionel metode. Sådanne metoder omfatter de mere klassiske, såsom immunodiffusion, immunelektroforese, agglutinationsmetoder og komplementfiksering, og de mere aktuelle metoder, der involverer anvendelse af specifikt påviselige mærkninger, 10 såsom radioimmunobestemmelser og ikke-radioisotop-metoder. Gennemførelsen af en immunobestemmelse af proteinanalyten under anvendelse af den foreliggende opfindelse omfatter de væsentlige trin, at den anvendte vandige testprøve behandles således, at hæmoglobin-Alc deri denatureres effektivt i 15 væsentlig grad, således at den ønskede lineære peptidepitop frilægges, at den denaturerede prøve bringes i kontakt med antistof reagenset, og at bindingen af antistofreagenset til hæmoglobin-Alc bestemmes. Bestemmelsestrinet vil naturligvis variere afhængigt af den grundlæggende immunbestemmelses-20 teknik, der anvendes. En almindelig metode til udførelse af denneJiestemmelse omfatter anvendelse af et mærket reagens, som vekselvirker med enten analyten eller antistofreagenset og anvendes til at indicere dannelse af et immunkompleks mellem analyten og antistofreagenset eller til at konkurrere 25 med en sådan dannelse.

De sidstnævnte metoder kan anvendes på mange forskellige måder, idet der f.eks. kan anvendes kompetitiv binding, hvorved et mærket reagens bringes til at konkurrere med proteinanalyten om binding til antistofreagenset. Mæng-30 den af mærket reagens, som er bundet til antistofreagenset, eller den frie form, som består af mærket reagens, der ikke er bundet på denne måde, måles på passende måde og kan relateres funktionelt til mængden af proteinanalyt i prøven. Da antistofreagenset ifølge den foreliggende opfin-35 delse er rettet mod en lineær epitop i proteinanalyten, kan det mærkede reagens være en mærket form af det dena- DK 167825 B1

O

17 turerede protein eller et denatureret fragment deraf eller som det vil foretrækkes, en mærket form af en peptidrest, der indeholder den lineære epitopsekvens af aminosyrer. Det sidstnævnte foretrukne reagens kan fremstil-5 les ved hjælp af tilgængelige metoder og apparatur til fremstilling af syntetiske peptider og kræver ikke isolering, rensning og denaturering af proteinmolekylet selv.

En anden nyttig immunobestemmelsesme'tode til påvisning af proteinanalyten er den, der er kendt som sand-10 wich-metoden. Ved denne metode anvender man to sæt af an tistofreagenser, hvoraf det ene er mærket, og det andet er tilpasset til at bevirke adskillelse af det første mærkede antistofreagens, som er bundet til proteinanalyten, fra det, der ikke er bundet. Det ikke-mærkede andet anti-15 stofreagens er typisk en immobiliseret eller immobiliser-bar form, således som det er kendt inden for teknikken.

Ved radioimmunobestemmelser skal den- frie form og den bundne form kunne skelnes eller separeres fysisk til måling af mærkestoffet, da signalet, som gives af mærk- ΛΛ ningen er kvalitativt det samme i begge former. En sådan teknik er kendt som heterogen på grund af nødvendigheden af en faseadskillelse. Der kendes andre heterogene immuno-bestemmelsesmetoder, herunder enzymmærkede immunobestem-melser, der undertiden betegnes ELISA-metoder (se US pa- ftfi tentskrift nr. 3.654.090), og fluorescens-immunobestem-melser (se US patentskrift nr. 4.201.763, 4.133.639 og 3.992.631).

I de senere år er der blevet udviklet talrige im- munobestemmelsesmetoder, hvorved adskillelsestrinnet und-30 gås ved anvendelse af en mærkning, hvis påviselige signal moduleres ved binding af det mærkede reagens til en bindingspartner, f.eks. antistof. Sådanne metoder er blevet kendt som homogene metoder, og når de står til rådighed foretrækkes de til anvendelse ved den foreliggen-35 de opfindelse, fordi adskillelser ikke er nødvendige, og der ikke anvendes radioisotoper. Nogle af sådanne meto-

Ulv 10/0^0 D I

18 0 der er fluorescensundertrykkelse og -forstærkning (se US patentskrift nr. 4.160.016), energioverførings-immunobe-stemmelse (se US patentskrift nr. 3.996.345) og dobbelt an-tistof-sterisk hindring-immunobestemmelse (se US patent-5 skrift nr. 3.935.074 og 3.998.943). Særlig foretrukne homogene immunobestemmelsesmetoder er sådanne, hvorved der anvendes et mærkestof, som deltager i en enzymkatalyseret reaktion. Eksempler herpå er substratmærket immunobestem-melse (se US patentskrift nr. 4.279.992 og GB patent-10 skrift nr. 1.552.607), prostetisk gruppe-(FAD)-mærket im-munobestemmelse (se US patentskrift nr. 4.238.565), enzym--modulator-mærket immunobestemmelse, f.eks. under anvendelse af inhibitor-mærkninger (se US-patentskrift nr. 4.134.972 og 4.273.866) og enzymmærket immunobestemmelse 15 (se US-patentskrift nr. 3.817.837).

Antistofreagenset ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved dets specifikke bindingsaffinitet til en lineær peptidepitop i hæmoglobin-Alc-gly- coproteinanalyten. Derfor vil udtrykket "antistofreagens" 20 som anvendt i den foreliggende beskrivelse referere til ethvert materiale fremkommet på en hvilken som helst måde, der indeholder et antistof-kombinationssted, som er specifikt for en sådan peptidepitop. Udtrykket omfatter derfor både hele antistoffer og passende fragmenter eller 25 polyfunktionaliserede former deraf. Når der er tale om et helt antistof, kan det tilhøre enhver af klasserne eller underklasserne af kendte immunoglobuliner, f.eks. IgG,

IgM osv. Ethvert fragment af ethvert sådant immunoglobulin, som bibeholder specifik bindingsaffinitet.til peptid-30 epitopen, kan også anvendes, f.eks. fragmenterne af IgG, der er almindeligt kendte som Fab, Fab1 of F(ab1)2- Desuden kan der anvendes aggregater, polymere, derivater, konjugater og hybrider af immunoglobuliner eller fragmenter deraf, hvor det er hensigtsmæssigt.

35 Immunoglobulin-kilden til antistofreagenset kan fås på enhver tilgængelig måde, såsom konventionelle an- 19 DK 167825 B1 tiserum-metoder og monoklonale metoder. Antiserum kan fås ved veletablerede metoder, der involverer immunisering af et dyr, såsom mus, kaniner, marsvin og lignende, med et passende immunogen. Immunoglobulinerne kan også fås ved 5 somatisk cellehybridisering, hvilket resulterer i, hvad der almindeligvis betegnes monoklonale antistoffer.

Monoklonale antistofreagenser er særlig foretrukne. Hybridomcellelinier bringes til at producere antistoffer mod kun den lineære peptidepitopdel af proteinmole-20 kylet snarere end mod hele proteinet, og sådanne cellelinier og deres antistoffer screenes til identificering og isolering af de monoklonale antistoffer, der reagerer selektivt med epitopen.

Ved én metode til dannelse af sådanne antistoffer 25 kobles et fragment af proteinkæden, svarende til og omfattende den naturligt forekommende lineære peptidepitop-sekvens, til en proteinbærer og injiceres i et laboratoriedyr til fremkaldelse af en immunreaktion. Alternativt kan immunogenet omfatte en lineariseret eller denatureret form 20 af proteinet eller et fragment deraf. Lymfocyter, såsom miltce.lJ.er, fra det immuniserede dyr fusioneres med myelom-celler til dannelse af hybridomer, som dyrkes og screenes for produktion af monoklonale antistoffer. De monoklonale antistoffer screenes for sådanne, der er selektive for pep-25 tidepitopen, og den pågældende cellelinie klones til anvendelse ved fremstilling af yderligere mængder af det monoklonale antistof.

Til dannelse af antistoffer mod et syntetisk pep-tidimmunogen i et laboratoriedyr, f.eks. BALB/c-mus, rot-30 ter og lignende, bliver et peptid indeholdende epitopen fremstillet og isoleret fra det naturligt forekommende protein eller syntetiseret kemisk og renset. Et sådant proteinfragment vil indeholde alle de kritiske aminosyreenheder af epitopen og kan indeholde yderligere aminosyreenheder, hvoraf 35 nogle eller alle vil svare til sekvensen af aminosyrer i hæmoglobin-Alc-glycoproteinet.

o 20 UK 1b/»Zb b l

For at sikre, at peptidfragmentet indeholdende epitopen er optimalt antigent, kan det fordelagtigt kobles multipelt til et immunogent bæremateriale. Det immunogene bæremateriale kan vælges blandt de konventionelt an-5 vendte, der har funktionelle grupper, som står til rådighed til kobling til peptidresten. I de fleste tilfælde vil bæreren være et protein eller polypeptid, selv om andre materialer, såsom kulhydrater, polysaccharider, lipopoly-saccharider, nucleinsyrer og lignende, med tilstrækkelig 10 størrelse og immunogenitet ligeledes kan anvendes. For det meste vil immunogene proteiner og polypeptider have molekylvægte mellem 4.000 og 10.000.000, fortrinsvis over 15.000, og mere sædvanligt over 50.000. Generelt vil proteiner taget fra én dyreart være immunogene, når de indføres i blod-15 banen hos en anden art. Særlig anvendelige proteiner er albuminer, globuliner, hæmocyaniner, gluteliner og lignende. Med hensyn til teknikkens stade vedrørende konventionelle immunogene bærematerialer og metoder til kobling af hap-tener dertil kan der henvises til følgende: Parker, "Radio-20 immunoassay of Biologically Active Compunds", Prentice- -Ha.il·- (Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1976), Butler, J. Immunol. Meth. T_r 1-24 (1974), Weinryb og Shroff, Drug Metab. Rev. 10, 271-283 (1974), Broughton og Strong, Clin. Chem. _22, 726-732 (1976), og Playfair et al., Br. Med. Bull. 25 30, 24-31 (1974).

Antallet af epitoper, som kobles til et givet immunogent bæremateriale, vil kun være begrænset af antallet af til rådighed stående koblingssteder på bæreren og kan være så højt som flere tusinde, når der· er tale om vis-30 se syntetiske polypeptider med høj molekylvægt, såsom po-lylysin. Tætheden af epitoper på en bestemt bærer vil afhænge af molekylvægten af bæreren og tætheden af til rådighed stående koblingssteder. Optimale epitop-tætheder, med hensyn til letheden og reproducerbarheden af syntesen af 35 immunogenet og antistofreaktionen, ligger mellem ca. 10 og ca. 50% af de til rådighed stående koblingsgrupper på den anvendte bærer.

21 DK 167825 B1

Peptidfragmenterne kobles til bærematerialet ved en hvilken som helst bekvem koblingsmetode. Funktionelle grupper på de naturlige aminosyrer i fragmentet eller funktionelle grupper indført ved kemisk modificering af 5 fragmentet vil normalt blive anvendt til direkte kobling eller kobling via bifunktionelle grupper til funktionelle grupper på bæreren. Det vil være foretrukket at udforme peptidfragmentet til at have en enkelt funktionel gruppe, der er reaktiv på en særlig måde, således at der fås en 10 entydig kobling til bæreren.

Den foreliggende opfindelse muliggør høj specifik immunobestemmelse af glycosyleret hæmoglobin i biologiske væsker, såsom helblod. Monoklonale antistoffer dannet mod de syntetiske glycosylerede N-terminale peptidrester, der 15 forekommer i Hb Alc, har vist sig at blive bundet specifikt til sådanne rester i den glycosylerede β-underenhed i hæmoglobin. Antistofferne kan fremstilles på forskellige måder ifølge konventionelle monoklonale metoder. I det væsentlige fremstilles antistofferne mod et syntetisk fremkommet im-20 munogen indeholdende den ønskede glycosylerede N-terminale peptidrest kemisk bundet til en immunogen baere'r, idet det glycosylerede peptid har mindst 2 og fortrinsvis fra ca. 5 til 15 aminosyreenheder svarende til Hb Alc. De resulterende monoklonale antistoffer er specifikke for det glycosylerede > 25 syntetiske peptid og den tilsvarende frilagte epitop for Hb Alc-molekylet.

Yderligere detaljer vedrørende fremstillingen og anvendelsen af Hb Alc-specifikke monoklonale antistoffer findes i dansk patentansøgning nr. 1307/91.

30 Den foreliggende opfindelse illustreres ved de føl gende specifikke eksempler. 1

O

22 UK 16/825 Bl

Eksempel 1.

Fremstilling og karakterisering af antistoffer mod glyco-peptidepitopen i Hb Alc.

a) Et 11-aminosyrers peptid indeholdende de 8 N- , -terminale enheder af β-hæmoglobin plus to enheder af tyro-5 sin plus en enhed af cystein syntetiseres ifølge B. Gutte og R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 91 (2)·, 501 (1969) , hvorved der fås følgende peptid: NE^-valin-histidin-leucin-threonin-prolin-gluta- minsyre-glutaminsyre-lys in-tyros in-tyrosin-cyste in-

-COOH

Til glycosylering af dette peptid omsættes 200 mg 15 af dette rensede peptid med 0,25M glucose i 20 ml vandfri pyridin i 48 timer ved stuetemperatur i mørke. Blandingen tørres i vakuum. Den fremkomne sirup resuspenderes i 20 mM kaliumphosphat med en pH-værdi på 2,95 og renses ved høj-tryksvæskechromatografi (HPLC).

20 De glycopeptidbærende fraktioner opløses i 0,1M

triethylammoniumacetat med en pH-værdi på 8 *-5 og chroma-tograferes på "Affigel 601"-boronat-affinitetsharpiks (Biorad) , hvorved glycopeptidet adsorberes selektivt. Harpiksen vaskes med 0,1M triethylammoniumacetat med pH-værdi 25 8,5, og glycopeptidet elueres med 0,1M triethylammonium acetat med pH-værdi 5,0. Eluatet frysetørres.

Produktet resuspenderes i 1 ml vand og omsættes med et 500 ganges molært overskud af dithiothreitol (til gendannelse af cysteinets SH-gruppe), og det reducerede 30 peptid renses igen ved HPLC og frysetørres. Dette gly- copeptid oplagres ved -20°C under ^ indtil videre anvendelse.

b) Et KLH-MBS-konjugat som ovenfor beskrevet ifølge R. Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 7!3, 3403 (1981), omsættes med produktet fra a) i et 2 ganges molært forhold 35 mellem glycopeptid og maleimid på bæreren i 50 mM kaliumphosphat med pH-værdi 7,2 i 1 time ved stuetemperatur.

DK 167825 Bl

O

23 c) Opløsningen fra b) blandes med et lige så stort volumen Freund's komplette adjuvans til dannelse af en vand--i olie-emulsion, og 200^ug konjugat injiceres i BALB/cBy--mus. Musene boostes efter 30 og 60 dage, aflives, og deres milt 5 anvendes til fusion ifølge Kohier og Milstein, Nature 256, 495 (1975), hvorved der dannes talrige hybridomer. Hybrid-ornerne screenes til identificering af sådanne, der producerer monoklonale antistoffer, som er specifikke for den glycosylerede peptidepitop.

10 Screeningen for A-^-specifikke monoklonale antistof fer gennemføres under anvendelse af en ELISA-metode, hvorved antigenet adsorberes på polystyren-mikrotiterplader (Linbro). Antigenerne er renset humant Alc og ikke-gly-CQSyleret Ao-hæmoglobin. A^c1 et renses fra et hæmo-15 lysat af røde blodlegemer ved anvendelse af to forskellige chromatografiske procedurer. Den første rensning består af binding af glycosyleret hæmoglobin til en boronat--affinitetsharpiks som beskrevet af Pierce Chemical Co.,

Rockford, Illinois, USA, produkt nr. 42.000. Typisk an-20 bringes 1-5 g haemoglobin på 100 ml boronatharpiks, og den bundne fraktion (glycohæmoglobinfraktion) eTueres som beskrevet af Pierce Chemical Co., GlycoTest bulletin, produkt nr. 42.000. Den eluerede glycohæmoglobinfraktion ækvili-breres i en puffer med lav ionstyrke og chromatograferes 25 på en ionbytterharpiks som beskrevet af M. MacDonald et al., J. Biol. Chem. 253, 2327-2332 (1978). Alc-"toppen" analyseres ved isoelektrisk fokusering og ved kulhydratanalyse under anvendelse af thiobarbitursyre-bestemmelsen, og resultaterne bekræfter, at denne rensning giver ultra-30 ' rent Alc~hæmoglobin, idet det rensede materiale både indeholder kulhydrat og adskiller sig fra normalt Ao-hæmoglobin med hensyn til isolelektrisk punkt. På lignende måde renses Ao-hæmoglobin ved hjælp af den egenskab, at det ikke bindes til boronat-affinitetsharpiksen og chromatograferes 35 som Ao-"toppen" ved den ionbytningschromatografiske rensning. De rene A^Q- og Ao-hæmoglobiner adsorberes på separa- DK 167825 Bl

O

24 te mikrotiterplader (2^ug pr. lOO^uliter PBS pr. hul) natten over ved 4°C. Pladerne blokeres i 1% BSA i PBS i 60 minutter ved stuetemperatur og vaskes derefter 4 gange i PBS.

Den ovenstående væske fra hver hybridomcellelinie sættes 5 til A^ - og Ao-pladen og inkuberes ved stuetemperatur i 60 minutter. Pladerne vaskes 4 gange i PBS, og et sekundært antistof (kanin-anti-muse-IgG-peroxidase, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA, i en 1:5000-fortyn-ding i 1% BSA i PBS) påføres og underkastes inkubering 10 i 60 minutter ved stuetemperatur. Pladen vaskes 4 gange i PBS, og der tilsættes 200^,uliter af en substratopløsning (24,3 mM citronsyre, 51,4 M natriumphosphat, pH-værdi 5,3, indeholdende 2,2 mM o-phenylendiamin og 5,2 mM hydrogen-peroxid). Reaktionen afsluttes efter 20 minutter ved til-15 sætning af 50^uliter 8M svovlsyre, og produktet af peroxi-dasereaktionen aflæses ved 492 mM.

Blandt 200 udgangshybridomer, der producerer antistoffer mod hæmoglobin, identificeres ni (9) som værende specifikke for A-^-epitopen, medens 191 reagerer med både 20 Alc ikke-glycosyleret hæmoglobin. Da præimmuniseret mu sesgrum ikke har nogen påviselig antis tof reåktion mod humant Ao- eller A^-hæmoglobin ved ELISA-proceduren, er den væsentligste immunreaktion mod sekvensen af 8 peptider, som er fælles for A^c og Ao. Da det syntetiske pep-25 tidimmunogen består af 8 aminosyrerester i hæmoglobinsekvensen, er den væsentligste muse-immunreaktion rettet mod pep-tidet og ikke kulhydratet (191 af de 200 hybridomer reagerer både med Ao og A^c) . Som forventet har det immuniserede museserum også bredt krydsreagerende antistoffer, der 30 · kan reagere med både Ao og A^c, hvilket tyder på, at der

ikke fås nogen specificitet for A^c, medmindre hybridomeme screenes for reaktivitet mod A^c og ikke Ao-hæmoglobin. De foretrukne hybridomer, der producerer antistoffer mod A^ --hæmoglobin og ikke mod Ao-hæmoglobin, er deponeret hos 35 ATCC med deponeringsbetegnelserne ATCC HB 8639 og ATCC HB

8869 henholdsvis den 11. oktober 1984 og den 10. juli 1985.

DK 167825 Bl

O

25 d) Identifikation af peptiderne, der konkurrerer med A^c om binding til antistof: Følgende peptider dannes ved enzymnedbrydning af det oprindelige glycosylerede peptid med 11 aminosyrer: 5

Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (glycopeptid 1)

Alle peptidfragmenter renses ved HPLC og kvantificeres 10 ved aminosyresekvens. Tryptisk nedbrydning af det oprindelige peptid giver:

Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys (glycopeptid 2) 15

En prolin-specifik endoprotease giver

Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro (glycopeptid 3) 20

Peptidet Glyco-Val-His-FAD (glycopeptid 4) ,-.-hvori dipep-tidet er koblet til N6-aminocyclohexyl-FAD og derefter gly-cosyleret, fremstilles ved metoden ifølge US patentskrift nr. 4.255.566 og fås fra Dr. Kin Yip og Dr. R. Buckler, 25 Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA.

Ved en typisk kompetitiv bestemmelse inkuberes hvert peptid i en mængde på 8 nanomol til 8 picomol i 100yuliter PBS, 7,2 mM Na2HPC>4, 288 mM NaH^PO^, 127 mM 30 NaCl, pH-værdi 7,4, med 100^,uliter ovenstående væske fra monoklonal celledyrkning i 60 minutter ved stuetemperatur. Denne blanding sættes til en polystyren-mikrotiter-plade overtrukket med lyug A-^-hæmoglobin pr. hul. Hvis peptidet konkurrerer med antistoffet, er antistoffet ikke 35 frit til at blive bundet til det immobiliserede A-^. Pladen vaskes 4 gange med PBS. Et andet antistof (kanin-anti-

O

DK 167825 B1 26 -muse-IgG koblet med peberrods-peroxidase) tilsættes i 30 minutter, og pladen vaskes med PBS. Substratet (o-phe-nylendiamin, 2,2 mM) og hydrogenperoxid (0,012%) tilsættes, og den fremkomne farve måles ved 492 nm. Kvantifice-5 ringen af produktet afspejler graden af konkurrence, idet f.eks. intet produkt indicerer, at det konkurrerende peptid totalt blokerer bindingen af antistoffet til det im- mobiliserede A. . Resultaterne viser, at alle de fire o-lc venfor beskrevne glycopeptider inklusive Glyco-Val-His-FAD 10 er effektive konkurrenter. Bindingen af et af antistofferne, Ab-4, til Alc blokeres totalt af glycopeptideme 1 til 4 (se fig. 3). Et andet antistof, Ab-3, blokeres af glycopeptid 1 til 3, men ikke af glycopeptid 4 (se fig. 1-3).

Peptider, som mangler kulhydratet, udviser ingen kom-15 petitiv inhibering, hvilket tyder på, at kulhydratet er en afgørende komponent af epitopen og tilvejebringer specificiteten af antistoffernes genkendelse af A.^—hæmoglobin (se fig. 1).

20 Eksempel 2.

Kompetitiv immunobestemmelse af Hb Alc.

Denne kompetitive immunobestemmelse er baseret på anvendelsen af en fast mængde hapten-mærkestof (som beskrevet i eksempel 5), der konkurrerer med Alc i lyseret helblod 25 om binding til det immobiliserede antistof. Da antistoffet genkender både A^c og hapten, bestemmer mængden af A^c i prøven mængden af hapten-mærkestof, der bindes til antistoffet. Da antistoffet er immobiliseret, kan alle ikke--bundne reaktanter fjernes ved et simpelt vaskningstrin.

30 Det bundne mærkestof kan derefter måles og sammenlignes med en standard til mængdebestemmelse af A-^c i de oprindelige blodprøver.

Bestemmelsen gennemføres med anvendelse af helblod som prøve og kan opdeles i de nedenfor anførte trin: 35 DK i67oZb bl

O

27 (1) Lyse af celler - denaturering af hæmoglobin.

Da bestemmelsen til slut kræver mindre end 0,3^-uli-ter helblod/ fortyndes et nøjagtigt pipetterbart volumen blQd (5-50^uliter fra et fingerstik eller fra helblod) S i en denaturerende opløsning (3M guanidin-HCl, 10 mM tris-HCl, pH-værdi 7,5) og opvarmes til 56°C i 2-15 minutter. Lavere temperaturer fungerer også, men kræver yderligere tid til komplet denaturering af prøven. Denatureringen a) inaktiverer koaguleringsmekanismerne, hvis 10 prøverne ikke er præpareret med antikoagulationsmidler, b) lyserer de røde blodlegemer, c) denaturerer proteaser, enzymer etc. og frilægger A-^-epitopen på hæmoglobin optimalt, d) synes at sterilisere prøven eller inhibere væksten af ..mikroorganismer i den denaturerede blodprøve, selv hvis 15 prøven ikke er præpareret aseptisk (f.eks. blod fra et fingerstik), og e) fører til en stabil klinisk prøve, der kan opbevares i flere dage ved stuetemperatur, uden at det påvirker den sluttelige bestemmelse.

(2) Fortynding og "konkurrence".

20 En portion af det denaturerede helblod pipetteres i d^t-1O-dobbelte volumen puffer indeholdende hapten-mærkestof. Dette fortynder effektivt hæmoglobinet til den rette koncentration til bestemmelsen og fortynder denatureringsmidlet til en lav koncentration, således at antistof- el-25 ler enzymaktiviteten ikke forstyrres. De antistofovertruk-ne perler tilsættes derefter i et bestemt tidsrum, hvo joinder antistoffet enten binder Alc-hæmoglobin eller hapten--HRP.

(3) Vaskning og aflæsning.

30 Efter den kompetitive inkubering vasker perlerne, og mærkestoffet måles efter tilsætning af et passende substrat. Signalet sammenlignes med en standard, og mængden af Alc' SOin er ste<^e ^ den oprindelige prøve af helblod, bestemmes..

35 Detaljerne ved bestemmelserne er sammenfattet i det følgende:

O

DK 167825 B1 28

Perle-overtrækningsprocedure i

Polystyrenperler (diameter 6,4 mmf spejlblank o-verflade) fås fra Precision Ball Company, Chicago, Illinois, USA. Der udvælges sådanne perler fra partierne, der 5 giver den laveste variation ved flere immunobestemmelser af den samme prøve. Før overtrækningen vaskes perlerne med absolut methanol og derefter med vand. Methanolvask-ningen synes at sænke variationskorrelationen for flerdob-belte bestemmelser af den samme prøve. En antis tof opløsning 10 (5^ug antis tof/10 O^ulter i 0,2M natriumborat-, pH-værdi 8,5, 0,02% natriumazid) sættes til de fugtige perler, og perlerne roteres natten over ved 4°C. Derefter vaskes perlerne og blokeres med 1% BSA i PBS indeholdende'0,02% natriumazid.

15 Typisk overtrækkes 500-1000 perler på én gang og anvendes i et tidsrum på flere uger uden tegn på tab af antistofaktivitet. Over træknings forsøg med radioaktivt- antistof viser , at der bindes 0,5^ug antistof pr. perle.

Perlerne anvendes kun ved denne immunobestemmelse 20 på grund af deres evne til at binde relativt høje mængder protein. Den hydrofobe absorption af protein" på polystyren er bekvem, men kan bestemt erstattes ved enhver af flere procedurer, hvor proteiner bindes covalent til polystyren, funk-tionaliserede harpikser eller siliciumdioxid. Polystyrenet 25 kan også have form af et rør eller en kuvette.

Arbejdsplanen kan sammenfattes som følger: a) 50yUliter helblod fortyndes i 1,0 ml denaturerende opløsning (3M guanidin-HCl, 10 mM tris, pH-værdi 7,5), der opvarmes til 56°C i 15 minutter, og igen fortyndes 100 30 ^uliter i 1,0 ml denatureringsmiddel.

b) 50^uliter af den ovenfor anførte opløsning sættes til 0,5 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS) med en pH-værdi på 7,5 indeholdende hapten-HRP. Inkubationerne, vaskningerne og de enzymatiske reaktioner gennemføres be- 35 kvemt i 48-huls polystyren-vævskulturplader.

O

DK 167825 B1 29 c) Der tilsættes antistofovertrukne perler og inkuberes i 30 minutter ved omgive ls es temperatur under vug-ning.

d) Perlerne vaskes med puffer (PBS) (sædvanligvis 5 3-1 ml's portioner).

e) Der tilsættes o-phenylendiamin-substrat og hy-drogenperoxid.

f) Reaktionen standses, og produktet aflæses efter 20 minutter.

10 Den ovenfor beskrevne bestemmelse anvendes til til vejebringelse af de nedenfor beskrevne kliniske data. Standardkurven er vist i fig. 4. Anvendelsen af glycopeptid 1 som kompetitor er vist i fig. 5. Vurderingen'af normale og diabetiske donorer er vist i fig. 6. Boronat-affinitetsbe-15 stemmeisen gennemføres nøjagtigt som beskrevet af Pierce Chemical Co. (GlycoTest, produkt nr. 42.000).

Eksempel 3.

Optimal frilæggelse af Alc-epitopen.

20 Optimal reaktivitet af den humane Alc~epitop ses efterbehandling af det naturlige hæmoglobin- (i helblod eller hæmolysat) ved procedurer eller med reagenser, der gør epitopen tilgængelig for antistoffets kombinerende sted. Den optimale tilgængelighed af epitopen kan opnås 25 ved en fysisk denaturering (værme, ultralydsbehandli’ng etc.), ved en kemisk procedure, der involverer klassiske denatureringsmidler (urinstof, guanidin, SDS, protease), eller ved en kombination af fysiske og kemiske procedurer. Mest effektiv er en procedure, ved hvilken helblpd (SO^uliter) 30 sættes til 1 ml opløsning af 3M guanidin-HCl, 10 mM tris--HC1, pH-værdi 7,4, og opvarmes til 56°C i mere end 1 minut. Den dannede prøve fungerer optimalt ved efterfølgende immunobestemmelser af A^c~epitopen. Opløsningen kan fortyndes 10 gange i puffer, hvilket fortynder guanidinet 35 effektivt til en koncentration på 0,3M, der har ringe eller ingen effekt på normale antistof-antigen-aktiviteter, DK 167825 Bl

O

30 hvorved der fås et egnet medium til efterfølgende immuno-bestemmelser.

Der anvendes den kompetitive immunobestemmelse i-følge eksempel 2. Kompetitoren er det Alc, som er til ste-5 de i helblod fra en diabetiker. Helblodsprøven placeres i 3,OM guanidin ved 20, 37 eller 56°C i tidsrum på 0-320 minutter. Resultaterne (fig. 7) viser, at epitopen gøres tilgængelig med tiden ved 20 eller 37°C og således effektivt konkurrerer med hapten-HRP-konjugatet. Ved 56°C er epitopen 10 maksimalt tilgængelig efter 5 minutter, hvilket er det tidligste tidspunkt, som er konstateret ved denne bestemmelse. Resultaterne viser, at i den naturlige hæmoglobin Alc-te-tramer er epitopen skjult og utilgængelig og konkurrerer ik-ke^med konjugatet af lineært syntetisk glycopeptid og HRP.

15 Hvis hæmoglobinet imidlertid denatureres, bliver den frilagte epitop en effektiv kompetitor for konjugatet af lineært glycopeptid og enzym.

Eksempel 4.

20 Sammenligning af specificiteten af polyklonale antistoffer fra får og monoklonale antistoffer fra mus. '-T

Et får immuniseres intramuskulært på 5 steder med glycopeptid-KLH-konjugat (4 mg) ifølge eksempel 1 b) i Freund's komplette adjuvans. På lignende måde foretages 25 der boost-injektioner efter 30 og 60 dage. Boostningen efter 60 dage sker i Freund's ukomplette adjuvans. Præim-mun-serum og immun- serum undersøges for Alc- og Ao-speci-ficitet ved en ELISA-bestemmelse som beskrevet i eksempel 1 c). Resultaterne (se fig. 7) viser, at det syntetiske 30 glycopeptid stimulerer en immunreaktion mod humant hæmoglobin, men at immunoglobulinerne ikke er specifikke for A .^-hæmoglobin. I modsætning hertil er muse-monoklonale antistoffer for Alc ganske specifikke for Alc, når de undersøges ved den samme bestemmelse (ELISA-bestemmelsen iføl-35 ge eksempel 1 c), se fig. 8). Forsøg på immunoaffinitets-rensning af antistof, som er specifikt for Al-c, fra fåre--antiserum falder ikke heldigt ud.

O

DK 167825 B1 31

Eksempel 5.

Fremstilling af hapten-mærkestof-konjugater.

Der fremstilles et konjugat af glycopeptid 1 (HRP). Hapten-HRP-konjugatet fremstilles ved at omsætte 15 mg pe-5 berrodsperoxidase (HRP) med et 10 ganges molært overskud af MBS (se eksempel lb)) i 50 mM natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH-værdi 7/0. MBS-HRP-konjugatet renses ved gelfiltrering (under anvendelse af den ovenfor anførte puffer) , og der tilsættes 0,34 mg af glycopeptid-haptenet 10 (peptid 1). Det færdige hapten-HRP-konjugat renses ved gelfiltrering på HPLC og anvendes i en fortynding på 1:1000 -1:100.000 ved den kompetitive immunobestemmélse ifølge eksempel 3.

15 Eksempel 6.

Strimmel-immunobestemmelse af Hb Alc.

a) 1 mg af det monoklonale antistof -ifølge eksempel 1 c) i 0/1M natriumboratpuffer, pH-værdi 8,5, kan blandes med et 200 ganges molært overskud af fluorescein-iso- 20 thiocyanat (FITC) og omsættes i 30 minutter ved stuetemperatur. Det fluorescein-mærkede monoklonale antistof kan renses ved gelfiltrering.

b) En strimmel (polystyren, cellulose etc.)r som bærer COOH-grupper, dyppes i 0,5 ml af et ukendt denatu- 25 reret hæmolysat, pH-værdi 7,5. Strimlen skylles med puffer med pH-værdi 7,5 og nedsænkes i det fluorescerende monoklonale antistof fra a) i pufret opløsning i 5 minutter ved stuetemperatur. Strimlen skylles igen, og graden af fluorescens på strimlen angiver andelen af Alc-Hb i 30 den ukendte prøve.

Eksempel 7.

Kobling af monoklonalt antistof til reagensstrimmel og anvendelse til en immunobestemmelse.

35 Whatman nr. 1-filtrerpapir (7 cm) anbringes i 20 ml iskoldt destilleret vand, og opløsningens pH-værdi ind-

O

DK 167825 B1 32 stilles til mellem 10,5 og 11,5 med 5M natriumhydroxidopløsning. Opløsningen overvåges kontinuerligt under hele aktiveringen, og pH-værdien holdes mellem 10,5 og 11,5 ved dråbevis tilsætning af 5M natriumhdroxidopløsning. En lil-5 le omrørerstang anbringes i bunden af bægerglasset indeholdende filtrerpapiret. Bægerglasset anbringes derefter i en isfyldt petriskål, som placeres på en magnetomrører.

1 g fast BrCN sættes til bægerglasset, og der inkuberes i 20 minutter under omrøring (på is). Filtrerpapiret fjernes 10 fra opløsningen og vaskesmed 10 ml iskoldt destilleret vand. Det vaskes derefter med iskold 0,2M Na2HPO^-citron-syre-puffer, pH-værdi 6,8. Der tilsættes antistof (1 mg/-ml i 0,2M Na2HPO^-citronsyre-puffer, pH-værdi 6,8), og koblingen af antistoffet får lov at forløbe i 1 time. Der til-15 sættes ethanolamin (10 ml af en 1 mM opløsning) til blokering af ikke-reagerede steder (15 minutter), og papiret vaskes med phosphatpufret saltopløsning (PBS-., 10 mM Na2HP0^, 140 mM NaCl, pH-værdi 7,5) til fjernelse af uomsatte komponenter .

20 Denne reagenstrimmel dyppes i en standardiseret mængde af ukendt denatureret hæmolysat indehbldende en mærket kompetitor for antistofbindingen til Alc-hæmoglo-bin. En hensigtsmæssig kompetitor er glycopeptidet (gly-copeptid 1) covalent koblet til peberrodsperoxidase (hap-25 ten-HRP) . Strimlen fjernes og skylles med PBS. Mængden af hæmoglobin bundet til strimlen måles (mængden er omvendt proportional med Alc i prøven, og Alc-hæmoglobinet kan kvantificeres ved sammenligning med standardprøver. 1 2 3 4 5 6

Eksempel 8.

2

Enzymbundet immunosorbens-bestemmelse af Alc.

3

Et fast volumen denatureret blodhæmolysat (lOO^uli- 4 ter) sættes til polystyren-mikrotiterplader og får lov at 5 bindes ved stuetemperatur i 60 minutter. Pladen vaskes 6 4 gange med PBS indeholdende 0,05% "Tween-20" (PBST). Det monoklonale antistof (koblet til peberrodsperoxidase) til- 33

O

DK 167825 B1 sættes (lOO^uliter, l^ug/ml) i PBST og omsættes i 30 minutter ved stuetemperatur. Overskuddet af antistof fjernes ved 4 vaskninger med PBST. Substratet (o-phenylendia-min, 2,2 mM) og hydrogenperoxid (0,012%) i PBS tilsættes, 5 og reaktionsproduktet måles ved 492 nm. Farveintensiteten afspejler den tilstedeværende mængde Alc i hæmolysatet, når den sammenlignes med standardværdier.

Eksempel 9.

10 Radioimmunobesteromelse af Alc.

lOO^uliter denatureret blodhaanolysat (220 nano-mol hæmoglobin) .blandes med 7 nanomol ioderet Glyco-Val-His--Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (500.000 cpm/7 nanomol) . Et monoklonalt antistof tilsættes i tilstrækkelig 15 mængde til at binde 50% af det glycosylerede peptid, hvis blodhæmolysatet indeholder det normale (ca. 3%) Alc-haanoglobin. Højere haato-blobin-Alc-værdier konkurrerer med peptidet og nedsætter derved det totale antal tællinger, som bindes af antistoffet. Antistoffet kan genvindes ved immuno-udfældning med et 20 andet antistof (kanin-anti-muse-IgG) eller ved adsorption på protein-A-overtrukne partikler. Det ioderede peptid bundet til antistoffet kan kvantificeres i en gammaisotoptæl-ler og afspejler mængden af tilstedeværende Alc i blodhæmolysatet, når der sammenlignes med standarder.

25 30 35

Claims (14)

1. Fremgangsmåde til immunobestemmelse af hæmoglobin--Alc-glycoprotein-analyten i en vandig testprøve, hvorved testprøven bringes i kontakt med et antistof reagens, som er 5 specifikt for binding af en kulhydratmodificeret lineær peptidepitop i hæmoglobin, og hvorved bindingen af antistof-reagenset hertil bestemmes, kendetegnet ved, at testprøven først behandles til denaturering af en væsentlig mængde af eventuelt tilstedeværende hæmoglobin-Alc deri for 10 at frilægge eller forøge frilæggelsen af den lineære peptidepitop til binding af antistofreagenset.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at testprøven behandles under denaturerende betingelser, der ikke i væsentligt omfang aggregerer eller 15 udfælder proteinanalyten.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at testprøven behandles med-et chaotropt middel med det formål at frilægge eller forøge frilæggelsen af epitopen.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende- t e g^n- e t ved, at testprøven behandles med'et proteolytisk enzym med det formål at frilægge eller forøge frilæggelsen af epitopen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende- - » 25 tegnet ved, at testprøven behandles med et thiocyanat-salt med det formål at frilægge eller forøge frilæggelsen af epitopen.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at proteinanalyten adsorberes til en fast 30 overflade.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at antistofreagenset er mono-klonalt og tilvejebragt ved immunisering af et dyr med (a) et syntetisk peptidiromunogen omfattende en rest af den kul- 35 hydratmodificerede lineære peptidepitop i hæmoglobin Alc DK 167825 B1 bundet til et immunogent bæremateriale eller (b) en denatureret eller nedbrudt form af hæmoglobin-Alc-glycoproteinet.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-7, kendetegnet ved, at testprøven er blod, og anti- 5 stofreagenset er et monoklonalt antistof eller et fragment deraf omfattende et antistof-kombinerende sted, som bindes specifikt til den glycosylerede N-terminale peptidsekvens i beta-underenheden af humant hæmoglobin.

9. Reagenssystem til immunobestemmelse af hæmoglobin-10 -Alc-glycoproteinanalyt i en vandig testprøve, hvilket system omfatter et antistofreagens, som er specifikt for binding af en kulhydratmodificeret lineær peptidepitop i hæmoglobin--Alc, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et kemisk middel, der ved kontakt med testprøven er i stand 15 til at denaturere en væsentlig mængde af hæmoglobin-Alc deri til frilæggelse eller forøgelse af frilæggelsen af den lineære peptidepitop til binding af antistofreagenset.

10. Reagenssystem ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det kemiske denatureringsmiddel ikke i væsent- 20 ligt omfang aggregerer eller udfælder proteinanalyten. ^_-ll. Reagenssystem ifølge krav 9 eller Ί0, kendetegnet ved, at det kemiske denatureringsmiddel er et chaotropt middel.

12. Reagenssystem ifølge krav 9 eller 10, k e n - 25 detegnet ved, at det kemiske denatureringsmiddel er et thiocyanatsalt.

13. Reagenssystem ifølge ethvert af kravene 9-12, kendetegnet ved, at antistofreagenset er tilvejebragt ved immunisering af et dyr med (a) -et syntetisk 30 peptidimmunogen omfattende en rest af den kulhydratmodificerede lineære peptidepitop bundet til et immunogent bæremateriale eller (b) en denatureret eller nedbrudt form af glyco-proteinet.

14. Reagenssystem ifølge ethvert af kravene 9-13, 35 kendetegnet ved, at det yderligere omfatter en mærket form af den kulhydratmodificerede lineære peptidepi- DK 167825 Bl top.

15. Reagenssystem ifølge ethvert af kravene 9-14, kendetegnet ved, at testprøven er blod, og antistofreagenset er et monoklonalt antistof eller et fragment 5 deraf, der omfatter et antistof-kombinerende sted, som bindes · specifikt til den glycosylerede N-terminale peptidsekvens i beta-underenheden af humant hæmoglobin. 10 15 20 25 30 35