KR20210068048A - 당화 헤모글로빈(％)의 측정 방법 - Google Patents

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오사무 미야자키
사토코 세오
미츠아키 야마모토
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세키스이 메디칼 가부시키가이샤
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Abstract

헤모글로빈을 포함하는 혈액 검체에 HbC나 HbS 등의 이상 헤모글로빈이 포함되어 있는 경우라도, 혈액 중의 당화 헤모글로빈(％)을 정확하게 측정할 수 있는, 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법 및 측정 시약의 제공을 과제로 한다. 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체와, 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 대한 모노클로날 항체의 2종류의 모노클로날 항체를 조합함으로써, 이상 헤모글로빈을 포함하는 검체라도 혈액 중의 당화 헤모글로빈(％)을 정확하게 측정할 수 있는 방법 및 해당 방법을 실시하기 위한 측정 시약을 제공한다.

Description

당화 헤모글로빈(％)의 측정 방법
본 발명은, 면역 반응을 이용한 당화 헤모글로빈(％)의 측정 방법 및 측정 시약에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 복수의 모노클로날 항체를 사용하는 당화 헤모글로빈(％)의 측정 방법 및 측정 시약에 관한 것이다.
헤모글로빈 A1c(이하, 단순히 HbA1c라고 나타내는 경우가 있음)는, 2개의 α쇄와 2개의 β쇄를 포함하여 헤테로 사량체 구조를 갖는 헤모글로빈의 β쇄 N말단의 아미노산 잔기의 α-아미노기에 글루코오스가 비효소적으로 결합한 당화 헤모글로빈이다. 이 HbA1c의 혈중 비율은 당뇨병의 비교적 장기의 혈당 컨트롤 상태를 반영하는 것이 알려져 있고, HbA1c를 측정하는 것은 혈당 컨트롤 상태를 아는 데 있어서 임상적으로 매우 의미가 있다. HbA1c의 면역학적인 측정 방법으로서는 다음과 같은 기술이 알려져 있다.
특허문헌 1에는, 미감작의 라텍스와 HbA1c를 포함하는 시료를 반응시키고, 이어서, 항HbA1c 항체를 반응시켜, HbA1c가 흡착한 라텍스의 항HbA1c 항체를 통한 응집을 측정하는 HbA1c(％)의 측정 방법이 개시되어 있다. 이 측정 방법에서는 모노클로날 항체는, HbA1c에 대한 항체 1종류밖에 사용되어 있지 않다.
특허문헌 2에는, 시료 중의 HbA1c를, 라텍스 등의 불용성 담체 입자에 흡착시켜, 항HbA1c 모노클로날 항체(제1 항체)와 반응시킨 후에, 해당 모노클로날 항체에 선택적으로 결합하는 제2 항체를 더 반응시켜, 불용성 담체 입자를 선택적으로 응집시키는 응집 면역 검정법이 개시되어 있다. 이 검정법에서는, 항체를 2종류 사용하고 있지만, 모노클로날 항체는 제1 항체의 항HbA1c 모노클로날 항체뿐이고, 제2 항체는 항HbA1c 모노클로날 항체에 결합하는 폴리클로날 항체이며 모노클로날 항체는 아니다.
또한, 종래의 제품으로서는, 라텍스를 포함하는 제1 시약과, 항인간 HbA1c 모노클로날 항체 및 항마우스 IgG 항체의 결합물을 포함하는 제2 시약을 포함하는 HbA1c(％) 측정 시약이 알려져 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 본 측정 시약에 의하면, 혈액 중의 HbA1c가 라텍스에 흡착하고, 라텍스에 흡착되어 있는 HbA1c에 상기 항체의 결합물이 면역 반응하고, 이때 발생하는 라텍스의 응집을 탁도로서 구하고 있다.
그런데, 정상의 헤모글로빈은 전술한 바와 같이, 2개의 α쇄와 2개의 β쇄를 포함하는 헤테로 사량체이지만, 일부의 아프리카인이나 미국 흑인의 혈액에는, β쇄의 일부가 변이된 이상 헤모글로빈이 존재하는 것이 알려져 있다. 구체적으로는 헤모글로빈(Hb)의 β쇄의 N말단으로부터 6번째의 Glu가 Val로 변이된 HbS나, 동일하게 6번째의 Glu가 Lys로 변이된 HbC 등이다. 그러한 변이된 배열을 갖는 이상 헤모글로빈을 유지하는 HbS 증상, HbC 증상을 갖는 자는 일본인으로는 매우 적지만 일정한 비율로 역시 존재한다. 그리고, 이러한 이상 헤모글로빈 증상의 환자 혈액을 종래의 HbA1c 측정 방법으로 측정한바, HbA1c(％)의 측정값(엄밀하게는 당화 HbS, 당화 HbC 등의 당화 헤모글로빈(％)의 측정값)이 HPLC법에 비해 고가화되어, 정확한 측정을 할 수 없는 것이 판명되었다(후기 실시예 중의 비교예 2 참조).
특허문헌 3에는, 시료 중의 모든 당화 헤모글로빈을, 당화 헤모글로빈의 형태에 관계없이 검출하는 것, 즉, 당화 인간 헤모글로빈 A, 당화 인간 헤모글로빈 S, 당화 인간 헤모글로빈 C를 검출하는 것을 목적으로 하여, 엔도펩티다아제 처리된 인간 헤모글로빈 함유 시료를 프롤린 특이적 엔도펩티다아제로 소화하고, 얻어지는 당화 펜타 펩티드의 레벨을 정량화함으로써, 시료 중에 존재하는 당화 헤모글로빈을 검출하는 방법이 기재되어 있다. 프롤린 특이적 엔도펩티다아제에 의한, 헤모글로빈 A, 헤모글로빈 S 및 헤모글로빈 C를 함유하는 시료의 소화는, 헤모글로빈 A, 헤모글로빈 S 및 헤모글로빈 C 각각의 경우에서 동일한 당화 펜타 펩티드를 발생시키는 것을 이용한 것이다.
상기 당화 펜타펩티드의 정량은, 마우스 모노크로날 항HbA1c 항체를 사용한 응집 저해 측정법에 의해 행해진다. 그러나, 본 방법에서는 2종류의 펩티다아제 처리 공정이 필요해, 조작이 번잡하다.
일본 특허 공개 평6-66795호 공보 일본 특허 공개 평6-167495호 공보 일본 특허 공표 제2011-503632
라피디아(등록 상표) 오토 HbA1c 첨부 문서 데타미나(등록 상표) LHbA1c 첨부 문서
본 발명은, 헤모글로빈을 포함하는 혈액 검체에 HbS나 HbC 등의 이상 헤모글로빈이 포함되어 있는 경우라도, 그 영향을 받지 않고, 혈중의 당화 헤모글로빈(％)을 정확하게 측정할 수 있는 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법 및 측정 시약의 제공을 과제로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해, 예의 검토한 결과, 항HbA1c 모노클로날 항체와, 항HbA1c 모노클로날 항체에 대한 모노클로날 항체를 조합함으로써, 이상 헤모글로빈 검체라도 혈액 중의 당화 헤모글로빈(％)을 정확하게 측정할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하는 데 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.
(1) 시료 중의 당화 헤모글로빈(％)을 측정하는 방법이며,
불용성 담체와 시료를 접촉시킴으로써 시료 중의 당화 헤모글로빈을 불용성 담체에 흡착시키는 공정과,
불용성 담체에 흡착한 당화 헤모글로빈과 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체를 접촉시킴으로써 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체, 당화 헤모글로빈 및 불용성 담체의 복합체를 형성하는 공정과,
당해 복합체와 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체를 접촉시킴으로써 불용성 담체를 응집시키는 공정
을 포함하는 상기 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법.
(2) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체가, 인간 IgG와는 반응하지 않는 항체인 (1)에 기재된 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법.
(3) 불용성 담체가 라텍스인 (1) 또는 (2)에 기재된 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법.
(4) 시료가 전혈 또는 혈구인 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법.
(5) 응집 정도를 광학적으로 검출하는 공정을 포함하는 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 측정 방법.
(6) 적어도 이하의 2종의 모노클로날 항체를 포함하는 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약.
1) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체
2) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체
(7) 불용성 담체를 더 포함하는 (6)에 기재된 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약.
(8) 제1 시약과 제2 시약을 포함하는 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약이며,
제1 시약은 불용성 담체를 포함하고, 제2 시약은 적어도 이하의 2종의 모노클로날 항체를 포함하는 (7)에 기재된 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약.
1) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체
2) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체
(9) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체가, 인간 IgG와는 반응하지 않는 항체인 (6) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 측정 시약.
(10) 불용성 담체가 라텍스인 (6) 내지 (9) 중 어느 한 항에 기재된 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약.
(11) (6) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약을 포함하는 당화 헤모글로빈(％) 측정 키트.
(12) 인간 당화 헤모글로빈에 결합되어 있는 모노클로날 항체와 반응하고, 또한 인간 IgG에 반응하지 않는 모노클로날 항체.
(13) 이상 헤모글로빈을 포함하는 시료 중의 당화 헤모글로빈(％) 측정값의 괴리 저감 방법이며, 적어도 이하의 2종의 모노클로날 항체, 불용성 담체 및 시료를 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 괴리 저감 방법.
1) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체
2) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체
(14) 이상 헤모글로빈을 포함하는 시료 중의 당화 헤모글로빈(％) 측정값의 고가화 억제 방법이며, 적어도 이하의 2종의 모노클로날 항체, 불용성 담체 및 시료를 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 고가화 억제 방법.
1) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체
2) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체
본 발명에 따르면, 혈액 검체가 정상의 헤모글로빈뿐만 아니라, HbS나 HbC 등의 이상의 헤모글로빈을 포함하는 경우라도, 정확한 당화 헤모글로빈(％)의 면역 측정이 가능하다. 또한, 본 발명에 따르면, 이상 헤모글로빈 검체를 특별히 선별하지 않고 모두 마찬가지로 측정할 수 있는 점에서 자동 연속 측정에 적합한 시약을 제공하는 것이 가능하다.
(항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체)
본 발명의 모노클로날 항체에는, 적어도 제1 모노클로날 항체와 제2 모노클로날 항체가 있고, 당화 헤모글로빈(％)의 측정 시에는 이것들을 조합하여 사용한다. 제1 모노클로날 항체는, 인간의 당화 헤모글로빈과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체라면 어느 모노클로날 항체여도 된다. 인간의 당화 헤모글로빈과 특이적으로 반응한다는 것은, 인간 당화 헤모글로빈에는 반응하지만, 당화되어 있지 않은 인간 헤모글로빈에는 실질적으로 반응하지 않는 것을 말한다.
본 발명의 제1 모노클로날 항체는, HbA1c 등의 당화 헤모글로빈에 특이적인 β쇄 N말단 영역을 인식하는 모노클로날 항체이지만, 이 β쇄 N말단 영역은 헤모글로빈의 고차 구조 중에 매몰되어 존재하기 때문에, 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체로 당화 헤모글로빈을 면역 측정하기 위해서는 검체의 변성 처리가 통상 필요해진다. 그러나, 라텍스 등의 불용성 담체에 당화 헤모글로빈을 흡착시키는 것에 의해 당화 헤모글로빈의 구조가 변화됨으로써, 당화 헤모글로빈의 β쇄 N말단 영역이 노출되어, 항당화 헤모글로빈 항체에 의한 면역 측정이 가능해진다고 여겨지고 있다.
(항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 대한 모노클로날 항체)
본 발명의 제2 모노클로날 항체는, 적어도 이하의 1)의 성질을 갖는 모노클로날 항체라면 어느 모노클로날 항체여도 된다. 바람직하게는 또한 2)의 성질을 갖는 모노클로날 항체이다.
1) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응한다
2) 인간 IgG에 반응하지 않는다
본 발명의 제1 모노클로날 항체와 제2 모노클로날 항체를 조합한 당화 헤모글로빈(％)의 측정 방법은, 시료 중에 정상 헤모글로빈의 변이체인 HbS나 HbC 등의 이상 헤모글로빈 검체라도 이들 변이에 의한 영향을 받기 어려운 당화 헤모글로빈(％)의 측정 방법이다. 본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 대상에는, 이러한 이상의 헤모글로빈이 당화된 당화 HbS, 당화 HbC와 정상의 당화 헤모글로빈(HbA1c) 모두 포함된다. 즉, 어느 당화 헤모글로빈을 포함하는 검체라도, 정확한 당화 헤모글로빈(％) 측정값이 얻어진다.
종래와 같은, 제2 항체로서 IgG 등의 폴리클로날 항체를 사용한 면역 응집법에서는, 이상 헤모글로빈이 존재하면 당화 헤모글로빈(％)의 측정값이 고가화되어 정상값으로부터 괴리된다는 문제가 있었다. 그러나, 본 발명의 측정 방법과 같이, 제2 항체를, 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 대한 모노클로날 항체로 함으로써, 이유는 명확하지는 않지만, 시료 중에 이상 헤모글로빈이 존재해도 정확하게 당화 헤모글로빈(％)을 측정하는 것이 가능하게 되었다.
본 명세서 중, 제1 모노클로날 항체와 제2 모노클로날 항체는, 각각의 항원과 반응시키는 공정이 순차 행해지는 경우는, 제1 모노클로날 항체는 1차 항체, 제2 모노클로날 항체는 2차 항체라고 칭하는 경우가 있다.
또한, 모노클로날 항체와 항원의 반응성에 대하여, 「반응한다」, 「인식한다」, 「결합한다」는, 동의의 의미로 사용된다.
본 발명의 항체와, 어느 화합물이 「반응하지 않는다」란, 어느 화합물과 실질적으로 반응하지 않는 것을 말하고, 예를 들어 후술하는 실시예에서는, 항원 고상화 ELISA의 플레이트 리더에 의한 측정으로 0.1Abs 미만을 말한다.
제1 모노클로날 항체를 취득하기 위한 항원은, 당화 헤모글로빈이면 되고, 전형적으로는 HbA1c가 바람직하게 사용되고, HbA1c는, HbA1c 전체여도 되고, 그 일부여도 된다. 후술하는 실시예에서는, 당화 헤모글로빈으로서 HbA1c, 당화되어 있지 않은 헤모글로빈으로서 HbA0을 사용하여 본 발명의 제1 모노클로날 항체를 취득했다. 따라서, 그 경우의 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체를 특히, 항HbA1c 모노클로날 항체라고 한다.
또한, 제2 모노클로날 항체를 취득하기 위한 항원으로서 인식되는 제1 모노클로날 항체는 모노클로날 항체 전체여도 되고, 그 일부여도 된다.
본 발명의 항체는, 항원으로서 캐리어 단백에 당화 펩티드(f-VHLT, f-VHLTPEEKYYC: f는 프룩토실화를 의미함)를 결합시킨 물질(이하, 당화 펩티드 결합 단백이라고 함)을 인산 완충 생리 식염수 등의 용매에 용해하고, 이 용액을 동물에 투여하여 면역함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 캐리어 단백으로서는, 소혈청 알부민, 키홀-림펫 헤모시아닌, 난백 알부민 등을 사용해도 된다. 필요에 따라 상기 용액에 적당한 아쥬반트를 첨가한 후, 에멀션을 사용하여 면역을 행해도 된다. 아쥬반트로서는, 유중 수형 유제, 수중 유중 수형 유제, 수중 유형 유제, 리포솜, 수산화알루미늄 겔 등의 범용되는 아쥬반트 외에, 생체 성분 유래의 단백질이나 펩티드성 물질 등을 사용해도 된다. 예를 들어, 프로인트의 불완전 아쥬반트 또는 프로인트의 완전 아쥬반트 등을 적합하게 사용할 수 있다. 아쥬반트의 투여 경로, 투여량, 투여 시기는 특별히 한정되지 않지만, 항원을 면역하는 동물에 있어서 원하는 면역 응답을 증강할 수 있도록 적절히 선택하는 것이 바람직하다.
면역에 사용하는 동물의 종류도 특별히 한정되지 않지만, 포유 동물이 바람직하여, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 마우스를 사용할 수 있다. 동물의 면역은, 일반적인 방법에 따라 행하면 되고, 예를 들어 항원의 용액, 바람직하게는 아쥬반트와의 혼합물을 동물의 피하, 피내, 정맥, 또는 복강 내에 주사함으로써 면역을 행할 수 있다. 면역 응답은, 일반적으로 면역되는 동물의 종류 및 계통에 따라 상이하므로, 면역 스케줄은 사용되는 동물에 따라 적절히 설정하는 것이 바람직하다. 항원 투여는 최초의 면역 후에 여러번 반복해서 행하는 것이 바람직하다.
모노클로날 항체를 얻는 경우, 계속해서 이하의 조작이 행해지지만, 그것에 한정되지 않고, 모노클로날 항체 그 자체의 제조 방법에 대해서는, 예를 들어 Antibodies, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988))에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
최종 면역 후, 면역한 동물로부터 항체 산생 세포인 비장 세포 혹은 림프절 세포를 적출하고, 높은 증식능을 갖는 미엘로마 세포와 세포 융합시킴으로써 하이브리도마를 제작할 수 있다. 세포 융합에는 항체 산생능(질·양)이 높은 세포를 사용하는 것이 바람직하고, 또한 미엘로마 세포는 융합하는 항체 산생 세포가 유래하는 동물과 적합성이 있는 것이 바람직하다. 세포 융합은, 당해 분야에서 공지의 방법에 따라 행할 수 있지만, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜법, 센다이 바이러스를 사용한 방법, 전류를 이용하는 방법 등을 채용할 수 있다. 얻어진 하이브리도마는 공지의 방법에 따라 증식시킬 수 있고, 산생되는 항체의 성질을 확인하면서 원하는 하이브리도마를 선택할 수 있다. 하이브리도마의 클로닝은, 예를 들어 한계 희석법이나 연한천법 등의 공지된 방법에 의해 행하는 것이 가능하다.
제1 모노클로날 항체를 취득하는 방법에 대하여 설명한다.
제1 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마의 선택은, 산생되는 항체가 실제의 측정에 사용되는 조건을 고려하여, 효율적으로 행할 수 있다. 예를 들어, ELISA법, RIA법 등에 의해, HbA1c에 반응하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택함으로써 얻어진다. 구체적으로는, 먼저, 배양 상청 중의 모노클로날 항체를, 고상화한 당화 펩티드 결합 단백과 반응시키고, 이어서 고상화한 HbA0과 반응시키는 항원 고상화 ELISA법 등에 의해, HbA1c에 대하여 높은 반응성을 나타내고, 또한 HbA0과는 반응하지 않는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하는 것 등에 의해 얻을 수 있다.
이와 같이 하여 선별된 하이브리도마를 대량 배양하는 것에 의해, 원하는 특성을 갖는 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 대량 배양의 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 하이브리도마를 적당한 배지 중에서 배양하여 모노클로날 항체를 배지 중에 산생시키는 방법이나, 포유 동물의 복강 내에 하이브리도마를 주사하여 증식시켜, 복수 중에 항체를 산생시키는 방법 등을 들 수 있다. 모노클로날 항체의 정제는, 예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법 등을 적절히 조합하여 행할 수 있다.
이어서, 제2 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마의 선택은, 제1 모노클로날 항체인 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택함으로써 행해진다. 또한, 비특이적 반응을 저감시키기 위해서는, 상기 공정 후에, 또한, 인간 IgG와의 반응성이 마우스 IgG보다도 낮은 항체를 선택하는 공정을 추가하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 먼저, 배양 상청 중의 모노클로날 항체로부터, 항원 고상화 ELISA법 등에 의해, 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 비해 높은 반응성을 나타내는 하이브리도마를 선택하는 공정 및 인간 IgG와의 반응성이 마우스 IgG보다도 낮은 것을 선택하는 공정의 두 공정을 거쳐서 얻을 수 있다.
본 발명의 항체로서는, 항체 분자 전체 외에 항원 항체 반응 활성을 갖는 항체의 기능성 단편을 사용하는 것도 가능하고, 상기와 같이 동물에 대한 면역 공정을 거쳐서 얻어진 것 외에, 유전자 재조합 기술을 사용하여 얻어지는 것이나, 키메라 항체를 사용하는 것도 가능하다. 항체의 기능성 단편으로서는, 예를 들어 F(ab')2, Fab를 들 수 있고, 이들 기능성 단편은 상기와 같이 하여 얻어지는 항체를 단백질 분해 효소(예를 들어, 펩신이나 파파인 등)로 처리함으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 모노클로날 항체는, 불용성 담체 위에 고정된 고정(고상)화 항체로서 사용하거나, 후술하는 당업자에게 주지 관용의 표지 물질로 표지한 표지 항체로서 사용할 수 있다. 이러한 고정화 항체나 표지 항체는 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 불용성 담체에 모노클로날 항체를 물리적으로 흡착시키거나, 혹은 화학적으로 결합(적당한 스페이서를 통해도 됨)시킴으로써 고정화 항체를 제조할 수 있다. 불용성 담체로서는, 폴리스티렌 수지 등의 고분자 기재, 유리 등의 무기 기재, 셀룰로오스나 아가로오스 등의 다당류 기재 등을 포함하는 불용성 담체를 사용할 수 있고, 그 형상은 특별히 한정되지 않고, 판상(예를 들어, 마이크로플레이트나 멤브레인), 비즈 혹은 미립자상(예를 들어, 라텍스 입자), 통 형상(예를 들어, 시험관) 등 임의의 형상을 선택할 수 있다.
본 발명의 제2 모노클로날 항체를 결합 가능한 표지 물질로 표지하여 표지 항체로 하는 것에 의해, 시료 중의 당화 헤모글로빈(％)을 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 제2 모노클로날 항체와 결합 가능한 표지 항체, 표지 단백질 A, 또는 표지 단백질 G 등을 사용할 수도 있다. 표지 물질로서는, 예를 들어 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 비오틴, 아비딘, 또는 방사성 동위체, 금 콜로이드 입자, 착색 라텍스 등을 들 수 있다. 표지 물질과 항체의 결합법으로서는, 당업자에게 이용 가능한 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디술피드법, 또는 과요오드산법 등의 방법을 사용할 수 있지만, 고정화 항체나 표지 항체의 종류 및 그것들의 제조 방법은 상기한 예에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 퍼옥시다아제나 알칼리 포스파타아제 등의 효소를 표지 물질로서 사용하는 경우에는 그 효소의 특이적 기질(효소가 서양 고추냉이 퍼옥시다아제인 경우에는, 예를 들어 O-페닐렌디아민 혹은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, ALP의 경우에는, p-니트로페닐·포스페이트 등)을 사용하여 효소 활성을 측정할 수 있고, 비오틴을 표지 물질로서 사용하는 경우에는 적어도 아비딘 혹은 효소 수식 아비딘을 반응시키는 것이 일반적이다.
본 명세서에 있어서, 「불용성 담체」를 「고상」, 항원이나 항체를 불용성 담체에 물리적 혹은 화학적으로 담지시키는 것 혹은 담지시킨 상태를 「고정」, 「고정화」, 「고상화」, 「감작」, 「흡착」, 「결합」이라고 표현하는 경우가 있다. 또한, 「검출」또는 「측정」이라는 용어는, 당화 헤모글로빈의 존재의 증명 및/또는 정량 등을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 항체를 사용하는 측정 방법에 있어서의 검출 대상의 「시료」로서는, 당화 헤모글로빈을 포함할 수 있는 시료라면 어느 것이어도 되고, 주로 생체(생물) 유래의 체액을 들 수 있다. 구체적으로는, 혈구 또는 전혈이다. 이들 시료는 그대로 사용되는 경우도 있지만, 검체 희석액으로 희석되거나, 기타의 전처리가 실시되고 나서 사용되는 경우도 있다.
본 발명에 의해 제공되는 측정용 시약의 양태로서는, 당화 헤모글로빈(％)의 측정을 할 수 있는 시약이라면, 특별히 한정되는 것은 아니다. 이하, 대표적인 입자 응집 면역 검정법인 라텍스 면역 응집법(이하, LTIA법이라고 함)을 예로 들어 각각을 설명한다.
<입자 응집 면역 검정법: (LTIA법)>
시료 중에 존재하는 당화 헤모글로빈(％)을 검출하기 위한 측정용 시약은 각각 적어도 이하의 요소:
(a) 제1 모노클로날 항체
(b) 제2 모노클로날 항체
(c) 불용성 담체 입자
가 필요해진다.
본 측정용 시약은 LTIA법에 적합하게 사용할 수 있다. 사용되는 라텍스 입자는, 감도 향상 등의 원하는 성능을 얻기 위해, 입경이나 종류를 적절히 선택할 수 있다. 라텍스 입자로서는, 항원인 HbA1c의 흡착·결합에 적합한 것이면 된다. 예를 들어, 폴리스티렌, 스티렌-술폰산(염) 공중합체, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 아크릴니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산에스테르 공중합체, 아세트산비닐-아크릴산에스테르 공중합체 등을 들 수 있다. 라텍스 입자의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 그 평균 입자경은, 라텍스 입자 표면의 HbA1c와 항체의 면역 반응 및 항체끼리의 응집 반응의 결과 발생하는 응집체가, 육안 또는 광학적으로 검출할 수 있는 데 충분한 크기를 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 평균 입자경으로서는 0.02 내지 1.6㎛이고, 특히 0.03 내지 0.5㎛가 바람직하다. 또한, 금속 콜로이드, 젤라틴, 리포솜, 마이크로 캡슐, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹스 또는 자성체 등의 재질을 포함하는 입자를 라텍스 입자 대신에 사용할 수도 있다. 이들 입자는 형광 물질을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 불용성 담체는 미감작의 것이 바람직하다. 본 발명의 라텍스 입자를 포함하는 시약은, 적절히 완충 성분(완충액)을 포함한다.
본 발명에 사용할 수 있는 완충액으로서는, 일반적으로 사용되는 것이면 되고, 예를 들어 트리스염산, 붕산, 인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 프탈산, 글루타르산, 말레산, 글리신 및 그것들의 염 등이나, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES 등의 굿 완충액 등을 들 수 있다.
본 발명의 시약은 2시약(2스텝법)이 바람직하고 3시약(3스텝법)으로 할 수도 있다. 2시약의 경우는, 불용성 담체를 포함하는 제1 시약과 2종류의 모노클로날 항체를 포함하는 제2 시약으로 나누는 것이 바람직하다. 또한, (a), (b), (c)를 각각 별도의 시약 구성으로 하는 3시약계(3스텝법)로 구성할 수도 있다.
라텍스의 응집의 측정은, 발생한 응집의 정도를 광학적 혹은 전기 화학적으로 관찰하는 것에 의해 당화 헤모글로빈(％)을 측정할 수 있다. 광학적으로 관찰하는 방법으로서는, 산란광 강도, 흡광도, 또는 투과광 강도를 광학 기기로 측정하는 방법(엔드 포인트법, 레이트법 등)을 들 수 있다.
시료를 측정하여 얻은 흡광도 등의 측정값을, 표준 물질(당화 헤모글로빈(％)이 기지의 시료)을 측정하여 얻은 흡광도 등의 측정값과 비교하여, 시료 중에 포함되어 있던 측정 대상 물질의 농도(정량값)를 산출한다. 또한, 투과광 또는 산란광 등의 흡광도 등의 측정은, 1파장 측정이어도 되고, 또는 2파장 측정(2개의 파장에 의한 차 또는 비)이어도 된다. 측정 파장은, 400㎚ 내지 800㎚ 중으로부터 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 시료 중의 측정 대상 물질의 측정은, 용수법에 의해 행해도 되고, 또는 측정 장치 등의 장치를 사용하여 행해도 된다. 측정 장치는, 범용 자동 분석 장치여도 되고, 전용의 측정 장치(전용기)여도 된다. 전용의 측정 장치로서, 미소 유로(마이크로 유로)를 이용하여 시료와 시약을 혼합하고, 반응시켜 검출을 행하는 이하와 같은 검사용 디바이스 장치여도 된다. 구체적으로는, 수평한 회전축 주위로 회전 조작되는 반응 카세트를 채용하고, 이 반응 카세트는, 미소 유로와, 미소 유로와 연통하여 액체 시료를 미소 유로에 도입하는 주입 구멍을 구비하고 있고, 간이하게 희석액을 도입할 수 있는 수단을 구비하고 있다. 당해 반응 유로는, 분석 시약을 내장한 시약 영역과, 액체 시료를 분석 시약에 접촉시키고, 또한 액체 시료가 분석 시약과 함께 교반됨으로써, 소정의 반응을 촉진하는 것이 충분히 행해지도록, 미소 유로를 따라 액체 시료의 중력에 의한 흐름을 어지럽히는 수단을 구비하고 있다. 이렇게 구성된 반응 카세트가, 회전 및 진동됨으로써, 액체 시료를 미소 유로를 통해 유동시켜 분석 시약에 접촉시키고, 또한 액체 시료가 분석 시약과 함께 교반됨으로써, 소정의 반응을 촉진하여, 액체 시료 중의 검출 가능한 반응을 측정한다는 구조의 장치이다.
또한, 본 발명의 측정은, 2스텝법(2시약법) 등의 복수의 조작 스텝에 의해 행하는 방법에 의해 실시하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따르면, 혈액 검체가 정상의 헤모글로빈뿐만 아니라, 변이체인 HbS나 HbC 등의 이상의 헤모글로빈을 포함하는 경우라도, 정확한 당화 헤모글로빈(％)의 면역 측정이 가능하게 되었다. 따라서, 본 발명의 측정 방법은, 이상 헤모글로빈을 포함하는 시료 중의 당화 헤모글로빈(％) 측정값의 괴리 저감 방법이고, 또한 이상 헤모글로빈을 포함하는 시료 중의 당화 헤모글로빈(％) 측정값의 고가화 억제 방법이기도 하다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 측정 시약을 복수로 나누어 당화 헤모글로빈(％) 측정 키트로 할 수도 있다. 또는, 다른 구성과 함께 당화 헤모글로빈(％) 측정 키트로 할 수도 있다. 또한, 당해 기타의 구성으로서는, 이외에 검출에 필요한 시약, 검체의 희석액, 검체 채취용의 용구, 또는 취급 설명서 등을 들 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예] 본 발명 측정 시약의 제조
1. 제1 모노클로날 항체의 취득
본 발명의 제1 모노클로날 항체로서, 항HbA1c 모노클로날 항체를 이하와 같이 제조했다.
(1) 정제 HbA0 및 정제 HbA1c의 조제
HbA0 및 HbA1c는, 비특허문헌(Melisenda J.McDonald et al, JBC, 253(7), 2327-2332, 1978)에 기재된 Bio-Rex70(바이오래드사)을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 인간 적혈구 용혈액으로부터 정제하고, 이후의 실험에 사용했다.
(2) 각종 펩티드 및 당화 펩티드의 조제
2종류의 아미노 배열의 펩티드(VHLTC(서열 번호 1) 및 VHLTPEEKYYC(서열 번호 2): 알파벳은 아미노산의 일 문자 표기를 나타냄)는, 펩티드 자동 합성 장치를 사용하여 Fmoc법에 의해 합성 및 정제했다. 각 펩티드의 순도는, HPLC에 의해 95％ 이상인 것을 확인했다. 또한, 각 펩티드의 분자량은, 질량 분석(MALDI-TOF법)에 의해 이론값과 동일한 것을 확인했다.
상기 2종류의 펩티드를 일본 특허 공개 소61-172064에 기재된 방법으로 당화하고, 당화 펩티드(f-VHLTC 및 f-VHLTPEEKYYC: f는 프룩토실화를 의미함)를 정제했다. 즉, 각 배열의 펩티드 각각과 글루코오스를 무수 피리딘 중에서 반응시켜 당화 펩티드를 합성하고, HPLC로 정제했다. 각 당화 펩티드의 분자량은, 질량 분석(MALDI-TOF법)에 의해 이론값, 즉 각 펩티드의 분자량에 162를 가산한 분자량과 동일한 것을 확인했다.
(3) 제1 모노클로날 항체의 취득
제1 모노클로날 항체인 항HbA1c 모노클로날 항체는, 이하와 같이 제조했다. 먼저, 상기 (2)에서 합성한 당화 펩티드(f-VHLTPEEKYYC)를 키홀-림펫 헤모시아닌에 결합시키고, 이것을 면역원으로 하여 마우스에 면역했다. 하이브리도마의 스크리닝에서는, 항원 고상화 ELISA로 당화 펩티드 결합 단백과 반응하고, 또한 정제 HbA0과 반응하지 않는 주를 6주 선택했다. 클로닝을 거쳐서, 최종적으로 항원 고상화 ELISA로 정제 HbA1c와 반응하고, 또한 정제 HbA0과 반응하지 않는 모노클로날 항체(항체 68207, 68208, 68210, 68211, 68213, 68214)를 얻었다.
2. 제2 모노클로날 항체의 취득
본 발명의 제2 모노클로날 항체로서, 항HbA1c 모노클로날 항체에 대한 모노클로날 항체를 이하와 같이 제조했다.
(1) 면역
상기 1.에서 얻어진 3종의 다른 마우스 항HbA1c 모노클로날 항체(68210, 68211, 68213: 세키스이 메디컬사제)를 면역원으로 하고, 래트를 숙주로 하여, 통상적인 방법으로 면역했다. 최종 면역은 세포 융합의 3 내지 4일 전에 행하고, 비장 세포 및 림프절 세포를 회수하고, 전기 융합법 또는 PEG법으로 미엘로마 세포(SP2/O)와 융합했다. 융합 세포는 96웰 플레이트로 배양하고, 세포 융합으로부터 7 내지 8일 후에 배양 상청을 회수하여 하기에 나타내는 스크리닝을 행하였다.
(2) 스크리닝
하이브리도마의 스크리닝에서는, 항원 고상화 ELISA로, 마우스 IgG와 반응하고, 또한 인간 IgG와 반응하지 않는 주를 선택했다.
(2-1) 항원 고상화 ELISA
(i) ELISA용 96웰 플레이트에 고상화 항원으로서 PBS로 1㎍/mL에 희석한 마우스 항HbA1c 모노클로날 항체(68208, 혹은 68214) 또는 인간 IgG를 50μL/well씩 분주하고, 실온에서 2시간 정치했다.
(ii) 0.05％ Tween20-PBS(PBST)(400μL/well)로 3회 세정 후, 블로킹액으로서 1％ BSA-PBST(100μL/well)를 분주하고, 실온에서 1시간 정치했다.
(iii) 블로킹액을 제거 후, 2배 희석한 배양 상청을 50μL/well씩 분주하고, 실온에서 1시간 정치했다.
(iv) 3회 세정 후, 10000배 희석한 HRP 표지 염소 항래트 폴리클로날 항체를 50μL/well씩 분주하고, 실온에서 1시간 정치했다.
(v) 3회 세정 후, OPD 발색액을 50μL/well씩 분주하고, 실온에서 10분간 정치했다.
(vi) 정지액을 50μL/well씩 분주하고, 반응 정지 후 플레이트 리더로 흡광도를 측정했다(Abs. 492㎚).
(2-2) 결과
총 13주(S07201R 내지 S072013R)의 하이브리도마를 취득했다(표 1).
Figure pct00001
(3) 획득 항체의 반응성의 확인
스크리닝으로 선택한 하이브리도마를 한계 희석법으로 단클론화하고, 통상적인 방법에 의해 마우스 복강에 투여하여, 복수를 얻었다. 얻어진 복수로부터 항체를 정제하고, 항원 고상화 ELISA로 반응성을 확인했다.
(3-1) 항원 고상화 ELISA
고상화 항원으로서 68210, 68213을 사용한 것 이외는, (2) 스크리닝과 동일한 방법으로 행하였다.
(3-2) 결과
얻어진 13종의 항체는, 어느 고상화 항원에 대해서도 인간 IgG보다 마우스 IgG(항마우스 IgG 모노클로날 항체)에 대하여 강한 반응성을 나타냈다.
Figure pct00002
3. 면역학적 측정 방법
(1) 실시예 처방
(i) 제1 시약의 조성을 이하에 나타낸다.
10mM EPPS(pH8.0)
라텍스 입자(평균 입경 약 120㎚)
(ii) 제2 시약의 조성을 이하에 나타낸다.
10mM Bis-Tris(pH6.0)
1차 항체(0.1㎎/mL 마우스 항HbA1c 모노클로날 항체)(표 3)
2차 항체(0.1㎎/mL 래트 항마우스 IgG 모노클로날 항체)(표 3)
500mM NaCl
0.05％ Tween-20
0.09％ 아지드화나트륨
Figure pct00003
(2) 측정 방법
측정에는, 히타치 7170형 자동 분석 장치를 사용했다. 검체 6.3μL와 제1 시약 150μL를 반응 셀에 첨가하여, 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 또한 제2 시약 50μL를 반응 셀에 첨가하여, 37℃에서 5분간 반응시키고, 2포인트 엔드법(측광 포인트 19-34), 주파장 660㎚, 부파장 800㎚로 흡광도 변화량을 측정했다. 검량선은 표준품으로서 교와 메덱스사제 데타미나 캘리브레이터 HbA1c 액상 시약용을, 메이커 지정의 방법으로 조정하여 제작했다.
(3) 비교예
(i) 비교예 1: HPLC법(아크레이사제 아담스 HA-8180T)
메이커에 의해 지정된 방법으로 사용하여, 각종 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정을 행하였다.
(ii) 비교예 2: 2차 항체로서 폴리클로날 항체를 사용한 LTIA법(1)(교와 메덱스사제 데타미나 L HbA1c)
교와 메덱스사제의 데타미나 L HbA1c를 메이커에 의해 지정된 방법으로 사용하여, 각종 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정을 행하였다. 측정 시, 장치는 히타치 7170형 자동 분석 장치를 사용했다.
(4) 참고예: 2차 항체로서 폴리클로날 항체를 사용한 LTIA법(2)(세키스이 메디컬사제)
실시예 2에 나타낸 제1 시약 및 1차 항체로서 68210을 0.06㎎/mL, 2차 항체로서 염소 항마우스 IgG 폴리클로날 항체(Fc 특이적 항체: 단바쿠 세세 고교사제) 0.05㎎/mL를 첨가한 것 이외는 실시예 2와 동일한 조성인 제2 시약을 사용하여, 각종 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정을 행하였다. 측정 시, 장치는 히타치 7170형 자동 분석 장치를 사용했다.
[시험예 1] 혈구 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
(1) 정상 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
기성품인 비교예 2(교와 메덱스사제 데타미나 L HbA1c)에 대하여, 참고예 및 실시예 1 내지 17에 있어서 정상 검체의 당화 헤모글로빈(％)을 고정밀도로 측정할 수 있는 것을 확인했다.
EDTA 체혈관에서 채혈된 임의의 정상 혈액 검체(동의를 얻은 지원자로부터 입수)를, 800G로 5분간 원심 분리하고, 얻어진 하층의 혈구층을 정제수로 100배 희석한 것의 당화 헤모글로빈(％)을 측정했다. 50검체 측정했을 때의, 각 시약의 데타미나 L HbA1c에 대한 상관식 및 상관 계수를 표 4에 나타낸다.
모두 상관 계수는 양호하고, 참고예, 실시예 1 내지 17에 있어서, 정상 검체에 대하여 고정밀도로 당화 헤모글로빈(％)을 측정할 수 있는 것이 나타났다.
Figure pct00004
(2) 각 이상 Hb 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
시판되고 있는 이상 Hb 검체(비즈컴 재팬으로부터 구입)에 대하여 당화 헤모글로빈(％)을 측정했다. 이것들은 혈구 검체이고, 채혈 후, 원심 분리에 의해 혈구층을 분리한 후, －70℃ 이하에서 동결 보존된 것이다.
(2-1) HbS 함유 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
비교예 1에 나타낸 HPLC법인 아크레이사제 아담스 HA-8180T는, 베리언트 모드(Variant mode)로, 혈구 및 전혈 검체에 대하여, 이상 Hb인 HbS와 HbC를 검출할 수 있다. 사용한 HbS를 함유하는 혈구 검체의 HbS(％)는 33.2％였다.
상기한 HbS를 함유하는 검체의 당화 헤모글로빈(％)을 HPLC법으로 측정한바, 6.2％였다. 또한, 상기한 HbS를 함유하는 검체를 실시예 1 내지 10, 비교예 2, 참고예의 시약으로 측정한 당화 헤모글로빈(％)과, HPLC법으로 측정했을 때의 당화 헤모글로빈(％)의 차(당화 헤모글로빈(％))를 표 5에 나타낸다.
2차 항체로서 폴리클로날 항체를 사용하고 있는 비교예 2에서는, 측정값은 6.9％로 되고, HPLC법에 대하여 0.7％나 고가화되었다. 또한, 2차 항체로서 폴리클로날 항체를 조합한 참고예에 있어서도, 측정값은 6.7％로 되어, HPLC법에 대하여 0.5％의 고가화가 인정되었다.
한편, 2차 항체로서 본 발명의 모노클로날 항체를 조합한 실시예 1 내지 10에 있어서는, 측정값은 5.9％ 내지 6.4％로 되고, HPLC법과의 차이는 －0.2％ 내지 0.2％였다. 변이 Hb인 HbS를 포함하는 혈구 검체에 있어서, 2차 항체로서 모노클로날 항체를 사용한 경우에, 측정 정밀도가 향상되었다고 할 수 있다.
Figure pct00005
(2-2) HbC 함유 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
사용한 HbC를 함유하는 혈구 검체의 HbC(％)를 HPLC법으로 측정한바, 31.8％ 내지 40.9％였다.
상기한 HbC를 함유하는 검체의 당화 헤모글로빈(％)을 HPLC법으로 측정한바, 4.8 내지 5.9％였다. 또한, 상기한 HbC를 함유하는 검체를 비교예 2, 참고예, 실시예 1의 시약으로 측정한 당화 헤모글로빈(％)과, HPLC법으로 측정했을 때의 당화 헤모글로빈(％)의 차(당화 헤모글로빈(％))를 표 6에 나타낸다.
상기한 검체를, 2차 항체로서 폴리클로날 항체를 사용하고 있는 비교예 2에서 측정한바, HPLC법에 대한 차는 0.9 내지 3.1％로 높고, 비교예 2의 시약으로는 HbC를 함유하는 혈구 검체의 당화 헤모글로빈(％)을 정확하게 측정할 수는 없었다. 참고예에 있어서는, HPLC법에 대한 차는 0.5 내지 1.7％이고, 비교예 2보다 정확하게 당화 헤모글로빈(％)을 측정할 수 있었다.
또한, 2차 항체로서 본원 발명의 모노클로날 항체를 조합한 실시예 1에 있어서는, HPLC법에 대한 차는 －0.4 내지 －0.2％이고, HbC를 함유하는 혈구 검체에 있어서도 당화 헤모글로빈(％)을 높은 정밀도로 측정할 수 있었다.
Figure pct00006
또한, 검체 번호 HbC-1에 대하여, 실시예 8 내지 17의 시약으로 측정한 결과를 표 7에 나타낸다. 비교예 1 내지 2, 참고예, 실시예 1의 측정 결과는, 표 6과 동일하다. HbC-1의 당화 헤모글로빈(％)은, 비교예 1의 HPLC법으로 측정한 경우, 5.8％였다. 이 검체를, 2차 항체로서 폴리클로날 항체를 사용하고 있는 비교예 2에서 측정한바, HPLC법에 대한 측정값의 차는 0.9％로 참고예나 본 발명의 방법과 비교하여 높고, 비교예 2의 시약에서는 HbC를 함유하는 검체의 당화 헤모글로빈(％)을 정확하게 측정할 수는 없었다. 참고예에 있어서는, HPLC법에 대한 측정값의 차는 0.5％이고, 비교예 2보다도 정확하게 측정할 수 있었다. 또한, 2차 항체로서 본원 발명의 모노클로날 항체를 조합한 실시예 8 내지 17에 있어서는, HPLC법에 대한 측정값의 차는 －0.1 내지 0.3％이고, HbC를 함유하는 검체에 있어서도 당화 헤모글로빈(％)을 높은 정밀도로 측정할 수 있었다.
Figure pct00007
[시험예 2] 전혈 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
(1) 정상 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
기성품인 비교예 2(교와 메덱스사제 데타미나 L HbA1c)의 혈구 검체의 당화 헤모글로빈의 측정값에 대하여, 비교예 3 및 실시예 3, 4, 8, 9, 11-13, 15에 있어서 전혈의 정상 검체에 대하여 고정밀도로 당화 헤모글로빈(％)을 측정할 수 있는 것을 확인했다.
시험예 1 (1) 정상 검체의 측정에서 사용한, EDTA 체혈관에서 채혈된 임의의 정상 혈액 검체의 당화 헤모글로빈(％)을 측정했다. 각 검체는, 원심 분리하지 않고 전혈 상태 그대로 사용하고, 정제수로 50배 희석하여 조제했다. 50검체 측정했을 때의 각 시약의 전혈 검체의 측정 결과에 대하여, 데타미나 L HbA1c로 혈구 검체를 측정했을 때의 측정값에 대한 상관 계수를 표 8에 나타낸다. 비교예 2의 시약에서는, 다른 시약을 사용한 경우와 비교하여 상관 계수가 가장 낮고, 전혈 검체에 대하여 고정밀도로 당화 헤모글로빈(％)을 측정할 수 없었다. 한편, 참고예, 실시예 3, 4, 8, 9, 11-13, 15에 있어서는, 모두 상관 계수는 양호하고, 전혈의 정상 검체에 대하여 고정밀도로 당화 헤모글로빈(％)을 측정할 수 있는 것이 나타났다.
Figure pct00008
(2) 각 이상 Hb 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
시판되고 있는 이상 Hb 검체(비즈컴 재팬으로부터 구입)를 측정에 사용했다. 이것들은 전혈 검체이고, 채혈 후, －70℃ 이하에서 동결 보존된 것이다.
(2-1) HbS 함유 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
사용한 HbS를 함유하는 전혈 검체의 HbS(％) 및 당화 헤모글로빈(％)을 HPLC법으로 측정한바, 각각 28.8 내지 37.1％ 및 4.6 내지 6.5％였다.
비교예 2, 참고예, 실시예 3, 4, 11, 13, 15의 시약으로 측정했을 때의 측정값 및 HPLC법에 대한 측정값의 차 당화 헤모글로빈(％)을 표 9에 나타낸다.
비교예 2의 시약으로 측정한 경우의 함량은, HPLC법에 대하여 0.5 내지 1.4％ 고가화되어, 측정 정밀도는 불량이었다.
이어서, 참고예의 시약으로 측정한 경우의 함량은, HPLC법에 대하여 0.3 내지 0.6％ 고가화되었기는 하지만 비교예 2보다 양호했다.
이에 비해, 실시예 3, 4, 11, 13, 15의 시약으로 측정한 경우의 측정값은, HPLC법과의 차가 －0.1 내지 0.3％로 작고, 측정 정밀도는 양호했다. 또한, 2차 항체로서 본 발명의 모노클로날 항체를 사용한 경우, 2차 항체로서 폴리클로날 항체를 사용한 경우(참고예)에 비해 측정 정밀도가 더욱 향상되었다.
Figure pct00009
(2-2) HbC 함유 검체의 당화 헤모글로빈(％)의 측정
사용한 HbC를 함유하는 전혈 검체의 HbC(％) 및 당화 헤모글로빈(％)을 HPLC법으로 측정한바, 각각 34.9％ 내지 39.4％ 및 5.0 내지 5.5％였다.
비교예 2, 참고예, 실시예 3, 8, 9, 12, 13의 시약으로 측정한 경우의 측정값의 HPLC법에 대한 차(당화 헤모글로빈(％))를 표 10에 나타낸다.
먼저, 비교예 2에서 측정한 경우의 측정값은, HPLC법에 대하여 3.4 내지 4.7％로 대폭으로 고가화되었다.
이어서, 참고예에서는, HPLC법에 대하여 0.9 내지 1.1％ 고가화되었기는 하지만 비교예 2보다 양호했다.
이에 비해, 실시예 3, 8, 9, 12, 13의 시약은, HPLC법에 대한 차는 0.1 내지 0.4％로 작고, 측정 정밀도는 양호했다. 2차 항체로서 본 발명의 모노클로날 항체를 사용한 경우에, 측정 정밀도가 향상되었다고 할 수 있다.
Figure pct00010
본 발명에 따르면, 혈액 검체가 정상의 헤모글로빈을 포함하는 경우뿐만 아니라, HbS, HbC 등의 이상의 헤모글로빈을 포함하는 경우라도, 정확한 당화 헤모글로빈(％)의 면역 측정이 가능하게 되었다.

Claims (14)

  1. 시료 중의 당화 헤모글로빈(％)을 측정하는 방법이며,
    불용성 담체와 시료를 접촉시킴으로써 시료 중의 당화 헤모글로빈을 불용성 담체에 흡착시키는 공정과,
    불용성 담체에 흡착한 당화 헤모글로빈과 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체를 접촉시킴으로써 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체, 당화 헤모글로빈 및 불용성 담체의 복합체를 형성하는 공정과,
    당해 복합체와 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체를 접촉시킴으로써 불용성 담체를 응집시키는 공정
    을 포함하는 상기 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체가, 인간 IgG와는 반응하지 않는 항체인 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 불용성 담체가 라텍스인 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료가 전혈 또는 혈구인 당화 헤모글로빈(％) 측정 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 응집 정도를 광학적으로 검출하는 공정을 포함하는 측정 방법.
  6. 적어도 이하의 2종의 모노클로날 항체를 포함하는 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약.
    1) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체
    2) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체
  7. 제6항에 있어서, 불용성 담체를 더 포함하는 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약.
  8. 제7항에 있어서, 제1 시약과 제2 시약을 포함하는 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약이며,
    제1 시약은 불용성 담체를 포함하고, 제2 시약은 적어도 이하의 2종의 모노클로날 항체를 포함하는 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약.
    1) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체
    2) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체가, 인간 IgG와는 반응하지 않는 항체인 측정 시약.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 불용성 담체가 라텍스인 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 당화 헤모글로빈(％) 측정 시약을 포함하는 당화 헤모글로빈(％) 측정 키트.
  12. 인간 당화 헤모글로빈에 결합되어 있는 모노클로날 항체와 반응하고, 또한 인간 IgG에 반응하지 않는 모노클로날 항체.
  13. 이상 헤모글로빈을 포함하는 시료 중의 당화 헤모글로빈(％) 측정값의 괴리 저감 방법이며, 적어도 이하의 2종의 모노클로날 항체, 불용성 담체 및 시료를 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 괴리 저감 방법.
    1) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체
    2) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체
  14. 이상 헤모글로빈을 포함하는 시료 중의 당화 헤모글로빈(％) 측정값의 고가화 억제 방법이며, 적어도 이하의 2종의 모노클로날 항체, 불용성 담체 및 시료를 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 고가화 억제 방법.
    1) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체
    2) 항당화 헤모글로빈 모노클로날 항체에 반응하는 모노클로날 항체
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