JP2011503632A - 糖化ヘモグロビン検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
赤血球中に存在するヘモグロビンは、ヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端へのグルコース分子の非酵素的付加によって糖化されうる。ひとたびヘモグロビン分子が糖化されると、その分子は糖化されたままであり、赤血球内の糖化ヘモグロビンの蓄積が、赤血球がそのライフサイクル中に接触したグルコースの平均レベルを反映する。したがって、個人の血液中に存在する糖化ヘモグロビンのレベルは、血液中のグルコースのレベルに比例し、その個人の直前の4週〜3ヶ月の間の平均1日血中グルコース濃度の指標である。
特定の実施態様において、本発明は、糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料をエンドペプチダーゼと接触させること、エンドペプチダーゼ処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及びヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを検出することを含む方法に関する。
本発明の特定の態様は、ヘモグロビンβ鎖中に存在することができるアミノ酸配列の変異によって影響されない、ヒト血液中に存在する糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法に関する。方法は、試料中のすべての糖化ヘモグロビンを、糖化されたヘモグロビンの形態にかかわりなく検出し、したがって、糖化されたヘモグロビンA、ヘモグロビンS及びヘモグロビンCを検出する。
DCA N(正常対照、DCA(登録商標)2000アナライザ試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics)又はDCA AB(異常対照、DCA(登録商標)2000アナライザ試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics)7.5μLを、250U/mLのペプシンを含有する150μLの試料変性試薬(ADVIA(登録商標)HbA1c試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics)とともに、室温で20分間インキュベート(培養)した。0.1mol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)中の150μLのプロリン特異的エンドペプチダーゼ(30U/mL)を、ペプシン処理された試料の半分に加え、プロリン特異的エンドペプチダーゼ処理された試料を室温で30分間インキュベートした。残りのペプシン処理された試料は、プロリン特異的エンドペプチダーゼでは処理せず、0.1mol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)150μLをこれらの試料に加えた。
実施例1で使用された凝集剤(ポリアスパルトアミドにコンジュゲートしたヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチド)及びプロリン特異的エンドペプチダーゼを含有する試薬の安定な調合のためのpH7.0の条件を決定した。
様々な濃度のHbA1cを含有する凍結乾燥ヒト全血(全血HbA1cカリブレータ、Aalto Scientific)の2μL試料を、250U/mLペプシン(試料変性試薬、ADVIA(登録商標)HbA1c試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics)148μLで10分間、手動で消化させるか、0.02mmol/Lのシトレート、0.2%のTriton X100、pH2.4溶液中の約6000U/mLのペプシンで9秒間、自動的に消化させるか、0.02mmol/Lシトレート、0.2%のTriton X100、pH2.4溶液中の約6000U/mLのペプシンで10分間、自動的に消化させるかした。そして、試料を、R1が0.4U/mLプロリン特異的エンドペプチダーゼを含有する凝集試薬である実施例2に記載したように、ADIVA(登録商標)1650計器上で、凝集阻止イムノアッセイ法で評価した。以下の表2で試料ごとに異なる変性条件に関してリストする凝集速度の間変化がないことは、約6000U/mLを含有するペプシン変性剤の場合には、ヘモグロビンを消化するのに9秒で十分であることを示す。
ヘモグロビンS(HbS)又はヘモグロビンC(HbC)を含有するヒト全血試料を、実施例2で記載したように、ADIVA(登録商標)1650計器上で、凝集阻止イムノアッセイ法で試験して、試料中の糖化ヘモグロビンの濃度を測定した。エンドペプチダーゼ試薬は、0.02mol/Lシトレート緩衝液(pH2.4)、0.2%Triton X100中、約6000U/mLのペプシンを含有するものであった。凝集試薬は、約1.5μg/mL凝集剤(ポリアスパルトアミドにコンジュゲートしたヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチド)及び漸増濃度のプロリン特異的エンドペプチダーゼ(0U/mL、0.1U/mL、0.2U/mL、0.33U/mL、0.43U/mL及び0.54U/mL)の混合物を、0.02mol/LのMOPS(pH7.0)、0.05%NaN3、0.2%のTween-20、3mmol/LのEDTA及び1.5%のBSAの溶液中に含有するものであった。
ヒト全血のペプシン及びプロリン特異的エンドペプチダーゼ消化は、糖化ヘモグロビンの割合を計算するときの、ヘモグロビンS及びヘモグロビンCによって生じる干渉を減少させる。凝集試薬の存在におけるペプシン消化
ヘモグロビンS及びヘモグロビンCを含有するヒト全血試料を、ADVIA(登録商標)1650計器上、表5に示すパラメータを使用して、生理食塩水で希釈した。
Claims (24)
- 糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、
糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料をエンドペプチダーゼと接触させること、
前記エンドペプチダーゼ処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及び
ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを検出すること
を含む方法。 - 前記試料がヒト全血である、請求項1記載の方法。
- 前記試料中の糖化ヒトヘモグロビンの割合を測定することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記エンドペプチダーゼが、ペプシン、アスペルギロペプシンII、カテプシンD、サッカロペプシン、ムコールペプシン、キモシン、ガストリシン及びphysirolisinからなる群より選択される酸エンドペプチダーゼである、請求項1記載の方法。
- 前記酸エンドペプチダーゼがペプシンである、請求項4記載の方法。
- 前記試料を、約1.0〜約5.0の範囲のpHで約5U/mL〜約10,000U/mLペプシンと接触させることを含む、請求項5記載の方法。
- 前記エンドペプチダーゼ処理された試料を、約5.0〜約9.0の範囲のpHで約0.1U/mL〜約30U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させることを含む、請求項1記載の方法。
- 前記ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを、高速液クロマトグラフィーの使用を含む方法又は前記糖化ペンタペプチドへの少なくとも一つの抗体の結合を含む方法によって検出することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを凝集阻止イムノアッセイ法によって検出することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記凝集阻止イムノアッセイ法で使用される前記凝集試薬が、ポリアスパルトアミドにコンジュゲートした糖化val-his-leu-thr-tyr-cysセキサペプチドである、請求項9記載の方法。
- 前記エンドペプチダーゼ処理された試料を、凝集試薬と接触させると同時に、接触させる前に又は接触させた後に、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させることを含む、請求項9記載の方法。
- 前記エンドペプチダーゼ処理された試料を、プロリン特異的エンドペプチダーゼと前記凝集試薬との混合物と接触させることを含む、請求項11記載の方法。
- プロリン特異的エンドペプチダーゼと前記凝集試薬との前記混合物が、約0.1g/dL〜約5.0g/dLウシ血清アルブミン及び約0.5mmol/L〜約10.0mmol/Lエチレンジアミン四酢酸を含み、約6.0〜約8.0の範囲のpHを有する、請求項12記載の方法。
- 前記エンドペプチダーゼ、プロリン特異的エンドペプチダーゼ及び凝集剤で処理された試料を、ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチド及び前記凝集試薬の両方に特異的に結合する抗体と接触させることをさらに含む、請求項11記載の方法。
- 少なくとも一つの抗体分子が一つ以上のラテックス粒子に結合している、請求項14記載の方法。
- 糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、
糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料を、凝集試薬と接触させると同時に、接触させる前に又は接触させた後に、エンドペプチダーゼと接触させること、
前記エンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及び
ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを凝集阻止イムノアッセイ法によって検出すること
を含む方法。 - 前記エンドペプチダーゼが、ペプシン、アスペルギロペプシンII、カテプシンD、サッカロペプシン、ムコールペプシン、キモシン、ガストリシン又はphysirolisinからなる群より選択される酸エンドペプチダーゼである、請求項16記載の方法。
- 前記酸エンドペプチダーゼがペプシンである、請求項17記載の方法。
- 前記試料をペプシンと前記凝集試薬との混合物と接触させることを含む、請求項18記載の方法。
- ペプシンと前記凝集試薬との前記混合物が、約3U/mL〜約100U/mLのペプシンを含み、約1.0〜約4.0の範囲のpHを有する、請求項19記載の方法。
- 前記のエンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料を、前記試料をヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチド及び前記凝集試薬の両方に特異的に結合する抗体と接触させると同時に又は接触させる前に、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させることをさらに含む、請求項16記載の方法。
- 前記のエンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料を、プロリン特異的エンドペプチダーゼと前記抗体との混合物と接触させることを含む、請求項21記載の方法。
- 前記混合物が、約2.0U/mL〜約30.0U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼを含み、約7.0〜約8.0の範囲のpHを有する、請求項22記載の方法。
- 少なくとも一つの抗体分子が一つ以上のラテックス粒子に結合している、請求項21記載の方法。
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