JP2006058295A - アッセイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特に、グリコヘモグロビンの存在及びレベルを、血液試料又はあらゆるこのような類似好適試料において検出することができる。本発明の組成物は、亜鉛結合ドメインを示すタンパク質、特にヘモグロビン、例えばグリコヘモグロビンの、結合の向上に使用される亜鉛被覆物を有する微粒子に関する。
【選択図】図1
Description
本発明は、グリコヘモグロビンA1c(HbA1c)検出のためのアッセイ法の改良及び該アッセイ法に関連した改良を提供する。本発明は、特に、亜鉛結合ドメインを表示するタンパク質、特にヘモグロビン、例えばグリコヘモグロビン、の結合の向上に使用される亜鉛被覆物を有する微粒子を提供する。
ヘモグロビン(Hb)は、赤血球に存在するタンパク質であり、酸素運搬の役割を担っている。ヘモグロビンは、いくつかの突然変異体で存在し、最も一般的な形態は、ヘモグロビンAであり、これは血中に見出される総ヘモグロビンの約90%を占める。
床試験)。特に、この検査によって、医師は、糖尿病患者が最適血糖管理を行なうことを確実にすることができ、さらに、医師による検査と検査の間のグルコースレベルを糖尿病患者が適切に管理することも確実にすることができる。
本発明者らは、亜鉛で被覆した微粒子が、亜鉛結合ドメインを有する標的タンパク質、特にヘモグロビン及びグリコヘモグロビンのような誘導体の結合を促進することを意外にも見出した。従って、これらの微粒子は、グリコヘモグロビンの検出法、さらには、少なくとも1つの亜鉛結合部位を示すタンパク質又は他の分子の分離法に使用することができる。
ヘモグロビンを含有する試料を準備するステップと、
試料からヘモグロビンを抽出し、存在するヘモグロビンを部分的に変性するステップと、
亜鉛分子で被覆した微粒子にヘモグロビンを曝露して、ヘモグロビン(Hb)及びグリコヘモグロビン(HbA1c)を微粒子に結合させるステップと、
試料中のHbA1cの量を測定するステップと、
を含むアッセイ法を提供する。
ジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
モグロビンを含有する個体から得た試料を準備するステップと、
試料を溶血させて、細胞結合ヘモグロビンを遊離し、ヘモグロビンを部分的に変性させるステップと、
亜鉛で被覆した微粒子上に、グリコヘモグロビンを捕捉するステップと、
試料に存在するグリコヘモグロビンに結合し得るシグナル発生分子に、試料を曝露するステップと、
グリコヘモグロビンに結合していないシグナル発生分子を除去するステップと、
結合したシグナル発生分子の量を定量化して、試料に存在するHbA1cのパーセンテージレベルを求めるステップと、
を含むアッセイ法を提供する。
せる。代替の実施形態において、試料の溶血と共にヘモグロビンの部分変性が生じる。
適切な支持体上に微粒子を捕捉するステップと、
微粒子を洗浄して、非結合物質を除去するステップと、
HbA1cに特異的なモノクローナル抗体であって、そのモノクローナル抗体に標識が結合してあるシグナル発生分子によって、HbA1cを標識するステップと、
試料に存在するHbA1cのパーセンテージを求めるステップと、
によって、求める。
本発明は、HbA1cグリコヘモグロビンレベルを求めるアッセイシステム及びスクリーニング法を提供する。本明細書において使用される「アッセイシステム」は、1つ以上の特定の事象を検出しそして/又は測定するアッセイを、実施し、その結果を分析するのに必要な全ての要素を包含する。
定されたシンチラントによってペプチドプローブに結合した放射標識タンパク質を特異的に検出する(Sonatore LMら、1996, Anal Biochem 240:289−297)。
患者からの生物学的試料を準備するステップと、
塩化亜鉛で予め被覆した微粒子上にヘモグロビンを捕捉するステップと、
亜鉛被覆微粒子から結合ヘモグロビンを溶離するステップと、
を含む方法を提供する。
試料を準備するステップと、
試料を、本発明の亜鉛被覆微粒子に曝露するステップと、
標的タンパク質を、亜鉛被覆微粒子上に捕捉するステップと、
微粒子を分離するステップと、
微粒子に結合した標的タンパク質の存在を検出するステップと、
場合により、微粒子から標的タンパク質を精製するステップと、
を含む方法を提供する。
粒子は、その密度を減少させるために、中空又は実質的に中空である。
ここに、本発明について、下記の実施例を参照して説明するが、例示が目的であって本発明を限定するものと理解すべきではない。さらに、以下の図に関しても説明する:
「AxSYM自動アッセイ条件」
0.5%TX−100及び0.8mMツィタージェント3−14を補充した溶解緩衝液で、血液を手動で溶解する。
溶解血液試料を、30%ショ糖中で同容量の亜鉛被覆EDTAシリカ微粒子と混合し、5分間インキュベートする。
タブに移し、MEIAで洗浄する。
ブロッキング緩衝液17に溶解した1μg/mlのαHbA1cを添加し、5分間インキュベートする。
MEIAで洗浄する。
pH7のHEPESで1:3000に希釈したα−マウス−アルカリホスファターゼを添加する。
MEIAで洗浄する。
MUPを添加し、読み取る。
「IMx自動アッセイ条件」
MEIA+5%BSAでタブを予備洗浄する。
30%ショ糖中で、0.1%亜鉛被覆EDTAシリカ微粒子と試料を混合する(1:1)。
タブに入れ、MEIA(2×50μl)で洗浄する。
HEPESに溶解した1μg/mlのαHbA1cを添加し、5分間インキュベートする。
MEIA(2×50μl)で洗浄する。
α−マウス−アルカリホスファターゼ複合体(HEPESで1:3000に希釈)を添加し、5分間インキュベートする。
MEIA(2×50μl)で洗浄する。
MUPを添加し、読み取る。
「96ウェル真空マニホールドアッセイ」
Zn微粒子を使用するHbの捕捉
シリカEDTA及びポリスチレンNTA微粒子を、ZnCl2で被覆し、次に、0.5%固形分で、Hb(0.5mg/ml)又は(0.2mg/ml)と共に10分間インキュベートした。OD 405nmを使用して、非結合物質を測定することによって、結合を評価した。0.5mg/ml及び0.2mg/mlについての読み取りは、405nmでのHb測定に関して、直線範囲内(linear range)である。
、0.1mg/ml Hbで75%)ことを示している。
シリカEDTA及びポリスチレンNTA微粒子を亜鉛で被覆し、0.5%固形分において、0、1、5及び10% HbA1cを添加した0.1mg/ml Hbと共にインキュベートした。粒子は、α−HbA1c抗体(10μg/ml)及びα−マウス−アルカリホスファターゼ(1:3000に希釈)で探索された。アルカリホスファターゼ基質と共にインキュベートした後、反応を停止し、OD 550nmを読み取った。
「種々のタイプの亜鉛被覆微粒子の使用」
シリカEDTA微粒子
IMx(実施例2に記載した方法)による分析前に、微粒子を亜鉛で被覆し、40%ショ糖に再懸濁した。
AxSYM(実施例1に記載した方法)による分析前に、微粒子を亜鉛で被覆し、30%ショ糖に再懸濁した。αHbA1c(2μg/ml)と5分間インキュベーションし、次に、α−マウス−アルカリホスファテーゼ(1:3000)と2分間インキュベートした。
真空マニホールド(実施例3に記載した方法)による分析前に、微粒子を亜鉛で被覆した。
微粒子を、結合能力に関して、真空マニホールドによって分析した(実施例3に記載した方法)。
キレートセファロースを亜鉛で被覆し、溶解血液試料と共にインキュベーションし、結合能力について真空マニホールドによる分析を使用した(実施例3に記載した方法)。
「種々の金属イオンの使用」
キレートセファロース
キレートセファロースを種々の金属イオンで被覆し、溶解血液試料と共にインキュベーションし、結合能力について、真空マニホールドによる分析を使用した(実施例3に記載した方法)。
シリカEDTA微粒子を種々の金属イオンで被覆し、IMx(実施例2に記載した方法)によって分析した。
「RBCを溶解し、しかも亜鉛被覆微粒子へのHbA1cの結合及び検出を可能にする界面活性剤の使用」
試験1
0.5%TX100及び0.8mMツィタージェント3−14を含有する緩衝液で血液試料を溶解し、AxSYM(実施例1に記載した方法)によって分析した。
0.5%TX100及び80mMコール酸塩を含有する緩衝液で血液試料を溶解し、AxSYM(実施例1に記載した方法)によって分析した。
0.5%TX100及び種々の界面活性剤を含有する緩衝液で血液試料(通常、5%HbA1c)を溶解し、IMx(実施例2に記載した方法)によって分析した。ブロッキング緩衝液17中において、αHbA1c−アルカリホスファターゼ(1μg/ml)でHbA1cを検出した。
「種々の大きさのシリカ微粒子上でのHbA1cの捕捉、及び検出における抗HbA1c−アルカリホスファターゼ複合体の使用」
80mMコール酸塩を含有する溶解緩衝液で血液試料を溶解し、IMx(実施例2に記載した方法の中の複合体を使用した唯1つのインキュベーションステップ)によって分析した。試料を、0.05%固形分において、種々の大きさ(1.5、0.5及び0.3μm)のシリカ微粒子と共にインキュベートした。0.2%アジ化ナトリウム 、2% PEG 1000及び1.2% StabilGuard複合希釈液を含むpH7.0のHepes中で、HbA1cは、αHbA1c−アルカリホスファターゼ(1μg/ml)によって検出された。
「AXSYM自動アッセイを使用した自動グリコヘモグロビン定量化の実施のための、条件及び試薬の最適化」
本発明のアッセイを実施する条件の最適化の結果として、AXSYM自動アッセイ機(Abbott Laboratories, US)での自動分析を使った本発明の実施には、次のプロトコール及び緩衝剤が好ましいことが確認された。
5μlの全血液試料(EDTA、FLUOX、クエン酸塩、ヘパリン)を、95μlのRBC溶解緩衝液(1/20希釈)に添加した。溶解試料を、100μlの試料希釈液でさらに希釈した(最終試料希釈1/40)。
DAKOマウス抗Hb(A、C、S)1c及び抗HbA1cを、一般的なマレイミド結合法を使用して、アルカリホスファターゼと自家結合させた。それらを評価し、抗Hb(A、C、S)1cアルカリホスファターゼ複合体が最も優れた性能であった。その複合体を、複合体希釈液中で0.25μg/mlの濃度で使用する(緩衝液の組成は、0.05M HEPES、6% Stabilguard、2% ポリエチレン1000、0.5% トリトンX100、1% StabilzymeAP、0.09% アジ化ナトリウム、pH7である)。
最も優れた性能は、0.2M HEPES、0.055M グリシン、0.05M 塩化マグネシウム、0.4M 塩化ナトリウム、1% トリトンX100、0.8mM ツィタージェント3−14、0.09% アジ化ナトリウム、pH8を使用して得られた。
タブブロッカー及び試料希釈液を使用する場合、AxSYM(登録商標)マトリックスセルの変化は最小限にされ、Hb結合は最適である。現在、2つの好ましい緩衝液は、緩衝液3(0.05M トリス、20% ショ糖、0.5M 塩化ナトリウム、0.1% 魚皮ゼラチン、10% Stabilguard、1mM 塩化亜鉛、0.09% アジ
化ナトリウム、pH8)、及び緩衝液7(0.05M トリス、20% ショ糖、2M 塩化ナトリウム、0.1% 魚皮ゼラチン、10% Stabilguard、5% ポリエチレングリコール8000、0.1% カゼイン加水分解物、1mM 塩化亜鉛、0.09% アジ化ナトリウム、pH8)である。
Claims (33)
- 試料中のグリコヘモグロビンのレベルを測定するアッセイ法であって、
ヘモグロビンを含有する試料を準備するステップと、
高親和性亜鉛結合部位を露出させる配座変化によって、ヘモグロビンを変性するステップと、
支持体に結合した亜鉛分子を使用して、ヘモグロビン分子を捕捉するステップと、
結合亜鉛分子に結合したグリコヘモグロビンの量を測定するステップと、
を含む方法。 - 変性を界面活性剤によって行なう、請求項1に記載のアッセイ法。
- 界面活性剤が、コール酸塩、N−オクチル−グルコシド、N−オクチル−チオグルコシド、トリトンX、ツィタージェント3−14及び胆汁酸塩からなる群から選択される1つ以上の界面活性剤である、請求項1又は2に記載のアッセイ法。
- 結合亜鉛分子によるヘモグロビンの捕捉を、変性界面活性剤の存在下に行なうことができる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアッセイ法。
- 亜鉛分子を微粒子に結合させる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアッセイ法。
- 微粒子が、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ、シリカビーズ、キレートセファロースビーズ又は磁性ビーズからなる群から選択されるビーズである、請求項5に記載のアッセイ法。
- 微粒子に適用される亜鉛被覆物が塩化亜鉛である、請求項5又は6に記載のアッセイ法。
- 微粒子がデキストラン又はポリエチレングリコール(PEG)である、請求項5に記載のアッセイ法。
- キレート剤が、支持体への亜鉛分子の結合を促進する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のアッセイ法。
- キレート剤が亜鉛結合キレート剤である、請求項9に記載のアッセイ法。
- キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、トリソジウムカルシウムジエチレントリアミン五酢酸塩(DTPA)、ジソジウムカルシウムシクロヘキサンジアミン四酢酸塩(CDTA)、エデト酸カルシウムナトリウム、DMSA、DMPS、エチレンジアミン(EDA)、ジエチレントリアミン(DETA)、アミノエチルエタノールアミン(AEEA)エチレンアミン類又はこれらの化合物と同様の亜鉛錯化特性を有するあらゆる他のキレート剤及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項9に記載のアッセイ法。
- ヘモグロビン含有試料が、全血液、赤血球、溶血血液又は血液抽出物である、請求項1〜11のいずれか一項に記載のアッセイ法。
- ヘモグロビン含有試料が、変性の前に溶解される全血液細胞である、請求項12に記載のアッセイ法。
- ヘモグロビンの変性も生じさせる界面活性剤を使用して、赤血球を溶解する、請求項12に記載のアッセイ法。
- 熱を使用して、赤血球を溶解する、請求項12に記載のアッセイ法。
- 試料中のグリコヘモグロビンのレベルを測定するアッセイ法であって、
血液試料を準備するステップと、
試料からヘモグロビンを抽出し、存在するヘモグロビンを部分的に変性するステップと、
亜鉛分子で被覆した微粒子にヘモグロビンを曝露して、ヘモグロビン及びグリコヘモグロビンを微粒子に結合させるステップと、
微粒子に結合したHbA1cの量を測定するステップと、
を含むアッセイ法。 - 試料の溶血によって細胞結合ヘモグロビンを遊離させ、試料からヘモグロビンを抽出する、請求項16に記載のアッセイ法。
- 処理工程の間のヘモグロビンの部分変性を、界面活性剤によって行なう、請求項16に記載のアッセイ法。
- 界面活性剤が、コール酸塩、N−オクチル−グルコシド、N−オクチル−チオグルコシド、トリトンX、ツィタージェント3−14及び胆汁酸塩からなる群から選択される1つ以上の界面活性剤である、請求項18に記載のアッセイ法。
- ヘモグロビンを亜鉛被覆粒子に曝露するステップをpH7付近で行なう、請求項16に記載のアッセイ法。
- HbA1cに選択的に結合し、それを標識し、それを検出可能にするシグナル発生分子に、HbA1cを接触させることによって、存在するHbA1cの量の測定を行なう、請求項16に記載のアッセイ法。
- HbA1cグリコへモグロビンレベルの評価による、糖尿病のin vitro診断及びモニタリングのためのアッセイ法であって、
血液試料を準備するステップと、
試料を溶血して、細胞結合ヘモグロビンを遊離させ、ヘモグロビンを部分的に変性させるステップと、
亜鉛で被覆した微粒子上にグリコヘモグロビンを捕捉するステップと、
微粒子上の捕捉グリコヘモグロビンを、グリコヘモグロビンに結合できるシグナル発生分子に曝露するステップと、
グリコヘモグロビンに結合していないシグナル発生分子を除去するステップと、
試料に存在するHbA1cのパーセンテージレベルを求めるために、結合したシグナル発生分子の量を定量化するステップと、
を含むアッセイ法。 - 適切な支持体上に微粒子を捕捉するステップと、
微粒子を洗浄して、非結合物質を除去するステップと、
HbA1cに特異的なモノクローナル抗体であって、そのモノクローナル抗体に標識が結合してあるシグナル発生分子によって、HbA1cを標識するステップと、
試料に存在するHbA1cのパーセンテージを求めるステップと、
によって、試料に存在するHbA1cのパーセンテージレベルを求める、請求項22に
記載のアッセイ法。 - 生物学的試料からヘモグロビンを分離する方法であって、
生物学的試料を準備するステップと、
亜鉛で被覆された微粒子上にヘモグロビンを捕捉するステップと、
亜鉛被覆微粒子から微粒子結合ヘモグロビンを溶離するステップと、
を含む方法。 - 捕捉するステップの前に、試料を溶血し、試料に存在するヘモグロビンを部分的に変性するステップをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 生物学的試料が血液である、請求項24に記載の方法。
- 試料に存在するグリコヘモグロビンの存在を定量化するアッセイに使用することができる、請求項24に記載の方法。
- 亜鉛結合部位を有する少なくとも1つの標的タンパク質の選択的結合についてのアッセイであって、
試料を準備するステップと、
亜鉛被覆微粒子に試料を曝露するステップと、
亜鉛被覆微粒子上に標的タンパク質を捕捉するステップと、
微粒子を分離するステップと、
微粒子に結合した標的タンパク質の存在を検出するステップと、
微粒子から標的タンパク質を任意に精製するステップと、
を含むアッセイ方法。 - 試料が生物学的試料である、請求項28に記載のアッセイ法。
- 亜鉛結合ドメインを有する標的タンパク質の選択的結合における、亜鉛被覆微粒子の使用。
- 請求項1〜30に記載のいずれか一項のアッセイ法の実施用のキットであって、請求項1に記載の微粒子並びにアッセイ法の実施のための使用説明書及びプロトコールを一緒に含むキット。
- 亜鉛結合ドメインを有するタンパク質を標的とした結合に使用される亜鉛被覆微粒子の使用。
- 診断アッセイ法において、ヘモグロビンを捕捉するために用いる亜鉛被覆微粒子の使用。
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