JP2001521173A - グリコヘモグロビンの測定 - Google Patents

グリコヘモグロビンの測定

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JP2001521173A JP2000518284A JP2000518284A JP2001521173A JP 2001521173 A JP2001521173 A JP 2001521173A JP 2000518284 A JP2000518284 A JP 2000518284A JP 2000518284 A JP2000518284 A JP 2000518284A JP 2001521173 A JP2001521173 A JP 2001521173A
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glycation
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イトー，ラルフ・ケー
サンゲラ，ゴードン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、GHbおよびヘモグロビン（Hb）に結合する捕捉分子を使用し、GHbを非グリコヘモグロビン（Hb）から識別する分子で結合GHbを検出してサンプル中のグリコヘモグロビン（GHb）をアッセイする新規方法を主題とする。GHbをHbから識別するために使用する分子は抗体であってもよい。本発明のアッセイおよび抗体は、糖尿病などの病態におけるGHbの評価に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ヘモグロビン、免疫学および血液分析に関する。
【０００２】 （発明の背景） グルコースの存在下、ヘモグロビン（Hb）は、アマドリ転移により安定化され
る非酵素的反応によりグリケーションされる。可能なグリケーション部位は、4 本のポリペプチド鎖のN末端アミノ酸、およびそれらの鎖内のリシンの遊離ε-ア
ミノ基である。最も反応性な部位（HbA1c）はβ-鎖のN末端バリンであり、それ は全結合グルコースの約60％をもたらす。また、結合糖は、それらの鎖内のε- アミノ基上の44個のグリケーション部位のいずれか（グリケーションの約34％）
、およびα鎖のN末端（グリケーションの約6％）にも出現しうる。いずれか1つ の部位におけるグリケーションの割合は、他の任意の部位におけるグリケーショ
ンに正比例する。したがって、グリコヘモグロビン（GHb）の全量とグリコヘモ グロビンの個々の任意の形態（例えば、HbA1c）における量との間には直線関係 が存在する。
【０００３】 個体におけるGHbのレベルの測定は、血中の血液グルコースレベルの経時的な 指標として役立ちうる。糖尿病患者におけるGHbの測定は、病態の有用な指標で ある。平均的な血液細胞は120日の寿命を有するため、GHbレベルは、数ヶ月にわ
たる個体の血中グルコースの履歴を反映し（Singer, Ann. Intern. Med., 1989,
110:125-137）、最も最近の血中グルコースレベルが最も強く表される。糖尿病
の進行、該疾患の抑制の効力またはその両方を判定するためには、2〜3ヵ月ごと
にGHbのレベルを測定することにより糖尿病をモニターすることが推奨される。
【０００４】 GHbの濃度を評価するための多数の方法は、HbからGHbを分離することを必要と
する。分離方法の1つのタイプは、GHbとHbとの電荷の相違に基づくものである。
これは、例えば、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）または通常の
イオン交換クロマトグラフィーにより行なうことができる。また、アフィニティ
ー結合、クロマトグラフィーおよびイムノアッセイなどの方法を用いるGHbのア ッセイにおいては、構造的相違が利用されている（Goldsteinら, Clin. Chem.,
1996, 32/10B, B64-B70）。
【０００５】 Hb β鎖のN末端領域からのグリコシル化合成ペプチド配列を使用して、天然Hb
A1cに対して一定の特異性を有する抗体が得られている（Knowles, 米国特許第4,
647,654号および第4,727,036号; Mezei, 米国特許第4,478,744号）。これらの抗
体が有する、天然HbA1cに対するアフィニティーは、それらを生産するのに使用 したペプチドに対するアフィニティーより有意に低い。天然HbA1cにおいては抗 原性部位への接近が困難であるため、HbA1cに関するイムノアッセイの開発にはH
bAlcの変性方法（Lewis, EP 407 860 A2; Knowles 4,727,036）が用いられてい る。もう1つのアプローチは、Hb分子を酵素（例えば、ペプシン）で分解してβ 鎖N末端部位を露出させるというものである。GHbのイムノアッセイのための方法
は、一般には、抗体および／またはアッセイの開発のために変性または分解の前
処理工程を用いる。
【０００６】 （発明の概要） 概して、本発明は、生物学的流体中のGHbを測定するための装置およびアッセ イ方法、該装置およびアッセイ方法において有用な抗体、ならびにそのような抗
体の製造方法を主題とする。該装置およびアッセイ方法は、糖尿病などの病態に
おけるGHbの評価に有用である。
【０００７】 本発明は、生物学的流体中のGHbをアッセイするための装置またはキットを主 題とする。該装置またはキットは、予め決められた量の固定化GHb/Hb捕捉分子を
含む固体支持部材を含む。所望により、該装置またはキットは、GHbに特異的な グリケーションプローブ、またはハプトグロビン（Hp）に結合したHbを検出する
ために用いるHb/Hp特異的プローブを検出する手段を含んでいてもよい。該グリ ケーションプローブは、例えば、抗体またはボロナート（boronate）誘導体であ
ってもよい。該Hb/Hp特異的プローブは抗体であってもよい。該捕捉分子はハプ トグロビンまたは抗体であってもよい。該グリケーションプローブを検出するた
めの手段は、適当な任意の方法、例えば、化学蛍光、電気検出（electrosensing
）、蛍光分析、蛍光消光、酵素免疫細胞化学、または粒子の可視化を含むもので
あってもよい。
【０００８】 本発明はまた、生物学的流体中のグリコヘモグロビンを検出するための方法を
主題とする。該方法は、（a）予め決められた量のGHb/Hb捕捉分子を含む固体支 持部材を準備し、（b）該生物学的流体を該支持部材と接触させ、それにより、G
Hb/Hbで飽和した支持部材を形成させ、（c）該GHb/Hb飽和支持部材をグリケーシ
ョンプローブと接触させ、（d）未結合グリケーションプローブを除去し、（e）
捕捉GHbに結合したグリケーションプローブを検出する工程を含む。
【０００９】 また、グリコヘモグロビンは、（a）予め決められた量のGHb/Hb捕捉分子を含 む固体支持部材を準備し、（b）該生物学的流体を該支持部材と接触させ、それ により、GHb/Hbで飽和した支持部材を形成させ、該GHb/Hb飽和支持部材をHb/Hp 特異的プローブと接触させ、（d）未結合Hb/Hp特異的プローブを除去し、（e） 捕捉GHbに結合したHb/Hb特異的プローブの量を測定し、該生物学的流体中にGHb が存在すればその量を求める工程を含む方法により、生物学的流体中でアッセイ
することができる。
【００１０】 該グリケーションプローブまたはHb/Hp特異的プローブは、直接的に標識した り、あるいは例えば抗体で間接的に検出することができる。該グリケーションプ
ローブは、未変性GHbまたはGHb配座異性体Hに特異的に結合しうる。該Hb/Hp特異
的プローブは、HbまたはHb配座異性体Hに特異的に結合しうる。好ましくは、該 グリケーションプローブは、GHb配座異性体Hに特異的に結合する。Hb/Hp特異的 プローブはHb配座異性体Hに結合するのが好ましい。
【００１１】 好ましくは、該捕捉分子はハプトグロビンである。あるいは、それは抗体であ
ってもよい。該生物学的流体はヒトまたは非ヒト哺乳動物に由来するものである
。典型的には、該生物学的流体は血液である。
【００１２】 本発明はまた、未変性GHbに特異的な又はGHb立体配座Hに特異的な抗体の製造 方法を主題とする。該方法は、（a）GHbをハプトグロビン（Hp）に結合させ、そ
れによりGHb/Hp複合体を得、（b）該GHb/Hp複合体を抗体産生系中に配置し、（c
）該産生系から抗体含有産物を得、（d）該産物中の、GHbまたはGHb配座異性体H
に特異的な抗体を検出する工程を含む。
【００１３】 本発明はまた、Hb配座異性体Hに特異的な抗体の製造方法を主題とする。該方 法は、（a）Hbをハプトグロビン（Hp）に結合させ、それによりHb/Hp複合体を得
、（b）該Hb/Hp複合体を抗体産生系中に配置し、（c）該産生系から抗体含有産 物を得、（d）該産物中の、Hb配座異性体Hに特異的な抗体を検出する工程を含む
。GHbまたはHbとHpとの結合は共有的であっても、非共有的であってもよい。Hp は、任意の哺乳動物（好ましくは、ヒトまたはヒツジ）に由来するものであって
もよい。該抗体産生系は、任意の非ヒト哺乳動物（好ましくは、ウサギ、マウス
、ラット、ヤギ、ニワトリ、ロバまたはヒツジ）であってもよい。あるいは、該
抗体産生系はin vitro系であってもよい。
【００１４】 本発明はまた、Hbの存在下、未変性GHb、GHb配座異性体HまたはHb配座異性体H
に選択的に結合する、前記の製造方法により得られた抗体を主題とする。例えば
、該抗体は、以下の結合特異性のいずれかを示しうる：（a）未変性GHb、（b）G
Hb配座異性体H、（c）未変性GHbおよびGHb配座異性体H、（d）未変性Hb、（e）H
b配座異性体H、および（f）未変性HbおよびHb配座異性体H。好ましくは、該抗体
は、未変性GHb、GHb配座異性体Hまたはそれらの両方に特異的に結合する。
【００１５】 本発明で用いる「ヘモグロビン」（Hb）は、非グリコ-ヘモグロビンの天然に 存在するすべての形態を意味し、ααββの四量体形態、およびαβなどの二量
体形態、ならびに捕捉分子に結合する疾患変異体を含む。
【００１６】 本発明で用いる「グリコヘモグロビン」（GHb）は、共有結合した糖部分を有 するヘモグロビン（例えば、HbA1c）、およびアマドリ転移を介した非酵素的反 応により形成されたGHbを意味する。
【００１７】 本発明で用いる「ヘモグロビン配座異性体H」（Hb配座異性体H）は、ハプトグ
ロビン結合事象により誘導されうる非天然コンホメーションのヘモグロビンを意
味する。
【００１８】 本発明で用いる「グリコヘモグロビン配座異性体H」（GHb配座異性体H）は、 ハプトグロビン結合事象により誘導されうる非天然コンホメーションのグリコヘ
モグロビンを意味する。
【００１９】 本発明で用いる「ハプトグロビン」は、ハプトグロビンの重鎖および軽鎖のす
べての立体配置を意味し、天然に存在する形態である1-1、2-1および2-2を含む 。
【００２０】 本発明で用いる「捕捉分子」は、グリコ形態および非グリコ形態のヘモグロビ
ンに対して、ほぼ等しいアフィニティーで結合する分子を意味する。
【００２１】 本発明で用いる「グリケーションプローブ」は、グリコHbに特異的に結合する
プローブを意味する。該グリコHbは捕捉分子に結合していなくても結合していて
もよい。
【００２２】 本発明で用いる「Hb/Hp特異的プローブ」は、捕捉分子に結合したHbに特異的 に結合するプローブを意味する。
【００２３】 本発明で用いる「抗体産生系」は、生きた動物またはin vitro系を意味する。
【００２４】 特に示さない限り、本発明で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発
明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意義を有する。
本発明に記載するものと類似した又は同等の方法および材料を本発明の実施また
は試験に使用することが可能であるが、適当な方法および材料は後記に記載する
ものである。本明細書中に記載するすべての刊行物、特許出願、特許および他の
参照文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。抵触の場合に
は、本明細書（定義を含む）により調整されることとなる。また、材料、方法お
よび実施例は例示にすぎず、限定的なものではない。
【００２５】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および請求の範囲から明ら
かとなろう。
【００２６】 （詳細な記載） 本発明の装置およびその操作を、１Ａ〜１Ｃに図示的に例示する。図１Ａは、
固体支持体12と該固体支持体上に固定化された予め決められた量のHp 11とを含 む捕捉領域10を示す。図１Ｂは、GHb 13/Hb 14で飽和した捕捉領域10（すなわち
、その捕捉部位のすべてが占拠されているもの）を例示する、図１Ｂにおいては
、過剰の（未結合）GHbおよびHbが除去されている。図１Ｃは、アルカリホスフ ァターゼ（AP）と共役したGHb特異的抗体15がGHbに結合している飽和捕捉領域を
表す。図１Ｃにおいては、未結合抗体が除去されている。APの基質であるp-アミ
ノフェニルホスファート（pAPP）を該飽和抗体処理捕捉領域に接触させると、該
酵素（AP）は、生成物であるp-アミノフェノール（pAP）を生成する。pAPの生成
速度またはpAPの生成量を電気化学的に測定する。サンプル中のGHbの量は、pAP の該速度または量に比例し、標準曲線に関連づけられる。このようにして、GHb の相対量を測定する。
【００２７】 該捕捉分子は、GHbおよびHbに、同様のアフィニティーで結合する。したがっ て、それはGHbおよびHbに、サンプル中のそれらの相対濃度を反映した比率で結 合する。該捕捉領域中のHpの全量は予め決められている。したがって、捕捉され
るGHb/Hbの全量は既知である。GHbの絶対量（前記のとおりに求める）および捕 捉GHb/Hbの既知量を用いて、サンプル中のGHbの相対量を計算する。
【００２８】 同様の装置においては、グリケーションプローブの代わりにHb/Hp特異的プロ ーブを使用する。この場合、捕捉領域に結合したHbをHb/Hp特異的プローブで検 出する。サンプル中に存在するGHbの相対量は、捕捉領域に結合したHbの量を捕 捉領域内の結合部位の合計数から引き算することにより計算する。
【００２９】 装置の要素（例えば、前記に記載のもの）が別々に供給されて、キットを構成
していてもよい。
【００３０】 本発明のもう1つの装置の一例を図２〜４に例示する。該装置は、サンプルウ イック（wick）1、引き寄せ（draw）ウィック2、ハプトグロビンカバーメッシュ
3、抗体メッシュ4、ダミー5およびセンサー6を含む。予め決められた量のハプト
グロビンをセンサー6上に固定化する。図３では、サンプルウィック1が支持体7 上に位置している。サンプルをサンプル／溶解ウィック1に適用すると、それは 抗体メッシュ4を通って拡散し、ハプトグロビンカバーメッシュ3を通って移動し
続ける。センサー6上の固定化Hpは、HbおよびGHbに対して、ほぼ等しいアフィニ
ティーで結合するため、該結合GHbはサンプル中のGHbの比率を表す。GHb:Hp複合
体に特異的でありAPと共役している抗体を該固定化GHb:Hp複合体に結合させる。
該引き寄せウィック2が飽和し、それにより液体の流動が停止するまで、サンプ ルを該メッシュを介して引き寄せる。センサー6内の孔8は、アルカリホスファタ
ーゼ基質（pAPP）9が可溶化し、該センサーの表面まで移動し、その位置でそれ が酵素共役体と相互作用して、検出可能な生成物を生成するのを可能にする。ダ
ミー5は、4と同様の抗体メッシュ、およびセンサー6と同様の検出電極を含む。 該ダミーは、それと会合した固定化Hpを有さない。その目的は、該アッセイにお
けるバックグラウンドノイズの測定値を得ることにある。したがって、最終的な
アッセイ測定値を得るためには、該センサーにおいて生成したシグナルからノイ
ズを差し引く。一般には、この装置においてGHbを検出するために使用する抗体 は、GHb:Hp複合体に対して、GHb単独体に対するより大きなアフィニティーを有 する。したがって、該抗体は、溶液中のGHb（またはHb）には優先的に結合しな いが、GHbがHpに結合して複合体を形成した後には結合する。GHbを検出するため
に使用する抗体が、GHbに対して、GHb:Hp複合体に対するより大きな又は等しい アフィニティーを有する場合には、より大量の抗体を該装置内で使用する。抗体
の使用量は、当業者に公知の方法により実験的に決定される。
【００３１】サンプルの調製 該アッセイにおいては、比較的少量のサンプル（例えば、生物学的流体）を使
用する。例えば、1回の試験で約1μl〜約250μlの全血を使用する。
【００３２】 サンプルは、採取直後に使用したり、あるいは使用前に保存（好ましくは冷凍
下）することができる。また、血液は、EDTA、ヘパリンまたはクエン酸ナトリウ
ムなどの物質を含む試薬で抗凝固処理することができる。
【００３３】 本発明における使用のために、血液サンプルを溶血させ、希釈することができ
る。これは、種々の方法、例えば、水中または非イオン界面活性剤（例えば、TR
ITON（登録商標）X-100）を含有する水溶液中への懸濁により行なうことができ る。
【００３４】固体支持体および捕捉分子 捕捉領域を形成させるために使用する固体支持体は、例えば、膜、ビーズ、微
粒子、磁性微粒子、マイクロタイタープレート、ラテックスコート微粒子または
チューブなどの種々の形状または形態であってもよい。該支持体は、例えば、ニ
トロセルロース、ナイロン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリアクリルアミド
、アガロース、デキストラン、ラテックス、シリカ、プラスチックまたはガラス
などの種々の材料よりなるものであってもよい。該支持材料は、捕捉分子との結
合（例えば、共有結合）に有用な官能基を含むように誘導体化することができる
。そのような官能基には、アルデヒド、脂肪族アミン、芳香族アミン、アミド、
カルボン酸、スルフヒドリル、クロロメチル、エポキシ、ヒドラジドおよびヒド
ロキシル基が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】 該アッセイで使用する捕捉分子は、ハプトグロビンであってもよく、あるいは
GHbおよびHbに同様のアフィニティー（例えば、2桁以内、好ましくは、1桁以内 ）で結合する能力を有する他の任意の分子であってもよい。
【００３６】 ハプトグロビン（Hp）は、HbおよびGHbに特異的に結合する天然に存在する血 漿タンパク質である。Hpは、2本の重鎖（H）および2本の軽鎖（L）を四量体とし
て含有する（Valetteら, 1981 J. Biol. Chem. 256:672-679）。ヒトHpには、2 つの形態のL鎖により決定される3つの主要表現型（Hp1-1、Hp2-1およびHp2-2） が存在する（LangloisおよびDelanghe, 1996 Clin. Chem. 42:1589-1600）。Hp は、Hbを肝臓に戻すことにより鉄を維持し腎損傷を防ぐメカニズムとして、血管
内溶血中にヘモグロビンに結合する。
【００３７】 HbおよびGHbは共に、四量体として存在しうる2本のα鎖および2本のβ鎖を含 む。該鎖の二量体はα1β1およびα2β2と称される。HbまたはGHbに対するHpの 結合は、HpのH鎖とHb（Greerら, 1981 J. Biol. Chem. 256:8771-8774）またはG
Hbの二量体との間で生じる。Hpに結合するHbまたはGHb上のアミノ酸領域はβ11-
25、β131-146およびα121-127である。該複合体は柔軟でない単位となり（Wejm
anら, 1984. J. Mol. Biol. 174:319-341）、この相互作用から生じるコンホメ ーション変化はグリケーション部位の免疫原性を増強しうる。
【００３８】 捕捉分子のもう1つの例は、GHbおよびHbを認識する抗体である。Hbのα鎖に特
異的に結合する抗体が好ましい。なぜなら、それは、GHbのグリケーション部位 の認識を妨げる可能性が低いからである（例えば、Biodesign International, c
at. no. H67696M）。
【００３９】 本発明で使用するためのHpの最適な形態は、当技術分野で公知の方法を用いて
実験的に決定することができる。Hpの種々の形態が、例えばSigma（Hp1-1, cat.
no. HO138; Hp2-1, cat. no. H9887; Hp2-2, cat no. H9762）から商業的に入 手可能である。
【００４０】引き寄せウィック 図２〜４に示すとおり、GHbに関してアッセイされるサンプルは、引き寄せウ ィックにより、固定化捕捉分子を含有する装置部分を介して引き寄せられる。該
ウィックは、ナイロン、ガラスウールまたは繊維、セルロース紙、綿、ヒドロゲ
ルまたはプラスチックを含む種々の材料よりなることが可能である。
【００４１】グリケーションプローブおよびHb/Hp特異的プローブ 本発明においては、該グリケーションプローブは、未変性GHb、GHb配座異性体
Hまたはそれらの両方に特異的に結合しうる。あるいは、該Hb/Hp特異的プローブ
はHbおよびHb配座異性体Hに特異的であってもよい。該グリケーションプローブ または該Hb/Hp特異的プローブは抗体であってもよい。適当な抗体は、後記で詳 しく説明するとおりに得ることができる。また、該グリケーションプローブまた
はHb/Hp特異的プローブは、抗体以外の分子であってもよい。例えば、ボロナー トはグリケーションプローブとして有用である。ボロナート（例えば、ジヒドロ
キボロナート）はGHbの糖部分と相互作用し、米国特許第4,269,605号に記載のと
おり、検出可能な物質に結合しうる。ボロナート化合物としては、例えば、ボロ
ン酸（boronic acid）、フェニルボロン酸、ホウ酸およびボロナート化合物また
は部分が挙げられる。本発明で使用しうる追加的なボロナート化合物は、Gallop
, 米国特許第4,496,722号に記載されている。ボロナートは、ヘモグロビンに結 合したグルコースのシス-ジオール部分を介してGHbと反応して、5員環構造を形 成する。ボロナートを標識するための方法は当技術分野で公知である（例えば、
米国特許第5,459,080号）。
【００４２】 該グリケーションプローブまたはHb/Hp特異的プローブは、メッシュまたはパ ッド上に担持させることができる。該メッシュまたはパッドは、ナイロン、セル
ロース、ニトロセルロース、紙、ポリエステル、ポリスルホン、ガラスウールま
たは繊維を含む種々の材料よりなるものであってもよい。グリケーションプロー
ブおよびHb/Hp特異的プローブは該メッシュまたはパッドに共有結合しない。例 えば、検出分子を含有する溶液に該メッシュまたはパッドを漬けた後、該メッシ
ュを乾燥させ、十分なプローブを、該装置において有用な該乾燥メッシュに付着
させる。また、該プローブを、該メッシュまたはパッド上または支持体上にドロ
ップコートまたはスプレーコート（すなわち、インクジェットスプレー）するこ
とができる。
【００４３】グリケーションプローブまたはHb/Hp特異的プローブの検出 捕捉分子に結合したGHbまたはHbを、それぞれグリケーションプローブまたはH
b/Hp特異的プローブにより検出する。ついで、結合したグリケーションプローブ
またはHb/Hp特異的プローブを、直接的または間接的な方法により検出する。直 接的な可視化の場合には、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアナー
ト、ローダミン、テキサスレッドまたはCy3）を該プローブに共有結合させるこ とができる。間接的な検出の場合には、「サンドイッチ」技術における第2の標 識分子（例えば、抗体）をサンプルに適用する。抗体を標識しそのような抗体を
検出するための方法は、当技術分野で公知である。例えばColigan等、Current P
rotocols in Immunology, John Wiley & Sons, 1994を参照されたい。
【００４４】 また、検出は、共有結合した酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）により
行なうことができる。酵素標識は、典型的には、基質の準備を要する。該基質は
該酵素と相互作用して、検出可能な生成物を与える。反応を終結させるために不
活性化工程が必要かもしれない。この不活性化工程に用いる方法は、水、適当な
バッファーでの洗浄、または化学不活性化剤の添加であってもよい。
【００４５】 プローブの検出に有用な他の方法には、電気化学的検出（EP 0745843A2; McNe
ilら, Frontiers in Biosensorics II, Practical Applications, Schellerら編
, pp.17-25, Birkhauser Verlag, Basel, 1997）、放射性崩壊の検出、および蛍
光消光法が含まれる。また、金コロイド、ラテックスビーズまたはポリピロール
などの粒子標識を用いることができる。そのような方法は当技術分野で公知であ
る（例えば、米国特許第5,252,459号; Oliver, Methods in Molecular Biology,
vol. 34, Javois編, pp. 299-307, Humana Press Inc., Totowa, NJを参照され
たい）。適用する具体的な方法は、用いる標識のタイプに左右されるであろう。
【００４６】抗体の製造方法 抗原製造用のGHbは種々の方法で得ることができる。1つの方法においては、高
度にグリコシル化されたGHbを糖尿病患者から単離する。このアプローチにおい ては、血液からGHbを集めるためにボロナートカラムを使用することができる。 本発明の抗体を得るために使用するGHbは、HbA1c、GHb形態の混合物、またはHbA
1c以外の単離されたGHb変異体であってもよい。
【００４７】 単離されたGHbまたはHbをHpと混合して、GHb:HpまたはHb:Hp複合体を形成させ
ることができ、それらを抗原として使用する。Hpは、いずれの哺乳動物（好まし
くは、ヒトまたはヒツジ）に由来するものであってもよい。後記のとおり、該複
合体は非複合化成分から分離し、免疫原として使用する。例えば、GHbをHp1-1と
反応させて、約150,000ダルトンの複合体を形成させる。該複合体を、サイズ排 除クロマトグラフィーにより、GHb（約64,000ダルトン）および未結合Hp（約85,
000ダルトン）から分離する。同様に、Hp1-1の代わりにHp2-1およびHp2-2を使用
することができる。Hp:GHb複合体を全タンパク質分析および分光吸光度により特
徴づけして、タンパク質の質量当たりの結合GHbの量を求める。
【００４８】 ヒトHpを使用する場合には、それはHp1-1サブクラスまたはその他のサブクラ ス（例えば、2-1、2-1）のもの、またはいくつかのサブクラスの混合物であって
もよい。種々のHpサブクラスが商業的に入手可能である。免疫原を製造するため
の他の方法（例えば、WO 96/39180に記載のもの）を用いることが可能である。
【００４９】 Hpに対するGHbおよびHbの結合は非常に高いアフィニティーの相互作用（すな わち、約10-10〜10-15）であるため、先行技術においては、それは「不可逆的」
であるとされている（Hwangら, 1980, J. Biol. Chem. 255:3083-3041）。した がって、非共有結合したHp/Hb複合体を使用することができる。あるいは、当技 術分野で公知の方法を用いて、該複合体を共有結合させることができる。いずれ
かの特定の理論に拘束されるものではないが、本発明の方法はGHbに対する抗体 を与えるはずである。なぜなら、該グリケーション部位は、それらが抗原として
提示されるのに有利な立体配置にあると考えられるが、それらはHp結合部位から
比較的遠いからである。したがって、HpはHbに結合して、HbA1cエピトープを露 出させる比較的強固な立体配置を形成するが、Hpは、HbまたはGHb上のグリケー ション部位の抗原性を妨げるとは考えられない。
【００５０】 GHbに対する細胞性および体液性免疫応答を増強させるために、該抗原をアジ ュバントと共に動物に投与することができる。該免疫原は、該抗原と該アジュバ
ントとのエマルションまたは混合物を形成させることにより調製する。好ましい
アジュバントはフロイントアジュバント（DIFCO, Detroit, MI）である。しかし
ながら、その他のアジュバント（Stewart-Tull, The Theory and Practical App
licaton of Adjuvants, 1995, Wiley, Chichester; AdamおよびSouvannavong, S
tructure of Antigens, CRC Press, Boca Raton, Fl, pp.159-177）、例えば、R
IBI Immunochem products（Hamilton MT）、Titermax（Norcross, GA）、Gerbu （Gaiberg, Germany）の種々の製品またはミョウバン混合物（これらに限定され
るものではない）の選択が許容される。
【００５１】 該抗原の抗体認識を更に増強するために、免疫応答モジュレーター（Harlowお
よびLane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo
ratory, New York, pp.53-137）を該免疫原と共に使用し、別々に動物に投与す ることができる。これには、細菌細胞壁の天然または合成成分、例えば、リポ多
糖体（LPS）、熱不活化百日咳（B. pertussis）ワクチンおよびグルカンが含ま れるが、これらに限定されるものではない。該免疫原を動物に運搬するには、IS
COMS（Immune Stimulating Complexes; 例えば、Coliganら, 前掲を参照された い）、リポソーム、および微粒子または同様の固相支持体を使用する。
【００５２】 免疫化方式は、正常、自己免疫またはSPFマウス、ラット、ハムスター、モル モット、ウサギ、フェレット、ヒツジ、ヤギまたはウシ（これらの種に限定され
るものではない）におけるモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方
の製造に有用である（GrovesおよびTucker, 1989, Vet. Immunol. Immunpath.,
23:1-14; Ouら, 1991, J. Immunol. Meth., 145:111-118）。投与経路は、皮下 、筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、リンパ系経由、経口的または粘膜に対するも
のであってもよい。また、それは足蹠経由で投与することができるが、この経路
は望ましくない窮迫を動物に与えるため避けるのが好ましい。用量は、例えば、
動物の体重に応じて約0.1ug〜約10mgであってもよい。ヒツジ、マウス、ウサギ またはヤギが好ましい。追加刺激頻度は約1週〜約1年であってもよい。
【００５３】 例えば、マウスにおいて抗体を産生させるためには、初回免疫として、完全フ
ロイントアジュバント中の10〜20μgのGHb/Hp複合体をいくつかの部位に投与す る。追加刺激は、不完全フロイントアジュバント中の10〜20μgのGHb/Hp複合体 を使用して2〜3ヵ月の時点で行なう。ウサギにおいて抗体を産生させるためには
、完全フロイントアジュバント中の約100〜500μgのGHb/Hp複合体を注射する。3
〜4ヵ月後、不完全フロイントアジュバント中の約20〜50μgの該抗原で該動物を
追加刺激する。GHb、GHb配座異性体H、HbおよびHb配座異性体H抗体に特異的に結
合する抗体に関して、2〜3週間後に血清を評価する。所望の抗体が有用な力価で
検出されるまで、約2〜3ヵ月間隔で追加的な追加抗原を投与する。また、GHbと 複合化したヒトHpを初回免疫に、GHbと複合体化した非ヒト（例えば、ヒツジ）H
pを追加刺激に使用するのが有利かもしれない。
【００５４】 重要でないいずれかの免疫優性エピトープに対する免疫応答の生成を避けるた
めに、TおよびBリンパ球において免疫寛容を誘導する方法を用いることができる
（Abbasら, 1991, Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Compan
y, Philadelphia, PA, pp. 204-221; Butler, 1991, Immunochemistry of Solid
Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL）。寛容技術の少数の例とし ては、シクロホスファミド、新生児免疫、および望ましくない抗原の高用量の注
射の利用によるものが挙げられる。
【００５５】 標的抗原を使用するイムノアッセイ（米国特許第5,478,754号; Goding, 1996,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, Lodon,
p.141-233）における評価のために、血清または血漿サンプルを該動物から採取 する。適当なイムノアッセイ方式には、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、ラ ジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光イムノアッセイ（FIA）、電気泳動技術、およ
び化学発光アッセイ（直接、間接または競合阻害アッセイにおけるもの）が含ま
れる。好ましくは、スクリーニングパネルは、関連交差反応物、および関心のあ
る抗原を含む。固相抗原アッセイにおける望ましくない成分に特異的な抗体を吸
収させるために、該交差反応物を含有する希釈剤を使用することができる。
【００５６】 融合には、脾臓、末梢血またはリンパ節から単離したB細胞を使用する。標準 的なPEGまたは電気融合技術（Goding, 前掲）を用いて、適合性のミエローマで 該B細胞を不死化するが、その代わりに、新たな細胞構築物またはファージ技術 において、リンパ球遺伝子産物を使用することが可能である。細胞培養を樹立さ
せクローニングして、選択培地の補助によりモノクローン性を確保する。永久的
な試薬の供給の可能性を保証するために、細胞バンクを作製する。既に記載され
ているとおりに、得られた抗体（または結合剤）を試験する。
【００５７】 抗体産生のための他の方法（例えば、非マウスミエローマ融合）を用いること
が可能である。また、当技術分野で公知の方法により、抗体をヒト化することが
できる。
【００５８】 抗体は、放射性もしくは蛍光性部分、粒子状標識（例えば、金コロイド）また
は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）を含む適当な任意のもので標識する
ことができる。抗体に標識を結合させるためのプロトコールは当技術分野で公知
である。
【００５９】 （実施例） 実施例１：ハプトグロビンはヘモグロビンに用量依存的に結合する グリコまたは非グリコヘモグロビンに対するハプトグロビンの結合能を示すた
めに、ELISA方式を用いた。Sigmaから得たハプトグロビン（全Hp型の純度99％の
プール）を50mM炭酸バッファー（pH9.6）に0.02mg/mlで再懸濁させた。100μlの
アリコートを96ウェルマイクロタイタープレートのウェル内に配置し、20℃で一
晩のインキュベーションにより該表面に固定化した。ウェルをPBS/0.1％ Tween
20で3回洗浄した。ウェルを、3％脱脂乳（Sigma）を含有する50mMグリシンバッ ファー（pH8.0）でブロッキングした。ヘモグロビン（Pierce）またはグリコヘ モグロビン（Pierce）を140μg/mlに希釈した。100μlのヘモグロビンまたはハ プトグロビンをHpコート化マイクロタイターウェルに加え、室温で20分間までイ
ンキュベートした。ウェルをPBSでリンスし、Hb（American Research Products,
Inc.; ARP）およびGHb（ARP）に対する抗体を適当なウェルに加え、室温で20分
間インキュベートした。1：1000希釈したアルカリホスファターゼに共役した抗 ヒツジ抗体（Sigma）を加え、室温で20分間インキュベートすることにより、抗 体結合を検出した。ウェルをPBSでリンスし、0.2M Trisバッファー（pH10.0）中
の24mM p-ニトロフェニルホスファート（p-NPP）200μlを各ウェルに加えた。La
bsystem Multiskan RCプレートリーダーを使用して、吸光度の変化率を405nmで1
0分間モニターした。このアッセイにおいて、ハプトグロビンはHbおよびGHbの両
方に結合した。この実験においては、7.5秒以内にGHb/HbはHpを飽和した。
【００６０】 実施例２：ニトロセルロース細片に固定化されたHpは視覚的に検出可能な量の
HbおよびHbA1cに結合する 膜結合Hpがヘモグロビンおよびグリコヘモグロビンに結合する能力を評価する
ために、実施例１と同様の実験を行なった。HpをPBS（pH7.4）に2.5、1.25、0.6
3および0.32mg/mlで再懸濁させ、4.0μlの各希釈液をニトロセルロース細片（Mi
llipore）に適用し、乾燥器中37℃で1〜4時間乾燥させ、ついで使用するまで保 存した。前記のとおり、ニトロセルロースに結合したHpをHbまたはGHbと共にイ ンキュベートした。Hpに特異的に結合していないすべてのHbおよびGHbを除去す るためにリンスした後、基質であるテトラメチルベンジジン（TMB）と共に該細 片を30秒間インキュベートした。TMBは、GHb/Hbオキシダーゼ活性により緑色発 色団へと酸化されるため、GHb/Hbの直接的な尺度を与える。得られた生成物を、
半定量的目視検査により評価した。GHbおよびHbは共に、この方法で検出可能で あった。
【００６１】 実施例３：Hpに結合した場合のHbおよびHbA1cは異なる抗体により識別されう る Hpに結合した場合のGHbの抗原性に関してアッセイするために、ヒツジ抗HbA1c
ポリクローナル抗体を使用した。ハプトグロビンをマイクロタイターウェル内に
固定化し、GHbとHbとの飽和レベルの混合物を該ウェル内でインキュベートして 、Hp:GHb/Hb複合体を形成させた。ヒツジ抗HbA1c抗体（1：10,000希釈）を該ウ ェルに加え、30分間インキュベートし、洗浄した。アルカリホスファターゼに共
役した二次抗ヒツジ抗体を使用して、結合抗体の量を検出した。過剰の二次抗体
を除去するために洗浄した後、Trisバッファー（pH10.0）中の基質p-NPPを加え た。405nmにおける1分当たりの吸光度の変化を10分間にわたりモニターした。正
常対照ヘモグロビン（4.8％）、異常（糖尿病）ヘモグロビン（16％）およびGHb
とHbとの混合物（10.4％および13.2％グリコヘモグロビンを含有）を含有するサ
ンプルを評価した。図５に示すとおり、このアッセイを用いて全4個の希釈度のG
Hbを識別することができた。
【００６２】 HpのGHb/Hb飽和結合は7.5秒以内に完了していることが判明した。
【００６３】 NaBH4はGHb上の糖を還元して、グルシトールを与える（WO91/02978を参照され
たい）。GHbに対して産生したいくつかの抗体は、天然GHbを認識する場合より大
きな特異性でGHbのグルシトール形態を認識するため、処理されたGHbに結合する
Hpの能力に対するNaBH4処理の効果を検討した。
【００６４】 2μg/ウェル（炭酸バッファー（pH9.6）中20μg/mlの100μl）をアリコート化
し一晩インキュベートすることにより、Hpをマイクロタイタープレート内に固定
化した。該ウェルを洗浄しブロッキングした（グリシンバッファー中の3％脱脂 乳で行なった）。GHbおよびHbを含有するサンプル（4.8%、10.4%、13.2%および1
6%のGHb）を50mM NaBH4中でそれぞれ28μg/mlまで希釈した。該サンプル100μl をウェルに加え、室温で10分間インキュベートした。ウェルを3回洗浄して、GHb
、HbおよびNaBH4を除去した。マウス抗HbA1cを該ウェルに加え、室温で30分間イ
ンキュベートした。洗浄後、p-NPPを加え、吸光度の変化率を、前記のとおりに 測定した。GHbに関するアッセイは、グルシトール形態（例えば、NaBH4で処理さ
れたもの）を該アッセイで使用した場合には、未処理形態の場合と比べて若干高
感度であることが判明した。
【００６５】 この実験においては、ヒツジポリクローナル抗A1c抗体の代わりに、1:500希釈
されたマウスモノクローナル抗GHb（Immtech）を使用した。該抗ヒツジIgGアル カリホスファターゼ共役体の代わりに抗マウスIgG共役体を使用した。結果は、 前記のとおりであった。
【００６６】 実施例４：免疫原の調製 前記の抗体を製造するために免疫原として使用するHpとGHbとを複合体形成さ せる。Hp1-1:GHbは、Hp1-1（分子量=85,000ダルトン）およびGHb（分子量=64,00
0ダルトン）をそれぞれ1:5（モル:モル）の比で混合することにより調製する。 一定の攪拌を37℃で1.0時間行ないながら、各成分を50mM PBS（pH7.4）に懸濁す
る。この比率は、すべての活性なHp1-1がGHbに結合して複合体を形成することを
保証する。所望の収量は、20〜30mg（150,000ダルトンの分子量を有するHp1-1:G
Hb）である。30mgのHp1-1と112mgのGHbとの混合物を出発物質として使用する。G
Hb:Hp複合体を、サイズ排除ゲルクロマトグラフィーにより該出発物質から分離 する。還元ゲル電気泳動、非還元ゲル電気泳動およびHPLCにより、該複合体の純
度を調べる。質量1mg当たりのGHb含量を分光分析を用いて測定して、複合体形成
しているHpとGHbとの比を推定する。
【００６７】 Hp2-1およびHp2-2はHp1-1より大きな複合体であり、どちらの表現型に関して も分子量は様々である。それぞれは、1,000,000ダルトン以上になりうる分子量 範囲を有する。Hp1-1に関して前記したとおり、過剰のGHbを各表現型と組合せ、
未複合化GHbをサイズ排除クロマトグラフィーにより除去する。純度およびGHb含
量（GHb:Hp複合体の質量1mg当たり）を、前記のとおりに測定する。
【００６８】 実施例５：GHbの検出のための金電極の使用 Hpに結合したGHbを検出するアッセイの実施可能性を試験するために実験を行 なった。脱イオン水中のHpの20μg/ml溶液中でのオーバーナイトインキュベーシ
ョンにより、HpをGI金電極細片上に固定化した。該電極を水で3回洗浄し、使用 するまで保存した。GHb/Hb溶液（0.0〜5.0nM/mlで2μl）を各細片に適用し、10 秒間インキュベートし、3回洗浄した。ついで細片をヒツジ抗GHb（1:10,000）中
で15分間インキュベートし、3回洗浄し、ついで共役体（1:2000）中でインキュ ベートし、洗浄した。ついで30μlのpAPPを電極表面上にピペッティングし、電 流をクロノアンプレオメトリーにより30秒にわたり測定した。図６に示すとおり
、観察された最低の検出レベルは約1.0pmolであった。この実験で使用した抗体 は、Hbに対する交差反応性を大量に有するため、該アッセイは、本発明で用いる
のには十分な精度を与えない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａは、捕捉分子を含む固体支持体を示す。 図１Ｂは、GHbおよびHbに結合した捕捉分子を含む固体支持体を示す。 図１Ｃは、GHbおよびHbに結合した捕捉分子ならびにグリケーションプローブ を含む固体支持体を示す。
【図２】 図２は、本発明を例示するアッセイ装置の平面図である。
【図３】 図３は、図１に記載のアッセイ装置の側面図である。
【図４】 図４は、本発明の捕捉／検出部分の詳細な断面図である。
【図５】 図５は、ヒツジ抗A1cを用いてHpに結合したHbを検出した場合の用量反応曲線 のグラフである。
【図６】 図６は、GHbを検出するための電気化学的方法の感度を示すデータのグラフで ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サンゲラ，ゴードン アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02158、ニユートン、ジエフアーソン・ス トリート・ナンバー・16・65 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA25 CA25 CB17 DA45 FA11 FB01 FB03 FB07 FB12 FB13 FB14 FB15 GC15 【要約の続き】

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 固体支持部材を含んでなる、生物学的流体中のグリコヘモグ
    ロビン（GHb）をアッセイするためのキットであって、該部材が、予め決められ た量の固定化グリコヘモグロビン/ヘモグロビン（GHb/Hb）捕捉分子を含むこと を特徴とするキット。
  2. 【請求項２】 グリケーションプローブを更に含む、請求項1に記載のキッ ト。
  3. 【請求項３】 Hb/Hp特異的プローブを更に含む、請求項1に記載のキット。
  4. 【請求項４】 該グリケーションプローブが抗体である、請求項2に記載の キット。
  5. 【請求項５】 該Hb/Hp特異的プローブが抗体である、請求項3に記載のキッ
    ト。
  6. 【請求項６】 該グリケーションプローブがボロナート誘導体である、請求
    項2に記載のキット。
  7. 【請求項７】 グリケーションプローブを検出する手段を更に含む、請求項
    2に記載のキット。
  8. 【請求項８】 Hb/Hp特異的プローブを検出する手段を更に含む、請求項3に
    記載のキット。
  9. 【請求項９】 該捕捉分子がハプトグロビン（Hp）である、請求項1に記載 のキット。
  10. 【請求項１０】 該捕捉分子が抗体である、請求項1に記載のキット。
  11. 【請求項１１】 該検出手段が、化学発光、電気検出、蛍光分析、蛍光消光
    、酵素免疫細胞化学、および結合粒子の可視化よりなる群から選ばれる、請求項
    7または請求項8に記載のキット。
  12. 【請求項１２】 生物学的流体中にGHbが存在すればそれを検出するための 方法であって、 a．予め決められた量のGHb/Hb捕捉分子を含む固体支持部材を準備し、 b．該生物学的流体を該支持部材と接触させ、それにより、GHb/Hbで飽和した 支持部材を形成させ、 c．該GHb/Hb飽和支持部材をグリケーションプローブと、該グリケーションプ ローブがその標的（該標的はGHbよりなる）に結合するのを許容する条件下で接 触させ、 d．未結合グリケーションプローブを除去し、 e．捕捉GHbに結合したグリケーションプローブの量を検出し、それにより、グ
    リコヘモグロビンが存在すればそれを検出する工程を含んでなる方法。
  13. 【請求項１３】 生物学的流体中にGHbが存在すればそれをアッセイするた めの方法であって、 a．予め決められた量のGHb/Hb捕捉分子を含む固体支持部材を準備し、 b．該生物学的流体を該支持部材と接触させ、それにより、GHb/Hbで飽和した 支持部材を形成させ、 c．該GHb/Hb飽和支持部材をHb/Hp特異的プローブと、該Hb/Hp特異的プローブ がその標的（該標的はHbよりなる）に結合するのを許容する条件下で接触させ、 d．未結合Hb/Hp特異的プローブを除去し、 e．捕捉Hbに結合したHb/Hp特異的プローブの量を測定し、該生物学的流体中に
    GHbが存在すればその量を求める工程を含んでなる方法。
  14. 【請求項１４】 該グリケーションプローブが抗体である、請求項12に記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】 該Hb/Hp特異的プローブが抗体である、請求項13に記載の 方法。
  16. 【請求項１６】 該抗体が、 a．GHb配座異性体Hに特異的に結合する抗体、および b．GHb配座異性体Hおよび未変性GHbに特異的に結合する抗体 よりなる群から選ばれる、請求項14に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該抗体が、 a．Hb配座異性体Hに特異的に結合する抗体、および b．Hb配座異性体Hおよび未変性Hbに特異的に結合する抗体 よりなる群から選ばれる、請求項15に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該抗体がGHb配座異性体Hに特異的に結合する、請求項12に
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該捕捉分子がHpである、請求項12または請求項13に記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】 該生物学的流体が哺乳動物由来である、請求項12または請
    求項13に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 該哺乳動物がヒトである、請求項20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 該哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項20に記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】 該生物学的流体が血液である、請求項20に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 GHb配座異性体H、未変性GHbまたはそれらの両方に特異的 な抗体の製造方法であって、 a．GHbをHpに結合させ、それによりGHb/Hp複合体を得、 b．該GHb/Hp複合体を抗体産生系中に配置し、 c．該産生系から抗体含有産物を得、 d．該産物中の、GHb配座異性体H、未変性GHbまたはそれらの両方に特異的な抗
    体を単離する工程を含んでなる製造方法。
  25. 【請求項２５】 Hb配座異性体HまたはHb配座異性体Hおよび未変性Hbに特異
    的な抗体の製造方法であって、 a．HbをHpに結合させ、それによりHb/Hp複合体を得、 b．該Hb/Hp複合体を抗体産生系中に配置し、 c．該産生系から抗体含有産物を得、 d．該産物中の、Hb配座異性体HまたはHb配座異性体Hおよび未変性Hbに特異的 な抗体を単離する工程を含んでなる製造方法。
  26. 【請求項２６】 該結合が非共有的である、請求項24または25に記載の製造
    方法。
  27. 【請求項２７】 該結合が共有的である、請求項24または25に記載の製造方
    法。
  28. 【請求項２８】 該抗体産生系が、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ニワト
    リ、ロバおよびヒツジよりなる群から選ばれる、請求項24または25に記載の製造
    方法。
  29. 【請求項２９】 該抗体産生系がin vitro系である、請求項24または25に記
    載の製造方法。
  30. 【請求項３０】 GHb配座異性体H、未変性GHbまたはそれらの両方に特異的 に結合する抗体。
  31. 【請求項３１】 Hb配座異性体Hに特異的に結合する抗体。
  32. 【請求項３２】 GHbおよびGHb配座異性体Hに特異的に結合する、請求項24 に記載の製造方法により得られる抗体。
  33. 【請求項３３】 HbおよびHb配座異性体Hに特異的に結合する、請求項25に 記載の製造方法により得られる抗体。
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