JPH01155268A - 血液中ヘモグロビン誘導体を簡便に測定するための変性試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｉ肌Ω宣１ 本発明は、血液試料中の特定のヘモグロビン誘導体の相
対量を測定するための方法に関する。更に詳しくは、本
発明は、血液中の誘導ヘモグロビンの割合又はパーセン
テージを測定するために全ヘモグロビンの分離測定及び
ヘモグロビン誘導体の測定を必要とする、グリケート化
（ｇｌｙｃａｔｅｄ）ヘモグロビンのようなヘモグロビ
ン誘導体の測定に関する。

ｉｎ　ｖｉｖｏの方法によって生成する、特定の誘導体
の形態で血流中に存在するヘモグロビンの相対量の測定
は、種々の医学的な状況において重要である。特に重要
なものはグリケート化ヘモグロビン（グリコジル化ヘモ
グロビンと称されることもある）の測定である。グリケ
ート化ヘモグロビンを測定して糖尿病のメリタス（ｍｅ
ｌｌｉｔｕｓ）中の長期的な血液グルコース制御を評価
することが、その使用頻度を増している。糖尿病の処置
において最も重要なグリケート化ヘモグロビンは、通常
ヘモグロビンＡｌｃとして知られている誘導体である。

このヘモグロビン誘導体は、グルコースとヘモグロビン
との非酵素的反応によってｉｎ　ｖｉｖｏで生成される
。グルコースは、天然ヘモグロビン中のβ鎖のアミノ末
端バリン残基に、再配列形態で共有結合付加するように
なる６通常の個体はその全ヘモグロビンの約３〜６％を
Ａｌｃ形態で有するが、制御されていない糖尿病患者の
個体は、３〜４倍高い量のこのヘモグロビン誘導体を血
液中に有しうる。

グリケート化ヘモグロビンを測定する目的で種々の方法
が開発されている６通常の方法は、陽イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電
気泳動及び染料コンプレックス形成（ヒドロキシフルフ
ラル／チオバルビッル酸）のような種々の技術に基くも
のである。これらの方法は、時間のかかる複雑なもので
あり、特別な熟練者を必要とし、不正確性及び非特異性
が避けられないことが良く知られている。ごく最近にな
って、イムノアッセイを行なってヘモグロビンＡｌｃを
測定することを可能にする、ヘモグロビンＡｌｃ中のグ
リケート化Ｎ末端ペプチド残基に対して特異なモノクロ
ーナル抗体が開発された（米国特許第４．６４７．６５
４号参照）。

モノクローナル抗体を用いるヘモグロビンＡｌｃのイム
ノアッセイ測定は高度に特異的であり、手順の冗長さ及
び複雑さは先行技術の方法と比較して太き（減少してい
る。それにもかかわらず、最適のヘモグロビンＡｌｃイ
ムノアッセイは、グリケート化Ｎ末端ペプチド残基を抗
体結合に利用しうるようにするために血液試料を変性条
件にかけることを必要とする（米国特許第４．６５８．
０２２号参照）０代表的な変性条件は、３Ｍ以上のグア
ニジン−Ｈ（ｌで、５６℃に１５分以上加熱することで
ある。

イムノアッセイ法をはじめとする先行方法の更なる制限
は、グリケート化ヘモグロビン濃度をパーセンテージと
して有意に示すことができるように、全ヘモグロビン測
定をそれぞれの測定と共に行なう必要があることである
。これによって、試験を行なうための全時間及び経費が
増大する。

及豆五蓋１ ここで、血液試料を、（１）試料中のヘモグロビンを変
性せしめるチオシアネート塩及び（ｉｉｉ）ヘモグロビ
ンをメトヘモグロビンの形態に転化せしめうる酸化剤を
含む変性試薬で処理した後、処理試料を全メトヘモグロ
ビンに関して試験し、試料の同一の又は他の部分を、対
象とする変性された形態のヘモグロビン誘導体に関して
試験することによって、グリケート化ヘモグロビンのよ
うな特定のヘモグロビン誘導体に関する、極めて単純で
、迅速で正確な試験を行なうことができることが見出さ
れた０次に二つの試験結果を、例えばパーセンテージの
ような任意の数学的な方法で関連させて、試料中のヘモ
グロビン誘導体の相対量を定量測定する。

メトヘモグロビンは、５４０ｎｍにおけるその特徴的な
吸光度を測定することによって簡便に測定される。対象
とするヘモグロビン誘導体の変性形態は、イムノアッセ
イによって簡単にかつ明確に測定することができる。特
に有用なイムノアッセイ法は粒子凝集抑制に基くもので
あり、これは、任意の好都合な波長、例えばメトヘモグ
ロビン測定と同一の波長、すなわち５４０ｎｍにおける
濁度によって読みを行なうように設定することができる
。このように、本発明によって、全ヘモグロビンと共に
ヘモグロビン誘導体のパーセントを測定し、ヘモグロビ
ン誘導体の測定を、単一の波長において、適当なブラン
ク値及び最適化と共に簡単な分光光度計によって行なう
ことが可能になる。

血中の天然ヘモグロビン（Ｆｅ＋２）を（Ｆｅ”）メト
ヘモグロビンの形態に転化させる酸化剤の存在が、チオ
シアネート変性剤と相乗的に作用し、試験のイムノアッ
セイ部分のための試料ヘモグロビンの変性速度が向上す
ることが見い出された。

酸化剤の非存在下においては、室温におけるチオシアネ
ート変性は、再現しうる程度の実質的に完全な変性を行
なうためには、約７分間以下を必要とする。有効量の酸
化剤が存在すると、実質的に完全な変性は３分以内で行
なうことができ、好ましい酸化剤、フェリシアニドの場
合には、室温において１分以内で行なうことができる。

また、酸化剤とチオシアネートとを配合することによっ
て、同一の試験試料について、全ヘモグロビン及びヘモ
グロビン誘導体の試験を行なうことも可能になる。

したがって、本発明によると、全試験時間が大きく減少
し、血液試料中のヘモグロビンＡｌｃのようなヘモグロ
ビン誘導体の相対量を定量する、迅速で、簡単で正確な
メトヘモグロビンイムノアッセイ法を行なうのが容易に
なる。

ましい　　　　の！日 変性試薬として、チオシアネート塩と酸化剤とを配合す
ることによって、血液試料中の実質的に全てのヘモグロ
ビンを、迅速かつ再現可能に変性チオシアン−メトヘモ
グロビン形態に転化する手段が提供される。得られるチ
オシアン−メトヘモグロビンは、全試料ヘモグロビンを
測定するための基礎として有用であり、対象とする変性
形態の特定のヘモグロビン誘導体は、かかる変性種に関
するイムノアッセイにおける分析対象物として有用であ
る。イムノアッセイは、好ましくは、対象とする変性ヘ
モグロビン誘導体に関するモノクローナル抗体の特異親
和力に基く。

チオシアネート塩は、イオン化によって、試験において
検出するためにヘモグロビン誘導体を変性するのに有効
なチオシアネートアニオン（ＳＣＮ”）を与えるいかな
る塩の形態からも選択することができる。対陽イオンは
、全ヘモグロビン及び誘導体化ヘモグロビン試験に対し
て生ずる可能性のある全ての障害を最小化又は排除する
ように選択される。アンモニウム、カリウム及びナトリ
ウムチオシアネートが本発明の目的に有用である。チオ
シアネート塩溶液を、混合物中において有効な変性濃度
を与えるのに充分な量で血液試料に加える０通常の場合
、変性混合物中において約０．５〜約６．０Ｍ、より通
常的には約１．５〜約３．５Ｍの濃度が用いられる。変
性剤の濃度を増加させると変性速度が速くなる。また、
温度を上昇させると、変性速度が概して上昇する。好ま
しい条件は、約３Ｍ以上の濃度のチオシアネートの存在
下での室温にあける変性である。変性混合物中のチオシ
アネートの濃度が、ヘモグロビン誘導体に関するイムノ
アッセイの特性に影響を与えつる濃度、例えば約１．５
〜２．０Ｍを超える濃度である場合には、混合物を適当
に希釈する。

酸化剤は、天然のヘモグロビン第１鉄イオンをその第２
鉄メトヘモグロビンの形態に転化するのに充分な電気化
学ポテンシャルを有する実質的にいかなる無機又は有機
酸化剤から選択することもできる。もちろん、その酸化
ポテンシャルによって選択された酸化剤の候補物質を、
試験系において試験し、全ヘモグロビン及び誘導体化ヘ
モグロビン試験に大きく影響を与えないことを確認する
１種々の酸化剤がヘモグロビンをそのメトヘモグロビン
の形態に転化させるのに有効であることが文献において
知られている［Ａｄｖａｎｃｅｓ　１ｎＣ１ｉｎｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｏ＋１ｓｔｒｙ、　８：１４２−１８５　（
１９６５）を参照］。

酸化ポテンシャルに基いて適当であると考えられる酸化
剤としては、フェリシアニド、ヨウ素酸塩、塩素酸塩、
臭素酸塩、クロム酸塩、塩化第２水銀、セリウム（ｒＶ
）及びタリウムイオン、次亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩、
ヨウ化物、ヒドロキシアミン、ブロモスクシンイミド、
クロロスクシンイミド、クロロアミン及びペルオキシド
が挙げられる。変性を実質的に完了させる時間を減少さ
せる変性速度の向上度合は、もちろん、選択される酸化
剤によって変化する。実験試験を速やかに行ない、チオ
シアネートと配合して充分に迅速な変性を与える酸化剤
を選択することができる。

実質的に完全な変性とは、本明細書においては、血液試
料中のヘモグロビンの変性によって、選択されたイムノ
アッセイを用いて検出することのできる実質的に最大量
の変性ヘモグロビン誘導体が与えられる時点を意味する
と理解される。したがって、完全な変性という概念は、
ヘモグロビン蛋白の全ての三次及び二次構造が完全に分
解されることが必要であることを意図するものではなく
、選択されたイムノアッセイ手段によって検出されるヘ
モグロビン誘導体のエピトープの露出が最大になること
を意図するものである。通常、イムノアッセイは、ヘモ
グロビン誘導体を特徴とする特のエピトープに対するモ
ノクローナル抗体の特異性に基くものである。したがっ
て、試料中のヘモグロビンの実質的に完全な変性とは、
かかるヘモグロビンの実質的に全てが、試験において完
全に検出されつるのに充分に変性されていることを意味
するものである。指定の時間間隔でヘモグロビン誘導体
イムノアッセイを行ない、試験応答曲線が極値に達する
点を観察することによって、与えられた変性条件下で実
質的に完全な変性に達するのに費やされる時間が測定さ
れる。

酸化剤は、過剰量、例えば試料中に通常存在するヘムの
５倍過剰量で加えられる。２０倍過剰以下の量を有利に
用いることができる。特定の試験に関する適当な量は、
当該分野の技術者によって決定することができる。

酸化剤の非存在下においては、室温におけるチオシアネ
ート変性は、実質的に完全な変性に達するのに７分以下
を要する。イムノアッセイに実質的に障害を及ぼすこと
なくこの変性時間を減少させることが見い出された酸化
剤としては、フェリシアニド、ヨウ素酸塩、塩素酸塩、
クロム酸塩及び亜硝酸塩が挙げられる。特ｊこ、塩素酸
塩及び亜硝酸塩が変性時間を３分以下に減少させ、また
、フェリシアニドが、約３Ｍ以上のチオシアネート濃度
を用いて室温において１分未満で実質的に完全に変性が
行なわれるという最良の結果をもたらすことが見い出さ
れた。

チオシアネート／酸化剤変性剤を用いることの主たる有
用性は、室温においで迅速な変性が得られることである
。しかしながら、好ましいと考えられる場合は、温度を
上昇させることによって変性を更に加速することができ
る。更に、異なる複数の酸化剤をチオシアネートと配合
して用いることも本方法によって考慮される。

チオシアネート／酸化剤変性剤対は、血液試料と段階的
に、又は好ましい場合には同時に混合することができる
０通常、チオシアネート及び酸化剤の変性試薬溶液を調
製し、これを血液試料と直接混合する。安定性の理由の
ために、変性試薬溶液は、試験において用いる直前に調
製されることが多い、しかしながら、安定性が許す場合
、あるいは、チオシアネート塩と酸化剤とを配合するこ
とを可能にする安定剤又は器具の構造を用いる場合には
、変性試薬溶液を長時間にわたって保存及び／又は包装
しておくことができる。変性剤成分は、乾燥した形態で
混合することができ、そうでない場合には、試験試料及
び／又は希釈剤又はバッファーによる再水和によって試
薬溶液を形成するように配合することができる。

本発明方法は、その変性形態においてイムノアッセイに
よって検出される血中のいかなるヘモグロビン誘導体の
試験に適用することもできると意図されている。かかる
ヘモグロビン誘導体としては、アルコールの乱用による
アセトアルデヒド−ヘモグロビン付加物、尿毒症患者の
血液中に存在する尿素−ヘモグロビン付加物、アスピリ
ン−ヘモグロビンコンプレックス、及び、特に、ヘモグ
ロビン蛋白上の反応性アミン基とグルコースとの非酵素
反応によって生成するグリケート化ヘモグロビンの類が
挙げられるが、これらに限定されるものではない０本発
明は、上記記載のようなヘモグロビンＡｌｃの測定に特
に適切である。　　。

処理され、変性された血液試料を、全メトヘモグロビン
及び対象とするヘモグロビン誘導体に関して別々に試験
し、次に、結果を数学的に関連させて、対象とする誘導
体化形態の血中ヘモグロビンの相対量の測定値を与える
。全メトヘモグロビンは、Ｄｒａｂｋｉｎｓ法（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｆｏｒＣｌｉｎｉ
ｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　
ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕ、Ｓ、。

Ｐｒｏｐｏｓｅｄ　Ｓ’ｔａｎｄａｒｄ　ＰＳＨ−１５
）のようないかなる通常の方法によっても測定すること
ができる。全メトヘモグロビンを測定する最も好都合な
方法は、特徴的な波長、例えば５４０ｎｍにおいて、溶
液におけるその吸光度を測定することによるものである
。

ヘモグロビン誘導体の測定は、通常、イムノアッセイに
よって行なわれる。上記記載の米国特許第４．６４７．
６５４号及び同第４，６５８゜０２２号において記載さ
れているように、モノクローナル抗体を展開させて、変
性蛋白中のヘモグロビン誘導体、例えばヘモグロビンＡ
ｌｃを特徴付けているエピトープに特異的に結合させる
ことができる。特定のイムノアッセイ法及び形式、並び
に標識化方法及び生成する信号の検出は、本発明に重要
なものではない、原則として、酵素標識体（ＥＬＩＳＡ
）の使用に基くものなどのような非ラジオアイソトープ
法が好ましい。

別の工程を用いずに行なうことができ、分析対象物濃度
に関連する測定可能な吸光度の変化な与えるので、粒子
凝集抑制イムノアッセイが特に有用な方法である。かか
る試験は、抗体粒子試薬と凝集試薬との特異的な相互作
用に基くものである。抗体粒子試薬は、水懸濁性粒子（
例えばポリスチレン又は他のラテックス）に結合してい
る抗体又はそのフラグメント含も、凝集剤は、抗体試薬
に対する多数のエピトピック（ｅｐｉｔｏｐｉｃｌな結
合部位を含む０分析対象物の非存在下においては、抗体
粒子と凝集剤とが互いに結合して、濁度測定によって速
やかに定量される光拡散性コンプレックスを形成する。

存在する分析対象物の量が増加すると、抗体粒子は分析
対象物と結合するようになって凝集剤と結合することが
できなくなるので、溶液の濁度が減少する。凝集剤は、
好適には、対象とするヘモグロビン誘導体を特徴付ける
エピトープを画定する多数の有機基、例えばペプチド残
基が付加しているポリマー骨格を有する。

例えば、ヘモグロビンＡｌｃの測定のためには、エピト
ープは、ヘモグロビンＡｌｃ中のグリケート化−Ｎ−未
満残基の配列に対応する数個のアミノ酸単位のグリケー
ト化ペプチド残基を含んでいてよい。

全メトヘモグロビン及び誘導ヘモグロビンの試験は、そ
れぞれ、処理された血液試料の同一の部分で行なうこと
も、又は異なる部分で行なうこともできる。後者の場合
、処理された試料の第１の容量部分を、通常はバッファ
ー中で適当な希釈を行なった後にメトヘモグロビンに関
して直接試験し、第２の容量部分を上記記載のように変
性ヘモグロビン誘導体に関して試験する。また、処理さ
れた試料を適当に希釈し、チオシアン−メトヘモグロビ
ンに関して試験を行なった後に、イムノアッセイ系の試
薬を加えるか、又は、かかる試薬に溶液を加えることに
よるように、両方の試験を、処理された試料の同一の容
量部分において連続して行なうこともできる。

粒子凝集抑制イムノアッセイ法を用いて、血液試料と本
発明の変性剤とを混合することによって形成される変性
剤混合物に、多数の可能な試験プロトコル（ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌ）を適用することができる。

一つのプロトコールは、ヘモグロビン測定のために、変
性剤混合物の一部をバッファー又は水で希釈することを
含む０例えば、終点測定か速度測定のいずれかを用いて
（室温又は３７℃で）５４０ｎｍにおいて行なわれるイ
ムノアッセイのために、変性剤混合物の第２の部分を、
抗体粒子試薬及び凝集剤と混合する。

他のプロトコールは、変性剤混合物を、凝集試薬を含む
溶液で希釈することを含む、ヘモグロビンをこの混合物
中で５５０　ｎｍにおいて測定する６次に、抗体粒子試
薬を加え、イムノアッセイ；例えば６００ｎｍにおける
速度測定を開始する。

他のプロトコールにおいては、変性剤混合物をバッファ
ーで希釈し、ヘモグロビンを測定する０次に、希釈され
た混合物を抗体粒子試薬及び凝集試薬と混合し、速度測
定によって、５４０ｎｍにおけるイムノアッセイ測定を
行なう。

更に他のプロトコールは、ヘモグロビンを変性剤混合物
中で直接測定することを含む６次に、乾燥形態の抗体粒
子試薬及び凝集試薬を、同時に又は連続して（その間に
ブランク値の読みを行なって、又は行なわないで）、変
性剤混合物中に溶解する。

特に有用な試験プロトコールを以下の実施例に記載する
。

本発明は、チオシアネート塩、酸化剤、及び、変性ヘモ
グロビン誘導体の測定のためのイムノアッセイ試薬を含
む、試験方法を行なうための試験系を提供する。好まし
くは、イムノアッセイ試薬は、上記記載の粒子凝集抑制
系に属するものである。メトヘモグロビン試薬を含ませ
ることもできるが、メトヘモグロビンを測定するための
好ましい吸光度法においては、希釈水又はバッファー希
釈剤を用いる可能性がある外はいかなる試薬も必要では
ない。試験系は、いかなる好都合な形態であってもよく
、通常は、試験系の成分を保持した容器を包装して組み
合わせたものを含む試験キットの形態をとる。

以下の実施例によって本発明を説明するが、これは本発
明を制限するものではない。

必要な材料： ・２％ラテックス懸濁液（直径０．０８５μのポリスチ
レンラテックス、Ｓｅｒａｇｅｎ。

Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）
・抗体溶液［米国特許第４，６４７．６５４号に記載の
ようにして調製し、蛋白Ａアフィニティークロマトグラ
フィー　（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ
、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、　Ｕ、Ｓ、Ａ　）によ
って腹水液から精製したモノクローナル抗体］・１０ｍ
Ｍグリシンバッファー、０．０２％アジド、ｐＨ９，３ ・１００ｍＭ　　ＮａＣＪ２ ラテックス濃度０．５％で抗体被覆を行ない、抗体は、
通常は、被覆反応において最終濃度１ｍｇ／ｄで用いた
。ＮａＣ４を加えた１０ｍＭグリシンバッファー中に必
要量の抗体を希釈し、所望の最終伝導度（０，５〜１．
８ｍｍｈａ）を得ることによって、２倍濃度の抗体溶液
を調製した０等量の１０ｍＭグリシンバッファーを混合
することによって、２％ラテックスを２倍濃度（又は１
％）に希釈した。ラテックス懸濁液を、抗体溶液を含む
容器中に注ぐことによって反応を開始させた。ラテック
スを加え乞際に、抗体溶液を電磁撹拌棒で混合した。溶
液は全て室温であった。電磁撹拌プレートからの加熱が
起こらないように容器を絶縁して混合を一晩（少なくと
も１５時間）継続した。これは、絶縁のための空間を約
１インチとって撹拌プレート上に容器を懸下することに
よって行なうことができる。

１５時間の撹拌後、得られた懸濁液を、５ｏｒｖａｌｌ
ＳＳ−３４０−ター（Ｄｕｐｏｎｔ、　Ｗｉｌｍｉｎｇ
ｔｏｎ、　ＤＥ。

Ｕ、Ｓ、Ａ　）用のポリプロピレン遠心管中に等量に分
割した（管あたり約１０ｉ）、ＦＪ濁液を、１５．００
Ｏｒｐｍ（２７００Ｘｇ）で６０分間遠心分離した。上
澄液をデカントした。ペレットを、所望の被覆蛋白［通
常は、Ｍｉｌｅｓ　Ｉｎｃ、。

Ｅｌｋｈａｒｔ、　ＩＮ、　Ｕ、Ｓ、Ａから得られる１
％プロテアーゼ遊離ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ−ｐｆ
）］を含む１０ｍＭグリシバッファーで２回洗浄した。

ペレットを洗浄するために、管中の元の容量と同量の洗
浄溶液を加えた。ペレットを、激しく撹拌し、短時間音
波処理（１０〜１５秒間）することによって再懸濁させ
た。最初の再懸濁の後、吸着ラテックスを、再遠心分離
にかける前に室温で１時間放置した。最初の再懸濁及び
遠心分離の後、ペレットが完全に分散したら直ちに再上
澄液を遠心分離した。第２の洗浄の後、最初の反応容量
と同量の容量中にペレットを再懸濁した。懸濁液を、０
．８μのフィルターを通して炉遇し、５℃で保存した。

元の上澄液、第１及び第２の洗浄からの上澄液及び最終
試料の１００倍希釈液の５４６％ｍにおける吸光度を測
定することによって濃度を測定した。これらの吸光度の
合計を、１００％、又は０．５％ラテックスと同等と仮
定した。最終試料の吸光度を、１００％を算出するため
に用いる吸光度の合計で割った。最終試料の１００倍希
釈液の吸光度に１００をかけて最終試料に関する吸光度
を得た。

例 −’　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ３４ｇ上澄
液　　　　　　　　　０．０４４ 第１の洗浄　　　　　　　０．０３４ 第２の洗浄　　　　　　　０．０２１ １００％（又は０．５％ラテックス） ＝　５．１０　＋　０．０４４　＋　０．０３４　＋　
０．０２１　＝　５．１９９最終試料のラテックス濃度 ＝　　（５，１／　５．１９９）ｘｏ、５％＝　０．４
９％１２監泉ＥＩ Ａｌｐｅｒｔ　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　
２６６：２３　（１９８３）の手順にしたがってポリ（
アスパラギン酸）を調製した。

アミノエタノール（８０ミリモル）及び４．９−ジオキ
サ−１，１２−ドデカンジアミン（２０ミリモル）を、
アルゴン下でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解
した。溶液を、ポリ（アスパラギン酸）（１０ミリモル
）及びＤＭＦの溶液で処理した。反応を、室温で１時間
、続いて７０℃で２時間撹拌した０次に、混合物を冷却
し、液の大部分を、減圧下で蒸発させることによって除
去した。油状の残査を、エーテル、次に温テトラヒドロ
フランで繰返し洗浄した。生成物を凝固させ、濾過によ
って回収した。粗生成物を水中に溶解し、ｐＨを中性に
調節した０次に、溶液を、ＢｉｏＲａｄ　　６　Ｐ　−
Ｄ　Ｇ脱塩ゲルカラム（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、　Ｕ、Ｓ、Ａ
、）を用いて精製した。アミノ官能化ポリマーを含むフ
ラクションをプールし、凍結乾燥した。ポリマー上のア
ミノ基の数をＨａｂｅｅｂのＴＮＢＳ試験［Ａｎａｌ　
。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４：３２８−３３６　（１９６６
）］によって測定すると、ポリマー（ｍｇ）あたり２２
であることがわかった。

アミノ官能化ポリ（アスパラギン酸）（１０，７ｍｇ）
及びＳＭＣＣ（３０ｍｇ）をＤＭＦ中に溶解した０反応
を室温で２時間撹拌させた。氷水を混合物に加え、Ｂｉ
’ｏｒｌａｄ　　６　Ｐ　−Ｄ　Ｇゲルカラムを用いて
活性化ポリマーを混合物から分離した。

次に、活性化ポリマーと、ヨーロッパ特許第１８５．８
７０号に記載の方法によって得られる次式： のグリケート化ペプチド（２０ｍｇ）とを、室温で３分
間反応させた１反応後、６Ｐ−ＤＧゲルカラムを用いて
生成物を再精製し、凍結乾燥した。

ＰＤＳ試験　［Ｇｒａｓｓｅｔｔｉ及びＭｕｒｒａｙ、
　Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　１１９：４４−
４９　（１９６７１１によって活性化ポリマー上のマレ
イミド基の数を測定すると、ポリマー（ｍｇ）あたり０
．４６マイクロモルであることがわかった。チロシンに
関する２７５ｍｍにおけるモル吸光係数を用いたＵＶ／
Ｖｉｓ吸光度測定によって、ポリマー上のＧｌｃ−ペプ
チドの量を測定すると、ポリマー（ｍｇ）あたり０．４
６マイクロモルであることがわかった。

０．０５％ＢＳＡ−ｐｆ及び０．１％ナトリウムアジド
を含有する２００ｍＭ−グリシンバッファー、ｐＨ９を
用いて濃縮吸着ラテックスを適当な濃度に希釈した。バ
ッファー中には、濃度４％のマンニトールも存在させた
。希釈後、吸着ラテックス溶液を短時間（５〜１０秒）
音波処理した。

鼓里見 凝集試薬の作用溶液を、ＩＩＩＩｇ／ｌｎＩの水保存溶
液から調製した。保存溶液を、０．１％ＢＳＡ−ｐｔ’
及び０．１％ナトリウムアジドを含有する２０ｍＭリン
酸塩バッファー、ｐＨ６で希釈することによって１０μ
ｇ／ｗｉｔ溶液を調製した。

血′をベースとした費′試Ｓ　び臨　試ａ血液をベース
とした標準試料及び血液試料は、用いる前に変性しなけ
ればならない、試験において用いるために、血液試料を
、Ａｍｅｓ　Ａ１１ｑｕｏｔ混合器（Ｍｉｌｅｓ　Ｉｎ
ｃ、、　Ｅｌｋｈａｒｔ、　ＩＮ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）の
ような振盪混合器によって良く混合した。次に、これら
の試料を変性剤／酸化剤（３Ｍ−ＮＨ４ＳＣＮ、２ｍｇ
／ｍ＆−Ｋｓ　Ｆｅ　（ｃＮ）ｂ、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ
、ｐＨ７，５）で１：３１に希釈した。変性剤中にフェ
リシアニドを存在させることによって、希釈試料又は標
準試料をヘモグロビン濃度の測定のために用いることが
可能になった。　ＯＰＴＩＭＡＴＥ”装置（Ｍｉｌｅｓ
　Ｉｎｃ、、　Ｅｌｋｈａｒｔ、　ＩＮ、　Ｕ、Ｓ、Ａ
、）で試験する前に、試料を少なくとも１５秒間放置し
て、蛋白の変性及びヘムの酸化を完了させた。

Ｂ、ＨｂＡｌｃに　するゝ　１　＝ ＯＰＴＩＭＡＴＥ装置に関して、三種の異なる手順をＨ
ｂＡｌｃの測定に用いた。二つは、終点法であり、その
うちの一つは凝集剤溶液を手動で加えることを必要とす
るものであり、もう一つは試験を完全に自動化したもの
である。第３の試験法は速度試験である。以下の記載に
よって、三種の試験の概要を簡単に説明する。

凝集剤を　　で口える、点拭罵 １　、　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７−Ｐｒｏｇｒａｍ
　Ｎｅｗ　Ｔｅ５ｔを用いて、以下の試験パラメーター
をＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴＲＹＮｏ、　２５のようにプ
ログラムした。

単位：無し 試験の種類：終点試験 小数位：２ 分配法：Ａ 遅延時間Ａ：１２００秒（試薬の分配から吸光度の読み
までの時間） 平衡時間＝６秒（吸光度の読取りの前に試料をキュベツ
ト中に保持する時間） 読取り時間：５秒（データを採取し、吸光度を７．７回
／秒読取る時間） キュベツト温度＝２５℃ 標準濃度：無し ファクター：１０００（この値を結果にかけてミリ吸光
度単位に変換する） 低Ｉ　／Ａ　（Ａ　ｂ　ｓ　）　：　２．０００高Ｉ　
／Ａ　（Ａ　ｂ　ｓ　）　　：　２．０００（低及び高
吸光度限界の両方を２．００に設定す ることによって、各試料 に関する実際の吸光度の 読みをＯＰＴＩＭＡＴＥに印刷さ せる） 低標準値：無し 高標準値：無し 吸光フィルター：５４０ｎｍ 移動温度：室温 試料容量：１０ｐＪｌ 試薬容量：０．５ｍｌ’ ２、試験を開始する前に、ピペッタ−／希釈器に、１０
０μ試料シリンジ及び１．０Ｗｄｌ試薬シリンジが装着
されていることを確認した。ピペッタ−／希釈器のタレ
ットを、試料シリンジに関しては１０％（１０１）、試
薬シリンジに関しては５０％（０，５ｍ７）に設定した
。

３、少なくとも５０ｐＪｌの試料をＯＰＴＩＭＡＴＥ試
料カップ中にピペットで加えた。

４、ピペッタ−／希釈器に吸着ラテックス溶液を充填し
た。

５　、　　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｒｅｐｅａｔｅｒピペ
ット（容量１．２５ｍ！’のチップ、■に設定）を用い
て、凝集剤溶液２５パをＯＰＴＩＭＡＴＥ反応カップ中
に手動で分配した。ブランクカップＮｏ、　６０及び比
濁反応が起こっていない全ての他のカップを取り除いた
。これらのカップ中に２５７Ｌ１のバッファー（２０ｍ
Ｍ−リン酸塩、ｐＨ６，０，１％ＢＳＡ−ｐｆ、０．１
％ナトリウムアジド）をピペットで加えた。

６、記載されている全ての指示にしたがってＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　Ｎｏ、２５−ＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　
Ｎｏ、２５を開始した１次に、ＯＰＴＩＭＡＴＥによっ
て、試料及び吸着ラテックスを反応カップ中に自動的に
ピペット滴下し分配し、２０分後の吸光度を読取った。

凝集　を　　・に口える終へ； １　、　ＯＰＴＩＭＡＴＥに、１．０−シリンジを有す
るＧ１１ｆｏｒｄ　Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ｄｉｓｐｅｎ
ｓｅｒを装着した。接続ケーブルを、ＯＰＴＩＭＡＴＥ
の後部のＪ４ボートに接続した。この外部分配器は以下
の手順によって用いることかできる。

（ａ）　Ｕｔｉｌｉｔｙ　１５、セキュリティーコード
９８０４５６を入力した。

（ｂ　）　Ｕｔｉｌｉｔｙ　５０、チエツク＝０、オプ
ション２０を入力した。

この分配器のタレットを５０％（０，５ｍｌ＋）に設定
した。

２　、　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７−Ｐｒｏｇｒａｍ
　Ｎｅｗ　Ｔｅ５ｔを用いて、以下の試験パラメーター
をＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴＲＹＮｏ、２４のようにプロ
グラムした。

単位：無し 試験の種類：終点試験 小数位：２ 分配法：Ａ及びＢ 塔からの分配Ｂ：有 分配Ａから分配Ｂまでの時間：５秒 遅延時間Ａ：１２００秒 平衡時間：６秒 読取り時間：５秒 キュベツト温度：２５℃ 標準濃度：無し ファクター：１０００ 低Ｉ／Ａ　（Ａｂｓ）：２．０００ 高Ｉ／Ａ　（Ａｂｓ）：２．０００ 低標準：無し 高標準：無し 吸光フィルター：５４０ｎｍ 移動温度：室温 試料容量：１Ｏｐ−１ 試薬容量：０．１ｍ！’ ３、試験を開始する前に、ピペッタ−／希釈器に、１０
０Ｊ１１試料シリンジ及び２５０４試薬シリンジが装着
されていることを確認した。ピペッタ−／希釈器のクレ
ットを、試料シリンジに関しては１０％（１０ＩＬ１）
、試薬シリンジに関しては工Ｏ％（２５１）に設定した
。また、イムノアッセイプローブがビペックー／希釈器
上で用いられていることを確認した。

４、少なくとも５０ＩＩＪｌの試料をＯＰＴＩＭＡＴＥ
試料カップ中にピペットで加えた。

５、ピペッタ−／希釈器に凝集剤溶液を充填した。

６、外部分配器に吸着ラテックス溶液を充填した。

７、記載されている全ての指示にしたがって、Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　Ｎｏ、２４−ＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
　Ｎｏ、２４を開始した。次に、ＯＰＴＩＭＡＴＥによ
って、試料及び凝集剤を反応カップ中に自動的にピペッ
ト滴下し分配し、その５秒後に吸着ラテックスを加えた
。２０分後に反応の吸光度を読取った。

違Ｉ拭囚 １　、　ＯＰＴＩＭＡＴＥに、１．０−シリンジを有す
るＧ１１ｆｏｒｄ　Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ｄｉｓｐｅｎ
ｓｅｒを装置した。接続ケーブルをＯＰＴＩＭＡＴＥの
後部のＪ４ポートに接続した。この外部分配器は以下の
手順によって用いることができる。

（ａ）　Ｕｔｉｌｉｔｙ　１５、セキュリティーコード
９８０４５＆を人力した。

（ｂ　）　Ｕｔｉｌｉｔｙ　５０、チエツク＝Ｏ、オプ
ション２０を入力した。分配器のタレットを５０％（０
，５ｍ７）に設定した。

２　、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７−Ｐｒｏｇｒａｍ　
Ｎｅｗ　Ｔｅ５ｔを用いて、以下の試験パラメーターを
ＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴＲＹＮｏ、２３のようにプログ
ラムした。

単位：無し 試験の種類：動的酵素試験 小数位：２ 分配法：Ａ及びＢ 塔からの分配Ｂ：有 分配Ａから分配Ｂまでの時間＝５５ 秒遅延間：２０秒 平衡時間二５秒 読取り時間：３０秒 キュベツト温度：３０℃ 標準濃度：無し ファクター：１０００ 低Ｉ／Ａ　（Ａｂｓ）：２．０００ 高Ｉ／Ａ　（Ａｂｓ）：２．０００ 吸光フィルター：５４０ｎｍ 移動温度：３０℃ 試料容量＝１０μ 試薬容量：０．７ ３、試験を開始する前に、ピペッタ−／希釈器に、１０
０４試料シリンジ及び２５０パ試薬シリンジが装着され
ていることを確認した。ピペッタ−／希釈器のタレット
を、試料シリンジに関しては１０％（１０ｄ）、試薬シ
リンジに関しては１０％（２５ｍ）に設定した。また、
イムノアッセイプローブがピペッタ−／希釈器上で用い
られていることを確認した。

４、少なくとも５０７Ｊの試料を、ＯＰＴＩＭＡＴＥ試
料カップ中にピペットで加えた。

５、ピペッタ−／希釈器に凝集剤溶液を充填した。

６、外部分配器に吸着ラテックス溶液を充填した。

７、記載されている全ての指示にしたがって、Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　Ｎｏ、２３−ＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
　Ｎｏ、２３を開始した。次に、ＯＰＴＩＭＡＴＥによ
って、試料及び凝集剤を反応カップ中に自動的にピペッ
ト滴加し分配し、その５秒後に吸着ラテックスを加えた
。この反応の吸光度を１４秒間後に読取った。吸光度の
読取りを全部で３０秒間行なった。ＯＰＴＩＭＡＴＥに
よって、採取されたデータ及び１分あたりの吸光度の変
化の見地から得られるデータから線状回帰線が測定され
た。

さｉ叉旦旦之皇亙 全ての血液試料に関して、試料中のＨｂＡｌｃ（％）を
算出するために、試料中のヘモグロビン濃度を測定しな
ければならない。ＨｂＡｌｃの測定に用いられるのと同
様の変性試料を、以下のプロトコルを用いたヘモグロビ
ン測定に用いた。

１　、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｎｏ、３７−Ｐｒｏｇｒ
ａｍ　Ｎｅｗ　ｔｅｓｔを用いて、以下の試験パラメー
タをＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　Ｎｏ。

２６のようにプログラムした。

単位：無し 試験の種類：終点試験 小数位：２ 分配法：Ａ 遅延時間Ａ：３００秒 平衡時間＝６秒 読取り時間＝５秒 キュベツト温度＝２５℃ 標準濃度：無し ファクター：１０００ 低Ｉ／Ａ　（Ａｂｓ）：２．０００ 高Ｉ／Ａ　（Ａｂｓ）：２．０００ 高標準値：無し 低標準値：無し 吸光フィルター：５４０ｎｍ 移動温度二室温 試料容量：’７０＃１ 試薬容量：０．５Ｍ１ ２、試験を開始する前に、ピペッタ−／希釈器に、１０
０ｇ’試料シリンジ及び１．０μ試薬シリンジが装着さ
れていることを確認した。ビペックー／希釈器のクレッ
トを、試料シリンジに関しては７０％（７（１’）、試
薬シリンジに関しては５０％（０，５パ）に設定した。

３、少なくとも１２０パの試料をＯＰＴＩＭＡＴＥ試料
カップ中にピペットで加えた。

４、ピペッタ−／希釈器に、０．０５％のＢＳＡ−ｐｆ
及び０．１％ナトリウムアジドを含有する２００ｍＭグ
リシン、ｐＨ９を充填した。

５、記載されている全ての指示にしたがって、Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　Ｎｏ、２６−ＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
　Ｎｏ、２６を開始した。次に、ＯＰＴＩＭＡＴＥによ
って、試料及びバッファーを反応カップ中に自動的にピ
ペット滴加し分配し、５分後に吸光度を読取った。

■ ＯＰＴＩＭＡＴＥによって得られた情報をＨｂＡｌｃ（
％）の結果に変換するために、多数の計算を行なわなけ
ればならない。

１、全ての試験実験に、ラテックスブランク反応（５０
０ｍラテックス＋３５４バツフアー）を含ませた。この
反応の吸光度を、他の全ての結果から減じなければなら
ない。

２、全ての血液試料に関して、ＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴ
ＲＹＮｏ、　２６から採取された情報を用いて、反応に
対するヘモグロビンの吸光度の寄与を算出した。ここで
得られた吸光度の結果を７で割って、血液１０パの吸光
度を算出した。次に、この値を、上記で得られた吸光度
の結果から減じた。

３、標準曲線を算出するために、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙＮｏ、３７−Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｎｅｗ　Ｔｅ５ｔを用
いてダミーイムノアッセイをプログラムした。以下のパ
ラメータをＵＳＥＲＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ　Ｎｏ、２
７のようにプログラムした。

プロトコル：　Ｎｏ、　１ 基準値：Ｇｌｃ−ペプチド標準試料に関して設定された
基準値を入力した（μＭ− ＨｂＡ１ｃ）。これは用いる吸着ラ テックスの量によるものである。他の パラメーターの値はいずれも重要では ないが、基準値を保存するために入力 しなければならない。

４　、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｎｏ、３３−イムノ
アッセイ計算式を用いて、四つのパラメータ論理標準曲
線を生成させた。

試験Ｎｏ、　：　Ｎｏ、　２７ 計算式：１．４−パラメータ論理式 Ｇｌｃ−ペプチド標準試料に関する吸光度の結果（ラテ
ックスブランク値を減じたもの）を入力した。次に、Ｏ
ＰＴＩＭＡＴＥによって、標準曲線を作成し、曲線と四
つのパラメータとの標準偏差を算出した。完了したら、
全ての試料に関する吸光度（−ラテックスブランク−Ｈ
ｂ分配）を代入することによって未知試料のＨｂＡｌｃ
を算出した。

５　、　ＵＳＥＲＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　Ｎｏ、２６から
の情報を用いて、各血液試料中のヘモグロビン濃度を算
出した。第１にヘモグロビン濃度をｇ　／　ｄｌの単位
で算出し、次に、この値を用いて、存在するヘモグロビ
ンβ鎖の濃度（ｍＭ）を決定した。

Ｈｂ　　（ｇ／ｄＩ）＝ ｍＭ−β−Ｈｂサブユニット＝ ６、ここで、ＨｂＡ１ｃ濃度及びヘモグロビン濃度（μ
Ｍ）（どちらもβ−サブユニットに基くものである）が
判明し、ＨｂＡｌｃ（％）を測定することが可能になる
。

ｌ工■迷皿旦ヌ 地方の臨床実験室から臨床試料（７Ｉ２）を得、通常の
ＨｂＡ１ｃアフィニティークロマトグラフィー法（Ｉｓ
ｏｌａｂ、　Ａｋｒｏｎ、　ＯＨ，Ｕ、Ｓ、Ａ、）によ
って試料を試験した。試料を、本発明を用いて上記のよ
うに試験した。関係を図に示す。

４、パ生゛　に・　る　々の　　　のり異なる酸化剤（
変性剤混合物中における血清をベースとした物質のヘム
濃度の２０モル過剰量）を、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、　ｐ
ｌ＝　７　、５バツフアー中の３Ｍ−ＮＨ４ＳＣＮと混
合した。この混合物を用い、上記の試料調製法において
記載されている手順にしたがって血液試料を変性した。

血液試料を加えた後、異なる時間間隔をおいて、上記の
方法において記載されているＨｂＡ１ｃ試験に関する濁
度測定試験によって、試料の免疫反応性を試験した。最
大の（かつ定常状態の）免疫反応性が得られるのに必要
な最小時間を測定した。結果を表１に示す。

表　　１ ヘモグロビンの変性への酸化剤の効果 ３Ｍ−ＮＨ４ＳＣＮ　　　なし　　　　　　　　　７３
Ｍ−ＮＨ４ＳＣＮ　　　ＫＩｏ、　　　　　　　　　５
３Ｍ−ＮＨ４ＳＣＮ　　　ＫＣｌ０．　　　　　　　　
２．５３Ｍ−ＮＨ４ＳＣＮ　　　ＫａＣｒ０４４３Ｍ−
ＮＨ４ＳＣＮ　　　ＮａＮ０゜ ３Ｍ−ＮＨＪＣＮ　　Ｎａ５Ｃｏ　（ＮＯ２）ａ　　　
　””：０　試験において、ヘムの濃度に対して２０モ
ル過剰量 ”２００モル過剰量 幸・１３７℃ ００イムノアツセイが障害をうけた 上記に、本発明を特に記載し例示した。明らかに、本発
明の精神及び範囲から逸脱することな（、発明の多くの
他の変更及び修正を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

図は、臨床標本中のヘモグロビンＡｌｃの測定における
、本発明の分析法と通常のアフィニティークロマトグラ
フィー法との間の関係の研究の結果を示すグラフである
。 ％Ｈｂ　ＡｉＣ（対照法）

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）血液試料中の特定のヘモグロビン誘導体の相対量
   を測定するための分析方法であって、（ａ）血液試料を
   、（ｉ）試料中に存在する実質的に全てのヘモグロビン
   を変性しうるチオシアネート塩、及び、（ｉｉ）試料中
   に存在する実質的に全てのヘモグロビンをメトヘモグロ
   ビンの形態に転化せしめうる酸化剤で処理し、 （ｂ）変性血液試料を、その中に存在するメトヘモグロ
   ビンの全量に関して試験し、 （ｃ）変性血液試料を、イムノアッセイによって、その
   中に存在する変性された形態のかかる特定のヘモグロビ
   ン誘導体の量に関して試験し、（ｄ）上記（ｂ）及び（
   ｃ）工程から得られる試験結果を関連させることを含む
   方法。
2. （２）かかる特定のヘモグロビン誘導体がヘモグロビン
   Ａｌｃである請求項１記載の方法。
3. （３）該酸化剤が、フェリシアニド、塩素酸塩及び亜硝
   酸塩からなる群より選択される請求項１記載の方法。
4. （４）該酸化剤が、フェリシアニド塩である請求項１記
   載の方法。
5. （５）工程（ａ）が室温で行なわれ、チオシアネート塩
   の濃度が約３Ｍ以上である請求項１記載の方法。
6. （６）血液試料中のヘモグロビンＡｌｃの相対量を測定
   するための分析方法であって、 （ａ）血液試料を、チオシアネート塩、及び、試料中に
   存在する実質的に全ての形態のヘモグロビンをそのメト
   ヘモグロビンの形態に転化せしめうる酸化剤を含む変性
   剤と配合し、 （ｂ）約５４０ｎｍにおける吸光度を測定することによ
   って、変性血液試料を、その中に存在するメトヘモグロ
   ビンの全量に関して試験し、 （ｃ）変性形態のヘモグロビンＡｌｃに対するモノクロ
   ナール抗体試薬の特異親和力に基くイムノアッセイによ
   って、変性血液試料を、その中に存在する変性ヘモグロ
   ビンＡｌｃの量に関して試験し、 （ｄ）上記（ｂ）及び（ｃ）工程から得られる試験結果
   を関連させることを含む方法。
7. （７）該酸化剤が、フェリシアニド、塩素酸塩及び亜硝
   酸塩からなる群より選択される請求項６記載の方法。
8. （８）該酸化剤がフェリシアニド塩である請求項６記載
   の方法。
9. （９）工程（ａ）が室温で行なわれ、変性剤溶液中のチ
   オシアネート塩の濃度が約３Ｍ以上である請求項６記載
   の方法。
10. （１０）該イムノアッセイが粒子凝集抑制に基くもので
    あり、該モノクローナル抗体試薬が水懸濁性粒子に結合
    しており、変性ヘモグロビンＡｌｃが、試薬粒子に対し
    て結合するための、該抗体試薬に関する多数のエピトピ
    ック（ｅｐｉｔｏｐｉｃ）な結合部位を含む凝集剤化合
    物と競合する請求項６記載の方法。
11. （１１）メトヘモグロビン試験を血液試料の第１の部分
    について行ない、変性ヘモグロビンＡｌｃに関するイム
    ノアッセイを試料の第２の部分について行なう請求項６
    記載の方法。
12. （１２）メトヘモグロビン試験及びイムノアッセイを、
    処理血液試料の同一の部分について、又はかかる試料部
    分のアリコートについて行なう請求項６記載の方法。
13. （１３）血液試料中の特定のヘモグロビン誘導体の相対
    量を測定するための試験系であって、 （ｉ）試料中に存在すると通常考えられる実質的に全て
    のヘモグロビンを変性しうるチオシアネート塩、 （ｉｉ）血液試料中に存在すると通常考えられる実質的
    に全ての形態のヘモグロビンをそのメトヘモグロビンの
    形態に転化せしめうる酸化剤、及び、 （ｉｉｉ）血液試料と、該チオシアネート塩及び酸化剤
    とを配合することによって得られる変性血液試料を、そ
    の中に存在する、変性ヘモグロビンの形態のかかる特定
    のヘモグロビン誘導体の量に関してイムノアッセイする
    ための試薬を含む試験系。
14. （１４）該酸化剤が、フェリシアニド、塩素酸塩及び亜
    硝酸塩からなる群より選択される請求項１３記載の試験
    系。
15. （１５）該酸化剤がフェリシアニド塩である請求項１３
    記載の試験系。
16. （１６）測定されるかかる特定のヘモグロビン誘導体が
    ヘモグロビンＡｌｃである請求項１３記載の試験系。
17. （１７）該酸化剤がフェリシアニド塩である請求項１６
    記載の試験系。
18. （１８）変性ヘモグロビンＡｌｃを試験するための試薬
    が、変性形態のヘモグロビンＡｌｃに特異なモノクロー
    ナル抗体試薬を含む請求項１６記載の試験系。
19. （１９）該イムノアッセイ試薬が、（ｉ）水懸濁性粒子
    に結合している該モノクローナル抗体又はそのフラグメ
    ント、及び、（ｉｉ）該抗体試薬に関する多数のエピト
    ピックな結合部位を含む凝集試薬を含み、それにより、
    該イムノアッセイ試薬によって粒子凝集抑制により変性
    ヘモグロビンＡｌｃを試験しうる請求項１８記載の試験
    系。