JP2607385B2 - ヘモグロビンの存在下におけるラテックス凝集イムノアッセイ及び試薬キット - Google Patents

ヘモグロビンの存在下におけるラテックス凝集イムノアッセイ及び試薬キット

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ラテックス凝集イムノアッセイに基く、血
液試料中の分析対象物の測定方法に関する。更に詳しく
は、本発明は、試験試料中に存在するヘモグロビンから
の非特異的凝集を阻止する方法に関する。本発明は、特
に、全血試料中のグリケート化ヘモグロビン（glycated
hemoglobin）、例えばヘモグロビンAlcの測定に関す
る。
ラテックス凝集イムノアッセイは、多価ラテックス抗
体試薬と、対応する多価形態の抗原又はハプテンとを結
合させることによる検出可能な凝集の形成に基くもので
ある。対象とする分析対象物がラテックス抗体試薬に関
してそれ自身多価である場合には、直接的な試験を行な
うことができる。しかしながら、対象とする分析対象物
が、低分子量ハプテンの場合のように多価でない場合に
は、かかるハプテン系分析対象物を定量するために競合
試験が行なわれる。凝集試薬を、抗分析対象物抗体試薬
に関する多数のエピトピック（epitopic）な結合部位を
含む系に加える。凝集試薬とラテックス抗体試薬との間
の結合によって検出可能な凝集が形成される。ラテック
ス抗体試薬に結合する凝集試薬と競合する分析対象物の
量を増加させることによって、得られる凝集の量を減少
させる。
先行技術においては、ラテックス凝集イムノアッセイ
法は、血液中の対象とする分析対象物を測定するために
主として血清又は血漿試料に対して行なわれている。全
血成分が存在することによってラテックス試薬の非特異
的凝集が生じることが知られている。したがって、全血
を試験することが所望又は必要である状況において、試
験結果の正確性が大きな障害を受ける可能性がある。こ
れは、特に、診断学上重要なヘモグロビン誘導体のよう
な赤血球に関連する血液成分の測定において当てはま
る。
発明の概要 ここで、反応混合物のpHを約8.5以上に保持すること
によって、全血試料に関して行なわれるラテックス凝集
イムノアッセイにおける非特異的凝集が有効に排除され
ることが見出された。非特異的凝集は、その正味の正電
荷性のために、陰電荷ラテックス粒子に非特異的に吸引
される、ヘモグロビンAoと称される天然の未変性ヘモグ
ロビンの存在によるものであると考えられている。試験
を高いpHにおいて行なうことにより、ヘモグロビンAoの
正味の電荷が中性化し、ラテックス粒子に対する静電気
的吸引力による凝集が起こらなくなる。
したがって、本発明は、ラテックス凝集イムノアッセ
イによる血液試料中の分析対象物の測定方法であって、
（ａ）血液試料と、水懸濁性ラテックス粒子に結合して
いる抗分析対象物抗体又はそのフラグメントを含む多価
ラテックス抗体試薬、並びに、分析対象物が単価しかな
い場合には、更に、抗分析対象物抗体又はそのフラグメ
ントに関する多数のエピトピックな結合部位を含む凝集
試薬とを配合することによって水性反応混合物を生成さ
せ、（ｂ）水性反応混合物中において得られる凝集を血
液試料中の分析対象物の関数として測定する方法に関す
る。本発明においては、約７以下のpHを有する水溶液中
に懸濁した際に正味の有効な表面陰電荷を有するラテッ
クス粒子、例えばポリスチレンラテックスを用いること
ができる。
また、ヘモグロビンによるラテックス粒子の観察され
る非特異的凝集によって血液試料中のヘモグロビンAoの
測定の基礎も与えられる。反応混合物は、血液試料及び
懸濁ラテックス粒子を含み、pHが約８以下に保持される
ように生成される。得られる凝集は試料中のヘモグロビ
ンAoの関数である。pH8以下においては、ラテックス粒
子は、その正味の表面陰電荷を保持し、ヘモグロビンの
静電気的吸引力によって凝集する。
好ましい実施態様の説明 ヘモグロビンAlcとして知られるヘモグロビン誘導体
を測定するためのラテックス凝集イムノアッセイの開発
過程において、量応答曲線が、完全な試薬系によるpH7.
4における試験実験と、凝集試薬を存在させないで行な
ったものとの間で実質的に同一であることが見出され
た。ヘモグロビンAlc類縁体ではなく、ウシ血清アルブ
ミンを被覆したラテックスが、血液試料の存在下で凝集
することも見出された。血液試料中の天然ヘモグロビン
が対象物になりうると考えられる。血液試料を蛋白分解
性酵素ペプシンで処理することによって非特異的凝集が
排除される。β−鎖中のＮ−末端アミノ基において変性
されていない天然ヘモグロビンであるヘモグロビンAoの
多価性はペプシン消化によって破壊されるであろう。更
に、その後の実験において、ヘモグロビンAoによって、
ラテックス粒子が、水性ラテックス懸濁液中のその濃度
に比例して凝集することが見出された。
したがって、ラテックス表面上の陰電荷基、例えばポ
リスチレン上のスルフェート基と、ヘモグロビン上の正
電荷アミノ基、例えば、ヘモグロビンのβ−鎖上のＮ−
末端アミノ基との間のイオン性吸引力によって、ヘモグ
ロビンAoがラテックスと相互作用すると考えられるが、
これは本発明において重要ではないと考えられる。それ
によって、ヘモグロビンの４量体が、ラテックス粒子の
結合による凝集を引き起こすのに十分な多価正電荷を与
える。更に、グリケート化ヘモグロビンのようなヘモグ
ロビン誘導体は、正電荷が減少又は除去されるように変
性されており、ラテックス粒子を凝集させる差動的な能
力がヘモグロビンAoと特定のヘモグロビン誘導体との間
で生じると考えられる。したがって、ヘモグロビンAoの
非特異的凝集効果を中和するpH条件下で試験を行なうこ
とによって、非特異的なラテックス凝集を実質的に引き
起こすことのない、特定のヘモグロビン誘導体、例えば
ヘモグロビンAlcに関する試験を行なうことが可能にな
る。
本発明は、種々のラテックス粒子に基く凝集イムノア
ッセイに適用することができる。ラテックスの殆どは、
中性のpHにおいて正味の表面陰電荷を有する粒子から成
っている。ラテックスの表面陰電荷の間の電荷反発作用
は、粒子が懸濁状態で保持されるのに重要なものであ
る。ここで用いるように、ラテックスという用語は、水
性液中において不連続な微粒子が懸濁する性質を意味す
るものと意図される。
本発明において有用なラテックス粒子は、ラテックス
凝集イムノアッセイの分野に詳しい当業者には明らかで
あろう。通常、かかる粒子は、試験に所望の抵抗試薬に
関して好適な支持体として機能し、分析の目的に十分な
凝集試薬の存在下で凝集するために必要な性質を有する
ことが必要とされる。ラテックス粒子は、通常、乳化重
合又は懸濁重合によって得られる［Bangs,L.B.（1984）
Uniform Latex Particles,Seragen Diagnostics Inc.,I
ndianapolis IN.USA.］。膨潤乳化重合を用いることも
できる［Ugelstad,J.ら，（1980）Adv.Colloid and Int
erface Sci.13:101−140］。良好なラテックス粒子を市
販物の中から選択することができる。ポリスチレン粒子
は特に有用である。
ラテックス粒子の密度は、制限されることなく、概し
て約0.1mg/ml〜約0.1g/mlの間で変化させることができ
る。ラテックス粒子の殆どは、粗面の微小球状の、制限
されることなく約0.04〜約1.2μの間で変化させること
のできる直径を有する粒子から成るものである。
抗体試薬のラテックス粒子への結合は、従来技術が適
用される領域のものである。通常、該結合は共有結合で
あっても非共有結合であってもよい。抗体試薬は、全抗
体、抗体フラグメント、多官能性抗体凝集物などから成
っていてよい。通常、全抗体、又はFab、Fab′又はＦ
（ab′）２のようなIgGフラグメントが用いられる。抗
体試薬を、通常の抗血清及びモノクローナル法のような
任意の利用可能な方法によって誘導することができる。
通常は、ヘモグロビンAoの正電荷性を中和し、それに
よって血液試料の存在下でのラテックス試薬の非特異的
凝集を排除するのには、イムノアッセイ反応を約8.5以
上のpHで行なうことで十分である。反応のpHは、もちろ
ん、分析対象物とラテックス試薬との間の免疫反応性が
実質的に減少する点、即ち、有用な試験がもはや得られ
ない点まで到達することのないようにされる。好ましく
は、水性反応混合物は、約8.75〜約10、より好ましくは
約9.5未満のpHを有し、約9.0のpHが特に有用である。こ
の目的のために好適なバッファーは、簡便性及び試験特
性に基いて選択することができる。グリシン及びビシン
（bicine）バッファーが好ましい。
凝集剤化合物は、凝集イムノアッセイの分野において
よく知られている方法によって調製される。この試薬
は、通常の条件においては、抗分析対象物抗体試薬に関
する多数のエピトピックな結合部位を含んでいる。かか
る部位は、分析対象物自身、又は、試験の目的のために
抗体によって結合されるのに十分な能力を保持する好適
な類縁体を用いることによって得ることができる。かか
る類縁体は、蛋白分析対象物の場合には、合成によって
又は消化によって得られる、抗体試薬、例えば、以下の
実施例において説明するようなヘモグロビンAlcのグリ
ケート化ペプチド（glycated peptide）残基のためのエ
ピトープ（epitope）を含む好適なフラグメントを含ん
でいる。
本発明は、潜在的な非特異性緩衝物質としてヘモグロ
ビンを含む試験試料の試験に適用することができる。か
かる試験試料は、通常、全血又は分離赤血球のような血
液使用の溶解産物を含む。
ヘモグロビンAoがラテックス粒子を凝集させる能力に
よってAoの測定方法も提供される。この実施態様におい
ては、ラテックス粒子が抗体試薬を担持する必要が無
く、また、凝集剤化合物も必要とされない。単純にヘモ
グロビン及びラテックス粒子の水性混合物のpHを約８以
下に保持することによって、ヘモグロビンAo濃度に相関
しうる凝集を得ることができる。本発明のこの態様に関
する有用なpH範囲の下限は、ヘモグロビンAoがラテック
ス粒子を凝集させる能力を失うことが経験的に分かって
いるpHである。通常、これは約４を超えるpHを要する。
本発明を以下の実施例によって示すが、これらに限定
されるものではない。
実施例 1.試薬の製造 A.抗体−ラテックス試薬 必要な材料 ・２％ラテックス懸濁液（直径0.085μのポリスチレン
ラテックス、Seragen,Indianapolis,IN,USA.） ・抗体溶液［米国特許第4,647,654号に記載のように調
製し、蛋白Ａ−アフィニティークロマトグラフィー（Bi
oRad Laboratories,Richmond,CA.USA.）によって腹水液
から生成したモノクローナル抗体］ ・10mM−グリシンバッファー、0.02％アジド、pH9.3 ・100mM−NaCl 抗体の被覆は0.5％のラテックス濃度で行なわれ、抗
体は、通常、被覆反応において1mg/mlの最終濃度で用い
られる。必要量の抗体を10mMのグリシンバッファー中に
希釈し、NaClを加えて最終的な所望の伝導度（0.5〜1.8
mohm）を与えることによって２倍の濃度の抗体溶液を調
製した。等容量の10mM−グリシンバッファーと共に混合
することによって、２％のラテックスを２倍の濃度（又
は１％）に希釈した。反応は、ラテックス懸濁液を抗体
溶液を含む容器内に注ぐことによって開始された。ラテ
ックスを加える際に、抗体溶液を電磁攪拌棒で攪拌し
た。溶液は全て室温下にあった。電磁攪拌プレートから
の加熱が起こらないように容器を絶縁して、混合を一晩
（少なくとも15時間）続けた。これは、容器を、絶縁の
ために約１インチの空間をとって攪拌プレート上に懸下
することによって行なうことができた。
15時間の混合後、得られた懸濁液を、Sorvall SS−34
ローター［DuPont,Wilmington,DE,USA.］用のポリプ
ロピレン遠心管に等しく（各管に約10ml）分配した。懸
濁液を15,000rpm（2700×ｇ）で60分遠心分離した。上
澄みをデカントした。ペレットを、所望の過被覆蛋白
［例えば、Miles Inc.,Elkhart,IN.USA.から得られる１
％プロテアーゼ遊離ウシ血清アルブミン（BSA−pf）］
を含む10mM−グリシンバッファーで２回洗浄した。ペレ
ットを洗浄するために、管中の元の容量に等しい量の洗
浄溶液を加えた。ペレットを、激しく攪拌し、短時間
（１回あたり10〜15秒）音波処理することによって再懸
濁させた。最初の再懸濁後、吸着ラテックスを再遠心分
離する前に室温で１時間放置した。最初の再懸濁及び遠
心分離の後、ペレットが完全に分散したら直ちに再懸濁
液を遠心分離した。第２の洗浄の後、ペレットを、最初
の反応容量と等しい容量中に再懸濁した。懸濁液を0.8
μのフィルターを通して過し５℃で保存した。
元の上澄み液、第１及び第２の洗浄からの上澄み液及
び最終試料の100倍希釈液の546nmの吸光度を測定するこ
とによって濃度を測定した。これら吸光度の合計は100
％であるか又は0.5％ラテックスと等しいと仮定した。
最終試料の吸光度を、100％を算出するために用いられ
る吸光度の合計で割った。最終試料の100倍希釈液の吸
光度に100をかけて最終試料の吸光度を得た。
例： 試料 A546 上澄み液 0.044 第１の洗浄液 0.034 第２の洗浄液 0.021 最終試料（100倍希釈） 0.051×100＝5.1 100％（又は0.5％ラテックス） ＝5.10＋0.044＋0.034＋0.021＝5.199 最終試料のラテックス濃度 ＝（5.1/5.199）×0.5％＝0.49％ B.凝集試薬 ポリ（アスパラギン酸）を、Alpert J.Chromatograph
y 266:23（1983）の方法にしたがって調製した。
アミノエタノール（80ミリモル）、及び、4,9−ジオ
キサ−1,12−ドデカンジアミン（20ミリモル）を、アル
ゴン下でジメチルホルムアミド（DMF）中に溶解した。
溶液をポリ（アスパラギン酸）（10ミリモル）及びDMF
の溶液で処理した。反応を、室温で１時間、次に70℃で
２時間攪拌した。次に、混合物を冷却し、液体の大部分
を減圧下において蒸発させることによって除去した。油
状の残査をエーテルで、次に温テトラヒドロフランで繰
り返し洗浄した。生成物を凝固させ、過によって回収
した。粗生成物を水中に溶解し、pHを中性に調節した。
次に、溶液をBioRad P6−DG脱塩ゲルカラム（BioRad La
boratories,Richmond,CA.USA.）を用いて精製した。ア
ミノ官能化ポリマーを含むフラクションをプールし、凍
結乾燥した。
ポリマー上のアミノ基の数を、Habeeb′s TNBS試験
［Anal.Biochem.14:328−336（1966）］によって測定す
ると、ポリマー1mgあたり22個であることが分かった。
アミノ官能化ポリ（アスパラギン酸）（10.7mg）及び
SMCC（30mg）をDMF中に溶解した。反応を室温で２時間
攪拌した。氷水を混合物に加え、BioRad 6P−DGゲルカ
ラムを用いて活性化ポリマーを混合物から分離した。次
に活性化ポリマーを、ヨーロッパ特許第185,870号に記
載の方法によって調製されたグリケート化ペプチド： （20mg）と室温で３分間反応させた。反応後、6P−DGゲ
ルカラムを用いて生成物を再精製し、凍結乾燥した。
活性化ポリマー上のマレイミド基の数をPDS試験［Gra
ssetti及びMurray,Arch.Biochem.Biophys.119:44−49
（1967）］によって測定すると、ポリマー1mgあたり0.4
6マイクロモルであることが分かった。また、ポリマー
上のGlc−ペプチドの量を、チロシンに関する275nmにお
けるモル吸光係数を用いて、UV/可視光吸収測定によっ
て測定すると、ポリマー1mgあたり0.46マイクロモルで
あることが分かった。
C.ウシ血清アルブミン被覆ラテックス ２％ラテックス溶液（4ml）を、１％プロテアーゼ遊
離BSAを含む10mM−グリシンバッファー（12ml）と混合
した。混合物を簡単に音波処理した。
2.BSA被覆ラテックスとヘモグロビンAoとの相互作用 Ｉ＝pH＝7.4 BSA被覆ラテックスを、50mM−リン酸ナトリウムバッ
ファー、0.05％BSA、0.02％ナトリウムアジド（pH＝7.
4）中で0.036％の濃度に希釈した。ラテックスを、種々
の既知Ao濃度を有する変性血液試料と混合した。550nm
における吸光度の変化を室温において長時間にわたって
記憶し、図１に示した（ヘモグロビンAo濃度:A＝99.5
％、Ｂ＝96％、Ｃ＝90％、Ｄ＝86％、Ｅ＝78％、Ｆ＝71
％）。
II.pH＝9.0 50mM−グリシン、80mM−塩化ナトリウム、0.05％−BS
A、0.02％ナトリウムアジド（pH＝9.0）中で0.05％に希
釈したBSA被覆ラテックスを用いて実験を繰り返した。
どの血液試料を加えても凝集は観察されなかった。
3.ヘモグロビンAo凝集に対するpHの効果 A.試薬 吸着ラテックス 濃縮吸着ラテックスを、BSA−pf0.05％及びナトリウ
ムアジド0.1％を含む200mM−グリシンバッファーを用い
て適当な濃度に希釈した。濃度４％のマンニトールもバ
ッファー中に存在させてよい。希釈後、吸着ラテックス
溶液を簡単に音波処理した（５〜10秒）。
凝集剤 凝集試薬の作用溶液を1.0mg/ml保存水溶液から調製し
た。保存溶液を、BSA−pf0.1％及びナトリウムアジド0.
1％を含有する20mM−ホスフェートバッファー（pH6）を
用いて希釈することによって10μg/ml溶液を調製した。
血液をベースとした標準試料及び臨床試料 血液をベースとした標準試料及び臨床試料は使用前に
変性されなければならない。試験において用いるため
に、血液試料を、Ames Aliquot混合器（Miles Inc.,Elk
hart,IN.USA.）のような振盪混合器によって良く混合し
た。次にこれらの試料を、変性剤／酸化体（3M−NH4SC
N、2mg/ml−K3Fe（CN）６、10mM−Tris、pH7.5）で1:31
に希釈した。変性剤中にフェリシアニドが存在すること
によって、希釈試料又は標準試料をヘモグロビン濃度の
測定に用いることが可能になった。試料を少なくとも15
秒間放置した後、OPTIMATETM装置（Miles Inc.Elkhart,
IN.USA.）上で試験し、蛋白を完全に変性しヘムを酸化
させた。
B.HbAlcに関する比濁試験 HbAlcを測定するためにOPTIMATE装置に関する三種の
異なる手順を用いた。二つは終点試験であり、そのうち
の一方は凝集剤溶液を手動で加える工程を必要とするも
のであり、もう一方は試験を完全に自動化したものであ
る。第３の試験方法は速度試験である。以下の記載によ
って三種の試験の概略を説明する。
凝集剤を手動で加える終点試験 1. Chemistry37のプログラムテストを用いて、以下の
試験パラメーターをUSER CHEMISTRY No.25のようにプロ
グラムした。
単位：無し 試験の種類：終点試験 少数位:2 分配法:A 遅延時間A:1200秒（試薬を分配してから吸光度を読取る
までの時間） 平衡時間:6秒（吸光度を読取る前に試料をキュベット内
に保持する時間） 読取時間:5秒（データを採取する時間、吸光度は１秒間
に7.7回読取る） キュベット温度:25℃ 標準濃度：無し ファクター:1000（結果にこのファクターをかけてミリ
吸光度単位に変換した） 低I/A（Abs）:2.000 高I/A（Abs）:2.000（吸光度の下限及び上限の両方を2.
00に設定することによって、OPTIMATEに各試料に関する
実際の吸光度を打ち出させる） 低標準：無し 高標準値：無し 吸光ファクター:540nm 移動温度：室温 試料量:10μ 試薬量:0.5ml 2. 試験を開始する前に、ピペッター／希釈器に100μ
試料シリンジ及び1.0ml試薬シリンジが装着されてい
ることを確認した。ピペッター／希釈器のタレットを、
試料シリンジに関しては10％（10μ）、試薬シリンジ
に関しては50％（0.5ml）に設定した。
3. 少なくとも50μの試料をOPTIMATE試料カップ中に
ピペットで加えた。
4. ピペッター／希釈器に吸着ラテックス溶液を充填し
た。
5. Eppendorf Repeater Pipette（容量1.25mlのチッ
プ、１に設定）を用いて凝集溶液25μをOPTIMATE反応
カップ内に手動で分配した。ブランク試験のカップNo.6
0及び濁り反応が起こっていない他の全てのカップを取
り外した。これらのカップ内に、バッファー（20mM−ホ
スフェート、pH6、0.1％BSA−pf、0.1％ナトリウムアジ
ド）25μをピペットで加えた。
6. 記載されている全ての指示にしたがって、Chemistr
y No.25−USER CHEMISTRY No.25を開始した。次に、OPT
IMATEによって自動的に、試料及び吸着ラテックスを反
応カップ内にピペット滴下し、分配し、20分後の吸光度
の読みを測定した。
凝集剤を自動的に添加する終点試験 1. OPTIMATE装置に、1.0mlのシリンジを備えたGilford
Automatic Dispenserを装着した。連絡ケーブルをOPTI
MATEの後部のJ4ポートに連結した。この外部分配器は、
（ａ）ユーティリティー15、セキュリティーコー980456
を入力する：（ｂ）ユーティリティー50、チェック＝
０、オプション20を入力する：この分配器のタレットを
50％（0.5ml）に設定することによって使用可能とな
る。
2. Chemistry 37−proguram New Testを用いて、以下
の試験パラメーターをUSER CHEMISTRY24のようにプログ
ラムした。
単位：無し 試験の種類：終点試験 少数位:2 分配法:A及びＢ 塔からの分配B:有 分配Ａから分配Ｂまでの時間:5秒 遅延時間A:1200秒 平衡時間:6秒 読取時間:5秒 キュベット温度:25℃ 標準濃度：無し ファクター:1000 低I/A（Abs）:2.000 高I/A（Abs）:2.000 低標準：無し 高標準値：無し 吸光フィルター:540nm 移動温度：室温 試料量:10μ 試薬量:0.1ml 3. 試験を開始する前に、ピペッター／希釈器に100μ
試料シリンジ及び250μ試薬シリンジが装着されて
いることを確認した。ピペッター／希釈器のタレット
を、試料シリンジに関しては10％（10μ）、試薬シリ
ンジに関しては10％（25μ）に設定した。イムノアッ
セイプローブがピペッター／希釈器上で用いられている
ことも確認した。
4. 少なくとも50μの試料をOPTIMATE試料カップ中に
ピペットで加えた。
5. ピペッター／希釈器に凝集剤溶液を充填した。
6. 外部分配器に吸着ラテックス溶液を充填した。
7. Chemistry No.24−USER CHEMISTRY No.24を開始
し、全ての指示に従った。次に、OPTIMATEによって自動
的に、試料及び凝集剤を反応カップ内にピペット滴下
し、分配し、５秒後に吸着ラテックスを加えた。20分後
に反応の吸光度の読みを測定した。
速度試験 1. OPTIMATE装置に、1.0mlのシリンジを備えたGilford
Automatic Dispenserを装着した。連絡ケーブルをOPTI
MATEの後部のJ4ポートに連結した。この外部分配器は、
（ａ）ユーティリティー15、セキュリティーコード9804
56を入力する：（ｂ）ユーティリティー50、チェック＝
０、オプション20を入力する：この分配器のタレットを
50％（0.5ml）に設定することによって使用可能とな
る。
2. Chemistry 37−proguram New Testを用いて、以下
の試験パラメーターをUSER CHEMISTRY 23のようにプロ
グラムした。
単位：無し 試験の種類：動的酵素 少数位:2 分配法:A及びＢ 塔からの分配B:有 分配Ａから分配Ｂまでの時間:5秒 遅延時間A:20秒 平衡時間:5秒 読取時間:30秒 キュベット温度:30℃ 標準温度：無し ファクター:1000 低I/A（Abs）:2.000 高I/A（Abs）:2.000 吸光フィルター:540nm 移動温度:30℃ 試料量:10μ 試薬量:0.1ml 3. 試験を開始する前に、ピペッター／希釈器に100μ
試料シリンジ及び250μ試薬シリンジが装着されて
いることを確認した。ピペッター／希釈器のタレット
を、試料シリンジに関しては10％（10μ）、試薬シリ
ンジに関しては10％（25μ）に設定した。イムノアッ
セイプローブがピペッター／希釈器上で用いられている
ことも確認した。
4. 少なくとも50μの試料をOPTIMATE試料カップ中に
ピペットで加えた。
5. ピペッター／希釈器に凝集剤溶液を充填した。
6. 外部分配器に吸着ラテックス溶液を充填した。
7. Chemistry No.23−USER CHEMISTRY No.23を開始
し、全ての指示に従った。次に、OPTIMATEによって自動
的に、試料及び凝集剤を反応カップ内にピペット滴下
し、分配し、５秒後に吸着ラテックスを加えた。14秒後
にこの反応の吸光度の読みを測定した。吸光度は全部で
30秒間読み取った。OPTIMATEによって、採取されたデー
タ及び１分あたりの吸光度の変化の見地から得られるデ
ータから線状回帰線が測定された。
ヘモグロビン測定 全ての血液試料に関して、試料中のHbAlcのパーセン
トを算出するために試料中のヘモグロビン濃度を測定し
なければならない。HbAlcの測定に用いたのと同一の変
性試料を、以下のプロトコール（protocol）を用いたヘ
モグロビン測定に用いた。
1. Chemistry 37のプログラムテストを用いて、以下の
試料パラメーターをUSER CHEMISTRY No.26のようにプロ
グラムした。
単位：無し 試験の種類：終点試験 少数位:2 分配法:A 遅延時間A:300秒 平衡時間:6秒 読取時間:5秒 キュベット温度:25℃ 標準濃度：無し ファクター:1000 低I/A（Abs）:2.000 高I/A（Abs）:2.000 低標準：無し 高標準値：無し 吸光フィルター:540nm 移動温度：室温 試料量:70μ 試薬量:0.5ml 2. 試験を開始する前に、ピペッター／希釈器に100μ
試料シリンジ及び1.0ml試薬シリンジが装着されてい
ることを確認した。ピペッター／希釈器のタレットを、
試料シリンジに関しては70％（70μ）、試薬シリンジ
に関しては50％（0.5ml）に設定した。
3. 少なくとも120μの試料をOPTIMATE試料カップ中
にピペットで加えた。
4. ピペッター／希釈器に、200mM−グリシン、0.05％B
SA−pf及び0.1％ナトリウムアジドを含むpH9のバッファ
ーを充填した。
5. Chemistry No.26−USER CHEMISTRY No.26を開始
し、全ての指示に従った。次に、OPTIMATEによって自動
的に、試料及びバッファーを反応カップ内にピペット滴
下し、分配し、５分後の吸光度の読みを測定した。
計算 OPTIMATEによって与えられた情報をHbAlc（％）の結
果に変換するために多数の計算を行なわなくてはならな
い。
1. 全ての試験実験にラテックスブランク試験（500μ
ラテックス＋30μバッファー）を含ませた。この反
応の吸光度を他の全ての結果から減じなければならな
い。
2. 全ての血液試料に関して、反応に対するヘモグロビ
ンの吸光度の寄与を、USER CHEMISTRY 26から得られた
情報を用いて計算した。これから得られた吸光度の結果
を７で割って、血液10μの吸光度を計算した。次に、
この値を上記で得られた吸光度の結果から減じた。
3. 標準曲線を算出するために、イムノアッセイNo.37
−Program New Testを用いて擬イムノアッセイをプログ
ラムした。以下のパラメーターをUSER IMMUNOASSAY No.
27のようにプログラムした。
プロトコール:No.1 較正値:Glc−ペプチド標準試料（単位μＭ−HbAlc）に
関して指定された較正値を入力した。これらは用いた吸
着ラテックスの全部に依存する。他の全てのパラメータ
ーは重要ではないが、較正値を供給するために入力しな
ければならない。
4. イムノアッセイNo.33−Immunoassay Calculations
を用いて４つのパラメーター論理標準曲線を作成した。
試験No.:No.27 計算式:1.4パラメータ論理式 Glc−ペプチド標準試料に関する吸光度結果（ラテッ
クスブランク値を減じたもの）を入力した。次に、OPTI
MATEによって、標準曲線を作成し、曲線及び４つのパラ
メーターの標準偏差を計算した。式が完成したら、全て
の試料に関する吸光度−ラテックスブランク値、−Hb分
配）を入力することによって未知試料のHbAlcを算出し
た。打ち出された結果がHbAlc濃度（μＭ）である。
5. 各血液試料におけるヘモグロビン濃度を、USER CHE
MISTRY No.26からの情報を用いて算出した。ヘモグロビ
ン濃度は、まず第１にG/dlの単位で算出され、次にこの
情報を用いて存在するヘモグロビンβ鎖の濃度（mM）を
測定した。
mM−βサブユニット中のヘモグロビン濃度： 6. ここで、HbAlc濃度及びヘモグロビン濃度（μＭ）
（どちらもβサブユニットに関する）が分かり、HbAlc
（％）を測定することが可能になる。
臨床的研究 臨床試料（71）を他方の臨床研究室から得、これを、
通常のHbAlcアフィニティークロマトグラフィー（Isola
b,Akron,OH,USA.）によって試料を試験した。本発明を
用いて、上記のようにして試料を試験した。関係を図３
に示す。
5.ヘモグロビンAo試験 80mM塩化ナトリウム、0.05％−BSA及び0.02％ナトリ
ウムアジドを含む50mM−ホスフェート、pH7.4を用い、
上記記載のAlc（％）に関する手順を用いて試料のAo
（％）を測定した。代表的な量応答曲線を図４に示す。
上記に本発明を詳細に説明し例示した。明らかに、本
発明の精神及び範囲から逸脱することなく発明の多くの
他の変更及び修正を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ラテックス粒子の凝集に対する、ヘモグロビン
Ao（天然の未変性ヘモグロビン）濃度を変化させること
の効果を示すグラフ）； 図２は、ヘモグロビンAoがラテックス粒子を凝集させる
能力に対するpHの効果を示すグラフ； 図３は、本発明によって得られるHbAlc試験結果と、標
準アフィニティークロマトグラフィー法によって得られ
る結果との関係を示すグラフであり； 図４は、本発明によって得られるヘモグロビンAoの量応
答曲線を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 フランセス・エム・イーガー アメリカ合衆国、インヂアナ 46540、 ミドルリバー、イースタン・スター・ド ライブ 306 (72)発明者 キン・ファイ・イップ アメリカ合衆国、インヂアナ 46514、 エルクハート、クリークヘイブン・ドラ イブ 51194

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ラテックス凝集イムノアッセイによって血
    液試料中の分析対象物を測定するための分析方法であっ
    て、 （ａ）血液試料を、水懸濁性ラテックス粒子に結合した
    抗分析対象物抗体又はそのフラグメントからなる多価ラ
    テックス抗体試薬、並びに分析対象物が単価である場合
    には、更に抗分析対象物抗体又はそのフラグメントのた
    めの多数のエピトピックな結合部位を含む凝集試薬、を
    配合することによって水性反応混合物を生成させ； （ｂ）水性反応混合物中に得られる凝集を血液試料中の
    分析対象物の関数として測定することを特徴とし、 その改良点が、pH約8.5以上を有する水性反応混合物を
    生成させ、それによって、血液試料中のヘモグロビンの
    存在によるラテックス試薬の非特異性凝集が起こる可能
    性を実質的に排除することからなる方法。
  2. 【請求項２】該ラテックス粒子が、約７以下のpHを有す
    る水溶液中に懸濁された場合に、有効な正味の表面陰電
    荷を有する請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】該ラテックス粒子が、ポリスチレンである
    請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】水性反応混合物が、約8.5からそのpHにお
    いて分析対象物とラテックス試薬との間の免疫反応性が
    実質的に減少するpHまでの間のpHを有するように生成さ
    れる請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】水性反応混合物が、約8.75〜約10の間のpH
    を有するように生成される請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】水性反応混合物が、約９のpHを有するよう
    に生成される請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】粒子凝集抑制イムノアッセイによって血液
    溶解産物を含む試験試薬中のヘモグロビンAlcを測定す
    る分析方法であって、 （ａ）血液試料、並びに、（ｉ）水懸濁性ポリスチレン
    ラテックス粒子に結合したヘモグロビンAlcに対する抗
    体又はそのフラグメントを含む多価抗体試薬、及び（i
    i）ヘモグロビンAlcのグリケート化ペプチド（glycated
    peptides）配列に対応する多数のグリコペプチドを含
    む凝集試薬、を含む試験試薬からなる水性反応混合物を
    約8.5以上のpHを有するように生成させる工程を含み； （ｂ）血液試料中のヘモグロビンAlcの関数として得ら
    れる凝集を測定する方法。
  8. 【請求項８】血液試料をヘモグロビン変性物によって予
    め処理し、抗体試薬が変性ヘモグロビンAlcに特異的に
    結合するモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含
    む請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】（ｉ）水懸濁性ラテックス粒子に結合して
    いる抗分析対象物抗体又はそのフラグメントを含む多価
    ラテックス抗体試薬； （ii）分析対象物が単価である場合には、抗分析対象物
    抗体又はそのフラグメントのための多数のエピトピック
    結合部位を含む凝集試薬；及び、 （iii）試験系成分と血液試料とを配合することによっ
    て生成される反応混合物のpHを約8.5以上に保持しうる
    バッファー； を含む、ラテックス凝集イムノアッセイによって血液試
    料中の分析対象物を測定するための試薬キット。
  10. 【請求項１０】該ラテックス粒子が、約７以下のpHを有
    する水溶液中に懸濁された場合に、有効な正味の表面陰
    電荷を有する請求項９記載の試薬キット。
  11. 【請求項１１】該ラテックス粒子が、ポリスチレンであ
    る請求項９記載の試薬キット。
  12. 【請求項１２】水性反応混合物が、約8.5からそのpHに
    おいて分析対象物とラテックス試薬との間の免疫反応性
    が実質的に減少するpHまでの間のpHを有するように生成
    される請求項９記載の試薬キット。
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