JP2683572B2 - 血液中ヘモグロビン誘導体を簡便に測定するための変性試薬 - Google Patents

血液中ヘモグロビン誘導体を簡便に測定するための変性試薬

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、血液試料中の特定のヘモグロビン誘導体の
相対量を測定するための方法に関する。更に詳しくは、
本発明は、血液中の誘導ヘモグロビンの割合又はパーセ
ンテージを測定するために全ヘモグロビンの分離測定及
びヘモグロビン誘導体の測定を必要とする、グリケート
化（glycated）ヘモグロビンのようなヘモグロビン誘導
体の測定に関する。
in vivoの方法によって生成する、特定の誘導体の形
態で血流中に存在するヘモグロビンの相対量の測定は、
種々の医学的な状況において重要である。特に重要なも
のはグリケート化ヘモグロビン（グリコシル化ヘモグロ
ビンと称されることもある）の測定である。グリケート
化ヘモグロビンを測定して糖尿病のメリタス（mellitu
s）中の長期的な血液グルコース制御を評価すること
が、その使用頻度を増している。糖尿病の処置において
最も重要なグリケート化ヘモグロビンは、通常ヘモグロ
ビンA1cとして知られている誘導体である。このヘモグ
ロビン誘導体は、グルコースとヘモグロビンとの非酵素
的反応によってin vivoで生成される。グルコースは、
天然ヘモグロビン中のβ鎖のアミノ末端バリン残基に、
再配列形態で共有結合付加するようになる。通常の個体
はその全ヘモグロビンの約３〜６％をA1c形態で有する
が、制御されていない糖尿病患者の個体は、３〜４倍高
い量のこのヘモグロビン誘導体を血液中に有しうる。
グリケート化ヘモグロビンを測定する目的で種々の方
法が開発されている。通常の方法は、陽イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
電気泳動及び染料コンプレックス形成（ヒドロキシフル
フラル／チオバルビツル酸）のような種々の技術に基く
ものである。これらの方法は、時間のかかる複雑なもの
であり、特別な熟練者を必要とし、不正確性及び非特異
性が避けられないことが良く知られている。ごく最近に
なって、イムノアッセイを行なってヘモグロビンA1cを
測定することを可能にする、ヘモグロビンA1c中のグリ
ケート化Ｎ末端ペプチド残基に対して特異なモノクロー
ナル抗体が開発された（米国特許第4,647,654号参
照）。
モノクローナル抗体を用いるヘモグロビンA1cのイム
ノアッセイ測定は高度に特異的であり、手順の冗長さ及
び複雑さは先行技術の方法と比較して大きく減少してい
る。それにもかかわらず、最適のヘモグロビンA1cイム
ノアッセイは、グリケート化Ｎ末端ペプチド残基を抗体
結合に利用しうるようにするために血液試料を変性条件
にかけることを必要とする（米国特許第4,658,022号参
照）。代表的な変性条件は、3M以上のグアニジン−HCl
で、56℃に15分以上加熱することである。
イムノアッセイ法をはじめとする先行方法の更なる制
限は、グリケート化ヘモグロビン濃度をパーセンテージ
として有意に示すことができるように、全ヘモグロビン
測定をそれぞれの測定と共に行なう必要があることであ
る。これによって、試験を行なうための全時間及び経費
が増大する。
発明の概要 ここで、血液試料を、（ｉ）試料中のヘモグロビンを
変性しせめるチオシアネート塩及び（ii）ヘモグロビン
をメトヘモグロビンの形態に転化せしめうる酸化剤を含
む変性試薬で処理した後、処理試料を全メトヘモグロビ
ンに関して試験し、試料の同一の又は他の部分を、対象
とする変性された形態のヘモグロビン誘導体に関して試
験することによって、グリケート化ヘモグロビンのよう
な特定のヘモグロビン誘導体に関する、極めて単純で、
迅速で正確な試験を行なうことができることが見出され
た。次に二つの試験結果を、例えばパーセンテージのよ
うな任意の数学的な方法で関連させて、試料中のヘモグ
ロビン誘導体の相対量を定量測定する。
メトヘモグロビンは、540nmにおけるその特徴的な吸
光度を測定することによって簡便に測定される。対象と
するヘモグロビン誘導体の変性形態は、イムノアッセイ
によって簡単にかつ明確に測定することができる。特に
有用なイムノアッセイ法は粒子凝集抑制に基くものであ
り、これは、任意の好都合な波長、例えばメトヘモグロ
ビン測定と同一の波長、すなわち540nmにおける濁度に
よって読みを行なうように設定することができる。この
ように、本発明によって、全ヘモグロビンと共にヘモグ
ロビン誘導体のパーセントを測定し、ヘモグロビン誘導
体の測定を、単一の波長において、適当なブランク値及
び最適化と共に簡単な分光光度計によって行なうことが
可能になる。
血中の天然ヘモグロビン（Fe+2）を（Fe+3）メトヘモ
グロビンの形態に転化させる酸化剤の存在が、チオシア
ネート変性剤と相乗的に作用し、試験のイムノアッセイ
部分のための試料ヘモグロビンの変性速度が向上するこ
とが見い出された。酸化剤の非存在下においては、室温
におけるチオシアネート変性は、再現しうる程度の実質
的に完全な変性を行なうためには、約７分間以下を必要
とする。有効量の酸化剤が存在すると、実質的に完全な
変性は３分以内で行なうことができ、好ましい酸化剤、
フェリシアニドの場合には、室温において１分以内で行
なうことができる。また、酸化剤とチオシアネートとを
配合することによって、同一の試験試料について、全ヘ
モグロビン及びヘモグロビン誘導体の試験を行なうこと
も可能になる。
したがって、本発明によると、全試験時間が大きく減
少し、血液試料中のヘモグロビンA1cのようなヘモグロ
ビン誘導体の相対量を定量する、迅速で、簡単で正確な
メトヘモグロビンイムノアッセイ法を行なうのが容易に
なる。
好ましい実施態様の説明 変性試薬として、チオシアネート塩と酸化剤とを配合
することによって、血液試料中の実質的に全てのヘモグ
ロビンを、迅速かつ再現可能に変性チオシアン−メトヘ
モグロビン形態に転化する手段が提供される。得られる
チオシアン−メトヘモグロビンは、全試料ヘモグロビン
を測定するための基礎として有用であり、対象とする変
性形態の特定のヘモグロビン誘導体は、かかる変性種に
関するイムノアッセイにおける分析対象物として有用で
ある。イムノアッセイは、好ましくは、対象とする変性
ヘモグロビン誘導体に関するモノクローナル抗体の特異
親和力に基く。
チオシアネート塩は、イオン化によって、試験におい
て検出するためにヘモグロビン誘導体を変性するのに有
効なチオシアネートアニオン（SCN-）を与えるいかなる
塩の形態からも選択することができる。対陽イオンは、
全ヘモグロビン及び誘導体化ヘモグロビン試験に対して
生ずる可能性のある全ての障害を最小化又は排除するよ
うに選択される。アンモニウム、カリウム及びナトリウ
ムチオシアネートが本発明の目的に有用である。チオシ
アネート塩溶液を、混合物中において有効な変性濃度を
与えるのに充分な量で血液試料に加える。通常の場合、
変性混合物中において約0.5〜約6.0M、より通常的には
約1.5〜約3.5Mの濃度が用いられる。変性剤の濃度を増
加させると変性速度が速くなる。また、温度を上昇させ
ると、変性速度が概して上昇する。好ましい条件は、約
3M以上の濃度のチオシアネートの存在下での室温におけ
る変性である。変性混合物中のチオシアネートの濃度
が、ヘモグロビン誘導体に関するイムノアッセイの特性
に影響を与えうる濃度、例えば約1.5〜2.0Mを超える濃
度である場合には、混合物を適当に希釈する。
酸化剤は、天然のヘモグロビン第１鉄イオンをその第
２鉄メトヘモグロビンの形態に転化するのに充分な電気
化学ポテンシャルを有する実質的にいかなる無機又は有
機酸化剤から選択することもできる。もちろん、その酸
化ポテンシャルによって選択された酸化剤の候補物質
を、試験系において試験し、全ヘモグロビン及び誘導体
化ヘモグロビン試験に大きく影響を与えないことを確認
する。種々の酸化剤がヘモグロビンをそのメトヘモグロ
ビンの形態に転化させるのに有効であることが文献にお
いて知られている［Advances in Clinical Chemistry,
8;142−185（1965）を参照］。酸化ポテンシャルに基い
て適当であると考えられる酸化剤としては、フェリシア
ニド、ヨウ素酸塩、塩素酸塩、臭素酸塩、クロム酸塩、
塩化第２水銀、セリウム（IV）及びタリウムイオン、次
亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩、ヨウ化物、ヒドロキシアミ
ン、ブロモスクシンイミド、クロロスクシンイミド、ク
ロロアミン及びペルオキシドが挙げられる。変性を実質
的に完了させる時間を減少させる変性速度の向上度合
は、もちろん、選択される酸化剤によって変化する。実
験試験を炭やかに行ない、チオシアネートと配合して充
分に迅速な変性を与える酸化剤を選択することができ
る。
実質的に完全な変性とは、本明細書においては、血液
試料中のヘモグロビンの変性によって、選択されたイム
ノアッセイを用いて検出することのできる実質的に最大
量の変性ヘモグロビン誘導体が与えられる時点を意味す
ると理解される。したがって、完全な変性という概念
は、ヘモグロビン蛋白の全ての三次及び二次構造が完全
に分解されることが必要であることを意図するものでは
なく、選択されたイムノアッセイ手段によって検出され
れヘモグロビン誘導体のエピトープの露出が最大になる
ことを意図するものである。通常、イムノアッセイは、
ヘモグロビン誘導体を特徴付ける独特のエピトープに対
するモノクローナル抗体の特異性に基くものである。し
たがって、試料中のヘモグロビンの実質的に完全な変性
とは、かかるヘモグロビンの実質的に全てが、試験にお
いて完全に検出されうるのに充分に変性されていること
を意味するものである。指定の時間間隔でヘモグロビン
誘導体イムノアッセイを行ない、試験応答曲線が極値に
達する点を観察することによって、与えられた変性条件
下で実質的に完全な変性に達するのに費やされる時間が
測定される。
酸化剤は、過剰量、例えば試料中に通常存在するヘム
の５倍過剰量で加えられる。20倍過剰以下の量を有利に
用いることができる。特定の試験に関する適当な量は、
当該分野の技術者によって決定することができる。
酸化剤の非存在下においては、室温におけるチオシア
ネート変性は、実質的に完全な変性に達するのに７分以
下を擁する。イムノアッセイに実質的に障害を及ぼすこ
となくこの変性時間を減少させることが見い出された酸
化剤としては、フェリシアニド、ヨウ素酸塩、塩素酸
塩、クロム酸塩及び亜硝酸塩が挙げられる。特に、塩素
酸塩及び亜硝酸塩が変性時間を３分以下に減少させ、ま
た、フェリシアニドが、約3M以上のチオシアネート濃度
を用いて室温において１分未満で実質的に完全に変性が
行なわれるという最良の結果をもたらすことが見い出さ
れた。
チオシアネート／酸化剤変性剤を用いることの主たる
有用性は、室温において迅速な変性が得られることであ
る。しかしながら、好ましいと考えられる場合は、温度
を上昇させることによって変性を更に加速することがで
きる。更に、異なる複数の酸化剤をチオシアネートと配
合して用いることも本方法によって考慮される。
チオシアネート／酸化剤変性剤対は、血液試料と段階
的に、又は好ましい場合には同時に混合することができ
る。通常、チオシアネート及び酸化剤の変性試薬溶液を
調製し、これを血液試料と直接混合する。安定性の理由
のために、変性試薬溶液は、試験において用いる直前に
調製されることが多い。しかしながら、安定性が許す場
合、あるいは、チオシアネート塩と酸化剤とを配合する
ことを可能にする安定剤又は器具の構造を用いる場合に
は、変性試薬溶液を長時間にわたって保存及び／又は包
装しておくことができる。変性剤成分は、乾燥した形態
で混合することができ、そうでない場合には、試験試料
及び／又は希釈剤又はバッファーによる再水和によって
試薬溶液を形成するように配合することができる。
本発明方法は、その変性形態においてイムノアッセイ
によって検出される血中のいかなるヘモグロビン誘導体
の試験に適用することもできると意図されている。かか
るヘモグロビン誘導体としては、アルコールの乱用によ
るアセトアルデヒド−ヘモグロビン付加物、尿毒症患者
の血液中に存在する尿素−ヘモグロビン付加物、アスピ
リン−ヘモグロビンコンプレックス、及び、特に、ヘモ
グロビン蛋白上の反応性アミン基とグルコースとの非酵
素反応によって生成するグリケート化へヘモグロビンの
類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、上記記載のようなヘモグロビンA1cの測定に
特に適切である。
処理され、変性された血液試料を、全メトヘモグロビ
ン及び対象とするヘモグロビン誘導体に関して別々に試
験し、次に、結果を数学的に関連させて、対象とする誘
導体化形態の血中ヘモグロビンの相対量を測定値を与え
る。全メトヘモグロビンは、Drabkins法（National Com
mission for Clinical Laboratory Standards of the
U.S.,Proposed Standard PSH−15）のようないかなる通
常の方法によっても測定することができる。全メトヘモ
グロビンを測定する最も好都合な方法は、特徴的な波
長、例えば540nmにおいて、溶液におけるその吸光度を
測定することによるものである。
ヘモグロビン誘導体の測定は、通常、イムノアッセイ
によって行なわれる。上記記載の米国特許第4,647,654
号及び同第4,658,022号において記載されているよう
に、モノクローナル抗体を展開させて、変性蛋白中のヘ
モグロビン誘導体、例えばヘモグロビンA1cを特徴付け
ているエピトープに特異的に結合させることができる。
特定のイムノアッセイ法及び形式、並びに標識化方法及
び生成する信号の検出は、本発明に重要なものではな
い。原則として、酵素標識体（ELISA）の使用に基くも
のなどのような非ラジオアイソトープ法が好ましい。
別の工程を用いずに行なうことができ、分析対象物濃
度に関連する測定可能な吸光度の変化を与えるので、粒
子凝集抑制イムノアッセイが特に有用な方法である。か
かる試験は、抗体粒子試薬と凝集試薬との特異的な相互
作用に基くものである。抗体粒子試薬は、水懸濁性粒子
（例えばポリスチレン又は他のラテックス）に結合して
いる抗体又はそのフラグメントを含む。凝集剤は、抗体
試薬に対する多数のエピトピック（epitopic）な結合部
位を含む。分析対象物の非存在下においては、抗体粒子
と凝集剤とが互いに結合して、濁度測定によって炭やか
に定量される光拡散性コンプレックスを形成する。存在
する分析対象物の量が増加すると、抗体粒子は分析対象
物と結合するようになって凝集剤と結合することができ
なくなるので、溶液の濁度が減少する。凝集剤は、好適
には、対象とするヘモグロビン誘導体を特徴付けるエピ
トープを画定する多数の有機基、例えばペプチド残基が
付加しているポリマー骨格を有する。例えば、ヘモグロ
ビンA1cの測定のためには、エピトープは、ヘモグロビ
ンA1c中のグリケート化−Ｎ−末端残基の配列に対応す
る数個のアミノ酸単位のグリケート化ペプチド残基を含
んでいてよい。
全メトヘモグロビン及び誘導ヘモグロビンの試験は、
それぞれ、処理された血液試料の同一の部分で行なうこ
とも、又は異なる部分で行なうこともできる。後者の場
合、処理された試料の第１の容量部分を、通常はバッフ
ァー中で適当な希釈を行なった後にメトヘモグロビンに
関して直接試験し、第２の容量部分を上記記載のように
変性ヘモグロビン誘導体に関して試験する。また、処理
された試料を適当に希釈し、チオシアン−メトヘモグロ
ビンに関して試験を行なった後に、イムノアッセイ系の
試薬を加えるか、又は、かかる試薬に溶液を加えること
によるように、両方の試験を、処理された試料の同一の
容量部分において連続して行なうこともできる。
粒子凝集抑制イムノアッセイ法を用いて、血液試料と
本発明の変性剤とを混合することによって形成される変
性剤混合物に、多数の可能な試験プロトコル（protoco
l）を適用することができる。
一つのプロトコールは、ヘモグロビン測定のために、
変性剤混合物の一部をバッファー又は水で希釈すること
を含。例えば、終点測定か速度測定のいずれかを用いて
（室温又は37℃で）540nmにおいて行なわれるイムノア
ッセイのために、変性剤混合物の第２の部分を、抗体粒
子試薬及び凝集剤と混合する。
他のプロトコールは、変性剤混合物を、凝集試薬を含
む溶液で希釈することを含む。ヘモグロビンをこの混合
物中で550nmにおいて測定する。次に、抗体粒子試薬を
加え、イムノアッセイ、例えば600nmにおける速度測定
を開始する。
他のプロトコールにおいては、変性剤混合物をバッフ
ァーで希釈し、ヘモグロビンを測定する。次に希釈され
た混合物を抗体粒子試薬及び凝集試薬と混合し、速度測
定によって、540nmにおけるイムノアッセイ測定を行な
う。
更に他のプロトコールは、ヘモグロビンを変性剤混合
物中で直接測定することを含む。次に、乾燥形態の抗体
粒子試薬及び凝集試薬を、同時に又は連続して（その間
にブランク値の読みを行なって、又は行なわないで）、
変性剤混合物中に溶解する。
特に有用な試験プロトコールを以下の実施例に記載す
る。
本発明は、チオシアネート塩、酸化剤、及び、変性ヘ
モグロビン誘導体の測定のためのイムノアッセイ試薬を
含む、試験方法を行なうための試験系を提供する。好ま
しくは、イムノアッセイ試薬は、上記記載の粒子凝集抑
制系に属するものである。メトヘモグロビン試薬を含ま
せることもできるが、メトヘモグロビンを測定するため
の好ましい吸光度法においては、希釈水又はバッファー
希釈剤を用いる可能性がある外はいかなる試薬も必要で
はない。試験系は、いかなる好都合な形態であってもよ
く、通常は、試験系の成分を保持した容器を包装して組
み合わせたものを含む試験キットの形態をとる。
以下の実施例によって本発明を説明するが、これは本
発明を制限するものではない。
実施例 1.試薬の調製 A.抗体−ラテックス試薬 必要な材料： ・２％ラテックス懸濁液（直径0.085μのポリスチレン
ラテックス、Seragen,Indianapolis,IN,USA.） ・抗体溶液［米国特許第4,647,654号に記載のようにし
て調製し、蛋白Ａアフィニティークロマトグラフィー
（BioRad Laboratories,Richmond,CA,U.S.A）によって
腹水液から精製したモノクローナル抗体］ ・10mMグリシンバッファー、0.02％アジド、pH9.3 ・100mM NaCl ラテックス濃度0.5％で抗体被覆を行ない、抗体は、
通常は、被覆反応において最終濃度1mg/mlで用いた。Na
Clを加えた10mMグリシンバッファー中に必要量の抗体を
希釈し、所望の最終伝導度（0.5〜1.8mmho）を得ること
によって、２倍濃度の抗体溶液を調製した。等量の10mM
グリシンバッファーを混合することによって、２％ラテ
ックスを２倍濃度（又は１％）に希釈した。ラテックス
懸濁液を、抗体溶液を含む容器中に注ぐことによって反
応を開始させた。ラテックスを加える際に、抗体溶液を
電磁撹拌棒で混合した。溶液は全て室温であった。電磁
撹拌プレートからの加熱が起こらないように容器を絶縁
して混合を一晩（少なくとも15時間）継続した。これ
は、絶縁のための空間を約１インチとって撹拌プレート
上に容器を懸下することによって行なうことができる。
15時間の撹拌後、得られた懸濁液を、Sorvall SS−34
ローター（Dupont,Wilmington,DE,U.S.A）用のポリプロ
ピレン遠心管中に等量に分割した（管あたり約10ml）。
懸濁液を、15,000rpm（2700×ｇ）で60分間遠心分離し
た。上澄液をデカントした。ペレットを、所望の被覆蛋
白［通常は、Miles Inc.,Elkhart,IN,U.S.Aから得られ
る１％プロテアーゼ遊離ウシ血清アルブミン（BSA−p
f）］を含む10mMグリシバッファーで２回洗浄した。ペ
レットを洗浄するために、管中の元の容量と同量の洗浄
溶液を加えた。ペレットを、激しく撹拌し、短時間音波
処理（10〜15秒間）することによって再懸濁させた。最
初の再懸濁の後、吸着ラテックスを、再遠心分離にかけ
る前に室温で１時間放置した。最初の再懸濁及び遠心分
離の後、ペレットが完全に分散したら直ちに再上澄液を
遠心分離した、第２の洗浄の後、最初の反応容量と同量
の容量中にペレットを再懸濁した。懸濁液を、0.8μの
フィルターを通して過し、５℃で保存した。
元の上澄液、第１及び第２の洗浄からの上澄液及び最
終試料の100倍希釈液の546nmにおける吸光度を測定する
ことによって濃度を測定した。これらの吸光度の合計
を、100％、又は0.5％ラテックスと同等と仮定した。最
終試料の吸光度を、100％を算出するために用いる吸光
度の合計で割った。最終試料の100倍希釈液の吸光度に1
00をかけて最終試料に関する吸光度を得た。
例試料 A546 上澄液 0.044 第１の洗浄 0.034 第２の洗浄 0.021 最終試料 0.051×100＝5.1 （100倍希釈） 100％（又は0.5％ラテックス） ＝5.10＋0.044＋0.034＋0.021＝5.199 最終試料のラテックス濃度 ＝（5.1/5.199）×0.5％＝0.49％ B.凝集試薬 Alpert J.Chromatography266:23（1983）の手順にし
たがってポリ（アスパラギン酸）を調製した。
アミノエタノール（80ミリモル）及び4,9−ジオキサ
−1,12−ドデカンジアミン（20ミリモル）を、アルゴン
下でジメチルホルムアミド（DMF）中に溶解した。溶液
を、ポリ（アスパラギン酸）（10ミリモル）及びDMFの
溶液で処理した。反応を、室温で１時間、続いて70℃で
２時間撹拌した。次に、混合物を冷却し、液の大部分
を、減圧下で蒸発させることによって除去した。油状の
残査を、エーテル、次に温テトラヒドロフランで繰返し
洗浄した。生成物を凝固させ、過によって回収した。
粗生成物を水中に溶解し、pHを中性に調節した。次に、
溶液を、BioRad 6P−DG脱塩ゲルカラム（BioRad Labora
tories,Richmond,CA,U.S.A.）を用いて精製した。アミ
ノ官能化ポリマーを含むフラクションをプールし、凍結
乾燥した。ポリマー上のアミノ基の数をHabeebのTNBS試
験［Anal.Biochem.14:328−336（1966）］によって測定
すると、ポリマー（mg）あたり22であることがわかっ
た。
アミノ官能化ポリ（アスパラギン酸）（10.7mg）及び
SMCC（30mg）をDMF中に溶解した。反応を室温で２時間
撹拌させた。氷水を混合物に加え、BioRad 6P−DGゲル
カラムを用いて活性化ポリマーを混合物から分離した。
次に、活性化ポリマーと、ヨーロッパ特許第185,870号
に記載の方法によって得られる次式： のグリケート化ペプチド（20mg）とを、室温で３分間反
応させた。反応後、6P−DGゲルカラムを用いて生成物を
再精製し、凍結乾燥した。
PDS試験［Grassetti及びMurray.Arch.Biochem.Biophy
s.119:44−49（1967）］によって活性化ポリマー上のマ
レイミド基の数を測定すると、ポリマー（mg）あたり0.
46マイクロモルであることがわかった。チロジンに関す
る275mmにおけるモル吸光係数を用いたUV/Vis吸光度測
定によって、ポリマー上のGlc−ペプチドの量を測定す
ると、ポリマー（mg）あたり0.46マイクロモルであるこ
とがわかった。
2.HbA1c（％）を測定するための試験方法 A.試薬 吸着ラテックス 0.05％BSA−pf及び0.1％ナトリウムアジドを含有する
200mM−グリシンバッファー、pH9を用いて濃縮吸着ラテ
ックスを適当な濃度に希釈した。バッファー中には、濃
度４％のマンニトールも存在させた。希釈後、吸着ラテ
ックス溶液を短時間（５〜10秒）音波処理した。
凝集剤 凝集試薬の作用溶液を、1mg/mlの水保存溶液から調製
した。保存溶液を、0.1％BSA−pf及び0.1％ナトリウム
アジドを含有する20mMリン酸塩バッファー、pH6で希釈
することによって10μg/ml溶液を調製した。
血液をベースとした標準試料及び臨床試料 血液をベースとした標準試料及び血液試料は、用いる
前に変性しなければならない。試験において用いるため
に、血液試料を、Ames Aliquot混合器（Miles Inc.,Elk
hart,IN,U.S.A.）のような振盪混合器によって良く混合
した。次に、これらの試料を変性剤／酸化剤（3M−NH4S
CN、2mg/ml−K3Fe（CN）ｂ、10mM−Tris、pH7.5）で1:3
1に希釈した。変性剤中にフェリシアニドを存在させる
ことによって、希釈試料又は標準試料をヘモグロビン濃
度の測定のために用いることが可能になった。OPTIMATE
TM装置（Miles Inc.,Elkhart,IN,U.S.A.）で試験する前
に、試料を少なくとも15秒間放置して、蛋白の変性及び
ヘムの酸化を完了させた。
B.HbA1cに関する濁度測定試験 OPTIMATE装置に関して、三種の異なる手順をHbA1cの
測定に用いた。二つは、終点法であり、そのうちの一つ
は凝集剤溶液を手動で加えることを必要とするものであ
り、もう一つは試験を完全に自動化したものである。第
３の試験法は速度試験である。以下の記載によって、三
種の試験の概要を簡単に説明する。
凝集剤を手動で加える終点試験 1.Chemistry37−Program New Testを用いて、以下の試
験パラメーターをUSER CHEMISTRY No.25のようにプログ
ラムした。
単位：無し 試験の種類：終点試験 小数位:2 分配法:A 遅延時間A:1200秒（試薬の分配から吸光度の読みまでの
時間） 平衡時間:6秒（吸光度の読取りの前に試料をキュベット
中に保持する時間） 読取り時間:5秒（データを採取し、吸光度を7.7回／秒
読取る時間） キュベット温度:25℃ 標準濃度：無し ファクター:1000（この値を結果にかけてミリ吸光度単
位に変換する） 低I/A（Abs）:2.000 高I/A（Abs）:2.000（低及び高吸光度限界の両方を2.00
に設定することによって、各試料に関する実際の吸光度
の読みをOPTIMATEに印刷させる） 低標準値：無し 高標準値：無し 吸光フィルター:540nm 移動温度：室温 試料容量:10μ 試薬容量:0.5ml 2.試験を開始する前に、ピペッター／希釈器に、100μ
シリンジ及び1.0ml試薬シッリンジが装着されている
ことを確認した。ピペッター／希釈器のタレットを、試
料シリンジに関しては10％（10μ）、試薬シリンジに
関しては50％（0.5ml）に設定した。
3.少なくとも50μの試料をOPTIMATE試料カップ中にピ
ペットで加えた。
4.ピペッター／希釈器に吸着ラテックス溶液を充填し
た。
5.Eppendorf Repeaterピペット（容量1.25mlのチップ、
１に設定）を用いて、凝集剤溶液25μをOPTIMATE反応
カップ中に手動で分配した。プランクカップNo.60及び
比濁反応が起こっていない全ての他のカップを取り除い
た。これらのカップ中に25μのバッファー（20mM−リ
ン酸塩、pH6、0.1％BSA−pf、0.1％ナトリウムアジド）
をピペットで加えた。
6.記載されている全ての指示にしたがってChemistry N
o.25−USER CHEMISTRY No.25を開始した。次に、OPTIMA
TEによって、試料及び吸着ラテックスを反応カップ中に
自動的にピペット滴下し分配し、20分後の吸光度を読取
った。
凝集剤を自動的に加える終点試験 1.OPTIMATEに、1.0mlシリンジを有するGilford Automat
ic Dispenserを装着した。接続ケーブルを、OPTIMATEの
後部のJ4ポートに接続した。この外部分配器は以下の手
順によって用いることができる。
（ａ）Utility15、セキュリティーコード980456を入力
した。
（ｂ）Utility50、チェック＝０、オプション20を入力
した。
この分配器のタレットを50％（0.5ml）に設定した。
2.Chemistry37−Program New Testを用いて、以下の試
験パラメーターをUSER CHEMISTRY No.24のようにプログ
ラムした。
単位：無し 試験の種類：終点試験 小数位:2 分配法:A及びＢ 塔からの分配B:有 分配Ａから分配Ｂまでの時間:5秒 遅延時間A:1200秒 平衡時間:6秒 読取り時間:5秒 キュベット温度:25℃ 標準濃度：無し ファクター:1000 低I/A（Abs）:2.000 高I/A（Abs）:2.000 低標準：無し 高標準：無し 吸光フィルター:540nm 移動温度：室温 試料容量:10μ 試薬容量:0.1ml 3.試験を開始する前に、ピペッター／希釈器に、100μ
試料シリンジ及び250μシリンジが装着されている
ことを確認した。ピペッター／希釈器のタレットを、試
料シリンジに関しては10％（10μ）、試薬シリンジに
関しては10％（25μ）に設定した。また、イムノアッ
セイプローブがピペッター／希釈器上で用いられている
ことを確認した。
4.少なくとも50μの試料をOPTIMATE試料カップ中にピ
ペットで加えた。
5.ピペッター／希釈器に凝集剤溶液を充填した。
6.外部分配器に吸着ラテックス溶液を充填した。
7.記載されている全ての指示にしたがって、Chemistry
No.24−USER CHEMISTRY No.24を開始した。次に、OPTIM
ATEによって、試料及び凝集剤を反応カップ中に自動的
にピペット滴下を分配し、その５秒後に吸着ラテックス
を加えた。20分後に反応の吸光度を読取った。
速度試験 1.OPTIMATEに、1.0mlシリンジを有するGilford Automat
ic Dispenserを装置した。接続ケーブルをOPTIMATEの後
部のJ4ポートに接続した。この外部分配器は以下の手順
によって用いることができる。
（ａ）Utility15、セキュリティーコード980456を入力
した。
（ｂ）Utility50、チェック＝０、オプション20を入力
した。分配器のタレットを50％（0.5ml）に設定した。
2.Chemistry37−Program New Testを用いて、以下の試
験パラメーターをUSER CHEMISTRY No.23のようにプログ
ラムした。
単位：無し 試験の種類：動的酵素試験 小数位:2 分配法:A及びＢ 塔からの分配B:有 分配Ａから分配Ｂまでの時間:5秒 遅延時間:20秒 平衡時間:5秒 読取り時間:30秒 キュベット温度:30℃ 標準濃度：無し ファクター:1000 低I/A（Abs）:2.000 高I/A（Abs）:2.000 吸光フィルター:540nm 移動温度:30℃ 試料容量:10μ 試薬容量:0.1ml 3.試験を開始する前に、ピペッター／希釈器に、100μ
試料シリンジ及び250μ試薬シリンジが装着されて
いることを確認した。ピペッター／希釈器のタレット
を、試料シリンジに関しては10％（10μ）、試薬シリ
ンジに関しては10％（25μ）に設定した。また、イム
ノアッセイプローブがピペッター／希釈器上で用いられ
ていることを確認した。
4.少なくとも50μの試料を、OPTIMATE試料カップ中に
ピペットで加えた。
5.ピペッター／希釈器に凝集剤溶液を充填した。
6.外部分配器に吸着ラテックス溶液を充填した。
7.記載されている全ての指示にしたがって、Chemistry
No.23−USER CHEMISTRY No.23を開始した。次に、OPTIM
ATEによって、試料及び凝集剤を反応カップ中に自動的
にピペット滴加し分配し、その５秒後に吸着ラテックス
を加えた。この反応の吸光度を14秒間後に読取った。吸
光度の読取りを全部で30秒間行なった。OPTIMATEによっ
て、採取されたデータ及び１分あたりの吸光度の変化の
見地から得られるデータから線状回帰線が測定された。
ヘモグロビン測定 全ての血液試料に関して、試料中のHbA1c（％）を算
出するために、試料中のヘモグロビン濃度を測定しなけ
ればならない。HbA1cの測定に用いられるのと同様の変
性試料を、以下のプロトコルを用いたヘモグロビン測定
に用いた。
1.Chemistry No.37−Program New testを用いて、以下
の試験パラメータをUSER CHEMISTRY No.26のようにプロ
グラムした。
単位：無し 試験の種類：終点試験 小数位:2 分配法:A 遅延時間A:300秒 平衡時間:6秒 読取り時間:5秒 キュベット温度:25℃ 標準濃度：無し ファクター:1000 低I/A（Abs）:2.000 高I/A（Abs）:2.000 高標準値：無し 低標準値：無し 吸光フィルター:540nm 移動温度：室温 試料容量:70μ 試薬容量:0.5ml 2.試験を開始する前に、ピペッター／希釈器に、100μ
試料シリンジ及び1.0μ試薬シリンジが装着されて
いることを確認した。ピペッター／希釈器のタレット
を、試料シリンジに関しては70％（70μ）、試薬シリ
ンジに関しては50％（0.5μ）に設定した。
3.少なくとも120μの試料をOPTIMATE試料カップ中に
ピペットで加えた。
4.ピペッター／希釈器に、0.05％のBSA−pf及び0.1％ナ
トリウムアジドを含有する200mMグリシン、pH9を充填し
た。
5.記載されている全ての指示にしたがって、Chemistry
No.26−USER CHEMISTRY No.26を開始した。次に、OPTIM
ATEによって、試料及びバッファーを反応カップ中に自
動的にピペット滴加し分配し、５分後に吸光度を読取っ
た。
計算 OPTIMATEによって得られた情報をHbA1c（％）の結果
に変換するために、多数の計算を行なわなければならな
い。
1.全ての試験実験に、ラテックスブランク反応（500μ
ラテックス＋35μバッファー）を含ませた。この反
応を吸光度を、他の全ての結果から減じなければならな
い。
2.全ての血液試料に関して、USER CHEMISTRY No.26から
採取された情報を用いて、反応に対するヘモグロビンの
吸光度の寄与を算出した。ここで得られた吸光度の結果
を７で割って、血液10μの吸光度を算出した。次に、
この値を、上記で得られた吸光度の結果から減じた。
3.標準曲線を算出するために、Immunoassay No.37−Pro
gram New Testを用いてダミーイムノアッセイをプログ
ラムした。以下のパラメータをUSER IMMUNOASSAY No.27
のようにプログラムした。
プロトコル:No.1 基準値:G1c−ペプチド標準試料に関して設定された基準
値を入力した（μＭ−HbA1c）。これは用いる吸着ラテ
ックスの量によるものである。他のパラメーターの値は
いずれも重要ではないが、基準値に保存するために入力
しなければならない。
4.Immunoassay No.33−イムノアッセイ計算式を用い
て、四つのパラメータ論理標準曲線を生成させた。
試験No.:No.27 計算式:1.4−パラメータ論理式 G1c−ペプチド標準試料に関する吸光度の結果（ラテ
ックスブランク値を減じたもの）を入力した。次に、OP
TIMATEによって、標準曲線を作成し、曲線と四つのパラ
メータとの標準偏差を算出した。完了したら、全ての試
料に関する吸光度（−ラテックスブランク−Hb分配）を
代入することによって未知試料のHbA1cを算出した。
5.USER CHEMISTRY No.26からの情報を用いて、各血液試
料中のヘモグロビン濃度を算出した。第１にヘモグロビ
ン濃度をg/dlの単位で算出し、次に、この値を用いて、
存在するヘモグロビンβ鎖の濃度（mM）を決定した。
βサブユニット（mM）中のヘモグロビンの濃度 6.ここで、HbA1c濃度及びヘモグロビン濃度（μＭ）
（どちらもβ−サブユニットに基くものである）が判明
し、HbA1c（％）を測定することが可能になる。
3.臨床的研究 他方の臨床実験室から臨床試料（７）を得、通常の
HbA1cアフィニティークロマトグラフィー法（Isolab,Ak
ron,OH,U.S.A.）によって試料を試験した。試料を、本
発明を用いて上記のように試験した。関係を図に示す。
4.変性速度に対する種々の酸化剤の効果 異なる酸化剤（変性剤混合物中における血清をベース
とした物質のヘム濃度の20モル過剰量）を、10mM−Tri
s、pH＝7.5バッファー中の3M−NH4SCNと混合した。この
混合物を用い、上記の試料調製法において記載されてい
る手順にしたがって血液試料を変性した。血液試料を加
えた後、異なる時間間隔をおいて、上記の方法において
記載されているHbA1c試験に関する濁度測定試験によっ
て、試料の免疫反応性を試験した。最大の（かつ定常状
態の）免疫反応性が得られるのに必要な最小時間を測定
した。結果を表１に示す。
上記に、本発明を特に記載し例示した。明らかに、本
発明の精神及び範囲から逸脱することなく、発明の多く
の他の変更及び修正を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
図は、臨床標本中のヘモグロビンA1cの測定における、
本発明の分析法と通常のアフィニティークロマトグラフ
ィー法との間の関係の研究の結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キン・ファイ・イップ アメリカ合衆国、インヂアナ 46514、 エルクハート、クリークヘイブン・ドラ イブ 51194 (56)参考文献 特開 昭60−263858（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−172064（ＪＰ，Ａ)

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】血液試料中の特定のヘモグロビン誘導体の
    相対量を測定するための分析方法であって、 （ａ）血液試料を、（ｉ）試料中において0.5〜6.0Mの
    濃度を与える量の、血液試料中に存在する実質的にすべ
    てのヘモグロビンを変性しうるチオシアネート塩と、
    （ii）血液試料中に存在する実質的にすべてのヘモグロ
    ビンをメトヘモグロビンの形態に転化させうる酸化剤と
    で処理して変性血液試料を得る工程、 （ｂ）変性血液試料中のメトヘモグロビンを定量する工
    程、 （ｃ）イムノアッセイによって、変性血液試料中の変性
    形態の特定のヘモグロビン誘導体を定量する工程、及び （ｄ）工程（ｂ）及び工程（ｃ）から得られる試験結果
    を関連させることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】特定のヘモグロビン誘導体がヘモグロビン
    A1cである、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】工程（ａ）が室温で行なわれ、チオシアネ
    ート塩の濃度が約3M以上である、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】血液試料中のヘモグロビンA1cの相対量を
    測定するための分析方法であって、 （ａ）血液試料を、試料中において0.5〜6.0Mの濃度を
    与える量のチオシアネート塩と、血液試料中に存在する
    実質的にすべての形態のヘモグロビンをそのメトヘモグ
    ロビンの形態に転化させうる酸化剤とを含む変性剤と混
    合して変性血液試料を得る工程、 （ｂ）約540nmにおける吸光度を測定することによっ
    て、変性血液試料中のメトヘモグロビンを定量する工
    程、 （ｃ）変性形態のヘモグロビンA1cに対するモノクロー
    ナル抗体試薬の特異親和力に基づくイムノアッセイによ
    って、変性血液試料中の変性ヘモグロビンA1cを定量す
    る工程、及び （ｄ）工程（ｂ）及び工程（ｃ）から得られる試験結果
    を関連させることを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】該酸化剤が、フェリシアニド、塩素酸塩及
    び亜硝酸塩からなる群より選択される、請求項１又は４
    記載の方法。
  6. 【請求項６】該酸化剤が、フェリシアニド塩である、請
    求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】工程（ａ）が室温で行なわれ、変性剤溶液
    中のチオシアネート塩の濃度が約3M以上である、請求項
    １又は４記載の方法。
  8. 【請求項８】該イムノアッセイが粒子凝集抑制に基づく
    ものであり、該モノクローナル抗体試薬が水懸濁性粒子
    に結合して試薬粒子を形成し、変性ヘモグロビンA1c
    が、試薬粒子に対して結合するための、該抗体試薬に関
    する多数のエピトープ様結合部位を有する凝集剤化合物
    と競合する、請求項４記載の方法。
  9. 【請求項９】工程（ｂ）を血液試料の第１の部分につい
    て行い、工程（ｃ）を血液試料の第２の部分について行
    う、請求項４記載の方法。
  10. 【請求項１０】工程（ｂ）及び工程（ｃ）を、変性血液
    試料の同一の部分について、又は変性血液試料部分のア
    リコートについて行なう、請求項４記載の方法。
  11. 【請求項１１】血液試料中の特定のヘモグロビン誘導体
    の相対量を測定するための試験薬であって、 （ｉ）試料中において0.5〜6.0Mの濃度を与える量の、
    試料中に存在すると通常考えられる実質的にすべてのヘ
    モグロビンを変性しうるチオシアネート塩、 （ii）血液試料中に存在すると通常考えられる実質的に
    すべての形態のヘモグロビンをそのメトヘモグロビンの
    形態に転化させうる酸化剤、及び、 （iii）血液試料と、チオシアネート塩及び酸化剤とを
    混合することによって得られる変性血液試料を、その中
    に存在する、変性形態の特定のヘモグロビン誘導体の量
    に関してイムノアッセイするための試薬を含む試験薬。
  12. 【請求項１２】特定のヘモグロビン誘導体がヘモグロビ
    ンA1cである、請求項11記載の試験薬。
  13. 【請求項１３】該酸化剤が、フェリシアニド、塩素酸塩
    及び亜硝酸塩からなる群より選択される、請求項11記載
    の試験薬。
  14. 【請求項１４】該酸化剤がフェリシアニド塩である、請
    求項11又は12項記載の試験薬。
  15. 【請求項１５】変性ヘモグロビンA1cを試験するための
    試薬が、変性ヘモグロビンA1cに特異なモノクローナル
    抗体試薬を含む、請求項12記載の試験薬。
  16. 【請求項１６】該イムノアッセイ試薬が、（ｉ）水懸濁
    性粒子に結合している該モノクローナル抗体又はそのフ
    ラグメント、及び、（ii）該抗体に関する多数のエピト
    ープ様結合部位を有する凝集試薬を含み、それにより、
    該イムノアッセイ試薬によって粒子凝集抑制により変性
    ヘモグロビンA1cを試験するための、請求項15記載の試
    験薬。
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5162237A (en) * 1988-04-11 1992-11-10 Miles Inc. Reaction cassette for preforming sequential analytical assays by noncentrifugal and noncapillary manipulations
IL94724A (en) * 1989-07-13 1994-02-27 Miles Inc Decomposition of red blood cells and denaturation of hemoglobin by the use of lithium salts
US5258311A (en) * 1989-07-13 1993-11-02 Miles Inc. Lithium salts as red blood cell lysing and hemoglobin denaturing reagents
US5151369A (en) * 1989-07-13 1992-09-29 Miles Inc. Lithium salts as red blood cell lysing and hemoglobin denaturing reagents
US5183739A (en) * 1990-02-27 1993-02-02 Exocell, Inc. Monoclonal antibodies specific for non-a1c glycated hemoglobin and immunoassay methods
DE4206932A1 (de) * 1992-03-05 1993-09-09 Boehringer Mannheim Gmbh Immunologische methode zur bestimmung eines haemoglobinderivates
WO1994000592A1 (en) * 1992-06-26 1994-01-06 Exocell, Inc. Monoclonal antibodies against glycated low density lipoprotein
US5372948A (en) * 1993-03-17 1994-12-13 Miles Inc. Assay and reaction vessel with a compartmentalized solubilization chamber
US6043043A (en) * 1993-04-02 2000-03-28 Bayer Corporation Method for the determination of hemoglobin adducts
US5874229A (en) * 1995-08-07 1999-02-23 Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. Method for avoiding influence of hemoglobin
JP3269765B2 (ja) 1995-12-14 2002-04-02 富士写真フイルム株式会社 ヘモグロビン誘導体の免疫学的測定方法及びその方法に用いる処理試薬
US5902731A (en) * 1998-09-28 1999-05-11 Lifescan, Inc. Diagnostics based on tetrazolium compounds
JPWO2002021142A1 (ja) * 2000-09-07 2004-01-15 和光純薬工業株式会社 総ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの測定方法
DE10054055A1 (de) * 2000-10-31 2002-05-23 Nmi Univ Tuebingen Verfahren zur Analyse von Proteinen
EP1414860B1 (en) * 2001-04-26 2009-12-30 Dako Denmark A/S Anti-glycated hemoglobin pan-specific monoclonal antibody
US6562581B2 (en) 2001-08-31 2003-05-13 Portascience Method for quantitative determination of glycated hemoglobin
US7459127B2 (en) 2002-02-26 2008-12-02 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Method and apparatus for precise transfer and manipulation of fluids by centrifugal and/or capillary forces
US7460960B2 (en) * 2002-05-10 2008-12-02 Epitome Biosystems, Inc. Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis
US7618788B2 (en) * 2002-05-10 2009-11-17 Millipore Corporation Proteome epitope tags and methods of use thereof in protein modification analysis
US7125711B2 (en) 2002-12-19 2006-10-24 Bayer Healthcare Llc Method and apparatus for splitting of specimens into multiple channels of a microfluidic device
US7094354B2 (en) 2002-12-19 2006-08-22 Bayer Healthcare Llc Method and apparatus for separation of particles in a microfluidic device
DE10305050A1 (de) * 2003-02-07 2004-08-19 Roche Diagnostics Gmbh Analytisches Testelement und Verfahren für Blutuntersuchungen
US7347617B2 (en) 2003-08-19 2008-03-25 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Mixing in microfluidic devices
US20050227370A1 (en) * 2004-03-08 2005-10-13 Ramel Urs A Body fluid analyte meter & cartridge system for performing combined general chemical and specific binding assays
WO2006112339A1 (ja) 2005-04-14 2006-10-26 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. ヘモグロビン誘導体の測定方法、それに用いる試薬組成物、測定キット、分析デバイス、及び分析システム
MY158000A (en) * 2006-01-04 2016-08-30 Jawaharlal Nehru University A novel process for detecting human haemoglobin variants
US7855057B2 (en) * 2006-03-23 2010-12-21 Millipore Corporation Protein splice variant/isoform discrimination and quantitative measurements thereof
CN101595386B (zh) * 2007-01-30 2012-05-09 爱科来株式会社 吩噻嗪衍生物色素的检测方法及用于该方法的显色剂试剂
JP5563470B2 (ja) * 2007-11-20 2014-07-30 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド 糖化ヘモグロビン検出法
EP2360471B1 (en) 2008-12-11 2017-02-15 Sekisui Medical Co., Ltd. Method for pre-treating sample containing glycated hemoglobin
EP2562539B1 (en) * 2010-03-31 2023-09-27 Sekisui Medical Co., Ltd. Method of analyzing hemoglobins
WO2016054033A1 (en) * 2014-09-30 2016-04-07 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Processes, systems, and devices for hemolysis detection via measurement of methemoglobin
CN110072989A (zh) 2016-10-24 2019-07-30 生物马特里卡公司 核酸在纸上的稳定化
EP3783359B1 (en) * 2018-04-18 2024-03-27 Sekisui Medical Co., Ltd. Haemoglobin analysis method
CN112113955B (zh) * 2020-09-15 2022-03-18 四川行之智汇知识产权运营有限公司 血红蛋白检测卡
CN113866406B (zh) * 2021-10-18 2022-09-27 深圳上泰生物工程有限公司 一种特异性检测糖缺失性转铁蛋白的试剂盒

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4247533A (en) * 1978-05-01 1981-01-27 The Rockefeller University Hemoglobin A1c radioimmunoassay
US4255385A (en) * 1979-10-23 1981-03-10 Abbott Laboratories Reagent and test kit for determining glycosylated hemoglobin
US4260516A (en) * 1979-12-07 1981-04-07 Abbott Laboratories Glycosylated hemoglobin standards
US4649122A (en) * 1980-09-02 1987-03-10 Leeco Diagnostics, Inc. Means for determining percentage of glycohemoglobin in whole blood
US4407961A (en) * 1981-03-16 1983-10-04 Sanders James L Ion-exchange system and method for isolation and determination of glycosylated hemoglobin in human blood
DE3141146A1 (de) * 1981-10-16 1983-04-28 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagens zur bestimmung von glykosiliertem haemoglobin
US4880749A (en) * 1984-06-05 1989-11-14 Eastman Kodak Company Analytical element and its use in a whole blood hemoglobin assay
US4647654A (en) * 1984-10-29 1987-03-03 Molecular Diagnostics, Inc. Peptides useful in preparing hemoglobin A1c immunogens
US4658022A (en) * 1985-08-08 1987-04-14 Molecular Diagnostics, Inc. Binding of antibody reagents to denatured protein analytes
CA1339952C (en) * 1984-10-29 1998-07-14 William J. Knowles Immunoassays for denatured protein analytes, particularly hb alc, and monoclonal antibodies thereto
DK145385D0 (da) * 1985-03-29 1985-04-01 Novo Industri As Monoklonalt antistof til immunkemisk analyse
US4800167A (en) * 1987-04-10 1989-01-24 Abbott Laboratories Reagent and process for the determination of hemoglobin in blood

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