JPH11237382A - 競合的アポペルオキシダーゼ検定法 - Google Patents
競合的アポペルオキシダーゼ検定法Info
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- JPH11237382A JPH11237382A JP10354203A JP35420398A JPH11237382A JP H11237382 A JPH11237382 A JP H11237382A JP 10354203 A JP10354203 A JP 10354203A JP 35420398 A JP35420398 A JP 35420398A JP H11237382 A JPH11237382 A JP H11237382A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 分析対象物を定性的又は半定量的に測定する
こと。 【解決手段】 金属ポルフィリンが結合した分析対象物
／分析対象物特異的結合パートナ（この合計分子量は、
アポペルオキシダーゼと金属ポルフィリンとの結合を防
げる程度に大きい）を用い、試料中の分析対象物の存在
により、金属ポルフィリン部分が遊離した結果（この分
子量は、アポペルオキシダーゼと金属ポルフィリンとの
結合を防げない程度に小さい）、アポペルオキシダーゼ
と金属ポルフィリンが結合してペルオキシダーゼを形成
させる。
こと。 【解決手段】 金属ポルフィリンが結合した分析対象物
／分析対象物特異的結合パートナ（この合計分子量は、
アポペルオキシダーゼと金属ポルフィリンとの結合を防
げる程度に大きい）を用い、試料中の分析対象物の存在
により、金属ポルフィリン部分が遊離した結果（この分
子量は、アポペルオキシダーゼと金属ポルフィリンとの
結合を防げない程度に小さい）、アポペルオキシダーゼ
と金属ポルフィリンが結合してペルオキシダーゼを形成
させる。
Description
【０００１】
【従来の技術】ペルオキシダーゼは、フェノール類及び
アミン類のような種々の化合物の、過酸化物による酸化
を触媒する酵素である。種々の化合物が、ヒドロペルオ
キシドから電子を解放して、供与種から電子を受容する
ことができる酸化体を生成することによってペルオキシ
ダーゼ酵素に似た挙動を示すため、「擬似ペルオキシダ
ーゼ」と呼ばれる。したがって、擬似ペルオキシダーゼ
は、過酸化物又はそうでないとしても被酸化性の化合物
の間の反応を触媒する、又はその反応に関与するという
点で、酵素様である。ヘモグロビン及びその誘導体を含
む擬似ペルオキシダーゼはまとめて「過酸化活性物質」
と呼ばれる。たとえば、過酸化活性物質、たとえばヘモ
グロビン及びその誘導体は、ヒドロペルオキシドと被酸
化性染料との相互作用を触媒する。このような相互作用
では、過酸化活性物質は、ペルオキシダーゼ酵素を模倣
し、被酸化性染料と過酸化物との相互作用を触媒する、
又はそれに関与する。過酸化物から過酸化活性物質に移
される酸素が、被酸化性染料から電子を受容することが
できる酸化体を生成する。得られる相互作用が、応答の
強さが過酸化活性物質の存在又は濃度を示す検出可能な
応答、たとえば色の推移を提供する。そのような検定に
使用するのに適した被酸化性染料は、ベンジジン、ｏ−
トリジン、アルキル基が炭素原子１〜６個を含む３，
３′，５，５′−テトラアルキルベンジジン、９−ジア
ニシジン、２，７−ジアミノフルオレン、ビス−（Ｎ−
エチル−キノル−２−オン）−アジン、（Ｎ−メチルベ
ンズチアゾール−２−オン）−（１−エチル−３−フェ
ニル−５−メチルトリアゾール−２−オン）−アジン又
はそれらの組み合わせを含む。有用なヒドロペルオキシ
ドは、クメンヒドロペルオキシド、５−ブチルヒドロペ
ルオキシド、ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオキシ
ド、１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒドロペルオ
キシド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒドロ
ペルオキシド、パラメンタンヒドロペルオキシド、１，
４−ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、ｐ−
５−ブチルイソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、
２−（α−ヒドロペルオキシイソプロピル）−６−イソ
プロピルナフタレン、テトラリンヒドロペルオキシド又
はそれらの組み合わせを含む。
アミン類のような種々の化合物の、過酸化物による酸化
を触媒する酵素である。種々の化合物が、ヒドロペルオ
キシドから電子を解放して、供与種から電子を受容する
ことができる酸化体を生成することによってペルオキシ
ダーゼ酵素に似た挙動を示すため、「擬似ペルオキシダ
ーゼ」と呼ばれる。したがって、擬似ペルオキシダーゼ
は、過酸化物又はそうでないとしても被酸化性の化合物
の間の反応を触媒する、又はその反応に関与するという
点で、酵素様である。ヘモグロビン及びその誘導体を含
む擬似ペルオキシダーゼはまとめて「過酸化活性物質」
と呼ばれる。たとえば、過酸化活性物質、たとえばヘモ
グロビン及びその誘導体は、ヒドロペルオキシドと被酸
化性染料との相互作用を触媒する。このような相互作用
では、過酸化活性物質は、ペルオキシダーゼ酵素を模倣
し、被酸化性染料と過酸化物との相互作用を触媒する、
又はそれに関与する。過酸化物から過酸化活性物質に移
される酸素が、被酸化性染料から電子を受容することが
できる酸化体を生成する。得られる相互作用が、応答の
強さが過酸化活性物質の存在又は濃度を示す検出可能な
応答、たとえば色の推移を提供する。そのような検定に
使用するのに適した被酸化性染料は、ベンジジン、ｏ−
トリジン、アルキル基が炭素原子１〜６個を含む３，
３′，５，５′−テトラアルキルベンジジン、９−ジア
ニシジン、２，７−ジアミノフルオレン、ビス−（Ｎ−
エチル−キノル−２−オン）−アジン、（Ｎ−メチルベ
ンズチアゾール−２−オン）−（１−エチル−３−フェ
ニル−５−メチルトリアゾール−２−オン）−アジン又
はそれらの組み合わせを含む。有用なヒドロペルオキシ
ドは、クメンヒドロペルオキシド、５−ブチルヒドロペ
ルオキシド、ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオキシ
ド、１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒドロペルオ
キシド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒドロ
ペルオキシド、パラメンタンヒドロペルオキシド、１，
４−ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、ｐ−
５−ブチルイソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、
２−（α−ヒドロペルオキシイソプロピル）−６−イソ
プロピルナフタレン、テトラリンヒドロペルオキシド又
はそれらの組み合わせを含む。
【０００２】米国特許第４，４９３，８９０号明細書に
は、グルコースオキシダーゼが、酵素的に不活性の高分
子量タンパク質成分（アポ酵素）及びＦＡＤ（低分子量
非タンパク質系補欠分子族）からなる複合酵素であるこ
とが開示されている。遷移金属ポルフィリンとは違っ
て、グルコースオキシダーゼのフラビンアデニンジヌク
レオチド（ＦＡＤ）部分は遷移金属を含まない。ＦＡＤ
部分は、この酵素のタンパク質部分が高親和力結合を介
してこの小さな配位子とで複合体を形成するため、「補
欠分子族」と呼ばれることもある。その結果、補欠分子
族は、酵素が機能するために必要であるタンパク質の必
須部分になる。アポグルコースオキシダーゼ及びＦＡＤ
は、高い結合親和力（結合定数は約１０1 0モル- 1）を有
するが、酸性化された硫酸アンモニウムを用いる処理で
効果的に分離することができる。米国特許第４，２３
８，５６５号明細書には、ＦＡＤを標識として用い、そ
れがアポグルコースオキシダーゼと結合して活性グルコ
ースオキシダーゼを形成する能力によってモニタする特
異的結合検定法が記載されている。液体媒体中の抗原を
測定するための均質系検定では、液体媒体の試料を、そ
の抗原に対する抗体と、ＦＡＤに結合した抗原（もしく
はその類似物）を含む標識された複合体とに合わせて、
試料に含まれる抗原を、抗体との結合を求めて抗原−Ｆ
ＡＤとで競合させる。また、アポグルコースオキシダー
ゼが存在し、抗体とで会合しない抗原−ＦＡＤと結合し
て、活性グルコースオキシダーゼを生成することができ
る。しかし、抗体と結合した抗原−ＦＡＤは、アポグル
コースオキシダーゼとでそのように結合することはでき
ないため、試料中の抗原の濃度が、公知の方法、たとえ
ば比色検定法による再結合から生じる測定可能なグルコ
ースオキシダーゼの量を決定する。「アポ酵素再活性化
免疫検定系（ＡＲＩＳ）」とも呼ばれるこの種の検定法
は、グルコースオキシダーゼのＦＡＤ補欠分子族へのハ
プテンの付着を含み、それがさらに、ハプテンと補欠分
子族との相互作用によってアポグルコースオキシダーゼ
の再活性化を可能にする。しかし、抗ハプテン抗体のハ
プテン−ＦＡＤ複合体への結合は、アポグルコースオキ
シダーゼとのその会合を妨げて、グルコースオキシダー
ゼ活性が観察されないようにするおそれがある。ｉ）Ｆ
ＡＤを無傷の酵素から解離させて安定なアポグルコース
オキシダーゼを得ることができ、ii）アポグルコースオ
キシダーゼは酵素活性を発現することができないが、Ｆ
ＡＤとでホロ酵素に再構成することが容易であり、ii
i）親ホロ酵素が高い代謝回転率を有し、Ｈ2Ｏ2反応生
成物を多様な方法によって高感度で測定することができ
るため、グルコースオキシダーゼがこの系にとって優れ
た酵素であることがみいだされた。しかし、アポグルコ
ースオキシダーゼＡＲＩＳ法は、尿中にＦＡＤ誘導体が
存在し、それがアポグルコースオキシダーゼとで再構成
して、擬陽性の検定結果を出すおそれのある活性酵素を
形成するため、尿分析に応用されても成功しなかった。
ＡＲＩＳ系は、補欠分子族複合体：結合パートナの分子
量によって限定されない。すなわち、再構成は、結合系
の分子量にかかわらず生じる。このタイプの検定法は、
補欠分子族複合体と結合パートナとの相互作用が、再構
成に対して立体障害を生じさせるような向きで生じるこ
とに基づく。この立体障害が、再構成の速度を補欠分子
族複合体と補欠分子族複合体結合パートナとで異ならせ
る阻害につながる。この２種の再構成速度における違い
を利用して、分析対象物を測定する。ペルオキシダーゼ
はまた、補欠分子族を、タンパク質から分離させてアポ
ペルオキシダーゼを形成することができる遷移金属ポル
フィリンの形態で含有する。本発明のアポペルオキシダ
ーゼ系は、金属ポルフィリンに付着した分析対象物／分
析対象物特異的結合パートナ複合体の分子量によって制
限される。理由は、この部分が、アポペルオキシダーゼ
と金属ポルフィリンとを再結合させることができる分子
量を超える合計分子量を有するとき、ペルオキシダーゼ
との再構成が阻止されるということがみいだされたから
である。約１８０キロダルトンを超える合計分子量を有
する複合体が、再構成を阻止するのに適していることが
みいだされた。本検定法は、結合パートナ：補欠分子族
複合体が、再構成を阻止できるほど大きなものであるこ
とに基づく。結合パートナは通常、高い分子量を有する
ため（抗体は普通、１６５キロダルトンの範囲であ
る）、ペルオキシダーゼ活性の存在は、一つの種、すな
わち、結合していない補欠分子族複合体からのみ生じる
ことができ、この唯一の種の活性を使用して分析対象物
を測定する。
は、グルコースオキシダーゼが、酵素的に不活性の高分
子量タンパク質成分（アポ酵素）及びＦＡＤ（低分子量
非タンパク質系補欠分子族）からなる複合酵素であるこ
とが開示されている。遷移金属ポルフィリンとは違っ
て、グルコースオキシダーゼのフラビンアデニンジヌク
レオチド（ＦＡＤ）部分は遷移金属を含まない。ＦＡＤ
部分は、この酵素のタンパク質部分が高親和力結合を介
してこの小さな配位子とで複合体を形成するため、「補
欠分子族」と呼ばれることもある。その結果、補欠分子
族は、酵素が機能するために必要であるタンパク質の必
須部分になる。アポグルコースオキシダーゼ及びＦＡＤ
は、高い結合親和力（結合定数は約１０1 0モル- 1）を有
するが、酸性化された硫酸アンモニウムを用いる処理で
効果的に分離することができる。米国特許第４，２３
８，５６５号明細書には、ＦＡＤを標識として用い、そ
れがアポグルコースオキシダーゼと結合して活性グルコ
ースオキシダーゼを形成する能力によってモニタする特
異的結合検定法が記載されている。液体媒体中の抗原を
測定するための均質系検定では、液体媒体の試料を、そ
の抗原に対する抗体と、ＦＡＤに結合した抗原（もしく
はその類似物）を含む標識された複合体とに合わせて、
試料に含まれる抗原を、抗体との結合を求めて抗原−Ｆ
ＡＤとで競合させる。また、アポグルコースオキシダー
ゼが存在し、抗体とで会合しない抗原−ＦＡＤと結合し
て、活性グルコースオキシダーゼを生成することができ
る。しかし、抗体と結合した抗原−ＦＡＤは、アポグル
コースオキシダーゼとでそのように結合することはでき
ないため、試料中の抗原の濃度が、公知の方法、たとえ
ば比色検定法による再結合から生じる測定可能なグルコ
ースオキシダーゼの量を決定する。「アポ酵素再活性化
免疫検定系（ＡＲＩＳ）」とも呼ばれるこの種の検定法
は、グルコースオキシダーゼのＦＡＤ補欠分子族へのハ
プテンの付着を含み、それがさらに、ハプテンと補欠分
子族との相互作用によってアポグルコースオキシダーゼ
の再活性化を可能にする。しかし、抗ハプテン抗体のハ
プテン−ＦＡＤ複合体への結合は、アポグルコースオキ
シダーゼとのその会合を妨げて、グルコースオキシダー
ゼ活性が観察されないようにするおそれがある。ｉ）Ｆ
ＡＤを無傷の酵素から解離させて安定なアポグルコース
オキシダーゼを得ることができ、ii）アポグルコースオ
キシダーゼは酵素活性を発現することができないが、Ｆ
ＡＤとでホロ酵素に再構成することが容易であり、ii
i）親ホロ酵素が高い代謝回転率を有し、Ｈ2Ｏ2反応生
成物を多様な方法によって高感度で測定することができ
るため、グルコースオキシダーゼがこの系にとって優れ
た酵素であることがみいだされた。しかし、アポグルコ
ースオキシダーゼＡＲＩＳ法は、尿中にＦＡＤ誘導体が
存在し、それがアポグルコースオキシダーゼとで再構成
して、擬陽性の検定結果を出すおそれのある活性酵素を
形成するため、尿分析に応用されても成功しなかった。
ＡＲＩＳ系は、補欠分子族複合体：結合パートナの分子
量によって限定されない。すなわち、再構成は、結合系
の分子量にかかわらず生じる。このタイプの検定法は、
補欠分子族複合体と結合パートナとの相互作用が、再構
成に対して立体障害を生じさせるような向きで生じるこ
とに基づく。この立体障害が、再構成の速度を補欠分子
族複合体と補欠分子族複合体結合パートナとで異ならせ
る阻害につながる。この２種の再構成速度における違い
を利用して、分析対象物を測定する。ペルオキシダーゼ
はまた、補欠分子族を、タンパク質から分離させてアポ
ペルオキシダーゼを形成することができる遷移金属ポル
フィリンの形態で含有する。本発明のアポペルオキシダ
ーゼ系は、金属ポルフィリンに付着した分析対象物／分
析対象物特異的結合パートナ複合体の分子量によって制
限される。理由は、この部分が、アポペルオキシダーゼ
と金属ポルフィリンとを再結合させることができる分子
量を超える合計分子量を有するとき、ペルオキシダーゼ
との再構成が阻止されるということがみいだされたから
である。約１８０キロダルトンを超える合計分子量を有
する複合体が、再構成を阻止するのに適していることが
みいだされた。本検定法は、結合パートナ：補欠分子族
複合体が、再構成を阻止できるほど大きなものであるこ
とに基づく。結合パートナは通常、高い分子量を有する
ため（抗体は普通、１６５キロダルトンの範囲であ
る）、ペルオキシダーゼ活性の存在は、一つの種、すな
わち、結合していない補欠分子族複合体からのみ生じる
ことができ、この唯一の種の活性を使用して分析対象物
を測定する。
【０００３】再構成に対する立体障害は、抗体：抗原結
合の特定の配向を要する。この配向は、小さな抗原の場
合には容易に展開されるが、大きな抗原の場合にはそう
はいかない。したがって、ＡＲＩＳ法は通常、１００〜
１，０００g/molの小さな分子量の抗原に限定される。
本方法は、立体障害に頼らず、補欠分子族複合体：結合
パートナの分子量に頼る。この技術は、検定がいかなる
サイズの分析対象物をも検出することができ、特定の結
合配向を有する抗体を調製する必要性を除くという利点
をもたらす。さらには、サイズ効果を利用してアポペル
オキシダーゼ系を提供することができるという発見に基
づく本発明は、速度を測定することなしに使用すること
ができる。尿試験片は通常、視覚的に読み取られ、視覚
的読み取りは速度測定に容易には適用できないため、本
発明は、試験片を使用する尿分析に特に有利である。
合の特定の配向を要する。この配向は、小さな抗原の場
合には容易に展開されるが、大きな抗原の場合にはそう
はいかない。したがって、ＡＲＩＳ法は通常、１００〜
１，０００g/molの小さな分子量の抗原に限定される。
本方法は、立体障害に頼らず、補欠分子族複合体：結合
パートナの分子量に頼る。この技術は、検定がいかなる
サイズの分析対象物をも検出することができ、特定の結
合配向を有する抗体を調製する必要性を除くという利点
をもたらす。さらには、サイズ効果を利用してアポペル
オキシダーゼ系を提供することができるという発見に基
づく本発明は、速度を測定することなしに使用すること
ができる。尿試験片は通常、視覚的に読み取られ、視覚
的読み取りは速度測定に容易には適用できないため、本
発明は、試験片を使用する尿分析に特に有利である。
【０００４】擬似ペルオキシダーゼはまた、除去される
と、擬似ペルオキシダーゼの、ペルオキシダーゼ活性を
欠く不活性アポ形態を生じさせる補欠分子族を有する。
たとえば、ヘモグロビンを低いpHに付して鉄ヘマチンを
解離させたのち、ろ過を実施して、ヘマチンとアポヘモ
グロビンとを分離させるなどによってヘモグロビンから
鉄ヘマチンを分離させると、不活性形態のヘモグロビン
が得られ、アポヘモグロビンと鉄ヘマチンとの再構成を
促進することにより、これを再活性化することができ
る。金属ポルフィリンの一部を構成する遷移金属は、考
慮されるタイプの試薬の中の結合価の混合物を有する。
と、擬似ペルオキシダーゼの、ペルオキシダーゼ活性を
欠く不活性アポ形態を生じさせる補欠分子族を有する。
たとえば、ヘモグロビンを低いpHに付して鉄ヘマチンを
解離させたのち、ろ過を実施して、ヘマチンとアポヘモ
グロビンとを分離させるなどによってヘモグロビンから
鉄ヘマチンを分離させると、不活性形態のヘモグロビン
が得られ、アポヘモグロビンと鉄ヘマチンとの再構成を
促進することにより、これを再活性化することができ
る。金属ポルフィリンの一部を構成する遷移金属は、考
慮されるタイプの試薬の中の結合価の混合物を有する。
【０００５】Abstracts of Histochemical Society（19
79）の３９項、７１７ページには、抗体とで複合する
と、アポペルオキシダーゼとの再構成を阻止される免疫
複合体、たとえばヘム標識抗原の存在又は非存在下で、
活性基とのアポ酵素の再構成の程度を利用する免疫検定
法が論じられている。
79）の３９項、７１７ページには、抗体とで複合する
と、アポペルオキシダーゼとの再構成を阻止される免疫
複合体、たとえばヘム標識抗原の存在又は非存在下で、
活性基とのアポ酵素の再構成の程度を利用する免疫検定
法が論じられている。
【０００６】特開平８−２２４０９５号公報は、Ｄ−ガ
ラクトース及びＯ2の存在下でＣｕ+ +をアポガラクトー
スオキシダーゼに付加してＨ2Ｏ2を生成し、これをペル
オキシダーゼの存在下で酸化縮合剤と反応させて、試験
される流体試料中の銅濃度を比色測定するキノイド染料
を生成する、Ｃｕ+ +の検定系を開示している。
ラクトース及びＯ2の存在下でＣｕ+ +をアポガラクトー
スオキシダーゼに付加してＨ2Ｏ2を生成し、これをペル
オキシダーゼの存在下で酸化縮合剤と反応させて、試験
される流体試料中の銅濃度を比色測定するキノイド染料
を生成する、Ｃｕ+ +の検定系を開示している。
【０００７】アポペルオキシダーゼの標識としてのヘム
部分の使用は、コロラド大学のP. K. Nakaneinにより、
抗原がその対応する抗体と結合しているとき、複合ヘマ
チン−抗原は容易にはアポペルオキシダーゼの中に挿入
されないことを提したAbstracts of Histochemical Soc
iety, 39（1979）で理論化されたが、この原理を用いる
流体試料中の分析対象物の検定法は実践に移されたこと
は一度もない。
部分の使用は、コロラド大学のP. K. Nakaneinにより、
抗原がその対応する抗体と結合しているとき、複合ヘマ
チン−抗原は容易にはアポペルオキシダーゼの中に挿入
されないことを提したAbstracts of Histochemical Soc
iety, 39（1979）で理論化されたが、この原理を用いる
流体試料中の分析対象物の検定法は実践に移されたこと
は一度もない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、流体試料中
の分析対象物の検定法において、流体試料を、ヒドロペ
ルオキシド、酸化還元染料、アポペルオキシダーゼ（も
しくはアポ擬似ペルオキシダーゼ）、及び、分析対象物
／分析対象物特異的結合パートナ複合体と結合したその
対応する金属ポルフィリンと合わせる工程を含み、前記
複合体が、そのポルフィリン成分がアポペルオキシダー
ゼと再結合することを阻止するのに十分に高い合計分子
量を有する検定法である。この形態では、アポペルオキ
シダーゼは、ヒドロペルオキシドと相互作用せず、酸化
還元染料中に有付きの応答を生じさせることはできな
い。しかし、分析対象物が存在する場合には、分析対象
物と、分析対象物特異的結合パートナとの間に、分析対
象物／分析対象物特異的結合パートナ複合体を分裂さ
せ、それにより、金属ポルフィリンに結合した部分の分
子量を、アポペルオキシダーゼとその補欠分子族との再
構成が阻止されるレベル未満に減らす相互作用が起こ
る。これは、アポペルオキシダーゼと金属ポルフィリン
とを再構成させて、ヒドロペルオキシド及び酸化還元染
料と相互作用して、強さが流体試料中の分析対象物の濃
度に正比例する色応答を提供することができる活性ペル
オキシダーゼを形成させる。
の分析対象物の検定法において、流体試料を、ヒドロペ
ルオキシド、酸化還元染料、アポペルオキシダーゼ（も
しくはアポ擬似ペルオキシダーゼ）、及び、分析対象物
／分析対象物特異的結合パートナ複合体と結合したその
対応する金属ポルフィリンと合わせる工程を含み、前記
複合体が、そのポルフィリン成分がアポペルオキシダー
ゼと再結合することを阻止するのに十分に高い合計分子
量を有する検定法である。この形態では、アポペルオキ
シダーゼは、ヒドロペルオキシドと相互作用せず、酸化
還元染料中に有付きの応答を生じさせることはできな
い。しかし、分析対象物が存在する場合には、分析対象
物と、分析対象物特異的結合パートナとの間に、分析対
象物／分析対象物特異的結合パートナ複合体を分裂さ
せ、それにより、金属ポルフィリンに結合した部分の分
子量を、アポペルオキシダーゼとその補欠分子族との再
構成が阻止されるレベル未満に減らす相互作用が起こ
る。これは、アポペルオキシダーゼと金属ポルフィリン
とを再構成させて、ヒドロペルオキシド及び酸化還元染
料と相互作用して、強さが流体試料中の分析対象物の濃
度に正比例する色応答を提供することができる活性ペル
オキシダーゼを形成させる。
【０００９】本発明の検定法は、定性的に使用すること
もできるし、正確さ及び精度を得るための適当な較正、
比色染料及び計器を用いて半定量的に結果を得ることも
できる。
もできるし、正確さ及び精度を得るための適当な較正、
比色染料及び計器を用いて半定量的に結果を得ることも
できる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】金属ポルフィリンは、過
酸化活性タンパク質の活性中心であり、酸性化及び限外
ろ過もしくはクロマトグラフィーによる分離によるその
除去は、ペルオキシダーゼ活性を有しないが、金属ポル
フィリン又は抗原と複合した金属ポルフィリンと混合さ
れると、再活性化することができるアポペルオキシダー
ゼの形成をもたらす。しかし、これらの抗原／金属ポル
フィリン複合体に結合する抗体は、この組み合わせが分
子量で約１８０キロダルトンを超えると、アポペルオキ
シダーゼの活性化を阻止する。抗原／金属ポルフィリン
複合体の抗原に結合した抗体が付加されている、流体試
料中の遊離抗原（分析対象物）が、抗体結合を求めて競
合し、それにより、流体試料中に存在する分析対象物に
比例して抗原／金属ポルフィリン複合体を抗体から解放
する。約１８０キロダルトン未満の合計分子量を有する
抗原／金属ポルフィリン複合体の場合、抗体を含まない
遊離複合体が、アポペルオキシダーゼを活性形態に再活
性化する。再活性化されたペルオキシダーゼの活性は、
１〜１２、好ましくは６．５〜８．５のpHで、酸化還元
指示薬及びヒドロペルオキシドを使用して検出すること
ができる。本発明のこの実施態様では、 ｉ）酸化還元指示薬、過酸化物、及び使用される金属及
び酸化還元指示薬に依存してpHを１〜１２の最適値に維
持するための緩衝剤と、 ii）特異的結合パートナ（分析対象物又はその結合パー
トナ）／金属ポルフィリン複合体と、 iii）ヘム補欠分子族を欠く過酸化活性物質、すなわち
アポペルオキシダーゼと、 iv）複合体結合化合物と、を含む試験組成物が提供され
る。
酸化活性タンパク質の活性中心であり、酸性化及び限外
ろ過もしくはクロマトグラフィーによる分離によるその
除去は、ペルオキシダーゼ活性を有しないが、金属ポル
フィリン又は抗原と複合した金属ポルフィリンと混合さ
れると、再活性化することができるアポペルオキシダー
ゼの形成をもたらす。しかし、これらの抗原／金属ポル
フィリン複合体に結合する抗体は、この組み合わせが分
子量で約１８０キロダルトンを超えると、アポペルオキ
シダーゼの活性化を阻止する。抗原／金属ポルフィリン
複合体の抗原に結合した抗体が付加されている、流体試
料中の遊離抗原（分析対象物）が、抗体結合を求めて競
合し、それにより、流体試料中に存在する分析対象物に
比例して抗原／金属ポルフィリン複合体を抗体から解放
する。約１８０キロダルトン未満の合計分子量を有する
抗原／金属ポルフィリン複合体の場合、抗体を含まない
遊離複合体が、アポペルオキシダーゼを活性形態に再活
性化する。再活性化されたペルオキシダーゼの活性は、
１〜１２、好ましくは６．５〜８．５のpHで、酸化還元
指示薬及びヒドロペルオキシドを使用して検出すること
ができる。本発明のこの実施態様では、 ｉ）酸化還元指示薬、過酸化物、及び使用される金属及
び酸化還元指示薬に依存してpHを１〜１２の最適値に維
持するための緩衝剤と、 ii）特異的結合パートナ（分析対象物又はその結合パー
トナ）／金属ポルフィリン複合体と、 iii）ヘム補欠分子族を欠く過酸化活性物質、すなわち
アポペルオキシダーゼと、 iv）複合体結合化合物と、を含む試験組成物が提供され
る。
【００１１】複合結合剤は、二つの形態のいずれか一方
をとることができる。 ａ）抗体が金属ポルフィリンに結合しているならば、結
合剤は、抗原又はより大きな分子、たとえばタンパク質
に結合した抗原であり、又は ｂ）抗原が複合体に結合しているならば、結合剤は、抗
体又は、抗原に結合することができるより大きな分子も
しくは他の生分子に結合した抗体であることができる。
たとえば、ＬＰＳが抗原であるならば、ＬＰＳに結合す
る高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を使用することがで
きる。ＩｇＧが分析対象物である場合、結合パートナは
補体因子タンパク質であることができる。
をとることができる。 ａ）抗体が金属ポルフィリンに結合しているならば、結
合剤は、抗原又はより大きな分子、たとえばタンパク質
に結合した抗原であり、又は ｂ）抗原が複合体に結合しているならば、結合剤は、抗
体又は、抗原に結合することができるより大きな分子も
しくは他の生分子に結合した抗体であることができる。
たとえば、ＬＰＳが抗原であるならば、ＬＰＳに結合す
る高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を使用することがで
きる。ＩｇＧが分析対象物である場合、結合パートナは
補体因子タンパク質であることができる。
【００１２】抗原／金属ポルフィリン複合体の例は、金
属、たとえばＦｅ、Ｍｎ、Ｃｕ及びＣｏ、ポルフィリ
ン、たとえばヘマチン、ジューテロ（デテロ）ポルフィ
リン及びコプロポルフィリンならびに抗原、たとえばタ
ンパク質、低分子量有機質及び細胞壁成分である。本発
明に使用することができるアポペルオキシダーゼ及びア
ポ擬似ペルオキシダーゼの例は、アポペルオキシダー
ゼ、アポヘモグロビン、アポミオグロブリン、アポシト
クロムＣ、アポカタラーゼ及びアポラクトペルオキシダ
ーゼである。
属、たとえばＦｅ、Ｍｎ、Ｃｕ及びＣｏ、ポルフィリ
ン、たとえばヘマチン、ジューテロ（デテロ）ポルフィ
リン及びコプロポルフィリンならびに抗原、たとえばタ
ンパク質、低分子量有機質及び細胞壁成分である。本発
明に使用することができるアポペルオキシダーゼ及びア
ポ擬似ペルオキシダーゼの例は、アポペルオキシダー
ゼ、アポヘモグロビン、アポミオグロブリン、アポシト
クロムＣ、アポカタラーゼ及びアポラクトペルオキシダ
ーゼである。
【００１３】本発明は、生物学的流体、たとえば血液及
び尿の中の低分子量成分及び高分子量成分を測定するの
に有用である試料競合的アポペルオキシダーゼ化学に基
づく新規な比色技術を伴う乾燥試薬を含む。典型的な分
析対象物は、薬、タンパク質及び細胞、すなわちグラム
陽性及びグラム陰性の細菌細胞を含む。本発明は、金属
ポルフィリン複合体が、複合体結合剤と結合していると
き、その複合体：結合剤複合体が約１８０，０００g/mo
lを超える分子量を有する限り、アポペルオキシダーゼ
の中に挿入されないという発見に基づく。抗体の分子量
（１６０，０００g/mol）までの化合物の複合がアポペ
ルオキシダーゼ再活性化を妨げず、それにより、複合
体：結合剤複合体が、抗原がその存在又は濃度が求めら
れる分析対象物であり、抗体がその分析対象物に特異的
な結合パートナである抗原：抗体複合体になりうるとい
うことがわかった。抗体以外の特異的結合パートナは、
アビジン／ビオチン対を含む。金属ポルフィリン複合体
は、たとえば、複合体結合剤（リガンド）が、抗体によ
って認識される分析対象物又はその誘導体である抗原で
あり、分析対象物が、抗体によって認識される抗原であ
る、抗体及び金属ヘマチンからなることができる。抗体
抗原の組み合わせが約１８０キロダルトンを超える合計
分子量を有するとき、それは、アポペルオキシダーゼに
挿入されず、ペルオキシダーゼ触媒反応は生じない。し
かし、複合体、複合体結合剤、アポペルオキシダーゼ及
びヒドロペルオキシドが、分析対象物を含有する流体試
料と合わされると、試料中の分析対象物が、複合体上で
抗原に結合した抗体との結合を求めて競合する競合反応
が、抗体を複合体から引き離す程度に起こり、それによ
り、その分子量を約１８０キロダルトン未満に減少させ
る。複合体はアポペルオキシダーゼと結合して、検出可
能な応答を提供するのに必要な反応を触媒する活性酵素
を提供することができる。この応答の大きさは、既知の
濃度の分析対象物を使用して作成した較正チャートとの
比較によって測定することができる試験流体中の分析対
象物の濃度に比例する。金属ポルフィリンが、抗原（分
析対象物）に特異的な抗体と複合し、結合剤が分析対象
物もしくは分析対象物誘導体であるとき、同様な応答が
観察される。
び尿の中の低分子量成分及び高分子量成分を測定するの
に有用である試料競合的アポペルオキシダーゼ化学に基
づく新規な比色技術を伴う乾燥試薬を含む。典型的な分
析対象物は、薬、タンパク質及び細胞、すなわちグラム
陽性及びグラム陰性の細菌細胞を含む。本発明は、金属
ポルフィリン複合体が、複合体結合剤と結合していると
き、その複合体：結合剤複合体が約１８０，０００g/mo
lを超える分子量を有する限り、アポペルオキシダーゼ
の中に挿入されないという発見に基づく。抗体の分子量
（１６０，０００g/mol）までの化合物の複合がアポペ
ルオキシダーゼ再活性化を妨げず、それにより、複合
体：結合剤複合体が、抗原がその存在又は濃度が求めら
れる分析対象物であり、抗体がその分析対象物に特異的
な結合パートナである抗原：抗体複合体になりうるとい
うことがわかった。抗体以外の特異的結合パートナは、
アビジン／ビオチン対を含む。金属ポルフィリン複合体
は、たとえば、複合体結合剤（リガンド）が、抗体によ
って認識される分析対象物又はその誘導体である抗原で
あり、分析対象物が、抗体によって認識される抗原であ
る、抗体及び金属ヘマチンからなることができる。抗体
抗原の組み合わせが約１８０キロダルトンを超える合計
分子量を有するとき、それは、アポペルオキシダーゼに
挿入されず、ペルオキシダーゼ触媒反応は生じない。し
かし、複合体、複合体結合剤、アポペルオキシダーゼ及
びヒドロペルオキシドが、分析対象物を含有する流体試
料と合わされると、試料中の分析対象物が、複合体上で
抗原に結合した抗体との結合を求めて競合する競合反応
が、抗体を複合体から引き離す程度に起こり、それによ
り、その分子量を約１８０キロダルトン未満に減少させ
る。複合体はアポペルオキシダーゼと結合して、検出可
能な応答を提供するのに必要な反応を触媒する活性酵素
を提供することができる。この応答の大きさは、既知の
濃度の分析対象物を使用して作成した較正チャートとの
比較によって測定することができる試験流体中の分析対
象物の濃度に比例する。金属ポルフィリンが、抗原（分
析対象物）に特異的な抗体と複合し、結合剤が分析対象
物もしくは分析対象物誘導体であるとき、同様な応答が
観察される。
【００１４】
【実施例】以下の手順及び例により、本発明を実施する
方法をさらに説明する。
方法をさらに説明する。
【００１５】Ａ．例IV〜VIIで使用する試薬を調製する
手法 Whatman 3MMを第一の水性浸漬液に含浸し、続いて第二
のエタノール浸漬液に含浸し、１００℃の乾燥温度を７
分間使用することにより、乾燥試薬紙を調製した。第一
の浸漬液は緩衝剤を含むものであり、第二の浸漬液は酸
化還元指示薬、ＴＭＢ及びヒドロペルオキシド、ＤＢＤ
Ｈを含むものであった。
手法 Whatman 3MMを第一の水性浸漬液に含浸し、続いて第二
のエタノール浸漬液に含浸し、１００℃の乾燥温度を７
分間使用することにより、乾燥試薬紙を調製した。第一
の浸漬液は緩衝剤を含むものであり、第二の浸漬液は酸
化還元指示薬、ＴＭＢ及びヒドロペルオキシド、ＤＢＤ
Ｈを含むものであった。
【００１６】第一の浸漬液は、７３mg/dlヘマチン−Ｉ
ｇＧ１０ml、１０mg/mlマウス抗ヒトκ鎖モノクロナー
ル抗体１．０ml、グリセロール−２−リン酸０．６６
g、アポヘモグロビン４．２μM、緩衝剤としての４−モ
ルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）０．６３g及
び界面活性剤としてのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）０．１１gからなるものであった。１N ＮａＯＨに
よってpHを７．５に調節した。
ｇＧ１０ml、１０mg/mlマウス抗ヒトκ鎖モノクロナー
ル抗体１．０ml、グリセロール−２−リン酸０．６６
g、アポヘモグロビン４．２μM、緩衝剤としての４−モ
ルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）０．６３g及
び界面活性剤としてのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）０．１１gからなるものであった。１N ＮａＯＨに
よってpHを７．５に調節した。
【００１７】第二の浸漬液は、ポリビニルピロリドン
２．５g、ＤＢＤＨ１．６g及びＴＭＢ０．７９５gをエ
タノール１００ml中に含有するものであった。
２．５g、ＤＢＤＨ１．６g及びＴＭＢ０．７９５gをエ
タノール１００ml中に含有するものであった。
【００１８】各浸漬成分の好適濃度及び許容可能範囲を
表１に示す。
表１に示す。
【００１９】 表１ アポペルオキシダーゼ試薬 好適濃度 許容可能範囲 第一の浸漬液（水性） グリセロール−２−リン酸 225nM 0〜800mM ＭＯＰＳ 225mM 0〜800mM ＳＤＳ 28mM 8〜100mM Ｆｅ−ＨＥＤＴＡ（アスコルベートスカベンジャ） 7.5mM 0〜20mM トリイソプロピルアミンボレート（安定剤） 33 0〜120 Ｆｅヘマチン−抗原（金属ポルフィリン複合体） 3.2μM 1〜20μＭ Ａｂ（競合的結合剤） ４．４μM 1〜20
μM アポヘモグロビン（アポペルオキシダーゼ） 4.2μM 1〜20μM １N ＮａＯＨでpH調節 7.5 1〜12 第二の浸漬液（エタノール） ポリビニルピロリドン 2.5ｗ％ 0〜7.5ｗ％ テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ） 33mM 5〜100mM ジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシド（ＤＢＤＨ） 66mM 5〜150mM オレンジＧ染料（バックグラウンド染料） 0.20mM 0〜5mM エチルオレンジ染料（バックグラウンド染料） 0.20mM 0〜5mM
μM アポヘモグロビン（アポペルオキシダーゼ） 4.2μM 1〜20μM １N ＮａＯＨでpH調節 7.5 1〜12 第二の浸漬液（エタノール） ポリビニルピロリドン 2.5ｗ％ 0〜7.5ｗ％ テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ） 33mM 5〜100mM ジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシド（ＤＢＤＨ） 66mM 5〜150mM オレンジＧ染料（バックグラウンド染料） 0.20mM 0〜5mM エチルオレンジ染料（バックグラウンド染料） 0.20mM 0〜5mM
【００２０】Ｂ．上記浸漬液から製造した試薬紙を細片
に裁断し、比重１．０１５の尿プールから種々のヘマチ
ンを含有する尿に浸漬した。浸漬から１分後にCLINITEK
（商標）２００＋計器を使用して測定した６６０nmでの
反射率を、試薬活性を表すものとして記録した。
に裁断し、比重１．０１５の尿プールから種々のヘマチ
ンを含有する尿に浸漬した。浸漬から１分後にCLINITEK
（商標）２００＋計器を使用して測定した６６０nmでの
反射率を、試薬活性を表すものとして記録した。
【００２１】例Ｉ 検出限界の研究 この例では、アポペルオキシダーゼをヘマチン及びヘマ
チン抗原複合体と比較して、検出可能濃度ならびにアポ
酵素再活性化に対する複合体及び抗原分子量の効果を測
定した。アポＰＯＤ、Ｆｅ+ 3ヘマチン及びヘマチン複合
体の組み合わせを含有する溶液をペルオキシダーゼ活性
に関して試験した。表３に示すHEMASTIX（登録商標）試
薬を使用して尿中のペルオキシダーゼ活性を測定した。
この試薬は、表１に示したものに類似しているが、金属
ポルフィリン複合体、競合的結合剤及びアポペルオキシ
ダーゼを欠き、一方で活性化剤としてレピジンを含有す
るものであった。この検出限界の研究の結果を表２にま
とめる。
チン抗原複合体と比較して、検出可能濃度ならびにアポ
酵素再活性化に対する複合体及び抗原分子量の効果を測
定した。アポＰＯＤ、Ｆｅ+ 3ヘマチン及びヘマチン複合
体の組み合わせを含有する溶液をペルオキシダーゼ活性
に関して試験した。表３に示すHEMASTIX（登録商標）試
薬を使用して尿中のペルオキシダーゼ活性を測定した。
この試薬は、表１に示したものに類似しているが、金属
ポルフィリン複合体、競合的結合剤及びアポペルオキシ
ダーゼを欠き、一方で活性化剤としてレピジンを含有す
るものであった。この検出限界の研究の結果を表２にま
とめる。
【００２２】
【表１】
【００２３】ヘマチン（ケースＡ）又は抗原ヘマチン複
合体（ケースＢ）のペルオキシダーゼ活性は、３．６nM
の濃度では検出することができなかった。アポＰＯＤは
また、それ自体は活性を示さなかった（ケースＥ）が、
ヘマチン（ケースＣ）及び抗原ヘマチン複合体（ケース
Ｄ）のペルオキシダーゼ活性は、アポＰＯＤの存在下で
おいて３．６nMで検出することができた。この例は、Ｄ
ＢＤＨ１０5モル／分の代謝回転率及び１０5の染料（Ｔ
ＭＢ）モル吸光率を有する酸化還元試薬及びヒドロペル
オキシド技術により、ペルオキシダーゼ再活性化による
nM量の検出が可能であることを実証した。ヘマチンと抗
原との複合は、アポ酵素再活性化を妨げなかった。実
際、ケースＤの抗原ヘマチン複合体では、再活性化は、
３．６nMアポペルオキシダーゼ（ケースＥ）を３．６nM
アポペルオキシダーゼ：抗原ヘマチン（ケースＤ）と比
較することによって測定することができるように、１分
で反射率２５．０％もの大きさの応答を生じさせた。驚
くべきことに、分子量１６０，０００g/molまでの抗原
の複合（ＩｇＧの場合）は、アポＰＯＤの再活性化を阻
止しなかった。再活性化は１分以内に完了し（短い平衡
時間を実証）、２０〜４０℃の温度又はＰＯＤ濃度に依
存しなかった。
合体（ケースＢ）のペルオキシダーゼ活性は、３．６nM
の濃度では検出することができなかった。アポＰＯＤは
また、それ自体は活性を示さなかった（ケースＥ）が、
ヘマチン（ケースＣ）及び抗原ヘマチン複合体（ケース
Ｄ）のペルオキシダーゼ活性は、アポＰＯＤの存在下で
おいて３．６nMで検出することができた。この例は、Ｄ
ＢＤＨ１０5モル／分の代謝回転率及び１０5の染料（Ｔ
ＭＢ）モル吸光率を有する酸化還元試薬及びヒドロペル
オキシド技術により、ペルオキシダーゼ再活性化による
nM量の検出が可能であることを実証した。ヘマチンと抗
原との複合は、アポ酵素再活性化を妨げなかった。実
際、ケースＤの抗原ヘマチン複合体では、再活性化は、
３．６nMアポペルオキシダーゼ（ケースＥ）を３．６nM
アポペルオキシダーゼ：抗原ヘマチン（ケースＤ）と比
較することによって測定することができるように、１分
で反射率２５．０％もの大きさの応答を生じさせた。驚
くべきことに、分子量１６０，０００g/molまでの抗原
の複合（ＩｇＧの場合）は、アポＰＯＤの再活性化を阻
止しなかった。再活性化は１分以内に完了し（短い平衡
時間を実証）、２０〜４０℃の温度又はＰＯＤ濃度に依
存しなかった。
【００２４】検出限界実験の手法 ヘマチン１０μl画分（リン酸緩衝溶液中３．６μM、
０．２３mg/dl）又はヘマチン−ベンスジョーンズタン
パク質（ＢＪＰ）（リン酸緩衝溶液中３．６μM、8.61mg
/dl）１０μl画分を、すべてリン酸緩衝溶液９８０μl
中で、アポＰＯＤ１０μlと混合したのち、さらなるリ
ン酸緩衝溶液で所望の濃度に希釈した。この溶液を４０
℃又は室温で１分間インキュベートした。試験溶液に浸
漬したHEMASTIX（登録商標）試薬の応答をCLINITEK（商
標）−２００反射率計で測定した。リン酸緩衝溶液のみ
における表１に記す試薬の応答は、１分で反射率が６
５．２％であった。
０．２３mg/dl）又はヘマチン−ベンスジョーンズタン
パク質（ＢＪＰ）（リン酸緩衝溶液中３．６μM、8.61mg
/dl）１０μl画分を、すべてリン酸緩衝溶液９８０μl
中で、アポＰＯＤ１０μlと混合したのち、さらなるリ
ン酸緩衝溶液で所望の濃度に希釈した。この溶液を４０
℃又は室温で１分間インキュベートした。試験溶液に浸
漬したHEMASTIX（登録商標）試薬の応答をCLINITEK（商
標）−２００反射率計で測定した。リン酸緩衝溶液のみ
における表１に記す試薬の応答は、１分で反射率が６
５．２％であった。
【００２５】アポセイヨウワサビペルオキシダーゼは、
米ミズーリ州セントルイスのSigmaChemical社から入手
したものである。リン酸緩衝溶液は、一塩基性リン酸ナ
トリウム０．６９ｇ、二塩基性リン酸ナトリウム０．７
１ｇ及び塩化ナトリウム０．４５ｇを水１００mlに加え
ることによって調製したものである。
米ミズーリ州セントルイスのSigmaChemical社から入手
したものである。リン酸緩衝溶液は、一塩基性リン酸ナ
トリウム０．６９ｇ、二塩基性リン酸ナトリウム０．７
１ｇ及び塩化ナトリウム０．４５ｇを水１００mlに加え
ることによって調製したものである。
【００２６】抗原応答実験の手法 ヘマチンＢＪＰ（リン酸緩衝溶液中３．６μM、８．６
１mg/dl）、抗ＢＪＰ（ＰＢＳ中３．６μM、５２．５６
mg/dl）及びＢＪＰ（リン酸緩衝溶液中３．６μM、８．
２８mg/dl）の試料１０μlを、アポＰＯＤ（リン酸緩衝
溶液中３．６μM、１４．０mg/dl）１０μl及びリン酸
緩衝溶液９６０Ｌと混合した。溶液を室温で５〜１０分
間インキュベートし、試験溶液に浸漬したHEMASTIX（登
録商標）試薬に対する応答をCLINITEK（登録商標）−２
００計器を使用して測定した。ヘマチンのみを含有する
リン酸緩衝溶液でのHEMASTIX（登録商標）試薬の応答
は、１分で反射率が６５．７％であった。ヒツジ抗ヒト
ＢＪＰモノクロナール抗体は、英国バーミンガムのBind
ing Site社から入手したものである。
１mg/dl）、抗ＢＪＰ（ＰＢＳ中３．６μM、５２．５６
mg/dl）及びＢＪＰ（リン酸緩衝溶液中３．６μM、８．
２８mg/dl）の試料１０μlを、アポＰＯＤ（リン酸緩衝
溶液中３．６μM、１４．０mg/dl）１０μl及びリン酸
緩衝溶液９６０Ｌと混合した。溶液を室温で５〜１０分
間インキュベートし、試験溶液に浸漬したHEMASTIX（登
録商標）試薬に対する応答をCLINITEK（登録商標）−２
００計器を使用して測定した。ヘマチンのみを含有する
リン酸緩衝溶液でのHEMASTIX（登録商標）試薬の応答
は、１分で反射率が６５．７％であった。ヒツジ抗ヒト
ＢＪＰモノクロナール抗体は、英国バーミンガムのBind
ing Site社から入手したものである。
【００２７】レピジンの添加に関して先に述べたHEMAST
IX（登録商標）試薬を、表１の処方よりも低いpHで、以
下の組成の二浸漬系の中で試験片に施し、例Ｉ〜IVで使
用した。
IX（登録商標）試薬を、表１の処方よりも低いpHで、以
下の組成の二浸漬系の中で試験片に施し、例Ｉ〜IVで使
用した。
【００２８】 表３ 許容可能濃度 範 囲 第一の浸漬液（水性） グリセロール−２−リン酸 225mM 0〜800mM ＭＯＰＳ 225mM 0〜800mM ＳＤＳ 28mM 8〜100mM トリイソプロピルアミンボレート 33mM 0〜120mM Ｆｅ−ＨＥＤＴＡ 7.5mM 0〜20mM １N ＮａＯＨでpH調節 6.3 5.5〜8.5 第二の浸漬液（エタノール） ポリビニルピロリドン 2.5ｗ％ 0〜7.5ｗ％ テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ） 33mM 5〜100mM ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド（ＤＢＤＨ） 66mM 5〜150mM レピジン 100mM 5〜150mM オレンジＧ染料（バックグラウンド染料） 0.20mM 0〜5mM エチルオレンジ染料（バックグラウンド染料） 0.20mM 0〜5mM
【００２９】例II 近接効果 この例では、ヘマチン−抗原複合体の抗体結合がアポ酵
素再活性化を阻止することを示す（表３）。表３に示す
データは、レピジンを含むが、アポペルオキシダーゼ、
抗原−ヘマチン抗原及び抗体を欠くHEMASTIX（登録商
標）処方を使用することによって生成した。後者を溶液
中に混合し、修正したHEMASTIX（登録商標）処方を有す
る試薬試験片をただちに溶液に浸漬し、CLINITEK（商
標）−２００＋反射分光計を使用して読み取った。
素再活性化を阻止することを示す（表３）。表３に示す
データは、レピジンを含むが、アポペルオキシダーゼ、
抗原−ヘマチン抗原及び抗体を欠くHEMASTIX（登録商
標）処方を使用することによって生成した。後者を溶液
中に混合し、修正したHEMASTIX（登録商標）処方を有す
る試薬試験片をただちに溶液に浸漬し、CLINITEK（商
標）−２００＋反射分光計を使用して読み取った。
【００３０】〔ヘマチン〕抗原／抗体複合体が１８０，
０００g/molを超える分子量を有する限り、アポ酵素再
活性化の阻止が観察された。したがって、スルファメタ
ジン＋抗体（分子量約１６１，０００）はアポ酵素活性
化を阻止しなかった。しかし、スルフメタジンをポリア
クリル酸（ＰＡＡ）に付着したもの（分子量２００，０
００g/mol）は、実験１０で観察された５１．５％の反
射率によって示されるように、アポ酵素の再活性化を阻
止した。また、抗原と抗体との結合を断つことによって
ヘマチン−抗原〔抗体〕複合体を遊離させてアポＰＯＤ
を再活性化させるその能力により、抗原（ＩｇＧ、分子
量１６０，０００及びＢＪＰ、分子量２３，０００）を
尿中に検出することができることがわかった。
０００g/molを超える分子量を有する限り、アポ酵素再
活性化の阻止が観察された。したがって、スルファメタ
ジン＋抗体（分子量約１６１，０００）はアポ酵素活性
化を阻止しなかった。しかし、スルフメタジンをポリア
クリル酸（ＰＡＡ）に付着したもの（分子量２００，０
００g/mol）は、実験１０で観察された５１．５％の反
射率によって示されるように、アポ酵素の再活性化を阻
止した。また、抗原と抗体との結合を断つことによって
ヘマチン−抗原〔抗体〕複合体を遊離させてアポＰＯＤ
を再活性化させるその能力により、抗原（ＩｇＧ、分子
量１６０，０００及びＢＪＰ、分子量２３，０００）を
尿中に検出することができることがわかった。
【００３１】
【表２】
【００３２】例III 干渉研究 この例では、ヘモグロビン（又はミオグロビン）０．８
１mg/dl及びアスコルベート２５mg/dlに対して抵抗を有
し、アポペルオキシダーゼ再活性化を検出するのに十分
な感度を有するペルオキシダーゼ検出乾燥試薬を使用し
た。ペルオキシダーゼ検出試薬は、HEMASTIX（登録商
標）試薬中のレピジン活性化剤を除去し、pHを７．５に
増すことによって製造した。修正なしで、ヘモグロビン
（又はミオグロビン）は擬陽性の応答を生じさせた。ア
スコルベートは、アスコルベートスカベンジャー系の使
用のため、系の中で擬陰性の応答を生じさせなかった。
１mg/dl及びアスコルベート２５mg/dlに対して抵抗を有
し、アポペルオキシダーゼ再活性化を検出するのに十分
な感度を有するペルオキシダーゼ検出乾燥試薬を使用し
た。ペルオキシダーゼ検出試薬は、HEMASTIX（登録商
標）試薬中のレピジン活性化剤を除去し、pHを７．５に
増すことによって製造した。修正なしで、ヘモグロビン
（又はミオグロビン）は擬陽性の応答を生じさせた。ア
スコルベートは、アスコルベートスカベンジャー系の使
用のため、系の中で擬陰性の応答を生じさせなかった。
【００３３】試薬は、それを、Ｆｅヘマチンとともに、
またＦｅヘマチンなしで、干渉物質を含有する溶液に浸
漬することによって試験した。HEMASTIX（登録商標）試
薬に対するこれらの配合変更はまた、アポペルオキシダ
ーゼ再活性化を検出するのに必要な試薬の感度を例Ｉで
の３nMからこの例IIIでの１２μMまで減らした。予想ど
おり、ヘマチン１２μMは、アポＰＯＤ１２μMの添加に
よって活性化された。この干渉研究の結果を以下の表５
に記す。
またＦｅヘマチンなしで、干渉物質を含有する溶液に浸
漬することによって試験した。HEMASTIX（登録商標）試
薬に対するこれらの配合変更はまた、アポペルオキシダ
ーゼ再活性化を検出するのに必要な試薬の感度を例Ｉで
の３nMからこの例IIIでの１２μMまで減らした。予想ど
おり、ヘマチン１２μMは、アポＰＯＤ１２μMの添加に
よって活性化された。この干渉研究の結果を以下の表５
に記す。
【００３４】
【表３】
【００３５】表５から、５．１％および３．０％応答対
７８．２％及び７６．５％によって示されるように、レ
ピジンを含むHEMASTIX（登録商標）がヘモグロビン又は
ミオグロビンによって干渉を受けると判断することがで
きる。
７８．２％及び７６．５％によって示されるように、レ
ピジンを含むHEMASTIX（登録商標）がヘモグロビン又は
ミオグロビンによって干渉を受けると判断することがで
きる。
【００３６】例IV 金属ポルフィリン研究 この例では、異なるタイプのアポペルオキシダーゼを再
活性化する能力に関して他の金属ポルフィリンを試験し
た。金属、たとえばＦｅ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｍ
ｎ、Ｃｏ及びＰｄをヘマチンに複合させ、ペルオキシダ
ーゼ検出剤に添加した。金属、たとえばＭｎ、Ｆｅ、Ｃ
ｕ及びＣｏならびにヘマチン以外のポルフィリン、すな
わちデテロポルフィン及びコプロポルフィンもまた、所
望の応答を提供することがわかった。これを表６に示
す。アポペルオキシダーゼと、鉄ポルフィリン及びマン
ガンポルフィリンとの組み合わせが、水に比べて色の形
成（より低い反射率）をもたらす。アポ擬似ペルオキシ
ダーゼ、アポヘモグロビンは、この実験で作用すること
がわかった。
活性化する能力に関して他の金属ポルフィリンを試験し
た。金属、たとえばＦｅ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｍ
ｎ、Ｃｏ及びＰｄをヘマチンに複合させ、ペルオキシダ
ーゼ検出剤に添加した。金属、たとえばＭｎ、Ｆｅ、Ｃ
ｕ及びＣｏならびにヘマチン以外のポルフィリン、すな
わちデテロポルフィン及びコプロポルフィンもまた、所
望の応答を提供することがわかった。これを表６に示
す。アポペルオキシダーゼと、鉄ポルフィリン及びマン
ガンポルフィリンとの組み合わせが、水に比べて色の形
成（より低い反射率）をもたらす。アポ擬似ペルオキシ
ダーゼ、アポヘモグロビンは、この実験で作用すること
がわかった。
【００３７】
【表４】
【００３８】表６のデータは、コラム１の反射率が６６
％以上であることによって示されるように、アポペルオ
キシダーゼ又はアポヘモグロビンなしでは金属ポルフィ
リンが検出されないことを実証する。アポペルオキシダ
ーゼ又はアポヘモグロビンのの添加は、コラム１及び３
における５６％以下の反射率によって示されるように、
色応答を生じさせる。応答は、３種の異なるポルフィリ
ンで類似している。Ｍｎ及びＣｕの使用は、コラム２に
示すように、Ｆｅに関して得られる応答に類似した応答
をもたらした。金属の活性は、使用する特定の過酸化
物、pH及び酸化還元指示薬に依存するため、他の金属は
この系の中で活性ではなかった。
％以上であることによって示されるように、アポペルオ
キシダーゼ又はアポヘモグロビンなしでは金属ポルフィ
リンが検出されないことを実証する。アポペルオキシダ
ーゼ又はアポヘモグロビンのの添加は、コラム１及び３
における５６％以下の反射率によって示されるように、
色応答を生じさせる。応答は、３種の異なるポルフィリ
ンで類似している。Ｍｎ及びＣｕの使用は、コラム２に
示すように、Ｆｅに関して得られる応答に類似した応答
をもたらした。金属の活性は、使用する特定の過酸化
物、pH及び酸化還元指示薬に依存するため、他の金属は
この系の中で活性ではなかった。
【００３９】例Ｖ ＩｇＧ用の完成した乾燥試薬 この例では、ペルオキシダーゼ再活性化を検出するため
のアスコルベート及びヘモグロビン耐性試薬を、アポヘ
モグロビン、ヒトＩｇＧと複合したＦｅヘマチン及び抗
ヒトＩｇＧとで一つの試薬に合わせた（表１）。表７に
よって示されるように、完成した試薬は尿中のＩｇＧを
検出し、試験溶液中のＩｇＧの濃度と記録された応答と
の間には良好な相関が見られた。
のアスコルベート及びヘモグロビン耐性試薬を、アポヘ
モグロビン、ヒトＩｇＧと複合したＦｅヘマチン及び抗
ヒトＩｇＧとで一つの試薬に合わせた（表１）。表７に
よって示されるように、完成した試薬は尿中のＩｇＧを
検出し、試験溶液中のＩｇＧの濃度と記録された応答と
の間には良好な相関が見られた。
【００４０】
【表５】
【００４１】例VI グラム陰性細胞用の完成した乾燥試
薬 この例では、ペルオキシダーゼ活性を検出するためのア
スコルベート及びヘモグロビン耐性試薬を、アポヘモグ
ロビン、複合したＦｅヘマチン及び抗ウサギ細菌リポ多
糖（ＬＰＳ）に対して特異的な抗体とで一つの試薬に合
わせた。Ｆｅヘマチン−ＬＰＳ複合体は、オボアルブミ
ンに付着したＬＰＳ分子１６．３個及びヘマチン分子
５．２個からなるものであった。表８によって実証する
ように、完成した試薬は尿中の細菌細胞を検出し、３種
のグラム陰性細胞が検出された。すべてのグラム陰性細
胞はそれらの表面にＬＰＳを有するため、この技術は、
グラム陰性尿路感染症のためのスクリーニングを提供す
る。グラム陰性細胞のＬＰＳがその抗体に結合するた
め、グラム陰性細胞を含有する試料は、抗体へのＬＰＳ
複合体の結合を分裂させるであろう。すると、ＬＰＳ複
合体は、遊離状態となり、アポヘモグロビンとで再構成
してその活性形態を形成し、検出可能な応答を出すこと
ができる。
薬 この例では、ペルオキシダーゼ活性を検出するためのア
スコルベート及びヘモグロビン耐性試薬を、アポヘモグ
ロビン、複合したＦｅヘマチン及び抗ウサギ細菌リポ多
糖（ＬＰＳ）に対して特異的な抗体とで一つの試薬に合
わせた。Ｆｅヘマチン−ＬＰＳ複合体は、オボアルブミ
ンに付着したＬＰＳ分子１６．３個及びヘマチン分子
５．２個からなるものであった。表８によって実証する
ように、完成した試薬は尿中の細菌細胞を検出し、３種
のグラム陰性細胞が検出された。すべてのグラム陰性細
胞はそれらの表面にＬＰＳを有するため、この技術は、
グラム陰性尿路感染症のためのスクリーニングを提供す
る。グラム陰性細胞のＬＰＳがその抗体に結合するた
め、グラム陰性細胞を含有する試料は、抗体へのＬＰＳ
複合体の結合を分裂させるであろう。すると、ＬＰＳ複
合体は、遊離状態となり、アポヘモグロビンとで再構成
してその活性形態を形成し、検出可能な応答を出すこと
ができる。
【００４２】
【表６】
【００４３】抗体はウサギ抗大腸菌（E.coli）ＬＰＳで
あった。カタログ番号ＹＢＤＢ３０５０６Ｒ：ロット番
号Ｇ４５２０、ウシ抗血清、米ニューヨーク州Westbury
のAccurate Chemical & Scientific社。
あった。カタログ番号ＹＢＤＢ３０５０６Ｒ：ロット番
号Ｇ４５２０、ウシ抗血清、米ニューヨーク州Westbury
のAccurate Chemical & Scientific社。
【００４４】以下の実験方法を以下の例に使用した。 複合体調製手順 ０．１N ＮａＯＨ中ヘマチンの溶液（５５mg/dl、６３
３．５１g/mol）８６８μMをアセトニトリル中１，３−
ジシクロヘキシルカルボジイミドの溶液（１９．４mg/d
l、２２６g/mol）８５８μMに加え、室温で５分間撹拌
した。活性化ヘマチン２５μM及び抗原（ヒトκＢＪＰ
３０mg/dl又はヒトγグロブリン（ＩｇＧ）２００mg/d
l）１２μMを含有する溶液を製造し、室温でさらに５分
間撹拌した。ヘマチン−抗原複合体を遠心分離によりAm
icon限外ろ過膜を使用して乾燥させることによって遊離
抗原から分離したのち、脱イオン水で数回洗浄した。ヘ
マチン複合体はＩｇＧ又はＢＪＰよりも膜を透過しにく
く、複合体は膜で捕集される結果となった。最後の洗浄
ののち、ヘマチン−抗原複合体を脱イオン水１７５mlに
溶解した。反応物は、クマシーブリリアントブルー法を
使用するタンパク質測定により、６４％強完全であり、
タンパク質１２８mg／複合体４．３μMを含有すること
がわかった。
３．５１g/mol）８６８μMをアセトニトリル中１，３−
ジシクロヘキシルカルボジイミドの溶液（１９．４mg/d
l、２２６g/mol）８５８μMに加え、室温で５分間撹拌
した。活性化ヘマチン２５μM及び抗原（ヒトκＢＪＰ
３０mg/dl又はヒトγグロブリン（ＩｇＧ）２００mg/d
l）１２μMを含有する溶液を製造し、室温でさらに５分
間撹拌した。ヘマチン−抗原複合体を遠心分離によりAm
icon限外ろ過膜を使用して乾燥させることによって遊離
抗原から分離したのち、脱イオン水で数回洗浄した。ヘ
マチン複合体はＩｇＧ又はＢＪＰよりも膜を透過しにく
く、複合体は膜で捕集される結果となった。最後の洗浄
ののち、ヘマチン−抗原複合体を脱イオン水１７５mlに
溶解した。反応物は、クマシーブリリアントブルー法を
使用するタンパク質測定により、６４％強完全であり、
タンパク質１２８mg／複合体４．３μMを含有すること
がわかった。
【００４５】クマシーブリリアントブルー法は、試料３
０μlをブラッドフォード試薬（クマシーブリリアント
ブルー０．０１g、８５％リン酸１０ml、エタノール５m
l及び水８５ml）１．５mlに加え、５９０nmでの吸光度
を測定し、その吸光度をタンパク質の濃度の標準曲線と
比較することによって実施した。
０μlをブラッドフォード試薬（クマシーブリリアント
ブルー０．０１g、８５％リン酸１０ml、エタノール５m
l及び水８５ml）１．５mlに加え、５９０nmでの吸光度
を測定し、その吸光度をタンパク質の濃度の標準曲線と
比較することによって実施した。
【００４６】アポヘモグロビンを製造する手法 ０．７％ヘモグロビン溶液のpHを１．５に下げ、得られ
た溶液を１０キロダルトン分画膜に通して限外ろ過した
のち、水を数回交換した。ろ過した物質を水に再構成し
た。アポヘモグロビンはろ過膜を透過したが、暗色のＦ
ｅ+ +ヘマチン及びヘモグロビンはろ別された。４４０ml
を捕集したろ液は、検定により、タンパク質（アポヘモ
グロビン）４３０mg又は２３μMを含有することがみい
だされた。この溶液のHEMASTIX（登録商標）結果は＋で
あり、ヘモグロビンの量が低いことを示した。ろ過膜を
透過しなかった捕集画分を水７５mlに溶解し、検定によ
り、タンパク質２７０mgを含有することがわかった。こ
れは、高濃度のヘモグロビンを示す＋＋＋＋＋のHEMAST
IX（登録商標）結果をもたらした。
た溶液を１０キロダルトン分画膜に通して限外ろ過した
のち、水を数回交換した。ろ過した物質を水に再構成し
た。アポヘモグロビンはろ過膜を透過したが、暗色のＦ
ｅ+ +ヘマチン及びヘモグロビンはろ別された。４４０ml
を捕集したろ液は、検定により、タンパク質（アポヘモ
グロビン）４３０mg又は２３μMを含有することがみい
だされた。この溶液のHEMASTIX（登録商標）結果は＋で
あり、ヘモグロビンの量が低いことを示した。ろ過膜を
透過しなかった捕集画分を水７５mlに溶解し、検定によ
り、タンパク質２７０mgを含有することがわかった。こ
れは、高濃度のヘモグロビンを示す＋＋＋＋＋のHEMAST
IX（登録商標）結果をもたらした。
Claims (20)
- 【請求項１】 流体試料中の分析対象物の検定法であっ
て、 流体試料を、アポペルオキシダーゼもしくはアポ擬似ペ
ルオキシダーゼ、及び分析対象物／分析対象物特異的結
合パートナ複合体と結合した金属ポルフィリンと共にヒ
ドロペルオキシド及び酸化還元染料と合わせる工程を含
み、前記複合体が、分析対象物が存在しない場合には、
アポペルオキシダーゼもしくはアポ擬似ペルオキシダー
ゼと金属ポルフィリンとの再構成を阻止するのに十分に
高い合計分子量を有するが、流体試料中に分析対象物が
存在する場合には、流体試料中の分析対象物と、前記複
合体の分析対象物特異的結合パートナ部分との間の、前
記複合体を分裂させ、それにより、金属ポルフィリンに
結合した部分の分子量を、アポペルオキシダーゼと金属
ポルフィリンとの再構成が阻害されるレベル未満に減ら
す相互作用により、そのような再構成を可能にして、ア
ポペルオキシダーゼとその対応する金属ポルフィリンと
を再構成させて、約１〜１２のpHでヒドロペルオキシド
及び酸化還元染料と相互作用して色応答を提供する活性
ペルオキシダーゼを形成させる検定法。 - 【請求項２】 分析対象物／分析対象物特異的結合パー
トナ複合体が、少なくとも約１８０キロダルトンの分子
量を有する、請求項１記載の検定法。 - 【請求項３】 分析対象物／分析対象物特異的結合パー
トナ複合体が、分析対象物特異的結合パートナを介して
金属ポルフィリンに結合している、請求項１記載の検定
法。 - 【請求項４】 分析対象物特異的結合パートナが、抗体
又はそのフラグメントである、請求項１記載の検定法。 - 【請求項５】 分析対象物／分析対象物特異的結合パー
トナ複合体が、分析対象物を介して金属ポルフィリンに
結合している、請求項１記載の検定法。 - 【請求項６】 分析対象物が細菌細胞又はその一部であ
る、請求項４記載の検定法。 - 【請求項７】 細菌細胞の一部が、リポ多糖（ＬＰＳ）
又はリポテイコ酸（ＬＰＡ）である、請求項６記載の検
定法。 - 【請求項８】 ヒドロペルオキシドが、クメンヒドロペ
ルオキシド、５−ブチルヒドロペルオキシド、ジイソプ
ロピルベンゼンヒドロペルオキシド、１−ヒドロキシシ
クロヘキサン−１−ヒドロペルオキシド、２，５−ジメ
チルヘキサン−２，５−ジヒドロペルオキシド、パラメ
ンタンヒドロペルオキシド、１，４−ジイソプロピルベ
ンゼンヒドロペルオキシド、ｐ−tert-ブチル−イソプ
ロピルベンゼンヒドロペルオキシド、２−（α−ヒドロ
ペルオキシイソプロピル）−６−イソプロピルナフタレ
ン、テトラリンヒドロペルオキシド又はそれらの組み合
わせである、請求項１記載の検定法。 - 【請求項９】 染料がベンジジン、ｏ−トリジン、アル
キル基が炭素原子１〜６個を含む３，３′，５，５′−
テトラアルキルベンジジン、９−ジアニシジン、２，７
−ジアミノフルオレン、ビス−（Ｎ−エチルキノール−
２−オン）−アジン、（Ｎ−メチルベンズチアゾール−
２−オン）−（１−エチル−３−フェニル−５−メチル
トリアゾール−２−オン）−アジン又はそれらの組み合
わせである、請求項１記載の検定法。 - 【請求項１０】 流体試料中の分析対象物の検定法であ
って、 流体試料を、アポペルオキシダーゼ、及び分析対象物／
分析対象物特異的結合パートナ複合体と結合した金属ポ
ルフィリンを含む試薬系と共にヒドロペルオキシド及び
酸化還元染料を合わせる工程を含み、前記分析対象物／
分析対象物特異的結合パートナ複合体は、少なくとも約
１８０キロダルトンの分子量を有しており、流体試料中
に分析対象物が存在する場合には、アポペルオキシダー
ゼと金属ポルフィリンとを再結合させて活性ペルオキシ
ダーゼを形成させて、それがヒドロペルオキシド及び酸
化還元染料と相互作用して色応答を提供することを可能
にする検定法。 - 【請求項１１】 流体試料中の分析対象物を測定するた
めの試験キットであって、 ｉ）酸化還元指示薬、過酸化物、及び流体試料と合わさ
ったとき、流体試料のpHを１〜１２のレベルに維持する
ための緩衝剤と、 ii）分析対象物又は分析対象物特異的結合パートナ／金
属ポルフィリン複合体と、 iii）ヘム補欠分子族を欠く過酸化活性物質と、 iv）複合体結合化合物と、を含む試験キット。 - 【請求項１２】 分析対象物特異的結合パートナが金属
ポルフィリンに結合し、また、複合体結合化合物が、分
析対象物、分析対象物の類似体又はより大きな分子に結
合した分析対象物である、請求項１１記載の試験キッ
ト。 - 【請求項１３】 分析対象物又はその類似体が金属ポル
フィリンに結合し、複合体結合化合物が分析対象物に特
異的な結合パートナである、請求項１１記載の試験キッ
ト。 - 【請求項１４】 流体試料中の、細胞表面にリポ多糖
（ＬＰＳ）又はリポテイコ酸（ＬＰＡ）を有する細菌細
胞の存在を検出する検定法であって、 流体試料を、アポペルオキシダーゼもしくはアポ擬似ペ
ルオキシダーゼ、及び抗高密度リポタンパク質（ＨＤ
Ｌ）／ＨＤＬ複合体と結合した金属ポルフィリンと共
に、ヒドロペルオキシド及び酸化還元染料を合わせる工
程を含み、前記複合体が、細菌が存在しない場合には、
アポペルオキシダーゼもしくはアポ擬似ペルオキシダー
ゼと金属ポルフィリンとの再構成を阻止するが、流体試
料中に細菌が存在する場合には、細菌とＨＤＬとの間
の、複合体を分裂させる相互作用により、そのような再
構成を可能にして、金属ポリフィリンをアポペルオキシ
ダーゼもしくはアポ擬似ペルオキシダーゼとで再構成さ
せて、１〜１２のpHでヒドロペルオキシド及び酸化還元
染料と相互作用して、流体試料中の細菌の存在を示す色
応答を提供することができる活性ペルオキシダーゼもし
くは擬似ペルオキシダーゼを形成させる検定法。 - 【請求項１５】 細菌がグラム陰性であり、その細胞表
面にＬＰＳを有する、請求項１４記載の検定法。 - 【請求項１６】 流体試料が尿である、請求項１５記載
の検定法。 - 【請求項１７】 グラム陰性細菌が、Proteus mirabili
s、Pseudomonas aeruginosa又は大腸菌（E.coli）であ
る、請求項１６記載の検定法。 - 【請求項１８】 細菌がグラム陽性であり、その表面に
ＬＰＳを有する、請求項１４記載の検定法。 - 【請求項１９】 流体試料が尿である、請求項１８記載
の検定法。 - 【請求項２０】 流体試料中のＩｇＧの存在を検出する
検定法であって、 流体試料を、アポペルオキシダーゼ、及び、抗ＩｇＧと
補体因子タンパク質（complement factor protein）と
の複合体と結合した金属ポルフィリンと共にヒドロペル
オキシド及び酸化還元染料を合わせる工程を含み、前記
複合体が、ＩｇＧが存在しない場合には、アポペルオキ
シダーゼと金属ポルフィリンとの再構成を阻止するが、
流体試料中にＩｇＧが存在する場合には、グラム陰性細
菌と補体因子タンパク質との間の相互作用により、その
ような再構成を可能にして、その補体因子タンパク質の
開裂は、金属ポルフィリンをアポペルオキシダーゼと再
構成させて、１〜１２のpHでヒドロペルオキシド及び酸
化還元染料と相互作用して、流体試料中のＩｇＧの存在
を示す色応答を提供することができる活性ペルオキシダ
ーゼを形成させる検定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US99038997A | 1997-12-15 | 1997-12-15 | |
| US08/990389 | 1997-12-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11237382A true JPH11237382A (ja) | 1999-08-31 |
Family
ID=25536101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10354203A Pending JPH11237382A (ja) | 1997-12-15 | 1998-12-14 | 競合的アポペルオキシダーゼ検定法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6228602B1 (ja) |
| EP (1) | EP0924521B1 (ja) |
| JP (1) | JPH11237382A (ja) |
| AU (1) | AU742373B2 (ja) |
| CA (1) | CA2249778A1 (ja) |
| DE (1) | DE69806567T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6074881A (en) * | 1998-08-03 | 2000-06-13 | Bayer Corporation | Method for the prevention of hemoglobin interference in reagent systems for measuring peroxidase activity |
| US6872573B2 (en) * | 2003-01-02 | 2005-03-29 | Bayer Corporation | Fluorescent creatinine assay |
| US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4208479A (en) * | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
| US4238565A (en) * | 1978-06-22 | 1980-12-09 | Miles Laboratories, Inc. | Specific binding assay with a prosthetic group as a label component |
| US4376165A (en) * | 1978-06-22 | 1983-03-08 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing an enzyme-labeled ligand for use in specific binding assays and the labeled conjugate produced thereby |
| JPS55111794A (en) * | 1979-02-19 | 1980-08-28 | Agency Of Ind Science & Technol | Production of lipid having high linolic acid content |
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