DE69806567T2

DE69806567T2 - Kompetitive Apoperoxidase-Bestimmung

Info

Publication number: DE69806567T2
Application number: DE69806567T
Authority: DE
Inventors: Michael J. Pugia
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1997-12-15
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2018-12-03
Also published as: CA2249778A1; EP0924521A1; JPH11237382A; AU742373B2; EP0924521B1; AU9707498A; US6228602B1; DE69806567D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Peroxidase ist ein Enzym, das die katalytische Oxidation verschiedener Verbindungen, wie von Phenolen und Aminen, mit Peroxiden katalysiert. Verschiedene Verbindungen werden als Pseudoperoxidasen bezeichnet, weil sie sich ähnlich wie das Peroxidase-Enzym verhalten, indem sie ein Elektron aus Hydroperoxiden zur Erzeugung eines Oxidans freisetzen, das dann dazu befähigt ist, wiederum ein Elektron aus einer Donor-Species aufzunehmen. Demnach sind die Pseudoperoxidasen Enzyme, indem sie Reaktionen zwischen Peroxiden oder sonstigen oxidierbaren Verbindungen katalysieren oder in sonstiger Weise daran beteiligt sind. Die Pseudoperoxidasen, die Hämoglobin und seine Derivate einschließen, werden kollektiv als peroxidativ wirksame Substanzen bezeichnet. Beispielsweise katalysiert eine peroxidativ wirksame Substanz, wie Hämoglobin und seine Derivate, die Wechselwirkung zwischen einem Hydroperoxid und einem oxidierbaren Farbstoff. Bei derartigen Wechselwirkungen ahmt die peroxidativ wirksame Substanz das Peroxidase-Enzym nach und katalysiert die Wechselwirkung zwischen dem oxidierbaren Farbstoff und dem Peroxid oder nimmt in sonstiger Weise daran teil. Der Sauerstoff, der aus einem Peroxid auf eine peroxidativ wirksame Substanz übertragen wird, erzeugt ein Oxidans, das dazu befähigt ist, ein Elektron aus einem oxidierbaren Farbstoff aufzunehmen. Die sich ergebende Wechselwirkung ergibt eine nachweisbare Reaktion, wie einen Farbübergang, worin die Intensität der Reaktion, das Vorliegen oder die Konzentration der peroxidativ wirksamen Substanz anzeigt. Geeignete oxidierbare Farbstoffe zur Verwendung in einem derartigen Assay schließen Benzidin, o-Toluidin, 3,3',5,5'- Tetraalkylbenzidin, worin die Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, 9-Dianisidin, 2,7-Diaminofluoren, Bis(N-ethylchinol-2-on)azin, (N-Methylbenzthiazol-2-on)-(1-ethyl-3-phenyl-5-methyltriazol-2-on)azin oder eine Kombination davon ein. Geeignete Hydroperoxide schließen Cumol-, 5-Butylbenzol-, Diisopropylbenzol-, 1-Hydroxycyclohexan-1-, 2,5-Dimethylhexan- 2,5-di-, Paramenthan-, 1,4-Diisopropylbenzol-, p-5-Butylisopropylbenzolhydroperoxid, 2-(α-Hydroperoxiisopropyl)-6-isopropylnaphthalin, Tetralinhydroperoxid oder eine Kombination davon ein.
In US 4,493,890 ist offenbart, dass Glucose-Oxidase ein konjugiertes Enzym aus einer enzymatisch inaktiven, hochmolekularen Protein-Komponente (Apo-Enzym) und FAD (einer niedermolekularen nicht-proteinischen prosthetischen Gruppe) ist. Nicht wie Übergangsmetall-Porphyrine, enthält der Flavinadenindinucleotid(FAD)-Teil von Glucose-Oxidase kein Übergangsmetall. Der FAD-Rest wird manchmal als eine prosthetische Gruppe bezeichnet, weil der Protein-Teil des Enzyms einen Komplex mit diesem kleinen Ligand durch Hochaffinitätsbindung bildet. Als Ergebnis, wird die prosthetische Gruppe ein integralet Teil des Proteins, den das Enzym benötigt, um zu funktionieren. Apo-Glucose-Oxidase und FAD weisen eine hohe Bindungsaffinität auf (Bindungskonstante von ca. 10¹&sup0; molar&supmin;¹) können aber wirkungsvoll durch Behandlung mit angesäuertem Ammoniumsulfat getrennt werden. In US 4.238 565 ist ein spezifischer Bindungsassay beschrieben, worin FAD als Markierung angewandt und durch seine Fähigkeit verfolgt wird, sich mit Apo-Glucose-Oxidase zu verbinden, um aktive Glucose-Oxidase zu bilden. In einem homogenen Assay zur Bestimmung eines Antigens in einem flüssigen Medium wird eine Testprobe des flüssigen Mediums mit Antikörper zu dem Antigen und einem markierten Konjugat zusammengebracht, umfassend das Antigen (oder Analog davon), das an FAD gekoppelt ist, so dass in der Probe enthaltenes Antigen mit Antigen-FAD um die Bindung zum Antikörper konkurriert. Apo-Glucose-Oxidase liegt ebenfalls vor und ist dazu befähigt, sich mit Antigen-FAD zu verbinden, das nicht mit Antikörper assoziiert ist, um aktive Glucose-Oxidase zu ergeben. Da allerdings Antikörper gebundenes Antigen-FAD zu einer solchen Verbindung mit Apo-Glucose-Oxidase nicht befähigt ist, diktiert die Konzentration von Antigen in der Testprobe die Menge an messbarer Glucose-Oxidase, die sich aus der Rekombination ergibt, durch bekannte Verfahren wie einen kolorimetrischen Assay. Diese Art von Assay, die manchmal als Apo-Enzym-Reaktivierungs-Immunoassay-System (ARIS) bezeichnet wird, beinhaltet die Bindung von Hapten an das FAD, die prosthtetische Gruppe von Glucose-Oxidase, was immer noch eine Reaktivierung der Apo-Glucose-Oxidase durch ihre Wechselwirkung mit der prosthetischen Gruppe ermöglicht. Allerdings kann eine Bindung des Anti- Hapten-Antikörpers an das Hapten-FAD-Konjugat seine Assoziation mit der Apo-Glucose-Oxidase verhindern, so dass keine Glucose-Oxidase-Aktivität beobachtet wird. Glucose-Oxidase hat sich als ausgezeichnetes Enzym für dieses System erwiesen, da (i) das FAD aus dem intakten Enzym dissoziiert werden kann, um eine stabile Apo-Glucose-Oxidase zu ergeben, (ii) die Apo- Glucose-Oxidase Enzym-Aktivität nicht exprimieren kann, aber leicht mit FAD zum Holoenzym rekonstituiert werden kann und da (iii) das Eltern-Holoenzym eine hohe Umsatzrate aufweist und das H&sub2;O&sub2;-Reaktionsprodukt mit hoher Empfindlichkeit mit verschiedenen Verfahren bestimmt werden kann.
Allerdings ist das Apo-Glucose-Oxidase-ARIS-Verfahren nicht erfolgreich bei Urinanalysen wegen des Vorliegens von FAD-Derivaten in Urin angewandt worden, was zu einer Rekonstitution mit der Apo-Oxidase führt, um das aktive. Enzym zu bilden, das falsche Positiv-Assayergebnisse verursachen kann. Die ARIS-Systeme sind durch das Molekulargewicht des Prosthetik- Konjugat-Bindungspartners nicht eingeschränkt, d. h. Rekonstitution tritt unabhängig vom Molekulargewicht des Bindungssystems auf. Dieser Typ von Assay beruht auf einer Bindungspartnerwechselwirkung mit dem Prosthetik- Konjugat, die bei einer solchen Orientation auftritt, dass sie sterische Hinderung für die Rekonstitution verursacht. Diese sterische Hinderung führt zu einer Inhibierung, die ihrerseits wiederum verursacht, dass die Rekonstitutionsraten unterschiedlich zwischen prosthetischem Konjugat und dem Bindungspartner des prosthetischen Konjugats werden. Der Unterschied bei den Rekonstruktionsraten der 2 Species wird herangezogen, um den Analyt zu messen. Peroxidasen enthalten auch eine prosthetische Gruppe in der Form eines Übergangsmetall-Prophyrins, das vom Protein abgetrennt werden kann, um eine Apo-Peroxidase zu bilden. Das Apo-Peroxidase-System der vorliegenden Erfindung ist durch das Molekulargewicht des Analyt/Analytspezifischen Bindungspartner-Konjugats eingeschränkt, das an das Metall- Porphyrin gebunden ist, da herausgefunden wurde, dass, wenn dieser Rest ein größeres Gesamtmolekulargewicht als dasjenige aufweist, das es für die Apo- Peroxidase und das Metall-Porphyrin ermöglicht, zu rekombinieren, die Rekonstitution mit der Peroxidase verhindert wird. Konjugate mit einem vereinigten Molekulargewicht von größer als ca. 180 K Dalton haben sich als geeignet zur Verhinderung einer Rekonstitution erwiesen. Der vorliegende Assay beruht auf dem Bindungspartner : Prosthetik-Konjugat, das so groß ist, dass es Rekonstitution verhindert. Da der Bindungspartner in typischer Weise ein hohes Molekulargewicht aufweist (Antikörper liegen normalerweise im 165 K Dalton-Bereich), kann das Vorhandensein einer Peroxidase-Aktivität nur aus 1 Species, dem ungebundenen Prostethik-Konjugat, resultieren, und die Aktivität dieser Einzelspecies wird verwendet, den Analyt zu messen.
Eine sterische Hinderung der Rekonstitution macht eine spezifische Orientation der Antikörper : Antigen-Bindung erforderlich, wobei diese Orientation leicht für kleine Antigene, nicht aber für große Antigene entwickelt wird. Demzufolge ist das ARIS-Verfahren normalerweise auf Antigene mit kleinem Molekulargewicht von 100 bis 1000 g/Mol beschränkt. Das vorliegende Verfahren beruht dagegen nicht auf einer sterischen Hinderung, sondern vielmehr auf dem Molekulargewicht des Prosthetik- Konjugat : Bindungspartners. Dieses technische Merkmal ergibt den Vorteil, dass mit dem Assay jede Größe eines Analyt erfasst und nachgewiesen werden kann, wobei auch die Notwendigkeit entfällt, Antikörper mit einer spezifischen Bindungsorientation herzustellen. Ausserdem kann die vorliegende Erfindung, die auf der Erkenntnis beruht, dass der Größeneffekt zur Bereitstellung eines APO-Peroxidasesystems genutzt werden kann, ohne Messgeschwindigkeiten angewandt werden kann. Dies ist bei Urinanalysen unter Verwendung von Teststreifen besonders vorteilhaft, da Urin-Streifen gewöhnlich visuell abgelesen werden und die durch Inaugenscheinnahme vorgenommenen Ablesungen nicht ohne weiteres auf eine Geschwindigkeits- bzw. Umsatz-Bestimmung anwendbar sind.
Die Pseudoperoxidasen weisen ebenfalls prostethische Gruppen auf, die, bei Entfernung, zu einer inaktiven Apo-Form der Peroxidase führen, der dann die Peroxidase-Aktivität fehlt. Wird beispielsweise Eisen-Hämatin vom Hämoglobin abgetrennt, wie durch eine Behandlung des Hämoglobins bei einem niedrigen pH-Wert, um das Eisen-Hämatin zu dissoziieren, worauf zur Abtrennung des Hämatins und Apo-Hämoglobins filtriert wird, ergibt sich eine inaktive Form von Hämoglobin, die reaktiviert werden kann, indem die Rekonstitution des Apo-Hämoglobins und des Eisen-Hämatins erleichtert werden. Die Übergangsmetalle, die einen Teil des Metall-Porphyrins darstellen, weisen eine Mischung von Valenzen in Reagenzien des in Frage kommenden Typs auf.
In Abstracts of the Histochemical Society (1979), Item 39, wird auf Seite 717 ein Immunoassay diskutiert, worin der Rekonstitutionsgrad von Apo-Enzymen mit aktiven Gruppen in An- oder Abwesenheit von Immuno- Komplexen wie von Häm-markiertem Antigen angewandt wird, welche bei Komplexierung mit Antikörper inhibiert werden, sich mit Apo-Peroxidase zu rekonstituieren (dass sie wiedererstellt werden).
JP-OS 8-224095 offenbart ein Assay-System für Cu&spplus;&spplus;, worin Cu&spplus;&spplus; zu APO-Galactose-Oxidase in der Gegenwart von D-Galactose und O&sub2; zur Erzeugung von H&sub2;O&sub2; gegeben wird, das mit einem oxidativen Kondensiermittel in der Gegenwart von Peroxidase reagiert, um einen chinoiden Farbstoff zu erzeugen, mit dem die Kupfer-Konzentration in der zu testenden flüssigen Probe kolorimetrisch gemessen wird.
Während über die Anwendung des Häm-Restes als Markierung für APO- Peroxidase in der Theorie von P. K. Nakanein, Univ. of Colo., Abstracts of the Histochemical Society, 39 (1979) nachgedacht wurde, wobei davon ausgegangen wurde, dass konjugiertes Hämatin-Antigen nicht ohne Weiteres in Apo-Peroxidase eingelagert werden könnte, wenn das Antigen an seinen entsprechenden Antikörper gebunden war, wurde ein Assay für Analyte in flüssigen Testproben unter Anwendung dieses Prinzips niemals in die Praxis überführt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Assay für einen Analyt in einer flüssigen Testprobe, wobei die flüssige Testprobe mit einem Hydroperoxid, einem Redox-Farbstoff, einer Apo-Peroxidase (oder Pseudo-Apo- Peroxidase) und seinem entsprechenden Metall-Prophyrin zusammengebracht wird, das an ein Analyt/Analyt-spezifisches Bindungspartner-Konjugat gebunden ist, das ein Gesamtmolekulargewicht aufweist, das genügend hoch ist, um dessen Porphyrin-Komponente daran zu hindern, sich erneut mit der Apo-Peroxidase zu verbinden. In dieser Form kann die Apo-Peroxidase nicht mit dem Hydroperoxid wechselwirken, um eine Farbreaktion im Redox-Farbstoff herbeizuführen. Allerdings gibt es bei Anwesenheit des Analyt eine Wechselwirkung zwischen dem Analyt und dem Analyt-spezifischen Bindungspartner, wodurch das Analyt/Analyt-spezifische Bindungspartner- Konjugat gebrochen und das Molekulargewicht des an das Metall-Porphyrin gebundenen Restes so Weit herabgesetzt werden, dass die Rekonstitution der Apo-Peroxidase und ihrer prosthetischen Gruppe inhibiert wird. Dadurch wird es ermöglicht, dass die Apo-Peroxidase und das Metall-Prophyrin rekonstituiert werden, um eine aktive Peroxidase zu bilden, die mit dem Hydroperoxid und dem Redox-Farbstoff wechselwirken kann, um eine Farbreaktion zu ergeben, deren Intensität direkt proportional zur Analyt- Konzentration in der flüssigen Testprobe ist.
Der Assay der vorliegenden Erfindung kann qualitativ angewandt werden, oder es können damit, unter Anwendung einer geeigneten Eichung, kolorimetrischer Farbstoffe und entsprechender Geräte für Genauigkeit und Präzision, halb-quantitative Ergebnisse erhalten werden.

Beschreibung der Erfindung

Metall-Porphyrine sind das Wirkzentrum peroxidativ wirksamer Proteine, und deren Entfernung wie durch Ansäuern und Abtrennung durch entweder Ultrafiltration oder Chromatografie führt zur Bildung von Apo- Peroxidasen, die keine Peroxidase-Aktivität aufweisen, aber reaktiviert werden können, wenn sie mit Metall-Porphyrinen vermischt werden, und dies sogar mit denjenigen, die an Antigene konjugiert sind. Antikörper-Bindung an diese Antigen-Metall-Porphyrin-Konjugate verhindert die Reaktivierung der Apo-Peroxidase, wenn diese Kombination ca. 180 K Dalton an Molekulargewicht übersteigt. Freies Antigen (Analyt) in einer flüssigen Testprobe, welcher der an das Antigen des Antigen/Metall-Porphyrin- Konjugats gebundene Antikörper zugefügt worden ist, konkurriert um die Antikörperbindung, um dadurch das Antigen-Metall-Porphyrin-Konjugat aus dem Antikörper im Mengenverhältnis zum in der flüssigen Testprobe vorliegenden Analyt freizusetzen. Im Fall von Antigen/Metall-Porphyrin-Konjugaten mit einem Gesamtmolekulargewicht von weniger als ca. 180 K Dalton reaktiviert das Antikörperfreie Konjugat die Apo-Peroxidase in die aktive Form. Die Aktivität der reaktivierten Peroxidase kann mit einem Redox-Indikator und einem Hydroperoxid bei einem pH-Wert von 1 bis 12 und vorzugsweise von 6,5 bis 8,5 nachgewiesen werden. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird eine Test-Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend:
i) einen Redox-Indikator und ein Peroxid sowie einen Puffer, um den pH-Wert bei einem optimalen Wert, abhängig vom verwendeten Metall und Redox-Indikator, von 1 bis 12 zu halten,
ii) das spezifische Bindungspartner (Analyt oder Bindungspartner dafür)/Metall-Porphyrin-Konjugat,
iii) die peroxidativ wirksame Substanz, der eine prosthetische Häm- Gruppe fehlt, d. h. Apo-Peroxidase, und
iv) Konjugat-Bindungsverbindungen.
Der Konjugat-Binder kann eine der zwei Formen aufweisen:
a) ist ein Antikörper an das Metall-Porphyrin gebunden, ist der Binder das Antigen oder das an ein größeres Molekül gebundene Antigen wie ein Protein, oder
b) ist ein Antigen an das Konjugat gebunden, kann der Binder ein Antikörper sein, oder es kann ein Antikörper, der mit einem größeren Molekül oder weiteren Biomolekülen verbunden ist, die ihrerseits wiederum das Antigen binden, verwendet werden. Ist beispielsweise LPS das Antigen, kann ein Lipoprotein hoher Dichte (HDL), das LPS bindet, verwendet werden. Ist IgG der Analyt, kann der Bindungspartner ein Komplementfaktor-Protein sein.
Beispiele von Antigen/Metall-Porphyrin-Konjugaten sind Metalle wie Fe, Mn, Cu und Co, Porphyrine wie Hämatin, Deteroporphyrin und Coproporphyrin und Antigene wie Proteine, niedermolekulare organische und Zellwand-Komponenten. Beispiele von Apo-Peroxidasen und -Pseudoperoxidasen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Apo- Peroxidase, Apo-Hämoglobin, Apo-Myoglobin, Apo-Cytochrom-C, Apo-Katalase und Apo-Lactoperoxidase.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Trocken-Reagens, das in einer neuen kolorimetrischen Technologie auf Basis einer konkurrierenden Apo-Peroxidase-Chemie angewandt wird, welche sich zur Messung von Komponenten mit kleinem und großem Molekulargewicht in biologischen Flüssigkeiten in Blut und Urin eignet. Typische Analyte betreffen Arzneimittel, Proteine und Zellen, d. h. Gram-positive und Gram-negative Bakterienzellen. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass Metall- Porphyrin-Konjugate nicht in Apo-Peroxidasen eingelagert werden, wenn sie durch einen Konjugat-Binder gebunden sind, solange der Konjugat-Binder- Komplex ein Molekulargewicht von mehr als ca. 180000 g/Mol aufweist. Es ist herausgefunden worden, dass die Konjugation von Verbindungen bis zu einem Molekulargewicht des Antikörpers (160000 g/Mol) die Apo-Peroxidase- Reaktivierung nicht störte, so dass der Konjugat-Binder-Komplex ein Antigen : Antikörper-Komplex sein kann, worin das Antigen der Analyt ist, dessen Vorliegen oder Konzentration analysiert werden, wobei der Antikörper ein spezifischer Bindungspartner für den Analyt ist. Spezifische Bindungspartner, die sich von Antikörpern unterscheiden, schließen Avidin/Biotin-Paare ein. Das Metall-Porphyrin-Konjugat kann beispielsweise aus einem Antikörper und einem Metall-Hämatin zusammengesetzt sein, worin der Konjuat-Binder (Ligand) ein Antigen wäre, das der Analyt oder ein Derivat davon ist, die vom Antikörper erkannt werden, wobei der Analyt das vom Antikörper erkannte Antigen ist. Weist die Antikörper-Antigen- Kombination ein vereinigtes Molekulargewicht von mehr als ca. 180 K Dalton auf, kann es nicht in die Apo-Peroxidase eingelagert werden, und es ergibt sich keine Peroxidase-katalysierte Reaktion. Werden allerdings das Konjugat, der Konjugat-Binder, eine Apo-Peroxidase und ein Hydroperoxid mit einer flüssigen Testprobe zusammengebracht, die einen Analyt enthält, erfolgt eine konkurrierende Reaktion, worin der Analyt in der Probe um die Bindung mit dem Antikörper konkurriert, der an das Antigen am Konjugat gebunden ist und in dem Maße, wie diese Konkurrenz Antikörper vom Konjugat abstreift und dadurch dessen Molekulargewicht auf unterhalb ca. 180 K Dalton herabsetzt, kann sich das Konjugat mit der Apo-Peroxidase verbinden, um ein aktives Enzym zu ergeben, das die Reaktion katalysiert, die benötigt wird, um die nachweisbare Reaktion zu ergeben. Das Ausmaß der Reaktion ist proportional zur Analyt-Konzentration in der Testflüssigkeit, wobei sich die Konzentration durch Vergleich mit Kalibrationskarten ermitteln lässt, die mit bekannten Analyt-Konzentrationen hergestellt sind. Eine ähnliche Reaktion wird beobachtet, wenn das Metall-Porphyrin mit einem Antikörper konjugiert ist, der spezifisch für das Antigen (den Analyt) ist, wobei der Binder der Analyt oder das Analyt-Derivat ist.
Das Verfahgren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird nun noch weiter durch die folgenden Verfahrensweisen und Beispiele erläutert.
A. Verfahrensweise zur Herstellung eines Reagens, das in den Beispielen IV und VII eingesetzt ist.
Trockenreagens-Papier wurde durch aufeinanderfolgende Imprägnierungen von Whatman 3MM mit einer wässrigen ersten Tauch-Lösung und einer zweiten Ethanol-Tauch-Lösung bei Trocknungstemperaturen von 100ºC über eine Dauer von 7 min hergstellt. Die erste Tauch-Lösung enthielt Puffer, während die zweite Tauch-Lösung den Redox-Indikator TMB und das Hydroperoxid DBDH enthielt.
Die erste Tauch-Lösung bestand aus 10 mL 73 mg/dL Hämatin-IgG, 1,0 mL 10 mg/mL Maus-Anti-Human-Kappa-Kette-Monoclonal-Antikörper, 0,66 g Glyceryl-2-phosphat, 4,2 uM Apo-Hämoglobin, 0,63 g 4-Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) als Puffer und aus 0,11 g Natriumdodecylsulfat (SDS) als oberflächenaktives Mittel. Der pH-Wert wurde auf 7,5 mit 1 N NaOH eingestellt.
Die zweite Tauch-Lösung enthielt 2,5 g Polyvinylpoyrolidon, 1,6 g DBDH und 0,795 g TMB in 100 mL Ethanol.
Die bevorzugte Konzentration und der zulässige Bereich jeder Tauch- Komponente sind in Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1 Apo-Peroxidase-Reagens
B. Die aus den obigen Tauch-Lösungen hergestellten Reagenspapiere wurden in Streifen geschnitten und in Urin getaucht, enthaltend verschiedene Hämatine aus einem Urin-Pool von 1,015 spezifischem Gewicht. Die Reflexion bei 660 nm, gemessen mit einem CLINITEKTM-200+-Gerät, erhalten 1 min nach dem Eintauchen, wurde als repräsentativ für die Reagens-Aktivität herangezogen.

Beispiel I - Nachweisgrenze-Studie

In diesem Beispiel wird Apo-Peroxidase mit Hämatin und Hämatin- Antigen-Konjugaten verglichen, um die nachweisbaren Konzentrationen und Effekte der Konjugation und des Antigen-Molekulargewichts auf die Apo- Enzym-Reaktivierungen zu bestimmen. Lösungen, enthaltend Kombinationen von Apo-POD, Fe&spplus;³-Hämatin und von Hämatin-Konjugat wurden bezüglich der Peroxidase-Aktivität getestet. Die Peroxidase-Aktivität wurde in Urin mit dem in Tabelle 3 angegebenen HEMASTIX®-Reagens gemessen. Dieses Reagens ähnelt dem in Tabelle 1 angegebenen, worin das Metall-Porphyrin-Konjugat, Konkurrenz-Binder und Apo-Peroxidase fehlen, welches aber Lepidin als einen Aktivator enthält. Die Ergebnisse dieser Nachweisgrenze-Studie sind in Tabelle 2 angegeben: Tabelle 2
Die Peroxidase-Aktivität von Hämatin (Fall A) oder von Antigen- Hämatin-Konjugat (Fall B) war bei einer Konzentration von 3,6 nM nicht nachweisbar. Die Apo-POD ergab auch keine Aktivität aus sich selbst (Fall E), wogegen die Peroxidase-Aktivität von Hämatin (Fall C) und von Antigen- Hämatin-Konjugat (Fall D) bei 3,6 nM in Anwesenheit der Apo-POD nachweisbar war. Dieses Beispiel belegt, dass nM Mengen über die Peroxidase- Reaktivierung mit der Redox-Indikator- und Hydroperoxid-Technologie nachgewiesen werden konnten, Welche eine Umsatzrate von 10&sup5; Mol DBDH/min und eine molare Farbstoff-Extinktion (TMB) von 10&sup5; aufweist. Die Konjugation des Hämatins mit Antigen störte die Apo-Enzym-Reaktivierung nicht. Tatsächlich ergab, in den Antigen-Hämatin-Konjugaten von Fall D, die Reaktivierung eine Reaktion, die bei 1 min so gross wie 25,0% R war, wie ermittelbar durch den Vergleich von 3,6 nM Apo-Peroxidase (Fall E) mit 3,6 nM Apo-Peroxidase : Antigen-Hämatin (Fall D). In überraschender Weise verhinderte die Konjugation von Antigenen bis zu einem Molakulargewicht von 160000 g/Mol (im Fall von IgG) die Reaktivierung der Apo-POD nicht. Die Reaktivierung war in 1 min vollständig (was die kurzen Gleichgewichtszeiten belegt), und sie war von Temperaturen von 20 bis 40ºC oder der Apo-POD- Konzentration nicht abhängig.

Verfahrensweise zum Nachweisgrenze-Versuch

Ein 10 uL Anteil Hämatin (3,6 uM, 0,23 mg/dL in Phosphat gepufferter Kochsalz-Lösung) oder ein 10 uL Hämatin-BJP-Los (3,6 uM, 8,61 mg/dL in Phosphat gepufferter Kochsalz-Lösung) wurden mit 10 uL Apo-POD (3,6 uM, 14,0 mg/dL in Phosphat gepufferter Kochsalz-Lösung) alle in 980 uL Phosphat gepufferter Kochsalz-Lösung vermischt und dann auf die gewünschte Konzentration mit weiterer Phosphat gepufferter Kochsalz-Lösung verdünnt. Die Lösung wurde 1 min lang bei 40ºC oder bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion von in die Test-Lösung getauchtem HEMASTIX®-Reagens wurde an einem CLINITEKTM-200-Reflexionsmessgerät gemessen. Die Reaktion des in Tabelle 1 angegebenen Reagens an der Phosphat-gepufferten Lösung allein betrug 65,2% Reflexion bei 1 min.
Apo-Meerrettich-Peroxidase wurde von Sigma Chemical Company aus St. Louis, MO, erhalten. Die Phosphat-gepufferte Lösung wurde durch Zugabe von 0,69 g monobasischem Natriumphosphat, 0,71 g dibasischem Natriumphosphat und von 0,45 g Natriumchlorid zu 100 mL Wasser hergestellt.

Verfahrensweise für einen Antigen-Reaktion-Versuch

Eine 10 uL Probe von Hämatin-BJP (Bence Jones-Protein) (3,6 uM, 8,61 mg/dL in Phosphat gepufferter Kochsalz-Lösung), anti-BJP (3,6 uM, 52,56 mg/dL in PBS) und von BJP (3,6 uM, 8,28 mg/dL in Phosphat-gepufferter Kochsalz-Lösung) wurde mit 10 uL Apo-POD (3,6 uM, 14,0 mg/dL in Phosphatgepufferter Kochsalz-Lösung und 960 L Phosphat gepufferter Kochsalz-Lösung vermischt. Die Lösung wurde 5 bis 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, und es wurde die Reaktion auf in die Test-Lösung getauchtes HEMASTIX®- Reagens mit einem KLINITEK®-200-Gerät gemessen. Die Reaktion des HEMASTIX ®-Reagens mit der Phosphat-gepufferten Kochsalz-Lösung, enthaltend Hämatin allein, betrug 65,7% Reflexion bei 1 min. Schaf-Anti-Human-BJB-Monoclonal- Antikörper wurde von The Binding Site Limited aus Birmingham, England, erhalten.
Das HEMASTIX®-Reagens, das bereits vorher mit der Zugabe von Lepidin und bei einem niedrigeren pH-Wert beschrieben wurde, als es mit der Formel von Tabelle 1 verglichen wurde, wurde auf dem Streifen in einem 2-Tauch- System der folgenden Zusammensetzung aufgebracht und in den Beispielen I bis IV eingesetzt. Tabelle 3

Beispiel II - Nachbarschaftseffekt

In diesem Beispiel wird die Antikörperbindung des Hämatin-Antigen- Konjugats gezeigt, um die Apo-Enzym-Reaktivierung zu verhindern (Tabelle 3). Die in Tabelle 3 angegebenen Daten wurden unter Anwendung der HEMASTIX ®-Formel mit Lepidin erzeugt, worin Apo-Peroxidase, Antigen-Hämatin-Antigen und Antikörper fehlten. Die letzteren wurden in Lösung vermischt, und es wurden Reagensstreifen mit der modifizierten HEMATIX®-Formel sofort in die Lösung getaucht und an einem CLINITEKTM-200+-Reflexionsspektrometer abgelesen.
Die Verhinderung der Apo-Enzym-Reaktivierung wurde beobachtet, solange der [Hämatin]-Antigen-Antikörper-Komplex ein Molekulargewicht von mehr als 180000 g/Mol aufwies. Demzufolge verhinderte Sulfamethazin plus Antikörper (Molekulargewicht 161000) die Apo-Enzym-Reaktivierung nicht. Allerdings verhinderte die Bindung von Sulfamethazin an Polyacrylsäure (PAA) (MG = 200000 g/Mol) die Reaktivierung des Apo-Enzyms, wie durch 51,5% R gezeigt, beobachtet für Lauf 10. Ebenfalls zeigte sich, dass ein Antigen (IgG-Mol. Gew. = 160000 und BJP-Mol. Gew. = 23000) in Urin durch seine Fähigkeit nachgewiesen werden konnte, Hämatin-Antigen [Antikörper]-Konjugat freizusetzen, um Apo-POD durch Brechen der Bindung zwischen dem Antigen und Antikörper zu reaktivieren. Tabelle 4

Beispiel III-Interferenz-Studie

In diesem Beispiel wurde ein Peroxidase-Nachweis-Trockenreagens mit Beständigkeit gegen 0,81 mg/dL Hämoglobin (oder Myoglobin) und gegen 25 mg/dL Ascorbat und genügend Empfindlichkeit zum Nachweis einer Apo- Peroxidase-Reaktivierung eingesetzt. Das Peroxidase-Nachweis-Reagens wurde hergestellt, indem der Lepidin-Aktivator im HEMASTIX®-Reagens entfernt und der pH-Wert auf 7,5 erhöht wurden. Ohne Modifikation verursachen Hämoglobin (oder Myoglobin) eine falsche Positiv-Reaktion. Ascorbat verursachte keine falsche Negativ-Reaktion im System wegen der Verwendung eines Ascorbat- Abfangsystems.
Das Reagens wurde durch Eintauchen in eine Lösung getestet, enthaltend die störende Substanz mit und ohne Fe-Hämatin. Diese Formulierungsänderungen beim HEMASTIX®-Reagens setzten auch die Empfindlichkeit des Reagens, die zum Nachweis der Apo-Peroxidase- Reaktivierung benötigt wird, von 3 nM in Beispiel I auf 12 uM im vorliegenden Beispiel III herab. Wie erwartet, wurden die 12 uM Hämatin durch die Zugabe von 12 uM Apo-POD aktiviert. Die Ergebnisse dieser Interferenz-Studie sind in der folgenden Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5
Aus Tabelle 5 ist ermittelbar, dass HEMATIX ® mit Lepidin von Hämoglobin oder Myoglobin gestört wird, wie gezeigt durch die 5,1% und 3,0% Reaktionen gegenüber 78,2 und 76,5.

Beispiel IV - Metall-Porphyrin-Studie:

In diesem Beispiel wurden weitere Metall-Porphyrine bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, unterschiedliche Typen von Apo-Peroxidasen zu reaktivieren. Metalle wie Fe, Cu, Mg, Zn, Ni, Mn, Co und Pd wurden an Hämatin komplexiert und zum Peroxidase-Nachweismittel gegeben. Metalle wie Mn, Fe, Cu und Co und Porphyrine, die sich von Hämatin unterschieden, d. h. Deteroporphyrin und Coproporphyrin, zeigten ebenfalls, dass sie die gewünschte Reaktion ergeben. Dies ist in Tabelle 6 durch die Kombination von Apo-Peroxidase mit Eisen- und Mangan-Porphyrin dargestellt, was zu einer Farbbildung (niedrigerere Prozent-R) verglichen mit Wasser führte. Die Apo-Pseudo-Peroxidase, Apo-Hämoglobin ergab ebenfalls, dass sie in diesem Versuch funktioniert Tabelle 6
Die Daten aus Tabelle 6 belegen, dass kein Metall-Porphyrin ohne Apo- Peroxidase oder Apo-Hämoglobin nachgewiesen wird, wie durch die Prozent- Reflexion in Spalte 1 mit > 66% R gezeigt. Die Zugabe von entweder Apo- Peroxidase oder von Apo-Hämoglobin verursacht eine Farbreaktion, wie durch die %R von < 56 in Spalten 1 und 3 gezeigt. Die Reaktion ist ähnlich für 3 unterschiedliche Porphyrine. Die Verwendung von Mn und Cu ergab Reaktionen ähnlich den für Fe erhaltenen, wie in Spalte 2 gezeigt. Die weiteren Metalle waren in diesem System nicht aktiv, da die Aktivität des Metalls vom besonderen Peroxid, pH und dem eingesetzten Redox-Indikator abhängt.

Beispiel V - Vollständiges Trocken-Reagens für IgG

In diesem Versuch wurde das Ascorbat- und Hämoglobin-beständige Reagens zum Nachweis der Peroxidase-Reaktivität mit Apo-Hämoglobin, Fe- Hämatin, konjugiert an Human-IgG und an Anti-Human-IgG, in 1 Reagens kombiniert (Tabelle 1). Wie in Tabelle 7 belegt, wies das vollständige Reagens IgG in Urin mit guter Korrelation zwischen der IgG-Konzentration in der Test-Lösung und der aufgenommenen Reaktion nach: Tabelle 7
Reagens enthielt 12 pH Fe-Hämatin-IgG, 12 pH anti-IgG und 12 pH Apo- Hämoglobin

Beispiel VI-Vollständiges Trocken-Reagens für Gram-negative Zellen

In diesem Beispiel wurde das Ascorbat- und Hämoglobin-beständige Reagens zum Nachweis der Peroxidase-Aktivität mit. Apo-Hämoglobin, konjugiertem Fe-Hämatin und mit einem Antikörper, spezfisch zu einem Anti- Kaninchen-Bakterium-Lipopolysaccharid (LPS), in 1 Reagens kombiniert. Das Fe-Hämatin-LPS-Konjugat wurde aus 16,3 LPS-Molekülen, gebunden an Ovar- Albumin, zusammen mit 5,2 Hämatin-Molekülen hergestellt. Wie in Tabelle 8 belegt, wies das vollständige Reagens bakterielle Zellen in Urin mit 3 Species nachzuweisender Gram-negativer Zellen nach. Da alle Gram-negativen Zellen LPS auf ihren Oberflächen aufweisen, ergibt diese technische Verfahrensweise ein Raster für Gram-negative Harntrakt Infektionen. Ein Specimen, enthaltend Gram-negative Zellen, würde die Bindung des LPS- Konjugats an den Antikörper brechen, da das LPS der Gram-negativen Zellen an den Antikörper gebunden wird. Das LPS-Konjugat ist dann frei, um sich mit Apo-Hämoglobin zu rekonstituieren, um seine aktive Form zu bilden, um eine nachweisbare Reaktion zu erzeugen. Tabelle 8
Der Antikörper war Kaninchen-Anti-E.coli-LPS, Katalog: #YBDB30506R: Los #G4520; Netto-Antisera; Accurate Chemical & Scientific Corporation of Westbury, NY.
Die folgenden Versuchsverfahren wurden in den folgenden Beispielen angewandt:

Verfahrensweise zur Herstellung eines Konjugats

Eine 868 uM Lösung von Hämatin in 0,1 N NaOH (55 mg/dL, 633,51 g/Mol) wurde zu einer 858 uM Lösung von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid in Acetonitril (19,4 mg/dL, 226 g/Mol) gegeben und 5 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung, enthaltend 25 uM des aktivierten Hämatins und 12 24 Antigen (entweder Human-Kappa-Bence Jones-Protein (BJP) mit 30 mg/dL oder Human- Gamma-Globulin (IgG) mit 200 mg/dL) wurde hergestellt und weitere 5 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Hämatin-Antigen-Konjugat wurde vom freien Antigen durch Zentrifugation bis zur Trockene an einer Amicon- Ultrafiltrationsmembran abgetrennt und anschließend mehrmals mit entionisiertem Wasser gewaschen. Das Hämatin-Konjugat läuft schwerfälliger durch die Membran als IgG oder BJP, was dazu führt, dass es im Konjugat an der Membran gesammelt wird. Nach der End-Wäsche wurde das Hämatin-Antigen- Konjugat in 175 mL entionisiertem Wasser aufgelöst. Die Reaktion war mit mehr als 64% vollständig gemäß Protein-Bestimmung mit dem Coomassie- Brilliantblau-Verfahren und enthielt 128 mg Protein/4,3 uM Konjugat.
Das Coomassie-Brilliantblau-Verfahren wurde durch Zugabe von 30 uL Probe zu 1,5 mL Bradford-Reagens (0,01 g Coomassie-Brilliantblau, 10 mL 85%-ige Phosphorsäure, 5 mL Ethanol und 85 mL Wasser) durchgeführt, wobei die Absorption bei 590 nm gemessen und mit einer Standard-Kurve der Protein-Konzentration verglichen wurde.

Verfahrensweise zur Herstellung von Apo-Hämoglobin

Eine 0,7%-ige Lösung von Hämoglobin wurde auf einen pH-Wert von 1,5 erniedrigt, worauf die sich ergebende Lösung durch eine 10 KDa Abschneidemembran ultrafiltriert und dann mehreren Spülungen mit Wasser unterzogen wurde. Filtriertes Material wurde in Wasser rekonstituiert. Das Apo-Hämoglobin lief durch den Filter, wogegen das dunkle Fe&spplus;&spplus;-Hämatin und Hämoglobin zurückblieben. Das Filtrat, wovon 440 mL gesammelt wurden, enthielt gemäß Assay 430 mg Protein (Apo-Hämoglobin) oder 23 uM. Das HEMASTIX®-Ergebnis war + für diese Lösung, was anzeigt, dass die Menge an Hämoglobin niedrig war. Die gesammelte Fraktion, die nicht durch den Filter lief, wurde in 75 mL Wasser aufgelöst und enthielt gemäß Assay 270 mg Protein. Es erzeugte ein HEMASTIX®-Ergebnis von +++++, was eine hohe Konzentration von Hämoglobin anzeigt.

Claims

1. Assay für einen Analyt in einer flüssigen Testprobe, wobei man die flüssige Testprobe mit einem Hydroperoxid und einem Redox-Farbstoff, zusammen mit einer Apo-Peroxidase oder Apo-Pseudoperoxidase und einem Metall-Porphyrin, das an ein Analyt/Analyt-spezifisches Bindungspartner- Konjugat gebunden ist, kombiniert, wobei das genannte Konjugat ein vereinigtes Molekulargewicht aufweist, das genügend hoch ist, die Rekonstitution der Apo-Peroxidase oder Apo-Pseudoperoxidase und des Metall- Porphyrins in der Abwesenheit von Analyt zu verhindern, eine solche Rekonstitution aber in der Anwesenheit von Analyt in der flüssigen Testprobe wegen der Wechselwirkung zwischen dem Analyt in der flüssigen Testprobe und dem Analyt-spezifischen Bindungspartner-Teil des Konjugats zu ermöglichen, welche das Konjugat bricht, um dadurch das Molekulargewicht des an das Metall-Porphyrin gebunden Rests herabzusetzen, bei welchem die Rekonstitution der Apo-Peroxidase und des Metall-Porphyrins inhibiert ist, so dass sich die Apo-Peroxidase und ihr entsprechendes Metall-Porphyrin rekonstituieren können, um eine aktive Peroxidase zu bilden, die mit dem Hydroperoxid und dem Redox-Farbstoff bei einem pH-Wert von ca. 1 bis 12 wechselwirkt, um eine Farbreaktion zu ergeben.

2. Assay gemäß Anspruch 1, worin das Analyt/Analyt-Bindungspartner- Konjugat ein Molekulargewicht von mindestens ca. 180 K Dalton aufweist.

3. Assay gemäß Anspruch 1, worin das Analyt/Analyt-spezifische Bindungspartner-Konjugat an das Metall-Porphyrin über den Analytspezifischen Bindungspartner gebunden ist.

4. Assay gemäß Anspruch 1, worin der Analyt-spezifische Bindungspartner ein Antikörper oder ein Fragment davon ist.

5. Assay gemäß Anspruch 1, worin das Analyt/Analyt-spezifische Bindungspartner-Konjugat an das Metall-Porphyrin über den Analyt gebunden ist.

6. Assay gemäß Anspruch 4, worin der Analyt eine bakterielle Zelle oder ein Teil davon ist.

7. Assay gemäß Anspruch 6, worin die bakteriellen Zellteile Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipoteichoinsäure (LPA) sind.

8. Assay gemäß Anspruch 1, worin das Hydroperoxid Cumol-, 5-Butylbenzol-, Diisopropylbenzol-, 1-Hydroxycyclohexan-1-, 2,5-Dimethylhexan-2,5- di-, Paramenthan-, 1,4-Diisopropylbenzol-, p-t-Butylisopropylbenzolhydroperoxid, 2-(α-Hydroperoxiisopropyl)-6-isopropylnaphthalin, Tetralinhydroperoxid oder eine Kombination davon ist.

9. Verfarhen gemäß Anspruch 1, worin der Farbstoff Benzidin, o-Toluidin, 3, 3',5,5'-Tetraalkylbenzidin, worin die Akylgruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, 9-Dianisidin, 2,7-Diaminofluoren, Bis(Nethylchinol-2-on)azin, (N-Methylbenzthiazolz-2-on)-(1-ethyl-3-phenyl-5- methyltriazol-2-on)azin oder eine Kombination davon ist.

10. Assay für einen Analyt in einer flüssigen Testprobe, wobei man eine flüssige Testprobe mit einem Reagens-System, umfassend ein Hydroperoxid und einen Redox-Farbstoff, zusammen mit einer APO-Peroxidase und einem Metall- Porphyrin, das an ein Analyt/Analyt-spezifisches Bindungspartner-Konjugat gebunden ist, kombiniert, wobei das Analyt/Analyt-spezifische Bindungspartner-Konjugat ein Molekulargewicht von mindestens ca. 180 K Dalton aufweist, um zu verursachen, dass die Apo-Peroxidase und das Metall- Porphyrin rekombinieren, um eine aktive Peroxidase in der Gegenwart des Analyt in der flüssigen Testprobe zu bilden, so dass sie mit dem Hydroperoxid und dem Redox-Farbstoff wechselwirken kann, um eine Farbreaktion zu ergeben.

11. Test-Kit zur Bestimmung eines Analyt in einer flüssigen Testprobe, wobei der Test-Kit umfasst:

i) einen Redox-Indikator und eine Peroxidase sowie einen Puffer, um den pH-Wert der flüssigen Testprobe bei einem Wert von 1 bis 12 zu halten, wenn der Puffer und die flüssige Testprobe zusammengebracht werden,

ii) einen Analyt oder ein Analyt-spezifisches Bindungspartner-Metall- Porphyrin-Konjugat,

iii) eine peroxidativ wirksame Substanz, der eine prosthetische Häm-Gruppe fehlt, und

iv) eine Konjugat-Bindungsverbindung.

12. Assay für das Vorliegen bakterieller Zellen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipotechoinsäure (LPA) auf der Zelloberfläche in einer flüssigen Testprobe aufweisen, wobei der Assay umfasst, dass man die flüssige Testprobe mit einem Hydroperoxid und einem Redox-Farbstoff, zusammen mit einer Apo-Peroxidase oder Apo- Pseudoperoxidase und einem Metall-Porphyrin, das an ein Konjugat von Anti- Hoch-Dichte-Lipoprotein (HDL) und HDL gebunden ist, kombiniert, wobei das Konjugat die Rekonstitution der Apo-Peroxidase oder Apo-Pseudoperoxidase und des Metall-Porphyrins in der Abwesenheit der Bakterien verhindert, eine solche Rekonstitution aber in der Anwesenheit der Bakterien in der flüssigen Testprobe wegen einer Wechselwirkung zwischen den Bakterien und dem HDL ermöglicht, welche das Konjugat bricht, wodurch es für das Metall- Porphyrin ermöglicht wird, sich mit der Apo-Peroxidases oder Apo- Pseudoperoxidase zu rekonstituieren, um eine aktive Peroxidase oder Pseudoperoxidase zu bilden, welche mit dem Hydroperoxid und dem Redox- Farbstoff bei einem pH-Wert von 1 bis 12 wechselwirken können, um eine Farbreaktion zu ergeben, die die Anwesenheit von Bakterien in der flüssigen Testprobe anzeigt.

13. Assay für das Vorliegen von IgG in einer flüssigen Testprobe, wobei der Assay umfasst, dass man die flüssige Testprobe mit einem Hydroperoxid und einem Redox-Farbstoff, zusammen mit einer Apo-Peroxidase und einem Metall-Porphyrin, das an ein Konjugat von Anti-IgG und Komplementfaktor- Protein gebunden ist, kombiniert, wobei das Konjugat die Rekonstitution der Apo-Peroxidase und des Metall-Porphyrins in der Abwesenheit von IgG verhindert, eine solche Rekonstitution aber in der Anwesenheit von IgG in der flüssigen Testprobe wegen der Wechselwirkung zwischen den Gramnegativen Bakterien und dem Komplementfaktor-Protein ermöglicht, wobei es durch das Brechen für das Metall-Porphyrin ermöglicht ist, sich mit der Apo-Peroxidase zu rekonstituieren, um eine aktive Peroxidase zu bilden, die mit dem Hydroperoxid und dem Redox-Farbstoff bei einem pH-Wert von 1 bis 12 wechselwirken kann, um eine Farbreaktion zu ergeben, die das Vorliegen des IgG in der flüssigen Testprobe anzeigt.