DE3485968T2

DE3485968T2 - Spezifischer Bindungstest.

Info

Publication number: DE3485968T2
Application number: DE84305823T
Authority: DE
Inventors: John P Fox; Eddie Hedaya; Violet Lippman
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1983-09-01
Filing date: 1984-08-24
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2004-08-25
Also published as: JPS6078350A; EP0140521A3; US4713324A; DE3485968D1; AU588520B2; AU3198984A; EP0140521A2; CA1231048A; JPH061275B2; EP0140521B1

Description

Die Erfindung betrifft spezifische Bindungstests, insbesondere Immunoassays zur Bestimmung von Substanzen von klinischem Interesse. Die Entwicklung der Techniken der spezifischen Bindungstests führte zu äußerst nützlichen analytischen Verfahren zur Bestimmung verschiedener organischer Substanzen von diagnostischer, medizinischer, umweltschützerischer und technischer Bedeutung, die in flüssigen Medien in sehr niedrigen Konzentrationen auftreten. Spezifische Bindungstests beruhen auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Liganden, d. h. einem bindungsfähigen zu bestimmenden Analyten, und einem Bindungspartner, d. h. einem Rezeptor, dafür. Die Anwesenheit des Rezeptors kann dazu benutzt werden, eine mechanische Abtrennung von gebundenem und ungebundenem markiertem Analyten zu erreichen, oder sie kann die Markierung derart beeinflussen, daß das erfaßbare Signal moduliert wird. Die erstgenannte Situation wird normalerweise als heterogen und die letztgenannte als homogen bezeichnet, da die letztgenannte Technik einen Abtrennungsschritt vermeidet. In den Fällen, in denen einer der beiden Teilnehmer an der spezifischen Bindung (Ligand und Bindungspartner) ein Hapten oder Antigen und der andere ein entsprechender Antikörper ist, ist der Test als Immunoassay bekannt. Vergleiche allgemein Odell und Daughaday (Hrsg.), Principles of Competitive Protein-Binding Assays, J.B. Lippincott Co., Philadelphia (1971).
In herkömmlichen Techniken für spezifische Bindungstests mit einem markierten Konjugat wird eine Probe des flüssigen zu untersuchenden Mediums mit unterschiedlichen Reagenzzusammensetzungen kombiniert. Derartige Zusammensetzungen umfassen ein markiertes Konjugat, das eine mit einer Markierung versehene bindende Komponente enthält. Die bindende Komponente in dem Konjugat bildet - gegebenenfalls mit anderen Bestandteilen der Reagenzzusammensetztung - und dem Liganden die Bestandteile des zu analysierenden Mediums unter Ausbildung eines Bindungsreaktionssystems, das zwei Arten oder Formen des Konjugats erzeugt, beispielsweise eine gebundene Form (Konjugatkomplex) und eine freie Form. Bei der gebundenen Form ist die bindende Komponente, beispielsweise ein Hapten oder Antigen, des Konjugats durch einen entsprechenden Bindungspartner, beispielsweise einen Antikörper, gebunden, während bei der freien Form die bindende Komponente nicht derart gebunden ist. Die relative Menge oder der Anteil des Konjugats, die bzw. der in der gebundenen Form vorliegt, verglichen mit der Menge der freien Form, ist eine Funktion der Anwesenheit (oder der Menge) des in der zu analysierenden Probe zu bestimmenden Liganden.
Viele Eigenschaften von natürlichen Zellmembranen lassen sich in einfachen doppelschichtigen Lipidsystemen, sogenannten Liposomen, nachahmen. Eine dieser Eigenschaften ist die Lyse. Die Lyse kann durch herkömmliche chemische Mittel, wie beispielsweise Detergentien, oder durch immunologische Reaktionen erzielt werden. Wenn eine vesiculare Membran, wie beispielsweise eine Liposommembran, ein von außen zugängliches Antigen enthält, wird dies mit dem entsprechenden Antikörper reagieren und Agglutination hervorrufen. Wenn das mit dem Antigen sensibilisierte Liposom mit dem entsprechenden Antikörper in Gegenwart von Komplement reagiert, wird die Membran irreversibel geschädigt und kann nicht länger als intakte Barriere mit selektiver Permeabilität funktionieren. Dies ist Immunolyse. Das Ausmaß der Immunolyse ist messend verfolgt worden, indem man sich mit Antigenen sensibilisierter Liposome bediente, die Markierungsmoleküle eingeschlossen enthielten, welche nach der Immunolyse in Freiheit gesetzt werden.
Die Lyse von Liposomen ist unter Verwendung einer großen Anzahl verschiedener Markierungssysteme untersucht worden. Eine Art von Markierungssystemen, die sich keiner außerhalb des Liposoms befindlicher auf Markierungen reagierender Reagenzien bedient, ist bekannt; dabei umschließt das Liposom eine Elektronenspinresonanz-Markierung, wie beispielsweise ein stabiles freies Radikal, wie Tempocholin. Tempocholin ist wasserlöslich, jedoch nicht membrandurchgängig, weshalb es innerhalb von Liposomen oder Vesikeln eingeschlossen werden kann und nicht durch Lipiddoppelschichten hindurchwandert. Das innerhalb von Liposomen eingeschlossene Tempocholin erzeugt ein charakteristisches breites paramagnetisches Resonanzsignal von geringer Amplitude. Dies erfolgt deshalb, weil eine hohe Konzentration an Spinmolekülen vorliegt, die zufolge ihrer dichten Nachbarschaft zueinander Signale austauschen. Wenn die Liposommembranen zerrissen werden, wie beispielsweise durch die Aktivierung von Komplement, werden die Tempocholinmoleküle in Freiheit gesetzt und im äußeren Medium verdünnt. Dies resultiert in einer leicht erfaßbaren qualitativen und quantitativen Veränderung im paramagnetischen Resonanzspektrum. Bumphries, G. M. und McConnell, H. M., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72: 2483-2487 (1975). Siehe auch Wei et al., J. Immunol. Methods, 9 : 165-170 (1975); Chan et al., J. Immunol. Methods, 21 : 185-195 (1978); und Hsia et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 308 : 139-148 (1978). Ein weiteres Markierungssystem, das sich keiner außerhalb des Liposoms befindlicher, mit Markierungen umsetzbarer Reagenzien bedient, verwendet eine Zusammensetzung, die einen Fluoreszenzfarbstoff, wie beispielsweise 1-Aminonaphthalin-3,6, 8-trisulfonat, sowie einen Fluoreszenzlöscher, wie beispielsweise a,a'-Dipyridinium-p-xylol-dibromid, innerhalb des Liposoms eingeschlossen enthält. Fluoreszenzfarbstoff und Fluoreszenzlöscher gelangen nach der Immunolyse des Liposoms ins Freie, und ihre nachfolgende Verdünnung in dem äußeren Volumen beseitigt die Löschung, so daß ein stark fluoreszierendes Signal resultiert. Siehe Smolarsky et al., J. Immunol. Methods, 15 : 255-265 (1977) und Geiger et al., J. Immunol. Methods, 17 : 7-19 (1977).
Eine andere Art von Markierungssystem bedient sich einer Elektrode in dem Reaktionsmilieu außerhalb des Liposoms. Ein Beispiel dafür ist die Verwendung eines Kaliumionen enthaltenden Liposoms. Die Kaliumionen gelangen nach Immunolyse des Liposoms in Freiheit und reagieren mit einer ionenselektiven Elektrode in dem äußeren Milieu. Siehe Katsu et al., Chem. Pharm. Bull, 30: 1504-1507 (1982). Gleichfalls wurden Tetrapentylammoniumionen in Liposomen eingeschlossen und nach Immunolyse unter Verwendung einer ionenselektiven Elektrode erfaßt. Desgleichen wurden Schaf-Erythrocyten Ghosts (Membranen) mit Trimethylphenylammoniumionen beladen und die Lyse mit einer ionenselektiven Elektrode erfaßt: D'Orazio et al., Anal. Chem. 49: 2083 (1977) und D'Orazio et al., Anal. Chem. Acta. 25: 109 (1979).
Eine der ersten Arten von Markierungssystemen, von denen berichtet worden ist, bedient sich eines Substrats, das innerhalb des Liposoms oder der Erythrocytenmembranvesikel eingeschlossen ist. Nach Immunolyse des Liposoms gelangt das Substrat nach außen und reagiert mit einer enzymhaltigen Zusammensetzung im Außenraum, wobei eine erfaßbare Reaktion erzeugt wird. Bei den frühen Beispielen dieser Art wird Glucose verwendet, die in dem Liposom eingeschlossen ist. Die Glucose gelangt nach der Immunolyse ins Freie, und ihre Freisetzung aus den Liposomen wird durch das Ansteigen der Absorption bei 340 nm gemessen, das nach Reduktion von NADP&spplus; in Gegenwart von Hexokinase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase und den erforderlichen Kofaktoren erfolgt. Siehe Hixby et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 64 : 290-295 (1969; Kinsky et al., Biochemistry, 8 : 4149-4158 (1969); Kinsky et al., Biochemistry, 9 : 1048 (1970). Bei einem neueren Beispiel dieser Art von System wird ein fluorogenes Substrat (Umbelliferonphosphat) oder ein chromogenes Substrat (p-nitrophenylphosphat) in dem Liposom eingeschlossen. Das Substrat gelangt nach Immunolyse des Liposoms in Freiheit und setzt sich mit einem Enzym (alkalische Phosphatase) in dem äußeren Volumen um. Es wird freies Substrat hergestellt, was zu einem erhöhten Signal führt.
Siehe Six et al., Biochemistry, 13 : 4050 (1974); Uemura et al., J. Biochem. 87 : 1221 (1980) und Uemura et al., J. Immunol. Methods, 53:221-232 (1982).
Die Lyse einschließlich der Immunolyse von Liposomen, die im Inneren eingeschlossene Enzyme als Markierungssubstanzen aufweisen, ist ebenfalls bekannt. Das Enzym reagiert mit dem Substrat in dem äußeren Reaktionsmilieu, was zu einer erfaßtbaren Reaktion führt. Beispielsweise wurden Versuche durchgeführt, bei denen eingeschlossene Enzymmarkierungsstoffe einschließlich Hexokinase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase und B-galctosidase verwendet wurden. Siehe Kataoka et al., Biochem. Biophys. Acta, 298 : 158-179 (1973). Außerdem kann Neerrettichperoxydase in dem Liposom eingeschlossen werden. Die Peroxydase gelangt nach Immunolyse ins Freie und katalysiert die folgende Umsetzung:
Durch die Oxidation von NADH und der daraus folgenden Bildung von Wasser wird Sauerstoff verbraucht. Die Abreicherung von Sauerstoff wird mit einer Sauerstoffelektrode erfaßt. Siehe Haga, Biochem. Biophys. Res. Comm., 95: 187- 192 (1980).
Mehrere Literaturstellen berichten über die Verstärkung der enzymatischen Aktivität nach der Lyse von enzymhaltigen Liposomen. Beispielsweise berichten Solomon et al., Biochem. Biophys. Acta, 455 : 332-342 (1976) über diese Beobachtung nach Lyse von Glucoseoyidase enthaltenden Liposomen durch entweder Ultraschallbehandlung oder Exposition gegenüber einem Detergens. Die enzymatische Aktivität der eingeschlossenen Glucoseoxidase diente als Maß für die Permeabilität der doppelschichtigen Membran der Liposomen gegenüber Glucose in einem Test, bei dem keine Abtrennung notwendig ist. Die Glucoseoxidation wurde in demselben Reaktionsgemisch vor und nach der Lyse des enzymhaltigen Liposoms durch das Detergens aufgrund der Sauerstoffaufnahme Bit Hilfe einer Sauerstoffelektrode messend verfolgt. Die beobachtete enzymatische Aktivität war nach der Lyse 4,60 mal größer, als sie vor der Lyse war.
Tokunaga et al., FEBS Letters, 106 : 85-88 (1979) berichten über eine in-vitro-Methode, bei der keine Abtrennung erfolgt, zur Bestimmung der Permeabilität von Liposomen, die alkalische Phosphatase, a-glucosidase und a-galactosidase enthalten. Die enzymatische Aktivität wurde bestimmt, indem man Substrat und eine gekuppelte Enzymreaktion in demselben Reaktionsgemisch vor und nach der Lyse durch ein Detergens verwendete. Unter Verwendung von alkalischer Phosphatase war die beobachtete enzymatische Aktivität 17,5 mal größer nach der Lyse, als sie vor der Lyse gewesen war. Diese Autoren behaupten, daß, falls der Km-Wert des im einzelnen verwendeten Enzyme Substrat- Paares sowohl innerhalb als auch außerhalb des Liposoms gleich ist, die intravesikulare Enzymaktivität mit der scheinbaren Geschwindigkeit der Substratpermeabilität in Beziehung gesetzt werden könne.
Magee et al. J. Cell Biology, 63 : 492-504 (1974) haben Meerrettichperoxidase enthaltende Liposomen verwendet. Die enzymatische Aktivität von Meerrettichperoxidase wurde spektrofotometrisch in demselben Umsetzungsgemisch vor und nach der Lyse durch ein Detergens bestimmt. Die Verhältnisse von beobachteter enzymatischer Aktivität vor der Lyse zu der nach der Lyse betrugen 8,3. Sie bemerken, daß Liposomen als nützliche Modelle für Membranen in Permeabilitätsstudien angesehen wurden, weil sie gegenüber Polyenantibiotika empfindlich sind und der Immunolyse unterliegen.
Mehrere verschiedene homogene spezifische Bindungstestsysteme mit markiertem Konjugat sind bekannt, von denen eines von Ullman et al. im US-Patent 4 193 983 beschrieben ist. Bei diesem Assaysystem sind eine Markierung und ein Ligand oder ein Ligandenanaloges nichtkovalent an die äußere Oberfläche eines kolloidalen Teilchens, wie beispielsweise eines Liposoms, gebunden, das in der Lage ist, seine Integrität in einer wäßrigen Umgebung beizubehalten. Das diskrete kolloidale Teilchen dient als Kern, der den Liganden oder sein Analoges und die Markierung in einer im wesentlichen fixierten mittleren räumlichen Beziehung zueinander hält. Dadurch, daß Markierung und Ligand in relativ dichter Nachbarschaft auf der Oberfläche des Teilchens angeordnet sind, kann die Nachbarschaft der Markierung und des Rezeptors, der an den Liganden angrenzend an die Markierung gebunden ist gemäß Methoden des Standes der Technik dazu verwendet werden, das von der Markierung ausgehende Signal zu modulieren. Eine Immunolyse ist nirgendwo vorgeschlagen. Vielmehr ist es die klare Lehre dieser Literaturstelle, daß eine Lyse der Vesikel die räumliche Beziehung (Nachbarschaft) von Markierung und Ligand, die für dieses Testverfahren erforderlich ist, beeinträchtigen würde.
Es sind auch schon spezifische Bindungstestsysteme vorgeschlagen worden, die eine mehrschichtige Lipidmembranvesikel verwenden, die derart behandelt oder vorbereitet worden ist, daß sie einen an die Oberfläche gebundenen Liganden oder ein an die Oberfläche gebundenes Ligandenanaloges und eine Markierung oder eine Reagenzsubstanz eingeschlossen enthält. Die übrigen Reagenzien für den Test umfassen: (1) einen Bindungspartner, beispielsweise einen Antikörper für den Liganden und (2) Komplement zur Bewirkung von Lyse der Vesikel nach Bindung des Bindungspartners an den an die Oberfläche gebundenen Liganden. Allgemein siehe hierzu McConnell, U.S.-Patent 3 850 578 und McConnell et al., U.S.-Patent 3 887 698 und Gregoriadis et al., Liposomes in Biological Systems, John Wiley & Sons, N.Y. (1980), insbesondere Kap. 12 mit dem Titel "Liposomes as Diagnostic Tools".
Im einzelnen sind Immunoassaysysteme bekannt, bei denen die Verwendung von Enzyme einkapselnden Liposomen angeregt wird. Hsia et al., U.S.-Patent 4 235 792 beschreibt eine kompetitive homogene Immunoassaymethode, bei der die Immunolyse eines mit einem Antigen sensibilisierten Liposoms, das eine Markierungssubstanz enthält, angewandt wird. Enzyme sind unter den Markierungsstoffen offenbart (Spalte 6, Zeilen 24-28).
Cole U.S.-Patent 4 342 826 offenbart einen spezifischen Bindungstest unter Verwendung von mit Antigen sensibilisierten, enzymhaltigen Liposomen. Diese Liposome werden immunspezifisch dazu veranlaßt, nach Bindung eines entsprechenden Antikörpers und Fixierung von aktivem Komplement Enzym freizusetzen. Nach der Freisetzung des Enzyms wird das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von enzymatischer Aktivität bestimmt. Cole betont den Vorteil des Zurverfügungstellens eines homogenen Systems, in dem die enzymatische Aktivität nach der Lyse wesentlich größer ist, beispielsweise zu einem Signal/Rauschen-Verhältnis von mindestens 5 bis 10 und vorzugsweise über 60 führt.
Jede der genannten Annäherungen an vesikuläre Markierungssysteme hat einen Fortschritt der einen oder anderen Art beim Maskieren von Markierungssubstanz vor dem Reaktionsmedium und damit beim Minimieren der Erzeugung eines Signals (Latenz) vor der Immunolyse herbeigeführt. Das heißt, das von intakten Liposomen beobachtete Signal ist beträchtlich geringer als das von lysierten Liposomen. Wie durch die Literaturstellen gezeigt, ist dieses Ziel weitgehend als Hauptpunkt bei der Verbesserung von Liposomen-Immunoassays angesehen worden. Außerdem war die kombinierte Lehre der Literatur auf diesem Gebiet diejenige, daß die zu erzielenden Vorteile vergrößert werden, wenn eine vollständige Maskierung vor der Lyse mit der Herstellung eines Signals von hoher Intensität nach der Immunolyse kombiniert wird.
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Verfahren und gemäß der vorliegenden Erfindung ist gefunden worden, daß bestimmte Markierungssubstanzen enthaltende Liposomen im intakten Zustand ein Signal von hoher Intensität erzeugen und ein geschwächtes oder gar gelöschtes Signal (umgekehrte Latenz) nach Lyse oder Veränderung der Membranpermeabilität. Die vorliegende Erfindung benutzt die Kombination einer Vesikel mit ausgewählten Reagenzien, so daß bestimmte Reagenzien außerhalb der Vesikel vor jeglicher Veränderung der Vesikel Zugang zu dem eingeschlossenen Markierungsstoff haben und die Veränderung der Vesikel Zugang durch andere Reagenzien oder Komponenten der Testzusammensetzung gewährleistet. Vorteile, die gemäß der vorliegenden Erfindung erzielt werden können, sind unter anderem erhöhte Empfindlichkeit von mindestens bis zum Bereich von etwa 10&supmin;¹&sup8;-molaren (M) Bestimmungen von Liganden in Serumproben, Verminderung von Serumstörungen, Einfachheit der Protokolle für homogene spezifische Bindungstests sowie Anwendbarkeit auf einen breiteren Bereich von hoch- und niedrigmolekularen Liganden (Analyten), als es bei homogenen Tests bisher möglich war.
Die obigen Vorteile werden mit einer Testzusammensetzung zur Bestimmung eines Liganden in einer Probe erzielt, wobei die Zusammensetzung folgende Bestandteile umfaßt
(a) einen Bindungspartner für den Liganden,
(b) ein Erfassungssystem, das mindestens zwei Komponenten aufweist,
(c) eine selektiv zugängliche Vesikel mit einem darin enthaltenen in der Oberfläche vorhandenen Liganden oder Ligandenanalogen und einer darin enthaltenen ersten Komponente des Erfassungssystems,
(d) eine Substanz, die die Zugänglichkeit der Vesikel als Reaktion auf die Bindung des in der Oberfläche vorhandenen Liganden oder Ligandenanalogen und des Bindungspartners modifiziert, und
(e) mindestens eine zusätzliche Komponente des Erfassungssystems, die mit der ersten Komponente unter Erzeugung eines erfaßbaren Signals reagieren kann, das durch Anlagerung des Bindungspartners und der die Vesikel modifizierenden Substanz an die Vesikel verkleinert wird.
Gemäß der Erfindung wird außerdem eine spezifische Bindungstestmethode zur Bestimmung eines Liganden in einer Probe angegeben, wobei die Methode darin besteht, daß man die Testzusammensetzung gemäß der Erfindung mit einer Probe vereinigt, die vermutlich den Liganden enthält, und eine Veränderung in dem erfaßbaren Signal beobachtet. Vorzugsweise umfaßt die Stufe der Vereinigung die Herstellung eines Gemisches aus einer Probe, die vermutlich den Liganden enthält, einem Bindungspartner für den Liganden, einem lumineszierenden Reagenz, Komplement und einem mit dem Liganden sensibilisierten, peroxidasehaltigen Liposom; Bebrütung des Gemisches und Vereinigung des Gemisches mit Wasserstoffperoxid. Die Lumineszenz des Gemisches wird nach Vereinigung mit dem Wasserstoffperoxid beobachtet. Die Erhöhung der Intensität und der Dauer des lumineszierenden Ausgabesignals steht in direkter Beziehung zu und ergibt sich aus der erhöhten Ligandenkonzentration in der Probe. Diese Verstärkung des Signals ist mit der verminderten Verfügbarkeit des Bindungspartners für die Bindung an die Liposomoberfläche sowie für die Initiierung von Komplementfixierung an die Liposomoberfläche verbunden. Wie oben erwähnt, steht dies im Gegensatz zu den Signalreaktionen, wie sie früher beobachtet wurden, bei denen ein schwächeres Signal bei höherer Ligandenkonzentration in der Probe beobachtet worden ist.
Wie oben erwähnt, weisen die Liposomen gemäß der Erfindung im intakten Zustand eine höhere Lumineszenz auf als im lysierten. Diese Erscheinung bietet die Grundlage für einen nützlichen und neuen homogenen Immunoassay, wenn derartige Liposomen durch Liganden oder Ligandenanaloge sensibilisiert werden. Diese können mit spezifischen Bindungspartnern, wie Antikörpern, in Wechselwirkung treten, um eine Zusammensetzung zu ergeben, die in Anwesenheit von Komplement lysiert wird. Eine derartige Lyse führt zu verringerter Lumineszenz. Andererseits steht der Ligand in der Probe mit dem sensibilisierten Liposom im Wettbewerb um verfügbare Antikörper, und in dem Ausmaß, in dem ein derartiger Wettbewerb auftritt, wird die durch Komplement induzierte Lyse verringert. Daher kann eine Dosis/Antwort-Kurve konstruiert werden, die die erhöhte Lumineszenzintensität mit der erhöhten Ligandenkonzentration in der Probe in Beziehung bringt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen eine lumineszierende Reagenzzusammensetzung für einen spezifischen Bindungstest sowie ein Verfahren zur Anwendung der Testzusammensetzung gemäß der Erfindung. Spezifische Ausdrücke in der folgenden Beschreibung, die sich lediglich auf eine bestimmte Ausführungsform beziehen, sind für alle Ausführungsformen exemplarisch, sofern nicht anders angegeben.
Probenfluide, mit denen Tests durchgeführt wurden, sind beispielsweise biologische, physiologische, technische sowie für den Umweltschutz entnommene Arten von Flüssigkeiten. Von besonderem Interesse sind biologische Fluide, wie beispielsweise Serum, Plasma, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Milch, Brühe und andere Kulturmedien sowie überstehende Flüssigkeiten, als auch Fraktionen der genannten Fluide. Physiologische Fluide von Interesse sind beispielsweise Infusionslösungen, Puffer, Konservierungs- oder antimikrobielle Lösungen und dergleichen. Technische Flüssigkeiten sind beispielsweise Gärungsflüssigkeiten sowie andere verbrauchte Verfahrensflüssigkeiten, wie sie beispielsweise bei der Herstellung von Arzneimitteln, Molkereiprodukten und Malzgetränken anfallen. Andere Quellen für Probenfluide, die nach herkömmlichen Verfahren untersucht werden, sind als ebenfalls unter diesen verwendeten Begriff fallend anzusehen und können ebenfalls gemäß der Erfindung getestet werden.
Der Ausdruck "Ligand" bezieht sich auf jede Substanz oder Klasse verwandter Substanzen, deren Anwesenheit qualitativ oder quantitativ in der Probe eines Fluids, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, bestimmt werden soll. Der vorliegende Test kann auf die Ermittlung von Liganden angewandt werden, für die ein spezifischer Bindungspartner existiert, und umgekehrt für die Ermittlung der Fähigkeit eines flüssigen Mediums, einen Liganden zu binden (gewöhnlich zufolge des Vorhandenseins eines Bindungspartners für den Liganden in der Probe). Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für das ein spezifischer Bindungspartner existiert oder durch immunologische oder synthetische Mittel zur Verfügung gestellt werden kann. Der Ligand, funktionell betrachtet, wird gewöhnlich aus Antigenen und dazugehörigen Antikörpern, Haptenen und dazugehörigen Antikörpern sowie aus Hormonen, Vitaminen, Stoffwechselprodukten und pharmakologischen Mitteln sowie ihren Rezeptoren und Bindungssubstanzen ausgewählt. Spezifische Beispiele für Liganden, die unter Anwendung der Erfindung bestimmt werden können, sind Hormone, wie Insulin, Choriogonadotropin, Thyroxin, Tr&ijlig;odthyronin, fullikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, thyroidstimulierendes Hormon und Estriol; Antigene und Haptene, wie Ferritin, Bradykinin, Prostagladine und tumorspezifische Antigene; Vitamine, wie Biotin, Vitamin B&sub1;&sub2;, Folsäure, Vitamin E, Vitamin A und Ascorbinsäure; Stoffwechselprodukte, wie 3',5'-Adenosinmonophosphat und 3',5'-Guanosinmonophosphat; pharmakologische Mittel oder Drogen, wie Aminoglycosidantibiotika wie Gentamicin, Amikacin und Sisomicin oder Suchtdrogen wie die Opiumalkaloide und Ergotderivate; Antikörper, wie mikrosomale Antikörper und Antikörper gegenüber Hepatitis und Allergenen; sowie spezifische Bindungsrezeptoren, wie Thyroxin bindendes Globulin, Avidin, Intrinsic-Factor und Transcobalamin.
Die Ausdrücke "Bindungspartner" oder "Rezeptor" beziehen sich auf jede Substanz oder Substanzklasse, die eine spezifische Bindungsaffinität zu dem Liganden aufweist, bei der der Ligand vor anderen Substanzen bevorzugt ist. In der Mehrzahl der Ausführungsformen umfaßt die Erfindung Reagenzien für spezifische Bindungstests, wobei die Reagenzien mit dem Liganden oder seinen bindenden Ausführungsorganen in der Probe immunchemisch reagieren. Das heißt, es besteht eine Antigen/Antikörper- oder Hapten/Antikörper-Beziehung zwischen Reagenzien und bzw. oder dem Liganden oder seinen bindenden Ausführungsorganen in der Probe. Diese Tests werden daher Immunoassays genannt, und die spezielle Wechselwirkung zwischen dem Liganden und seinem Rezeptor oder Bindungspartner ist die immunchemische Bindung. Monoclonale Antikörper sind besonders geeignete Rezeptoren. Jedoch ist es für den Fachmann selbstverständlich, daß auch andere Bindungswechselwirkungen zwischen dem Liganden und dem Bindungspartner die Grundlage für spezifische Bindungstests bilden können, wie beispielsweise die Bindungswechselwirkungen zwischen Hormonen, Vitaminen, Stoffwechselprodukten und pharmazeutischen Mitteln und ihren entsprechenden Rezeptoren und Bindungssubstanzen. Beispielsweise werden Polypeptidhormon-Rezeptoren als Bindungsmittel oder Partner in Langan et al., (Hrsg.), Ligand Assay, Masson Publishing U.S.A. Inc., New York, Seiten 211 f. (1981) erörtert.
Der Ausdruck "selektiv zugängliche Vesikel" bezieht sich auf eine ein- oder mehrkammerige Hülle, die ein inneres Volumen umschließt und eine Wand besitzt, die aus einer oder mehreren Komponenten zusammengesetzt ist und eine oder mehrere innere Kammern bildet, die das Innenvolumen ergeben. Ein Beispiel für eine derartige Vesikel ist ein Zellghost, der dadurch gebildet wird, daß man eine Zellmembran öffnet, die inneren Komponenten der Zelle entfernt und die Membran erneut schließt. Ein weiteres Beispiel ist ein Liposom, eine ein- oder mehrkammerige Vesikel, die aus Lipiden, insbesondere Lipidgemischen einschließlich mindestens eines Phosphorlipids, die eine kontinuierliche Wand oder eine doppelschichtige Lipidmembran bilden, besteht. Ein gemeinsamer Bestandteil dieser Lipidgemische ist Cholesterin. Es ist beobachtet worden, daß Lipidgemische, die etwa 10 bis 40% (Mol Cholesterin/ Mole Gesamtlipid) enthalten, dazu verwendet werden können, Liposomen herzustellen, die bei der Zusammensetzung und dem Verfahren gemäß der Erfindung nützlich sind. Liposomen können nach einer beliebigen von einer Vielzahl von Methoden hergestellt werden. Beispielsweise können mehrlamellare Vesikeln (MLVs) durch Dünnschichtverdampfung und Hydratisieren des Lipidfilms hergestellt werden. Außerdem können Phasenumkehrverdampfungs-Vesikeln (REVs) hergestellt werden. Diese Techniken sind exemplarisch für die Herstellung einsatzfähiger Vesikeln. Hinsichtlich eines allgemeinen Überblicks über Liposomen und ihre Bildung wird auf Papahadjopoulos et al. (Hrsg.), Liposomes, Ann. N.Y. Acad. Sci., Band (1978); Tom et al. (Hrsg.), Liposomes and Immunobiology, Elsevier North Holland Inc., N.Y. (1980); und Gregoriadis et al., Liposomes in Biological Systems, John Wiley & Sons, N.Y. (1980) verwiesen.
Liposomen können so hergestellt werden, daß sie in ihrer Oberfläche Reste von Liganden oder Ligandenanalogen eingeschlossen enthalten. Derartige Liposomen werden unter Verwendung von Konjugaten aus Liganden und Amphiphilen hergestellt, die üblicherweise die Form eines Moleküls aus Ligand/Kupplungskomponente/Amphiphiles aufweisen. Amphiphile sind Substanzen, die sowohl wasserlösliche als auch wasserunlösliche Bereiche aufweisen. Sie lassen sich am besten durch die Lipidamphiphilen exemplifizieren, wie beispielsweise die Phosphatidyl-ethanolamine, Phosphatidyl-serin, Phosphatidyl-inosit, Sphingomyelin-cerebroside, Phosphatidsäure, Plasmalogene, Cardiolipine und Fettsäuren.
Zum Kuppeln des interessierenden Antigenmaterials an das amphiphile Molekül kann eine Reihe von Kupplungsreagenzien und Kupplungsreaktionen verwendet bzw. angewandt werden. So kann beispielsweise eine Carboxylgruppe eines Antigenmaterials an eine Aminogruppe eines amphiphilen Moleküls durch unmittelbare Umsetzung unter Erzeugung eines N-substituierten Antigenamids gekuppelt werden, wobei der N-Substituent der Rest des amphiphilen Moleküls ist. Bei anderen Beispielen wird ein bestimmtes Reagenz zur Kupplung des Antigenmaterials an das amphiphile Molekül verwendet, und dieses Kupplungsreagenz kann zu Anfang mit entweder dem Antigenmaterial oder mit dem amphiphilen Molekül unter Erzeugung eines reaktionsfähigen Zwischenprodukts oder eines Vorläufers umgesetzt werden, das bzw. der danach weiter unter Ausbildung des endgültigen Liganden- oder Sensibilisator-Konjugats umgesetzt werden kann. Beispiele für derartige Kupplungsreagenzien sind Acylisocyanate, 4-Fluor-3-nitrophenylazide und Maleinsäure und ihre Derivate, die mit vorhandenen Aminogruppen umgesetzt werden können, wobei man N,N'-substituierte Maleinimide erhält. Die Tatsache, daß ein Antigen zuerst an ein ausgewähltes Amphiphiles, wie beispielsweise Phosphatidylethanolamin, -serine oder -inosit gekuppelt und anschließend in das Lipidgemisch, aus dem die Liposomen gebildet werden, eingebracht werden kann, da diese Kupplungsreaktion in einer Reihe von Lösungsmitteln durchgeführt werden kann, die nicht notwendigerweise mit anderen, wie beispielsweise enzymhaltigen Systemen verträglich zu sein brauchen.
Alternativ können Liganden an die Oberfläche von vorgebildeten Liposomen kovalent gebunden oder adsorbiert werden. Wenn Liposomen vorgebildet werden, so können sie an ihrer äußeren Oberfläche mehrere chemische Funktionalitäten aufweisen, mit denen Antigene kovalent verknüpft werden können. Die wichtigsten unter diesen sind: Aminogruppen, die von Phosphatidylethanolamin abgeleitet sind, Hydroxylgruppen, die durch Phosphatidylinosit geliefert werden, und Carboxylgruppen, die durch Fettsäuren oder Phosphatidylserin zur Verfügung gestellt werden. Auf diese Weise können Antigene durch herkömmliche chemische Umsetzungen an vorgebildete Liposomen gekuppelt werden, wobei man bifunktionelle Kupplungsmittel verwendet, wie beispielsweise: Glutaraldehyd, Diimidester, aromatische und aliphatische Diisocyanate, Bis-p-nitrophenylester von Dicarbonsäuren, aromatische Disulfonyl-chloride und bifunktionelle Arylhalogenide, wie 1,5-Difluor-2,4- dinitrobenzol, p,p'-Difluor-m,m'-dinitrodiphenylsulfone. Geeignete Umsetzungen, die für solche Kupplungen verwendet werden können, sind in Williams et al., Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York (1967) beschrieben. In einigen Fällen können Antigene an die Liposomoberfläche adsorbiert werden, wie von Uemura und Kinsky, Biochemistry, 11 : 4085-4094 (1972) gezeigt wurde.
Die Zusammensetzung gemäß der Erfindung enthält weiter eine Substanz, die die Zugänglichkeit der Vesikel als Reaktion der Bindung zwischen dem in der Oberfläche eingelagerten Liganden oder Ligandenanalogen und dem Bindungspartner modifiziert. Das Hauptbeispiel für diese Substanz ist eine Gruppe von Verbindungen, die kollektiv als Komplement bezeichnet werden. Komplement ist einer der hauptsächlichen chromonellen Wirkstoffe für die durch Immunkomplexe induzierte Gewebsschäden durch Zerstörung oder Lyse von Zellmembranen. Die Bindung von komplementfixierenden Antikörpern an Liganden oder Ligandenanaloge an der Oberfläche von Vesikeln, wie beispielsweise Liposomen oder Zellghosts, induziert, wie gezeigt wurde, die Fixierung von Komplement. Die sich daraus ergebenden Veränderungen in der Membrandurchlässigkeit durch stattfindende Membranzerreißung oder -lyse oder durch Bildung von funktionellen "Löchern" in der ansonsten unversehrten Membran erlauben die Abgabe der Komponente(n) des Erfassungssystems, die innerhalb der Vesikel waren, oder den Zugang von Komponenten im äußeren Medium zu den Erfassungskomponenten innerhalb der Vesikel. Die Tierart, von der Komplement für seinen Einsatz stammt, muß mit der Quelle für Antikörper und das den Antikörper sensibilisierenden Immunogen gemäß bekannten Reaktionsfähigkeiten verträglich sein. Einen allgemeinen Überblick über Komplement und seine Wirkungen ist aus Rapp et al., Molecular Basis of Complement Action, Appleton-Century- Crofts (1970) ersichtlich. Außerdem wird die Rolle von Komplement in vielen der oben genannten Literaturstellen, die sich mit anderen Liposomimmunoassays befassen, erörtert.
Die Zusammensetzung verwendet ein Erfassungssystem, das mindestens zwei Komponenten enthält. Die erste Komponente befindet sich innerhalb der Vesikel und die mindestens eine weitere Komponente ist damit reaktionsfähig, wobei ein erfaßbares Signal erzeugt wird, welches durch die Anlagerung des Bindungspartners und der die Vesikel modifizierenden Substanz an die Vesikel verringert wird. Das Hauptbeispiel dafür ist ein lumineszierendes Erfassungssystem. Lumineszenz ist die chemische Erzeugung von Licht. Die Analyse auf der Grundlage der Messung von imitiertem Licht bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken: hohe Empfindlichkeit, breiter linearer Bereich, niedrige Kosten je Test und verhältnismäßig einfache und kostengünstige Ausrüstung. Die Arten von Lumineszenz, die das meiste Interesse hervorgerufen haben, sind die Chemilumineszenz (CL) und die Biolumineszenz (BL). Die letztere ist die Bezeichnung für eine spezielle Form von Lumineszenz, die in biologischen Systemen auftritt, bei denen ein katalytisches Protein die Wirksamkeit der Lumineszenzreaktion erhöht. Tatsächlich ist in bestimmten Fällen die Umsetzung ohne eine Proteinkomponente unmöglich. Sie allgemein Kricka et al., (Hrsg.), Clinical and Biochemical Luminescence, Marcel Dekker, Inc., N.Y., NY (1982); DeLuca et al., (Hrsg.), Bioluminescence and Chemiluminescence, Basic Chemistry and Analytical Applications, Academic Press, N.Y., NY (1981); Morawetz et al., (Hrsg.) Luminescence from Biological and Synthetic Macromolecules, Eighth Kazir Conference, Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 366 (1981); und Proceedings of International Symposion on Analytical Application of Bioluminescence and Chemiluminescence, State Printing & Publishing, Inc. Westlake Village, CA (1979).
Das Verfahren der CL in Lösung umfaßt drei Stufen:
(a) Vorreaktionen zur Erzeugung des Schlüssel-Zwischenprodukts; (b) Anregungsstufe, bei der die chemische Energie des Schlüssel-Zwischenproduktes in elektronische Anregungsenergie umgewandet wird; und (c) Lichtemission von dem angeregten Produkt, das bei der chemischen Reaktion gebildet wird. Ganz allgemein enthalten die Reaktionsteilnehmer ein Oxidationsmittel und ein Reduktionsmittel, wobei das Reduktionsmittel als Folge davon, daß es oxidiert wird, Licht emittiert. Häufig ist es bevorzugt, einen Katalysator mitzuverwenden, wie beispielsweise Häm oder Peroxidase. Die CL-Reaktionen, die in diesem Abschnitt beschrieben sind, besitzen alle das gemeinsame Merkmal, daß sie Wasserstoffperoxid, ein Oxidationsmittel, erfassen. Dies macht sie besonders für den klinischen Chemiker interessant, weil sie eine Alternative für die kolorimetrischen Peroxidbestimmungsmethoden anbieten, wie sie bei vielen klinischen Tests derzeit angewandt werden.
Allgemein ist Wasserstoffperoxid das üblichste verwendete Oxidationsmittel. Andere Oxidationsmittel, die verwendet werden, sind Ethylhydroperoxid, Hypochlorid, Jod, Permanganat und Sauerstoff in Gegenwart eines geeigneten Katalysators. Enzymsysteme einschließlich gekuppelter Enzymsysteme, die Oxidationsmittel, wie Wasserstoffperoxid, als Zwischen- oder Endprodukt erzeugen, werden gemäß der Erfindung als Quelle für derartige Oxidationsmittel für das Lumineszenz-Erfassungssystem verwendet. Beispiele hierfür sind die Glucose/Glucoseoxidase- oder Glycerin/Glycerinoxidase-Reaktionen zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid.
Die Erscheinung der Chemilumineszenz als Folge einer Umsetzung mit Wasserstoffperoxid ist in mehreren Klassen von reduzierenden Verbindungen, die Licht emittieren (Luminophore) gefunden worden, insbesondere bei zyklischen Diacylhydraziden. Eines der am meisten verwendeten ist Luminol (5-Amino-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion). Eine Verschiebung in der Stellung der Aminogruppe vermindert die Wirksamkeit; so ist beispielsweise Isoluminol (6-Amino-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion) nur 10% so wirksam wie Luminol. Die Substitution in der Ringstruktur beeinflußt die Lumineszenz merklich. Elektronenziehende Substituenten im Benzolring erniedrigen die Lumineszenz, während elektronenabgebende Substituenten die Lichtausbeute erhöhen, Substitution in 5- und 8- Stellung ist dabei wirksamer als die in 6- und 7-Stellung. Eine vollständige Lichtauslöschung erfolgt, falls der heterocyclische Ring substituiert ist. Annellierte Analoge von Luminol, die 300% wirksamer als Luminol sind, sind ebenfalls hergestellt worden. Siehe McCapra, The Chemiluminescence of Organic Compounds, Q.Rev. (London), 20: 485 (1966). Mehrere andere chemilumineszierende Systeme sind entwickelt worden, einschließlich solcher, die Lucigenine, wie Bis-N-methylacridinium-nitrat, Acridiniumphenyl-carboxylate, Diaryl-oxalate, wie Bis-(trichlorphenyl)-oxalat, Lophin und mehrwertige Phenole, wie Pyrogallol oder Gallussäure, verwenden. Einen ausgezeichneten Überblick über Lumineszenz und ihre Rolle bei chemischen Tests ist Gorus et al., Applications of Bio- and Chemiluminescence in the Clinical Laboratory, Clin. Chem., 25 : 512-519 (1979) und Whitehead et al., Analytical Luminescence: Its Potential in the Clinical Laboratory, Clin. Chem. 25 : 1531-1546 (1979) entnehmbar.
Biolumineszenz (BL), ist, wie oben erwähnt, eine Form von Lumineszenz, die in biologischen Systemen auftritt. Bei den meisten BL-Systemen katalysiert das Enzym Luciferase die Lumineszenzoxidation eines Substrats, Luciferin. Die generische Bezeichnung "Luciferase" bezieht sich auf ein Enzym, das die Oxidation eines Substrats, wie Luciferin, unter Erzeugung von Licht katalysiert. Die generische Bezeichnung "Luciferin" bezieht sich auf eine reduzierte Verbindung, die zu einem elektronisch angeregten Singulettzustand oxidiert werden kann und bei ihrer Rückkehr in den Grundzustand Licht erzeugt. Das am vollständigsten untersuchte von diesen Systemen ist das des Leuchtkäfers (Feuerfliege), für das die Umsetzung wie folgt lautet:
Diese Umsetzung wird am besten bei etwa 25ºC in einem Glycinpuffer (pH 7,8) durchgeführt. Die meisten der restlichen BL-Systeme sind bei Meeresorganismen, wie Meeresbakterien, beobachtet worden. Beispielsweise wird das Umsetzungssystem für Vibrio fischeri und Beneckea harveyi durch folgende Formeln charakterisiert:
Licht
Bei dieser Umsetzung bedeutet RCHO einen langkettigen aliphatischen Aldehyd. Die Umsetzung wird am besten bei Temperaturen unterhalb 25ºC und einem pH-Wert-Bereich von etwa 6,4 bis 7,2 für V. fischeri und von 5,6 bis 6.8 für B. harveyi durchgeführt. Diese und andere BL-Systeme werden vollständig in Gorus et al., l.c. und Whitehead et al., l.c. erörtert.
Der Ausdruck "peroxidativ aktive Substanz" definiert die genaue chemische Aktivität der in Rede stehenden Substanzen. Eine Peroxidase ist ein Enzym, das eine Umsetzung katalysiert, in der Wasserstoffperoxid eine andere Substanz oxidiert. Die Peroxidasen sind allgemein Proteine, die Eisenporphyrinreste enthalten. Peroxidase tritt in Meerrettich, Kartoffeln, dem Saft von Feigenbäumen und in Rüben auf (Pflanzenperoxidase); ferner in Milch (Lactoperoxidase) sowie in weißen Blutkörperchen (Verdoperoxidase); außerdem tritt sie in Mikroorganismen auf und kann durch Fermentieren hergestellt werden. Bestimmte synthetische Peroxidasen, wie solche, wie sie aus Theorell und Maehly, Acta Chem. Scand., 4 : 422-434 (1950) bekannt sind, eignen sich ebenfalls zur Verwendung in H&sub2;O&sub2;-Erfassungssystemen. Weniger geeignet sind solche Substanzen, wie Hämin, Methämoglobin, Oxihämoglobin, Hämoglobin, Hämochromogen, alkalisches Hämatin, Häminderivate sowie bestimmte andere Verbindungen, die peroxidative oder peroxidaseähnliche Aktivität zeigen, nämlich die Fähigkeit, die Oxidation einer anderen Substanz mittels Wasserstoffperoxids und anderer Peroxide zu katalysieren. Andere Substanzen, die nicht Enzyme sind, jedoch peroxidative Aktivität aufweisen, sind: Eisensulfocyanat, Eisentannat, Eisen(II)ferrocyanid, Chromsalze (wie Kaliumchromsulfat), die an Silicagel adsorbiert sind, usw.
Wie oben erwähnt, wird bei der Bestimmung durch Lumineszenz-Lichtenergie erzeugt. Es ist möglich, diese Energie auf ein andere Molekül oder andere Moleküle zu übertragen, wodurch ein erfaßbares Signal bei einer anderen Wellenlänge oder sogar ein Signal eines anderen Typs erzeugt wird. Beispielsweise kann dem Erfassungssystem ein Fluoreszenzfarbstoff zugesetzt werden. Der Luminophor und der Fluoreszenzfarbstoff können so ausgewählt werden, daß Licht bei der Anregungswellenlänge des Fluoreszenzfarbstoffs emittiert wird. Die Fluoreszenz wird dann bei der Wellenlänge erfaßt, die von dem ausgewählten Fluoreszenzfarbstoff diktiert wird. Diese und andere Energieübertragungsmechanismen können mit dem Lumineszenzsystem kombiniert werden, um das erfaßbare Signal wie gewünscht zu modifizieren. Ein Vorteil des Energieübertragungssystems besteht darin, daß man eine Störung durch endogene oder Hintergrundemissionen der zu untersuchenden Probe, die sich nicht leicht von dem durch das Lumineszenzsystem erzeugten Signal unterscheiden lassen, beseitigen oder vermeiden kann.
Es können auch verschiedene Inhibitoren, Löscher oder Modulatoren verwendet werden, um die Reaktionsfähigkeit oder das Signal des Erfassungssystems zu modifizieren. Substanzen, die die Emzymaktivität inhibieren oder vermindern, sind bekannt und können mitverwendet werden, um das Enzym nach seiner Freisetzung von dem Liposom zu beeinflussen oder um dieses Liposom nach Modifizierung der Permeabilität zu durchdringen. Beispielsweise verringern, wie beobachtet wurde, Cyanidionen die Aktivität von freigesetzter Peroxidase, ohne das Testsystem sonst zu beeinflussen. Es wurden auch Antikörper beschrieben, die die Peroxidaseaktivität inhibieren. Substanzen, die Lumineszenz- oder Fluoreszenzsignale löschen, können mitverwendet werden, um die beobachtete Erscheinung der umgekehrten Latenz zu verstärken. Mehrere derartige Löschsubstanzen und -mechanismen sind bekannt. Beispielsweise kann die oben beschriebene Lumineszenz/ Fluoreszenz-Energieübertragung unter Verwendung eines fluoreszierenden Stoffes durchgeführt werden, dessen Fluoreszenz gelöscht wird, wenn eine Bindung zwischen Antigen und Antikörper erfolgt ist. Dieses wurde hinsichtlich herkömmlicher Bindungstestsysteme in J. Clin. Path. 30: 526 (1977) beschrieben. Enzymmodulator-Systeme sind in Boguslaski et al. US-Patent 4 134 792 beschrieben.
Das Testverfahren gemäß der Erfindung wird normalerweise durch Kombination der ligandenhaltigen Probe, des Antikörpers, der für den sensibilisierten Liganden spezifisch ist, des peroxidasehaltigen Liposoms und von Komplement durchgeführt. Nach einer geeigneten Bebrütungsdauer wird das obige Gemisch mit der lumineszierenden Verbindung und Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel vereinigt. Die dadurch erzeugte Lumineszenz wird mit einem lichtempfindlichen Detektor, wie beispielsweise einem Photomultiplier, einem photographischen Film oder einer Halbleiterdiode, bestimmt.
Die folgenden Ausführungsbeispiele beschreiben Versuche, die bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden. Sofern irgend möglich, wurden herkömmliche, reagenzreine Standardchemikalien verwendet.

Beispiel I

Umgekehrte Latenz von lumineszierenden Liposomsystemen

Die in diesem Beispiel referierten Versuche zeigen die Lumineszenzänderung eines Reaktionsgemisches, das ein Meerrettichperoxidase enthaltendes Liposom (HRP/Liposom), eine chemilumineszierende Verbindung (CL) und ein Oxidationsmittel für die CL-Verbindung enthält, wenn das Gemisch einem Detergens ausgesetzt wird, das die Liposomen lysiert. Wie weiter unten beschrieben, wurde eine höchst unerwartete Erscheinung beobachtet.
Meerrettichperoxidase enthaltende Liposomen wurden wie folgt hergestellt. Ein Lipidfilm wurde durch Verdampfen eines Gemisches aus 13 mg Eilecithin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3 mg Dicethylphosphat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 1,1 mg Cholesterin in 12 ml eines 4 : 1-Gemisches (Volumen/Volumen) von Chloroform und Methanol auf der Innenoberfläche eines birnenförmigen Kolbens hergestellt. Das Verdampfen wurde unter Vakuum mittels Wasserstrahlpumpe bei 40ºC durchgeführt, bis ein trockener Film beobachtet wurde. Danach wurde dieser Film unter Vakuum 2 h bei 0,5 mm Hg weiter getrocknet. Der so gebildete Lipidfilm wurde mit 4,0 ml TRIS-Puffer, der 2,0 mg Meerrettichperoxidase (HRP) (Miles Laboratories, Inc., EIkhart, IN) je ml enthielt, über Nacht bei 4ºC unter Rühren mit einem Magnetrührer hydratisiert. Die Stammlösung von Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) wurde hergestellt, indem man 100 ml einer TRIS-Lösung (60,5 g/l; pH 8,6) mit 150 ml einer Kochsalzlösung (58,5 g/l) vereinigte und das Volumen mit destilliertem Wasser auf 1,0 l ergänzte, wonach man eine 0,05 molare TRIS- und eine 0,15 molare Kochsalz Endkonzentration erhielt. Die auf diese Weise hergestellten Liposomen wurden von freier Peroxidase durch Gelchromatographie eines Volumens von 1,0 ml der Lipidsuspension über eine Säule von 1,5·32 cm aus Sepharose 6B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) unter Verwendung von TRIS-Puffer als Eluierungsmittel abgetrennt. Es wurden 40 Fraktionen von je 1,8 ml gesammelt. HRP/ Liposomen wurden in den Fraktionen 11 bis 14 isoliert, wie durch die Anwesenheit eines Absorptionsmaximums zufolge von Trübung bei 410 nm mit Hilfe eines Gilford- Spektrophotometers Modell 250 (Gilford Instruments, Inc. Oberlin, OB) bestätigt wurde. Die Fraktionen 12 und 13 wurden vereinigt und unter einer Stickstoffatmosphäre bei 4ºC aufbewahrt.
Eine Luminol-Reagenzlösung wurde wie folgt hergestellt. 221,5 mg Luminol (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wurden in 50 ml TRIS-Puffer gelöst und mit 4 Tropfen 50%iger Natronlauge (Gewicht/Volumen) versetzt, um das Luminol vollständig zu lösen, worauf man eine 2,5·10&supmin;² molare Luminollösung erhielt. 0,5 ml dieser Lösung wurden mit 49,5 ml TRIS-Puffer vermischt wobei man die Luminolreagenzlösung mit einer 2,5·10&supmin;&sup4;-molaren Luminolkonzentration erhielt.
Das Wasserstoffperoxid-Reagenz wurde hergestellt, indem man 14 ul 30%iges, wäßriges H&sub2;O&sub2; (Volumen/Volumen) (Fisher Scientific, Orangeburg, NY) zu 50 ml TRIS- Puffer hinzusetzte.
Die vereinigte HRP/Liposom-Fraktion (Fraktionen 12 und 13) wurde durch katalytische Oxidation von Luminol in Gegenwart von Wasserstoffperoxid wie folgt dem Test unterworfen. Ein Volumen von je 1,0 ml einer Reihe von HRP/Liposom-Verdünnungen wurde in TRIS-Puffer hergestellt. Eine äquivalente Reihe von Verdünnungen wurde in TRIS- Puffer, der 1% (Gewicht/Volumen) TRITON-X-100® (Rohm & Haas Co., Philadelphia, PA) enthielt, hergestellt. Von jeder Verdünnung wurde ein Volumen von 100 ul in eine separate Polypropylen-Röhre injiziert, die in einem Turner-Luminometer des Modells 20 (Turner Designs, Mountain View, CA) angeordnet war und die 200 ul 2,5·10&supmin;&sup4;-molares Luminol und 200 ul 2,5·10&supmin;³-molares H&sub2;O&sub2; in TRIS-Puffer enthielt. Nachdem die Umsetzung auf diese Weise in dem bestimmten Reaktionsgemisch, das dem Test unterzogen wurde, eingeleitet worden war, wurde die Lumineszenz in jedem Reaktionsgemisch durch Integration des Signals nach einer Wartezeit von 0,5 s über 60 s erfaßt und in Form von willkürlich gewählten Lumineszenzeinheiten aufgezeichnet. Die beobachtete integrierte Lumineszenz für HRP/Liposom-Verdünnungen, die mit TRITON-X-100 chemisch lysiert worden waren, und für intakte HRP/Liposom-Verdünnungen sowie das Verhältnis des Signals von lysierten zu intakten HRP/Liposom-Verdünnungen (L/I) für jede der Liposom-Verdünnungen sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt. Tabelle I HRP/Liposom-(Verdünnung) CL-Signal (mit Triton) CL-Signal (ohne Triton) Verhältnis
Aus den Daten in Tabelle I ergibt sich eine unerwartete Erscheinung. Die für intakte Liposomen beobachtete Lumineszenz ist größer als die für chemisch lysierte Liposomen. Dies belegt eine umgekehrte oder inverse Latenz, da das Lumineszenzsignal der lysierten Liposomen, dividiert durch das Lumineszenzsignal der intakten Liposomen kleiner als 1,0 ist. Diese Beobachtung stellt die Grundlage für die Schaffung eines spezifischen Bindungstests dar, für den die von intakten Liposomen abgeleitete Lumineszenz größer ist als die von Liposomen abgeleitete Lumineszenz, die durch Antikörper und Komplement lysiert werden, wie dies in den späteren Beispielen gezeigt wird.

Beispiel II

Die folgenden Versuche, die durchgeführt wurden, untersuchten, ob die größere Lumineszenz von intakten Liposomen gegenüber der "gelöschten" Lumineszenz von chemisch lysierten Liposomen, wie es in Beispiel I beobachtet und berichtet worden war, dadurch verursacht worden ist, daß freie Peroxidase dem lysierenden Agens, wie beispielsweise dem Detergens TRITON-X-100, ausgesetzt und von diesem möglicherweise inaktiviert worden ist.
Zunächst wurden Lösungen von HRP hergestellt, indem man 2,0 mg HRP einer aliquoten Menge von 5,9 ml TRIS- Puffer zusetzte, woraus eine 1·10&supmin;&sup5;-molare Konzentration an HRP resultierte, wie durch Absorption bei 403 nm bei einem Extinktionskoeffizienten von 91 mM&supmin;¹ cm&supmin;¹ bestimmt worden war. Es wurde eine Verdünnungsreihe dieser HRP- Lösung in TRIS-Puffer hergestellt. Eine äquivalente Verdünnungsreihe in TRIS-Puffer mit einem Gehalt von 1% (Gew./Vol.) TRITON-X-100® wurde ebenfalls hergestellt. Von jeder dieser Lösungen wurden 100 ul in getrennte Polypropylenröhren von 8·50 mm injiziert, die in ein Turner- Luminometer Modell 20 eingesetzt wurden und 200 ul 2,5·10&supmin;&sup4; molares Luminol und 200 ul 2,5·10&supmin;³-molares H&sub2;O&sub2; in TRIS-Puffer enthielten. Nachdem die Umsetzung auf diese Weise in dem zu analysierenden Reaktionsgemisch in Gang gesetzt worden war, wurde die Lumineszenz in jedem Reaktionsgemisch durch Integrieren des Signals nach einer Wartezeit von 0,5 s über 60 s erfaßt und aufgezeichnet. Die beobachtete integrierte Chemilumineszenz für HRP-Lösungen mit und ohne TRITON-X-100® sowie das Verhältnis für jede der Verdünnungen ist in der folgenden Tabelle II angegeben. Tabelle II [HRP] M CL-Signal (mit TRITON) CL-Signal (ohne TRITON) Verhältnis
Eine Verstärkung der durch Peroxidase katalysierten Oxidation von Luminol durch Wasserstoffperoxid wurde in Gegenwart von TRITON-X-100 beobachtet. Somit inhibiert TRITON-X-100® die durch Peroxidase katalysierte Oxidation von Luminol nicht und ist nicht die Ursache für die Löschungserscheinung, die im vorhergehenden Beispiel erwähnt worden ist.

Beispiel III

Die nächsten Versuche, die durchgeführt worden sind, erstreckten sich auf die Untersuchung der Wirkung von leeren Liposomen auf das Chemilumineszenzsignal, das bei einer durch freie Peroxidase katalysierten Oxidation von Luminol durch H&sub2;O&sub2; beobachtet wurde. Dies wurde durchgeführt, uni zu bestimmen, ob die Erscheinung der umgekehrten Latenz aus der vereinigten Anwesenheit von freier Peroxidase und leeren Liposomen resultieren würde.
Die Liposomen wurden wie folgt hergestellt. Zunächst wurde ein Lipidfilm gebildet, indem man ein Gemisch aus 7,3 mg Eilecithin, 1,75 mg Dicetylphosphat und 2,9 mg Cholesterin in 13 ml eines 4 : 1-Gemisches (Vol./Vol.) von CHCl&sub3; und Methanol auf der Innenoberfläche eines birnenförmigen 50-ml-Kolbens zur Trockene verdampfte. Das Verdampfen wurde unter Vakuum durchgeführt, wie in Beispiel I beschrieben. Der auf diese Weise hergestellte Lipidfilm wurde mit 2,0 ml TRIS-Puffer, dem keine Peroxidase zugesetzt worden war, über Nacht bei 4ºC unter Rühren mit einem magnetischen Rührer hydratisiert, und die so hergestellte Liposompräparation wurde zur Verwendung in der weiter unten beschriebenen Weise bei 4ºC aufbewahrt.
Eine HRP-Lösung wurde hergestellt, indem man 13, 6 mg HRP zu 5,0 mg TRIS-Puffer zusetzte, worauf man eine 5·10&supmin;&sup5;-molare HRP-Konzentration erhielt, bestimmt durch die Absorption bei 403 nm bei einem Extinktionskoeffizienten von 91 mM&supmin;¹ cm&supmin;¹. Diese Lösung wurde anschließend auf eine 5·10&supmin;&sup7;-molare Konzentration verdünnt, indem man 0,25 ml mit 25 ml TRIS-Puffer vereinigte, wobei man eine Lösung erhielt, die zur Herstellung von Proben verwendet wurden, und zwar mit (1) Enzym allein, (2) Enzym plus TRITON-X-100®, (3) Enzym plus leeren Liposomen und (4) Enzym plus TRITON plus leeren Liposomen. Die Formulierung jedes der obigen Gemische und Kontrollproben (minus HRP) ist in der Tabelle III zusammengefaßt. Je 100 ul dieser Lösungen wurde in getrennte Polypropylenröhren injiziert, die 200 ul 2,5·10&supmin;&sup4;-molares Luminol und 200 ul 2,5·10&supmin;³-molares H&sub2;O&sub2; in TRIS-Puffer enthielten und in ein Turner-Luminometer Modell 20 eingesetzt wurden. Nach auf diese Weise begonnener Umsetzung in dem zu untersuchenden jeweiligen Reaktionsgemisch wurde die Lumineszenz nach einer Wartezeit von 0,5 s durch Integration des Signals über 60 s erfaßt und aufgezeichnet. Das CL-Signal wurde in jeder Röhre in der gleichen Weise, wie in Beispiel I beschrieben, beobachtet und ist ebenfalls in der Tabelle III angegeben. Tabelle III HRP (ul) TRIS-Puffer (ul) 1% TRITON (ul) Liposomen (ul) CL-Signal
Die Daten der Tabelle III zeigen zunächst, daß lediglich eine sehr geringe Lumineszenz bei den Präparationen (a) bis (d) beobachtet wurde, die kein HRP enthielten, insbesondere bei den Präparationen (c) und (d), die leere Liposomen enthielten. Präparationen (e) bis (f) zeigen eine sehr hochgradige Lumineszenz in Gegenwart von 50 ul HRP. Im Gegensatz dazu enthielten die Präparatioen (g) und (h) 50 ul HRP und leere Liposomen in Abwesenheit bzw. Gegenwart von TRITON-X-100 und zeigten eine Lumineszenz, die lediglich halb so stark war wie die in Abwesenheit von Liposomen beobachtete. Ein Vergleich der Präparationen (g) und (h) zeigt, daß TRITON-X-100®. Die Wirkung besitzt, daß es die Lumineszenz in Gegenwart von Liposomen leicht erhöht. Die Präparationen (i) und (j) zeigen eine hochgradige Lumineszenz in Gegenwart von 100 ul HRP. Im Gegensatz dazu enthielten die Präparationen (k) und (l) 100 ul HRP und leere Liposomen in Abwesenheit bzw. Gegenwart von TRITON-X-100 und wiesen eine beträchtlich geringere Lumineszenz auf. Ein Vergleich der Präparationen (k) und (1) zeigt, daß TRITON-X-100® die Wirkung besaß, daß es die Lumineszenz in Gegenwart von Liposomen leicht erhöhte. Zusammenfassend ist festzustellen, daß der Zusatz von leeren Liposomen zu Meerrettichperoxidase außerhalb der Liposomen zu einer Abnahme des Lumineszenzsignals führte. Wenn TRITON-X-100® in das Bebrütungsgemisch eingebracht worden war, wurde das Chemilumineszenzsignal erhöht.

Beispiel IV

Theophyllinbestimmung mit lumineszierenden Liposomen

Theophyllin (1,3-dimethylxanthin) wird allgemein bei der Behandlung von Bronchialasthma verwendet. Die Serumkonzentration der Droge muß streng überwacht werden, da die Droge einen engen therapeutischen Bereich von 10 bis 20 ug/ml aufweist, wobei Drogenkonzentrationen von über 20 ug/ml toxisch sein können. Die Versuche, über die weiter unten berichtet wird, zeigen, daß der Lumineszenz-Immunoassay mit umgekehrter Latenz gemäß der Erfindung dazu verwendet werden kann, Serumspiegel von Theophyllin quantitativ zu erfassen.

Herstellung von sensibilisiertem HRP/Liposom

Mit Theophyllin sensibilisierte HRP/Liposomen wurden wie folgt hergestellt. Zunächst wurde ein Lipidfilm gebildet, indem man, wie in Beispiel I beschrieben, ein Gemisch aus 7,3 mg Eilecithin, 1,7 mg Dicethylphosphat, 0,6 mg Cholesterin und 0,15 mg Theophyllin-Konjugat in 10,0 ml eines Gemisches von 4 Volumenteilen Chloroform und 1 Volumenteil Methanol auf der Innenoberfläche eines birnenförmigen Kolbens verdampfte. Der Theophyllinsensibilisator, der verwendet wurde, war ein Theophyllindipalmitoylphosphatidyl-ethanolamin-Konjugat (Theophyllin-DPPE). Ein derartiges Konjugat kann nach der in Haga et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 95:187-192 (1980) beschriebenen Methode hergestellt werden. Dasselbe Theophyllin-DPPE-Konjugat wurde nach einem modifizierten Verfahren synthetisiert und analysiert, wobei seine Identität und Reinheit bestätigt wurde. Das gereinigte Konjugat wurde als isoliertes Produkt der präparativen Flüssigkeitschromatographie erhalten, das einen einzigen Fleck bei der Dünnschichtchromatographie ergab. Die Identität dieses Konjugats wurde durch NMR-, UV- und IR-Spektren sowie durch Elementaranalyse bestätigt.
Der auf diese Weise gebildete Lipidfilm oder Lipidüberzug wurde mit 2,0 ml TRIS-Puffer, der 2 mg/ml HRP enthielt, über Nacht bei 4ºC unter Rühren mit einem Magnetstabrührer hydratisiert. Die so hergestellten mit Theophyllin sensibilisierten HRP/Liposomen wurden von freier Peroxidase durch Chromatographieren von 1,0 ml der Lipidsuspension über eine 1,5·32 cm große Säule von Sepharose 63 unter Verwendung von TRIS-Puffer als Elutionsmittel getrennt. 40 Eluatfraktionen von je 1,8 ml wurden gesammelt. Die mit Theophyllin sensibilisierten HRP/Liposomen wurden in den Fraktionen 12 bis 14 und freie Peroxidase in den Fraktionen 27 bis 34 gefunden.
Jede der auf diese Weise gesammelten Eluatfraktionen wurde spektrofotometrisch getestet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Peroxidase wie folgt zu bestätigen. Eine aliquote Menge von je 50 ul jeder Fraktion wurde mit 200 ul TRIS-Puffer vereinigt. Jede aliquote Menge eines parallelen Sets von Fraktionen wurde mit 200 ul TRIS-Puffer vereinigt, der 1% (Gew./Vol.) TRITON-X-100® enthielt. Von jeder hergestellten Präparation wurde eine aliquote Menge von 20 ul in eine Küvette mit einer optischen Weglänge von 1,0 cm, die 3,0 ml TRIS-Puffer und 50 ul eines Guajacol-Stammreagenzes (o-Methoxyphenol: Matheson, Coleman & Bell, Norwood, OH), (2,45 mg/ml TRIS-Puffer) eingebracht. Jede dieser Küvetten wurde in ein Gilford- Spektrophotometer Modell 250 eingebracht, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 ul einer H&sub2;O&sub2;-Stammlösung initiiert, die durch Vereinigen von 50 ul 30%iger (Vol./Vol.) wäßriger H&sub2;O&sub2;-Lösung (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA) mit 100 ml TRIS-Puffer hergestellt worden war. Der Inhalt jeder Küvette wurde bei einer Wellenlänge von 436 nm während 60 s nach der Initiierung der Umsetzung gemessen. Die Ergebnisse dieses Verfahrens bestätigten das Vorhandensein von Peroxidase in den Fraktionen 12 bis 14 und 27 bis 34. Da Liposomen, wie oben erwähnt, lediglich in den Fraktionen 12 bis 14 beobachtet wurden, war sichergestellt, daß die Fraktionen 27 bis 34 freie Meerrettichperoxidase enthielten.

Herstellung der anderen Reagenzien

Es wurden Theophyllinproben mit 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 50 und 100 ug Theophyllin je ml von einer Theophyllin- Stammlösung hergestellt, die aus 5,3 mg Theophyllin (Sigma, w.o.), gelöst in 50 ml TRIS-Puffer bestand, indem man aliquote Teile davon mit zusätzlich ein TRIS-Puffer verdünnte.
Das Antitheophyllinantikörperreagenz wurde aus einem handelsüblichen Antitheophyllin-Kaninchenantiserwn (Kallestad Inc., Austin, TX, Katalog Nr. 334) wie folgt hergestellt. 100 ul des Kallestad-Antiserums wurden zu 900 ul TRIS-Puffer hinzugegeben, so daß eine Antikörper- Stammlösung von 1 : 10 (Vol./Vol.) erhalten wurde.
Komplement-Reagenz wurde wie folgt hergestellt. Lyophilisiertes Meerschweinchenserum aus einer Flasche (Pel Freeze, Rogers, AK, Katalog Nr. 38005-1) wurde mit 3,0 ml destilliertem Wasser rekonstituiert. Ein Volumen von 0,5 ml des rekonstituierten, Komplement enthaltenden Serums wurde mit Azid-TRIS-Puffer vereinigt, so daß eine Verdünnung von 1 : 10 (Vol./Vol.) erhalten wurde, die bei dem Testverfahren verwendet wurde. Dieser Azid-TRIS- Puffer wurde hergestellt, indem man 208,1 mg Natriumazid in 100 ml TRIS-Puffer löste.

Testverfahren und Ergebnisse

Zunächst wurden je 10 ul der oben beschriebenen Theophyllinproben in eine der Gläser von zwei Reihen von Reagenzgläsern eingebracht. Danach wurden 50 ul einer Verdünnung 1 : 5 in TRIS-Puffer der Antikörperstammlösung in jedes Glas der ersten Reihe von Reagenzgläsern eingeführt und 50 ul einer Verdünnung 1 : 10 des Stammantikörpers in TRIS-Puffer in jedes Glas der zweiten Reihe. Darauf wurden 40 ul einer Verdünnung von 1 : 4 in TRIS- Puffer der mit Theophyllin sensibilisierten Liposompräparation (Fraktion 13) in das Gemisch in jedem Glas der ersten Reihe und 40 ul einer Verdünnung von 1 : 10 in TRIS-Puffer in das Gemisch in jedem Glas der zweiten Reihe eingebracht. Beide Reihen wurden anschließend 5 min lang bei 37ºC bebrütet. Nach der 5-minütigen Bebrütungsdauer wurde in jedes Gemisch in jedem Glas jeder Reihe 100 ul einer Verdünnung von 1 : 10 des Komplementreagenzes in TRIS-Puffer eingeführt. Danach erfolgte eine Bebrütung bei 37ºC während weiterer 5 min.
Es wurden auch Vergleichsproben hergestellt, indem man 10 ul einer 10, 50 und 100 ug Theophyllin je ml enthaltenden Probe und eines leeren TRIS-Puffers, der kein Theophyllin enthielt, verwendete, indem man 40 ul der Verdünnung der Liposompräparation von 1 : 4 und 150 ul TRIS-Puffer anstelle von Antikörper und Komplement zusetzte. Aliquote Teile von 100 ul jeder dieser Präparationen wurden abgezogen und in ein getrenntes Polypropylenröhrchen injiziert, das in einem Turner-Luminometer Modell 20 angeordnet war und 200 ul des 2,5·10&supmin;&sup4; molaren Luminolreagenzes und 200 ul des 2,5·10&supmin;³ molaren H&sub2;O&sub2;-Reagenzes enthielt. Nachdem auf diese Weise die Umsetzung in dem zu untersuchenden Reaktionsgemisch initiiert worden war, wurde der Lumineszenzausgang gemessen, indem man nach einer Wartezeit von 0,5 s 60 s lang integrierte und aufzeichnete. Die beobachteten Ergebnisse sind in der Tabelle IV zusammengefaßt. Tabelle IV CL-Signale Theophyllin (g/ml) 1/4 Verdünnung von Liposomen 1/10 Verdünnung von Liposomen Vergleichsgemisch
Eine Zunahme der Lumineszenz wurde bei Erhöhung der Probenkonzentration an Theophyllin für beide Reagenzformulierungen festgestellt. Im Gegensatz dazu produzierten die Vergleichslösungen einheitlich unverminderte Lumineszenz - unabhängig von der Theophyllin-Konzentration der droben. Dies zeigt klar und einfach die Anwendung der Erscheinung der umgekehrten Latenz auf eine Immunoassay- Zusammensetzung und -Methode zur quantitativen Bestimmung von Theophyllinspiegeln bei Mindestkonzentrationen von 1,25 ug/ml sowie bei Konzentrationen, die das 5-fache der toxischen Schwellendosis betrugen.

Beispiel V

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung eines Inhibitors für Peroxidase, namlich des Cyanidions, auf das für intakte Liposomen und für Liposomen, die chemisch mit TRITON-X-100® lysiert worden waren, beobachtete Signal in einem Lumineszenztest auf Peroxidase, bei dem die Lumineszenz des Reaktionsgemisches zu einem festgesetzten Zeitpunkt nach Initiierung der Reaktion aufgezeichnet wurde.
Liposomen, die gemäß Beispiel I hergestellt worden waren, wurden von freier Peroxidase durch Gelchromatographie nach den in Beispiel I beschriebenen Verfahren abgetrennt. Die als Eluat erhaltenen Liposomfraktionen wurden vereinigt und als Stammsuspension bei 4ºC aufbewahrt. Eine Arbeitssuspension aus einer Verdünnung der Liposom-Stammsuspension von 1 : 40 wurde in TRIS- Puffer hergestellt (intakte Liposomen). Analog wurde eine Verdünnung der Liposom-Stammsuspension von 1 : 40 in TRIS-Puffer hergestellt, die 0,2% (Gew./Vol.) TRITON- X-100® enthielt (lysierte Liposomen).
Eine 1 mM Stammlösung von Natriumcyanid (NaCN) in TRIS-Puffer (1 mM CN-TRIS) wurde hergestellt, indem man 5,0 mg NaCN in 100 ml TRIS-Puffer löste. Reagenzlösungen aus Natriumcyanid in TRIS-Puffer wurden aus der 1 mM CN-TRIS-Lösung hergestellt; ihre Konzentration war 0,083, 0,2, 0,33, 0,5 und 0,75 mM in bezug auf NaCN in TRIS-Puffer.
Die Lumineszenz von intakten und chemisch lysierten Liposomen wurde gemessen, indem man 100 ul der Liposomverdünnung von 1 : 40 in getrennte Polypropylenröhrchen injizierte, die 300 ul von entweder TRIS-Puffer oder 300 ul einer der Cyanidreagenzlösungen, 50 ul von 5·10&supmin;³ M H&sub2;O&sub2; in TRIS-Puffer und 50 ul von 10&supmin;² M Luminol in TRIS-Puffer enthielten. Diese Röhrchen wurden in ein Turner-Luminometer Modell 20 eingebracht. Die Lumineszenz wurde 15 min nach Initiierung der Reaktion aufgezeichnet. Tabelle V zeigt die beobachtete Lumineszenz für intakte und chemisch lysierte Liposomen sowie das Signalverhältnis von lysierten und intakten HPR/Liposomen (L/I-Verhältnis) für jede der Konzentrationen von Cyanid ([CN]mM) in den Reagenzien. Tabelle V [CN] mM CL-Signal mit TRITON CL-Signal ohne TRITON L/I-Verhältnis
Unter den Bedingungen des Versuchs, bei denen kein Cyanid vorhanden war, betrug das L/I-Verhältnis 0,76. Bei der niedrigsten Cyanidreagenzkonzentration von 0,083 mM betrug das L/I-Verhältnis 0,01. Die Lumineszenz der intakten Liposomen wurde um nicht mehr als 34% durch die Reihe von untersuchten Cyanidkonzentrationen inhibiert. Die Lumineszenz der chemisch lysierten Liposomen wurde bei den in diesen Versuchen angewandten Cyanidkonzentrationen um mehr als 97% inhibiert. Dies zeigt somit, daß die Anwesenheit von Cyanid die beobachtete Erscheinung der umgekehrten Latenz verstärkt.

Beispiel VI

Das vorliegende Beispiel zeigt ein Verhältnis der umgekehrten Latenz durch Verwendung eines Inhibitors für Peroxidase, nämlich des Cyanidions, unter solchen Bedingungen, bei denen sonst ein Verhältnis der umgekehrten Latenz nicht beobachtet wird.
Die mit Theophyllin sensibilisierten Liposomen, die Meerrettichperoxidase enthielten und gemäß Beispiel IV hergestellt worden waren, wurden bei der folgenden Reihe von Versuchen verwendet. Eine Arbeitssuspension von Liposomen wurde hergestellt, indem man eine aliquote Menge der Fraktion 13 wie folgt mit TRIS-Puffer verdünnte. Eine aliquote Menge von 12 ul von Fraktion 13 wurde 588 ul TRIS-Puffer zugesetzt, so daß eine Verdünnung von 1 : 50 erhalten wurde (intakte Liposomen). Analog wurde eine aliquote Menge von 12 ul von Fraktion 13 zu 588 ul TRIS-Puffer mit einem Gehalt von 0,7% (Gew./Vol.) von TRITON-X-100® zugesetzt, so daß eine Verdünnung von 1 : 50 erhalten wurde (lysierte Liposomen).
Eine Reagenzlösung in TRIS-Puffer, die im Hinblick auf Natriumcyanid 0,33 mM war, wurde hergestellt, indem man 2,0 ml von 1 mM CN-TRIS zu 4,0 ml TRIS-Puffer zusetzte.
Die Luminolreagenzien wurden aus einer Stammlösung in TRIS-Puffer, die im Hinblick auf Luminol 2,5·10&supmin;² molar war, und die, wie in Beispiel I beschrieben, hergestellt worden war, durch Verdünnen mit TRIS-Puffer hergestellt. Die Konzentrationen der Luminolreagenzien sind in der Tabelle VI angegeben.
Wasserstoffperoxid-Reagenzien wurden wie folgt hergestellt. Eine Stammlösung, die im Hinblick auf H&sub2;O&sub2; 5·10&supmin;²-molar war, wurde hergestellt, indem man 57 ul 30%iges (Vol./Vol.) wäßriges H&sub2;O&sub2; zu 10,0 ml TRIS-Puffer zusetzte. Danach wurde diese Stammlösung dazu verwendet, um die Wasserstoffperoxid-Reagenzien durch Verdünnen mit TRIS-Puffer herzustellen, wobei die erhaltenen Konzentrationen ebenfalls in Tabelle VI angegeben sind.
Die Lumineszenz von intakten und chemisch lysierten Liposomen wurde gemessen, indem man 100 ul der Arbeitssuspension aus intakten Liposomen oder 100 ul der Arbeitslösung aus chemisch lysierten Liposomen in getrennte Polypropylenröhrchen injizierte, die 300 ul 0,33 mM CN-TRIS-Lösung, 50 ul eines der Luminolreagenzien und 50 ul eines der H&sub2;O&sub2;-Reagenzien enthielten. Die Röhrchen wurden in ein Turner Luminometer Modell 20 gegeben. Die Lumineszenz wurde für die Umsetzung in jedem Röhrchen durch Integration des Signals über 60 s nach einer Wartezeit von 0,5 s gemessen und aufgezeichnet.
Die Lumineszenz wurde außerdem für intakte und chemisch lysierte Liposomen in einem Vergleichsversuch aufgezeichnet, bei dein das Cyanidreagenz durch TRIS- Puffer ersetzt worden war. Die beobachtete Lumineszenz, die Konzentration an Luminol und Wasserstoffperoxid in den Reagenzien und das Signalverhältnis von lysierten zu intakten Liposomen (L/I-Verhältnis) ohne Cyanid sind in Tabelle VI bei Versuch (a) angegeben. Analog ist die beobachtete Lumineszenz für die Versuche, bei denen die Konzentration an Natriumcyanid in dem Umsetzungsgemisch 0,2 mM war, in Tabelle VI bei den Versuchen (b) bis (e) angegeben. Tabelle VI [R&sub2;&sub0;&sub2;] M [LUMINOL] M CL-Signal mit TRITON CL-Signal ohne TRITON LI-Verhältnis (a) (b) (c) (d) (e)
Die Daten in Tabelle VI zeigen, daß unter den Bedingungen, bei denen ein umgekehrtes Latenzverhältnis nicht beobachtet wird (Versuch (a)), die Zugabe eines Inhibitors für Peroxidase zu dem Lumineszenz-Reaktionsgemisch zu einer stärkeren Verringerung des Signals für lysierte als für intakte Liposomen führt (Versuch (b)). Das L/I-Verhältnis betrug ohne Cyanid im Reaktionsgemisch 5,6 (Versuch (a)), während das L/I-Verhältnis in Gegenwart eines Inhibitors für Peroxidase nämlich von Cyanid gemäß Versuch (b) 0,09 betrug. Die Versuche (b) bis (e) zeigen die umgekehrte Latenz über einen Bereich unterschiedlicher Konzentrationen an H&sub2;O&sub2; und Luminol.

Beispiel VII

Das vorliegende Beispiel beschreibt die Verwendung von Liposomen, die Meerrettichperoxidase enthielten, in einem Immunoassay für Theophyllin, bei dem das Lumineszenzsignal, das sich von intakten Liposomen ableitet, größer ist als das von lysierten Liposomen. Die Peroxidase wurde durch Oxidation von Luminol mit H&sub2;O&sub2; als Oxidationsmittel bestimmt. Die Lumineszenz wurde durch Aufzeichnen des Signals zu einem festen Zeitpunkt nach Initiierung der Umsetzung gemessen. Ein Inhibitor für Peroxidase, nämlich das Cyanidion, war in dem Lumineszenz-Reaktionsgemisch eingeschlossen.

Herstellung der Reagenzien

Die mit Theophyllin sensibilisierten Liposomen, die Peroxidase enthielten und die gemäß Beispiel IV hergestellt worden waren, wurden für die folgende Reihe von Versuchen verwenden. Eine Liposomsuspension wurde hergestellt, indem man Fraktion 13 von Beispiel IV mit TRIS- Puffer im Verhältnis 1 : 10 verdünnte (Liposomreagenz).
Antitheophyllin-Antiserum und Komplement stammten aus derselben Quelle, wie sie in Beispiel IV beschrieben ist. Das Antikörperreagenz wurde hergestellt, indem man Antitheophyllinantiserum mit TRIS-Puffer im Verhältnis 1 : 10 verdünnte (Antikörperreagenz). Das Komplementreagenz wurde hergestellt, indem man Meerschweinchenserum mit TRIS-Puffer im Verhältnis 1 : 10 verdünnte (Komplementreagenz).
Es wurden Theophyllinproben von 2,5, 5, 10, 20, 40, 60 und 100 ug Theophyllin je ml aus der Theophyllin- Stammlösung gemäß Beispiel IV durch Verdünnen mit TRIS- Puffer hergestellt.
Eine Reagenzlösung, die 5·10&supmin;² molar an H&sub2;O&sub2; war, wurde hergestellt, indem 57 ul 30%iges H&sub2;O&sub2; (Vol./Vol.) zu 10,0 ml TRIS-Puffer hinzufügte (H&sub2;O&sub2;-Reagenz).
Eine Reagenzlösung, die 10&supmin;²-molar an Luminol war, wurde hergestellt, indem man 179 mg Luminol in etwa 80 ml TRIS-Puffer löste und das Ganze mit vier Tropfen 50%iger Natronlauge (Gew./Vol.) versetzte. Der pH-Wert dieser Lösung wurde mit verdünnter Salzsäure auf 8,6 eingestellt und das Volumen durch Zugabe von TRIS-Puffer auf 100 ml ergänzt (Luminolreagenz).
Eine Reagenzlösung, die 0,33 mM an NaCN war, wurde in TRIS-Puffer vom pH-Wert 8,6 hergestellt, wie in Beispiel VI beschrieben (Cyanidreagenz).

Assay Verfahren und Ergebnisse

In getrennten Reagenzgläsern wurden 20 ul einer der Theophyllinproben, wie oben beschrieben, oder 20 ul TRIS (0 ug Theophyllin je ml) mit 50 ul Antikörperreagenz und 100 ul Komplementreagenz 5 min lang bei 37ºC bebrütet. Das Gemisch aus Probe, Antikörper- und Komplement- Reagenz wurde mit 50 ul Liposomreagenz versetzt und das Ganze weitere 2 min bei 37ºC bebrütet. Ein aliquoter Teil von 100 ul jedes dieser Probengemische wurde abgezogen und in getrennte Polypropylenröhrchen injiziert, die in ein Turner Luminometer Modell 20 eingebracht wurden. Jedes Polypropylenröhrchen enthielt 300 ul Cyanidreagenz, 50 ul H&sub2;O&sub2; Reagenz und 50 ml Luminolreagenz. Die Lumineszenz wurde 11 min nach der Initiierung der Reaktion in jedem Röhrchen aufgezeichnet.
Die Konzentration an Theophyllin in jeder Probe und die beobachtete Lumineszenz sind in Tabelle VII angegeben.

Tabelle VII

[THEOPHYLLIN]

ug/ml LUMINESZENZ
0 265
2,5 341
5 389
10 431
20 479
40 559
60 597
100 625
Von den in Tabelle VII angegebenen Daten ergibt sich eine Dosis/Signal-Beziehung zwischen der Lumineszenz des Gemisches aus Probe, Antikörperreagenz, Komplementreagenz, Liposomreagenz, Cyanidreagenz, H&sub2;O&sub2;-Reagenz und Luminolreagenz einerseits und der Menge an Theophyllin in der Probe andererseits.

Beispiel VIII

Die nächste Versuchsreihe zeigt die Verwendung von Glucoseoxidase und Glucose und Sauerstoff zur Erzeugung von H&sub2;O&sub2; aus Sauerstoff und die Verwendung von Cyanid, einem Inhibitor für Peroxidase, in einem Immunoassay für mit Theophyllin sensibilisierte Liposomen, die Peroxidase enthalten.

Reagenzherstellung

Theophyllinlösungen von 2,5, 5, 10, 20, 40, 60 und 100 ug Theophyllin je ml in TRIS-Puffer wurden aus der Theophyllin-Stammlösung gemäß Beispiel IV hergestellt. Ein aliquoter Teil von 1,0 ml jeder Theophyllinlösung wurde mit 1,0 ml normalem Kaninchenserum (Irving Scientific, Irvine, CA) vereinigt, und man erhielt Theophyllinproben von 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 30 und 50 ug/ml. Analog wurde ein aliquoter Teil von 1,0 ml TRIS-Puffer mit einem aliquoten Teil von 1,0 ml normalem Kaninchenserum vereinigt, um eine Probe mit 0 ug/ml Theophyllin herzustellen.
Eine Lösung, die bezüglich Luminol 8·10&supmin;²-molar war, wurde hergestellt, indem man 719,8 mg Luminol in etwa 40 ml TRIS-Puffer löste und das Ganze mit acht Tropfen 50%iger Natronlauge (Gew./Vol.) versetzte. Das Endvolumen wurde mit TRIS-Puffer auf 50 ml ergänzt. Diese Lösung wurde vor ihrer Verwendung durch einen Filter mit 0,45 um Porenweite filtriert. Eine Stammlösung, die bezüglich Luminol 4·10&supmin;²-molar war, wurde hergestellt, indem man 10,0 ml 8·10&supmin;² molares Luminol mit 10,0 ml TRIS-Puffer vereinigte.
Eine Lösung von 4,0 mg Glucoseoxidase/ml (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN lyophilisierter Grad 1 von Asperpillus niger) wurde hergestellt, indem man 40 mg Glucoseoxidase in 10,0 ml TRIS-Puffer löste. Eine aliquote Menge von 1,0 ml dieser Lösung wurde mit 9,0 ml TRIS-Puffer vereinigt, und man erhielt eine Stammlösung von 0,4 mg Glucoseoxidase/ml.
Eine Verdünnung von mit Theophyllin sensibilisierten Liposomen im Verhältnis 1:10 wurde hergestellt, indem man 0,25 ml der Fraktion 13 gemäß Beispiel IV mit 2,25 ml TRIS- Puffer vereinigte.
Ein Reagenz, das Luminol, Glucoseoxidase und mit Theophyllin sensibilisierte Liposomen enthielt, wurde hergestellt, indem man 2,0 ml der 4·10&supmin;²-molaren Luminol- Stammlösung mit 2,0 ml der Liposomsuspension (1/10) und 4,0 ml der Lösung mit 0,4 mg Glucoseoxidase/ml vereinigte (Reagenz 1).
Eine Lösung, die bezüglich Glucose 0,2-molar war, wurde hergestellt, indem man 1,82 g Glucose (Aldrich, Milwaukee, WI) in 50,0 ml TRIS-Puffer löste. Eine Stammlösung in TRIS-Puffer, die bezüglich Glucose 4·10&supmin;² molar, bezüglich NaCN 0,8 mM war, wurde hergestellt, indem man 0,5 ml 0,2 molarer Glucoselösung mit 2,0 ml der 1 mM CN-TRIS-Lösung, hergestellt gemäß Beispiel V, vereinigte.
Antitheophyllin-Antiserum und Meerschweinchenserum stammten aus derselben Quelle, wie in Beispiel IV beschrieben. Eine Verdünnung von Antitheophyllin-Antiserum im Verhältnis 1 : 20 wurde hergestellt, indem man 0,25 ml Antitheophyllin-Antiserum vom Kaninchen mit 4,75 ml TRIS-Puffer vereinigte. Eine Komplementverdünnung von 1/ 1,25 wurde hergestellt, indem man 2,0 ml Meerschweinchenserum mit 0,5 ml TRIS-Puffer vereinigte.
Ein Reagenz, das Glucose, Cyanid, Antitheophyllin- Antiserum und Komplement enthielt, wurde hergestellt, indem man 1,0 ml der Verdünnung des Kaninchen-Antitheophyllin-Antiserums im Verhältnis 1/20 mit 1,0 ml der Verdünnung von Meerschweinchenserum im Verhältnis 1/1,25 und 2,0 ml der Stammlösung, die bezüglich Glucose 4·10&supmin;²-molar und bezüglich Natriumcyanid 0,8 mM war, in TRIS-Puffer vereinigte (Reagenz 2).

Assayverfahren und Ergebnisse

Eine aliquote Menge von 20 ul jeder der Theophyllinproben in 50%igem (Vol./Vol.) normalem Kaninchenserum wurden getrennt mit 200 ul des Reagenzes 1 in einem Polypropylenröhrchen vereinigt und vermischt. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 200 ul des Reagenzes 2 und Vermischen eingeleitet. Jedes Polypropylenröhrchen wurde anschließend in ein Turner Luminometer Modell 20 eingesetzt und die Lumineszenz 15 min nach Initiierung des Assays beobachtet und aufgezeichnet.
Die Tabelle VIII zeigt die Konzentration von Theophyllin in jeder Probe und die aufgezeichnete Lumineszenz.

Tabelle VIII

THEOPHYLLIN

(um/ml) LUNINESZENZ
0 138
1,25 152
2,5 227
5,0 270
10,0 338
20,0 471
30,0 510
50,0 492
Aus den Daten der Tabelle VIII ergibt sich eine Dosis/Signal-Beziehung zwischen der Menge an Theophyllin in jeder Probe und der aufgezeichneten Lumineszenz.

Claims

1. Zusammensetzung zur Bestimmung eines Liganden in einer Probe, wobei die Zusammensetzung folgende Bestandteile umfaßt:

(a) einen Bindungspartner für den Liganden,

(b) ein Erfassungssystem, das mindestens zwei Komponenten aufweist,

(c) eine selektiv zugängliche Vesikel mit einem darin enthaltenen in der Oberfläche vorhandenen Liganden oder Ligandenanalogen und einer darin enthaltenen ersten Komponente des Erfassungssystems,

(d) eine Substanz, die die Zugänglichkeit der Vesikel als Reaktion auf die Bindung des in der Oberfläche vorhandenen Liganden oder Ligandenanalogen und des Bindungspartners modifiziert, und

(e) mindestens eine zusätzliche Komponente des Erfassungssystems, die mit der ersten Komponente unter Erzeugung eines erfaßbaren Signals reagieren kann, das durch Anlagerung des Bindungspartners und der die Vesikel modifizierenden Substanz an die Vesikel verkleinert wird.

2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Vesikel eine erfaßbare Reaktion beim Nichtvorhandensein der Anlagerung des Bindungspartners und der die Vesikel modifizierenden Substanz an die Vesikel zeigt.

3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, worin die erfaßbare Reaktion nach der Anlagerung des Bindungspartners und der die Vesikel modifizierenden Substanz an die Vesikel verkleinert wird.

4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Vesikel aus einer Lipidmembran oder einem Phospholipid besteht oder ein Sterin enthält oder ein Amphiphiles umfaßt, an das der Ligand oder das Ligandenanaloge gebunden ist.

5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Vesikel aus einer biologischen Zellmembran besteht.

6. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Erfassungssystem luminesziert.

7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, worin die erste Komponente des Erfassungssystems eine peroxidativ aktive Substanz, wie Peroxidase, enthält und daß die mindestens eine zusätzliche Komponente ein Luminophor umfaßt.

8. Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, worin die mindestens eine zusätzliche Komponente außerdem ein Oxidationsmittel, wie Wasserstoffperoxid, für den Luminophor umfaßt, wobei das Oxidationsmittel ein Substrat für die peroxidativ aktive Substanz ist.

9. Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, worin die mindestens eine zusätzliche Komponente außerdem ein enzymatisches System, wie beispielsweise Glucoseoxidase und Glucose, umfaßt, das ein Oxidationsmittel für den Luminophor erzeugen kann.

10. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Erfassungssystem außerdem ein Energieübertragungssystem umfaßt.

11. Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 9 und 10, worin das Erfassungssystem einen Luminophor und das Energieübertragungssystem Fluor umfaßt, das Lichtenergie bei der Wellenlänge des Luminophors absorbiert und bei einer davon verschiedenen Wellenlänge fluoresziert.

12. Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, umfassend eine zusätzliche Substanz, wie einen Inhibitor, wie Cyanid, der die Lumineszenz des Erfassungssystems nach Veränderung der Zugänglichkeit der Vesikel vermindert.

13. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, worin der Ligand ein Hapten oder Antigen und der Bindungspartner ein Antikörper dafür ist.

14. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die die Vesikel modifizierende Substanz komplement ist.

15. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, umfassend:

(a) einen Antikörper für den Liganden,

(b) Komplement,

(c) einen Luminophor,

(d) Wasserstoffperoxid und

(e) ein Liposom mit einem Liganden oder Ligandenanalogen an seiner Oberfläche und Peroxidase in seinem Inneren, wobei das Liposom ein erfaßbares Signal zeigt, das verkleinert wird, nachdem das Liposom mit dem Antikörper und dem Komplement gebunden ist.

16. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Bestimmung eines Liganden in einer Probe.