JPS6078350A - 逆潜伏特異的結合測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発明は特異的結合測定法、特に臨床的に興味ある物質
の測定のための免疫検定法の分野に関する。特異的結合
測定技術の発達により、液状媒質中に非常に低濃度に存
在する、診断上、医学上、環境上および産業上重要な種
々の有機物質測定のための極めて存用な分析法が提供さ
れた。特異的結合測定法はりガンげ、すなわち測定すべ
き結合し得る被分析物と、それに対する結合パートナ−
すなわち受答体との間の特異的相互作用を基礎としてい
る。受答体の存在は結合されたまたは結合されていない
標識被分析物を機械的に分離するのに利用することがで
き、また標識に影響を与えて検出可能な信号を適当に変
化させるようにすることができる０前者の場合は通常不
均一系と呼び、後者の場合は分離工程が張くなるので均
一系と呼ばれる。りがンＰおよびその結合パートナ−の
一方がハプテンまたは抗原であり他方が対応する抗体で
ある場合はこの測定法は免疫検定法として知られている
。全般的には、オーデル（０ａｅｌ　）およびドーがデ
ィ（Ｄａｕｇｈａｄａｙ　）編、プリンシプルズ　オシ
　コンペテイテイゾ　ゾロテンパインディングアッセイ
（競争的タンパク質結合測定法の原理）、（Ｊ　、Ｂ、
　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ社、フイラデルフイア、１９７
１年）を参照されたい。

従来の標識複合体特異的結合測定法ＶＣおいては、測定
すべき液状媒質の試料を種々の試剤組成物と結合させる
。かかる組成物には標識と一体化した結合成分を含有し
て成る標ｌＩｉ　４）１合体か含まれる。

複合体中の結合成分は、試剤組成物に他のｇ分があれば
その成分および分析すべき媒質中のりガンドと牌に結合
反応系を形成して２種のまたは２形態の複合体、例えは
結合された種（複合錯体〕と遊離種とを生ずる。結合さ
れた種においては複合体の結合成分例えばハシテンまた
は抗原は対応する結合パートナ−例えば抗体によって結
合されているのに対し、遊離種においては結合成分はこ
のような結合をしていない。結合された種になる複合体
と遊離種になる複合体との相対的量または比率は被検試
料中の検出すべきりがンドの存在（または葉）の関数で
ある。

天然の細胞膜の多くの性質は、リポソームと称する簡単
な脂質二分子層系によって再現することができる。これ
らの性質の一つにリーシス（溶解）がある０リーシスは
通常の化学薬品例えば洗剤、または免疫学的反応によっ
て達成することができる。小胞例えばリポソームの膜が
外部から接近し得る抗原を含む場合、これは対応する抗
体と反応して凝果を起す。抗原感作リポソームが補体の
存在において対応する抗体と反応すると膜は非可逆的に
損傷を受け、もはや無傷の選択的透過性隔壁としては機
能しな（なる。これがイムツリシス（免疫溶解）である
。イムツリシスの程度は、従来イムツリシスによって放
出される標識分子を内部に有する抗原増感リポソームを
使用してモニターされてきた。

リポソームの溶解の研究は種々の標識系を使用して行わ
れてきた。リポソーム外部如標識と反応する試剤を使用
しない一つの型の標識系が開示されており、この系では
リポソームは内部に成子常磁性共鳴スピン標識、例えば
安定な遊離基例えばテンポコリンを有している。テンポ
コリンは水溶性であるが膜は透過しないのでリポソーム
または小胞内に囲み込むことができ、脂質二分子層を通
って漏洩することがない。す？ソーム内に囲み込まれた
テンポコリンは小振幅の特有の広い常磁性共鳴信号を生
ずる。これは高濃度のスピン分子が存在しこれらが相互
に近接しているため（？Ｉｔ号を交換するからである。

リポソーム膜が例えば補体による活性化によって破壊さ
れるとテンポコリン分子は放出されて外部媒質中で希釈
される。この結果常磁性共鳴スペクトルには容易に検出
し得る質的および量的の変化を生ずる。、Ｈｕｍｐｈｒ
ｌｅｓ　、　Ｇ、Ｍ。

およびＭｃＣＯｎｎｅｌｌ　、　Ｈ，Ｍ、　、Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　ＡＣａ＋Ｌ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７２：２４８３−２４８７（１９７５
）を参照されたい、さらにまたＷｅｉ等、Ｊ、　工ｍｍ
ｕｎｑｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　、　９　：　１６５−１７０　（１９
７５）　；＋□１１−□□ Ｃｈａｎ　等１．Ｔ、　■ｍｍｕｎＱ１．　Ｍｅｔｈｏ
ｄ８１２１　：　１８５−１９５（１９７８）およびＨ
ｓｉａ等、Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　３０８　：　１５９−１４
８　（１９７８）を参照されたい。リポソーム外部の標
識反応性試剤を使用しない今一つの標識系では、げい光
体例えば１−アミノナフタレン−Ｆ、、６．８−トリス
ルホネートと消光剤例えばａ　、　ａ’−ジ２リゾニウ
ムｐ−キシレンジブロミｈＯとを含有する組成物をリポ
ソーム内部に封入して使用する。リポソームのイムツリ
シスによってけい光体および消光剤が逸出し、続いて外
部媒質中で希釈されるため消光が無くなり高いけい光信
号を生ずる。Ｓｍｏｌａｒθｋｙ等、Ｊ、　ｒｍｍｕｎ
ｏｌ、　Ｍｅｔ’ｈｏｄｆｌ　Ｉ　１５　：　２５５−
２６５（１９７７）およびＧｅｉｇＱｒ等、Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ　ｌ　１７　ニア　−１９（
１９７７）を参照されたい。

今一つの標識系はリポソーム外部の反応環境内で電極を
使用するものである。この一つの例ではカリウムを入れ
たリポソームを使用する。す］ｅソームのイムツリシス
によってカリウムイオンが外部に出て外部環境内のイオ
ン選択性電極と反応する。Ｋａｔｅｕ等、ｃｈｅｍ、　
ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　３０　：１５０４−１５０
７（１９８２）を参照されたい。

テトラペンチルアンモニウムイオンもリポソーム内に封
入されイムツリシスの際にイオン選択性を極を使用して
検出されている。５ｈｉｂａ等、Ａｎａ、１゜（！ｈｅ
ｍ、、　５２二１６１０（１９８０）およびＣｈｅｍ、
−Ｌｅｔｔ’、　１５５　（１９８０）を参照されたい
。またヒツジの赤血球ゴースト（膜）にトリメチルフェ
ニルアンモニウムイオンを負荷し、イオン選択性電極に
よってリーシスの検出を行っている。

Ｄ’Ｏｒａ　ｚ　ｉ　ｏ等、Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、、
　４９　：　２０８３（１９７７）およびＤ’０ｒａｚ
ｉｏら、Ａｎａｌ’　Ｃｈｅｍ。

Ａｃｔａ、　２５　：　１０９　（１９７９）を参照さ
れたい。

ここに述べる第一の型の標識系の一つはリポソームまた
は赤血球膜小胞内に基質を封入使用するものである。リ
ポソームのイムツリシスが起きると基雀が外部に出て、
外部の酵素含有組成物と反応して検出し得る応答を生ず
る。この初期の例ではリポソーム内にグルコースを封入
使用する。イムツリシスによってグルコースが外部に出
、ＩＪ＆ソームからのグルコースの放出は、ヘキソキナ
ーゼ（グルコース−６−リン酸脱水素酵素）および必要
な補助因子の存在におけるＮＡＤＰ＋の還元によって生
ずる６４０ナノメートルにおける吸光度増加により測定
される。Ｈｌｘｂｙ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、６　４　二　２９０−２９５（１
９６９）；Ｋ１ｎ５ｋｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｔｌｔｒ
ｙ　、　１３　：　４１４９−４１５８（１９６９）　
；　Ｋ１ｎ５ｋｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＋　
９　：１０４Ｂ（１９７０）を参照されたい。この型の
標識系のさらに最近の例においては、けい光層基質（ウ
ンベリフェロンホスフェート）または色素原基’［（ｐ
−二トロンエニルホスフエート〕をリポソームに封入す
る。リポソームのイムツリシスによって基質か外部に出
て外部液中の酵素（アルカリ性ホスファターゼ）と反応
する。遊離の基質が生成し、信号の増加が生ずる。Ｂｉ
、ｘ等、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｅｔｒｙ　、　１３　：　
４０５０　（１９７４）　：Ｕｅｍｕｒａ等、Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　、　８７　：　１２２１（１９８０）
；およびＵｅｍｕｒｌｌ等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏａｓ　、５　３　二　２２１−２５２（１９
８２）　を参照されたい。

標識として酵素を内部て耐大保有するリポソームのイム
ツリシスをはじめとする溶解も報告されている。酵素は
外部反応媒質中の基質と反応して検出し得る応答を生ず
る。例えばヘキソキナーゼ（グルコース−６一リン酸デ
ヒｒ口ｒナーゼ）とＢ−ガラクトシダーゼとを含む封入
酵素標識を使用する実験が行われた。Ｋａｔａｏｋａ等
、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　、　２９８　：　１５８
−１７９　（１９７３）、参照。また、西洋わさびのペ
ルオキシダーゼをリポソーム内に封入することができる
。このペルオキシダーゼはイムツリシスに際して外部に
出て次の反応の触媒となる： Ｍｎ” ２　ＮＡＤＨ＋０２　＋　２　Ｈ＋−ン２　ＮＡＤ”　
＋　２　Ｈ２ＯＮＡＤＨの酸化によって酸素が消費され
水が生成する。酸素の消耗を酸素電極によって検出する
。

Ｈａｇ！ｌ　ｌ　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　ＢＩＯｐｈ７８−
　Ｒｅｇ＋’　Ｃｏｍｍ、　Ｉ　９５　＝１８７−１９
２（１９８０）参照。

いくつかの文献には酵素含有リポソームの溶解による酵
素活性の増強についての報告がある。例えばＳｏｌｏｍ
ｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａａｔ
ａ　。

４５５：３３２−３４２（１９７６）はゲルコースオキ
シダーゼ含有リポソームを音波処理または洗剤処理によ
って溶解した場合のこの観察を報告している。封入され
たグルコースオキシダーゼの酵素活性が、非分離型検定
においてリポソームの二倍子層膜のグルコースに対する
透過性の尺度の役をなした。同じ反応混合物において、
グルコースの酸化を酵素含有リポソームの洗剤による溶
解の前および後に酸素電極を使用して酸素の取込みによ
って追跡した。溶解後の酵素活性は俗解前の４．６０倍
も大きいことが観測された。

Ｔｏｋｕｎａ　ｇａ　等　ＣＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ
　、［１０６−＝　８５−８８（１９７９））はアルカ
リ性ホスファターゼ、生−グルコシダーゼと久−がラク
トシダーゼを含有するリポソームの透過性の試験管内非
分＠型側定法を報告している。同じ反応混合物中で洗４
１によるリーシスの前と後とに基質および共役酵素反応
を使用して酵素活性を測定した。アルカリ性ホスファタ
ーゼを使用して観察された酵素活性はり−シス後はリー
シス前の１７．５倍も大きかった。

これらの著者は、もしある酵素−基質対の１かリポソー
ムの内部と外部とで等しいならば、小胞内酵紫活性を基
質の見掛透過速度と関係づけることができると述べてい
る。

Ｍａｇｅｅ等（、ｒ、　ｃｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ　、　
６５　：　４９２−５０４（１９７４））は西洋わさび
ペルオキシダーゼを含有するリポソームを使用している
。西洋わさびペルオキシダーゼの酵素活性を同−反応混
合物内で洗剤によるリーシスの前と後とに分光光度測定
によって測定した。観察された酵素活性のリーシス前後
の比は８．３に達した。彼等は、リボソームはそのポリ
エン系抗生物質に対する感度と免疫溶解に対する感受性
とにより、透過性研究における膜の模型として有用と報
告されていると述べている。

数種の均−系標識複合体特異的結合測定系が既に知られ
ており、その一つはＵｌｌｍａｎらにより米国特許第４
．１９３．９８３号明細書に開示されている。この測定
系においては標識およびリガンドまたはリガンド類似体
が、水性環境中でその状態を保持し得るコロイド状粒子
、例えばリポソームの外部表面に非共有結合的て結合さ
れる。個々のコロイド状粒子は、リガンドまたはその類
似体と標識との平均的空間的関係を実質的に一定に保つ
中心ないし核として作用する。標識とリガンドとを粒子
表面上で比較的接近させておくことにより、標識と標識
の隣りのリガンドに結合された受容体との近接を利用し
て公知技術により標識からの信号を加減することができ
る。イムツリシスはどこにも示唆されていない。実際こ
の文献が明瞭に示していることは、もし小胞が溶解すれ
ば、この分析法に必要な標識とリガンドとの空間的関係
（近接）に悪影響を及ばすであろうということである。

表面に結合したりガンｒまたはりがンｒ類似体と小胞内
部に封入された標識または試剤物質とを有するように製
造または処理された多分子層脂質膜を使用する特異的結
合測定系が提案されている。

この分析における残りの試剤としては（１）りがンドに
対する結合パートナ−例えば抗体および＋２１結合パー
トナーの表面結合リガンｒとの結合に際して小胞の溶解
を起す補体が含まれる。全般九関し、ＭｃＣｏｎｎｅｌ
ｌ、米国特許第３．８５０．５７８号明細書およびＭｃ
Ｃｏｎｎｅｌ’１等、米国特許第３．８８７．６９８号
明細書およびＧｒｅｇｏｒ　１ａｄｉｓ等、Ｌｉｐｏｓ
ｏｍｅｓ　ｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ
　（生物学的系におけるリポソーム）（ジョンウイリー
アンドサンズ、ニューヨーク、１９８０年）、特に第１
２章ｒ　Ｌｉｐｏｓｏ−ｍｅｓ　ａｓ　Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃ　Ｔｏｏｌｓ　（診断用手段としてのリポソーム
）」を参照されたい。

さらに、酵素を内部に封入したリポソームの使用を示唆
した免疫検定系が開示されている。Ｈｓｉａ等の米国特
許第４，２３５．７９２号明ｍ書には標識を貧有する抗
原増感リポソームのイムツリシスを使用する競合的均一
系免疫検定法が記載されている。開示された標識の中に
は酵素も記されている（ゴラム６、第２４−２８行）。

Ｃ０１ｅの米国特許＠　４，３４２，８２６号明細書に
は抗原増感された酵素含有すポソー文を使用する特異的
結合測定系が開示されている。これらのリポソームは対
応する抗体の結合および活性補体の固定によって免疫特
異的に酵素を放出する。酵素の放出により酵素活性の有
無が検出される。ＣＯ１θは酵素活性がリーシスによっ
て本質的に増大するような、例えば１４１号：ノイズ」
比が少くとも５−１０、好ましくは６０以上であるよう
な均−系を提供するという利点を強調している。

小胞標識系を目指す上記の各方法は、標識を反応媒質か
ら隔離してイムツリシス以前の信号発生な最小とする（
ａ伏）点においてそれぞれ何等かの進歩を与えるもので
ある。すなわち無傷のリポソームから観測される信号は
溶解されたリポソームからの信号に比して相当弱い。上
記文献によって示された通り、この目的は、リポソーム
免疫検定の改善において考慮すべき主要な点であると広
く認められてきた。さらに、この分野における文献が総
合的に教える所は、リーシス以前の完全隔離とイムツリ
シス後の高強度信号発生とを組合せれば、得られる利益
はさらに大ぎ（なるということである。

上記の従来の諸方法と対照的に本発明によれば、ある種
の標識含有リポソームは無傷の場合に高強度の信号を発
生し、溶解または膜透過性変化の場合に信号が減少また
は消滅する（逆潜伏）ことが発見された。本発明では、
小胞外部のある試剤が小胞に何等の変化が生ずる前に封
入された標識に接近することができ、小胞の変化によっ
て試験組成物中の他の試剤または成分か標識に接近し得
るようになるような、小胞と選はれた試剤（榎数）との
組合せを使用する。本発明によって得られる従来の均一
系検定法と比較しての利点としては、感度の増加（”少
くとも、血清試料中約１１３−１８モル濃度（Ｍ）の範
囲までのりがンド測定）、血清干渉の減少、均一系特異
的結合測定法の実験記録の単例性、および従来の均一系
検定法におけるよりも広い範囲の昼分子および低分子リ
ガンＰ（被分析物）への適用可能性が挙げられる。

以上の利点は、ｆａｔ　ＩＪガントに対する結合パート
ナ−１（ｂ）少くとも二つの構成要素を有する検出系、
Ｉｃ１表面に合体したりがンドまたはリガンド類似体と
内部に前記検出系の第一の構成要素を有する選択的に接
近可能な小胞、（ｄ）表面合体リガンｒまたはりがンド
類似体と結合パートナ−との結合に応答して小胞の接近
可能性を変化させる物質、およびｔｅｌ前記第一の構成
要素と反応して検出し得る応答を生じこの応答は結合パ
ートナ−および小胞変性物質と小胞との反応によって低
下するものとする、前記検出系の少（とも一つの追加的
構成要素を含有して成る、試料中のリガンド測定用組成
物によって達成される。

さらに不発明によれば、本発明の試験用組成物をリガン
Ｐを含むと思われる試料と混合し、検出し得る信号に生
ずる変化を観測することがら成る、試料中のりがンー測
定のための特異的結合測定法が提供される。好ましくは
上記混合工程は、リガンドを含むと思われる試料、該り
がンドに対する結合パートナ−、ルミネセンス剤、補体
およびりがンにで増感したペルオキシダーゼ含有リポソ
ームの混合物をつ（す、この混合物をインキユベートシ
、その混合物を過酸化水素と混合することから成る。１
１へ酸化水素との混合後混合物のルミネセンスを観察す
る。ルミネセンスの強度と継続時間との増加は試料中の
りがンドの濃度増加と直接に関係し、またその濃度増加
の結果である。この信号増大は、リポソーム表面に結合
すべき結合パートナ−が減少しリポソーム表面で補体の
固定が始まることと関係している。先に記したようにこ
れは、従来観察された信号応答の場合には試料のりがン
１濃度が高いほど観察される信号が低いのと対照的であ
る。

先に述べた通り本発明のリポソームは俗解した場合より
も無傷の場合の方が高いルミネセンスを示す０この現象
は、このようなリポソームがリガンドまたはりがンｒ類
似体で増感された場合、有用で新規な均一系免疫検定法
の基礎を与える。これらは特異的結合パートナ−例えば
抗体と相互に作、用して、補体の存在においてリーシス
を起す組成物を与えることができる。かかるリーシスの
結果ルミネセンスは減少する。一方において、試料中の
りがンげは増感されたリポソームと抗体獲得を争い、こ
の競合の程度に応じて補体によるり−シスが減少する。

このため、試料中のりがンｆａ度が増加するとルミネセ
ンス強度が増加するという関係の薬量一応答曲線が得ら
れる。

本発明の好ましい態＠圧は、ルミネセンス性特異的結合
測定用試薬組成物、この試験用組成物の一つ以上の成分
を組入れた試験装置、試験用組成物の一つ以上の成分を
それ尋れ組入れた容器または装置を他の成分または材料
と組合せ包装したものから成る試験用キット、および本
発明のこの試験用組成物、装置およびキットを使用する
方法が含まれる。以下の記載において特定の態様のみに
ついて使用される特定の用語は特記しない限りすべての
態様（（対し適用されるものである。

試験の対象となる試料液体には生物学的、生理学的、産
業的、環境的およびその他の種類の液体が含まれる。特
に興味かあるのは生物学的液体、例えば血清、血漿、尿
、脳を髄液、唾液、ξルク、肉汁その他の培養地、およ
びそれらすべての上澄液並びに両分である。興味ある生
理学的液としては輸液、緩衝液、防腐または抗菌溶液等
が挙げられる。産業的の液としては、例えば医薬、乳製
品、麦芽発酵飲料の製造に使用する発酵培地その他の製
造工程液か挙げられる。従来の方法によって試験される
その他の起源の試料液もこの用語の範囲内にあると考え
られ、同様に本発明に従って測定することができる。

１リガンド」なる用語は、試料液例えば上記したような
試料液中のその存在を定性的または定量的に測定すべき
任意の物質、または園類の物質の群をいう。本発明の測
定は特異的結合パートナ−の存在するリガンドの検出お
よび、逆に、ある液体媒賀がリガンドを結合する（通常
試料中のりガントに対する結合パートナ−の存在によっ
て）能力の検出に適用することができる。リガンドは通
常ペプチｒ１　タンパク質、炭水化物、糖タン／９り質
、ステロイｒまたはその他の有機分子でその時角的結合
パートナ−が存在するかまたは免疫学的もしくは合成的
手段によってそれを与えることかできろものである。機
能的用語を用いるならば、りがンｒは通常、抗原および
その抗体、ノＳｆテンおよびその抗体、ならびにホルモ
ン、ビタミン、中間代謝物および薬理学的剤、およびそ
れらの受容体および結合物質から選ばれる。本発明を使
用して検出し得るりがンドの具体例としてはホルモン例
工ばインシュリン、絨毛膜生殖腺刺戟ホルモン、チロキ
シン、トリヨーげチロニン、卵胞１１ｉ１１１１ホルモ
ン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺戟ホルモンおよびエス
トリオール；抗原およびノーブテン例えばフェリチン、
プラジキニン、プロスタグランジンおよび腫瘍特異性抗
原；ビタミン例えばビオチン、ぎタミンＢｘ２、ＪＡＲ
ｅ　、ビタミンＥ１　ビタミンＡ１およびアスコルビン
酸；中間代謝物例えば３’、５’−アデノシンモノホス
フェートおよび６′。

５′−グアノシンモノホス７エート；薬理学的剤または
薬剤例えばアミノグリコシ１抗生物質例えばｒシソミシ
ン、アミカシンおよびシソミシン、または乱用性薬物例
えばアヘンアルカロイｒおよび変角誘導体；抗体例えば
肝炎およびアレルゲンに対するミクロソーム的抗体；お
よび特異的結合受容体例えばチロキシン結合グロブリン
、アビジン、内因性因子およびトランスコバラミンが挙
げられる。

「結合パートナ−」または「受答体」なる用語は他の物
質よりも優先的にりがンドに対して特異的結合受容体性
を存する任意の物質、または物質群を指す。本発明の実
施態様の大部分においては、試料中のりがンドまたはそ
の結合エフェクターと免疫化学的に相互作用を行う特異
的結合測定用試剤が使用される。すなわち、試料中のり
がンｒまたはその結合エフェクターおよび（または）試
剤の間には抗原−抗体またはハシテン−抗体関係が生す
る。従ってかかる測定は免疫検定と呼ばれ、りがンにお
よびその受容体、または結合パートナ−との間の特殊の
相互作用は免疫化学的結合である。モノクローナル抗゛
体は特に適当な受容体である。しかしホルモン、ビタミ
ン、中間代謝物、薬理学的剤、およびそれらそれぞれの
受容体および結合物９４間の相互作用を含め、りがンド
と結合パートナ−との間のその他の結合相互作用が特異
的結合受容体の基礎として役立つことは当業界でよ（知
られている。例えば結合剤またはパートナ−としてのポ
リペプチドホルモン受容体がＬａｎｇａｎ等（編）、リ
ガンドアッセイ（りがンド検定）（Ｍａｓｓｏｎ　Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｕ、Ｓ、Ａ、社、ニューヨーク、２
１１頁以降（１９８１年））に論じられている。

「選択的て接近し得る小胞」なる語は、内部のある容積
を囲い込み、一つ以上の成分から構成され上記の内部容
、償を構成する一つ以上の内部隔室を形成する壁を有す
る、単一のまたは多（の隔室から成る嚢を指す。か＼る
小胞の一例は、細胞膜を開いて内部の成分を除去し、膜
を再シールして形成される細１把イーストである。別の
例は、連続壁すなわち二倍子１−脂質膜を形成する脂質
、特に少くとも一つのリン脂質を含有する脂質混合物力
）ら成る単−室または多室の小胞であるリポソームであ
る。これら脂質混合物の共通的成分はコレステロールで
ある。全脂質モル当り約１０−４０モル係のコレステロ
ールを含有する脂質混合物か本発明の組成物および方法
に有用なリポソーム製造に使用し得ることが判明した。

リポソームは任意の多（の方法によって製造することが
できる。例えば多層小胞（ＭＬＶｓ　）はフィルム蒸発
および脂質フィルムの水利によって製造することができ
る。

逆相蒸発小胞（ＩＶＥＩ　）も製造することかできる。

これらは有用な小胞の提供技術の例の二三を示したもの
である。ＩＪポソームおよびその形成の概説については
、Ｐａｐａａｈａｄｊ　ｏｐｏｕｌｏｅ等（編）、リポ
ソームズ、Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ；　ＡｃａｃＬ、　Ｓｃｉ
、＋　３０８巻（１９７８年）　；　Ｔｏｍ等（編）、
Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ　（リポソームおよび免疫生物学）、ｇｌｓｅｖｉｅ
ｒ　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌｌａｎｄ社、　＋ｑ、ｙ、（１
９８０年）；およびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ等、Ｌｉｐ
ｏｓｏｍｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏ’ｌｏｇ１−ｃａｌ　Ｓｙ
θｔｅｍｓ　（生物学的系におけるリポソーム）、Ｊｏ
ｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ社、　Ｎ、Ｙ、　（１
９８０年）を参照されたい。

リポソームは表面に合体したりガンＰまたはりがンー類
似体部分を有するようにっ（ることができる。かかるリ
ポソームはりがンげ一両親媒性物質複合体（通常リガン
ド−カプラー−両親媒性物質分子の形をとる）を使用し
て形成される。両親媒性物質は水溶性と水不溶性の両領
域を含有する物質である。その最も良い例は脂質両親媒
性物質、例えばホスファチジルエタノールアミン、ホス
ファチジルセリン、ホス７アチジルイノシトール、スフ
ィンゴミエリンセレゾロシげ、ホスファチジン酸、ゾラ
スマロデン、カルシオリピンおよび脂肪酸である。

対象の抗原性物質を両親媒性分子にカップリングするに
は、種々のカップリング剤およびカップリング反応を使
用することができる。すなわち例えば抗原性物質のカル
ボン酸基を両親媒性分子のアミノ基と１１接反応させて
カップリングし、Ｎ置換基が両親媒性分子の残基である
抗原性Ｎ酋換アミドを製造することができる。別の例で
は抗原性物質を両親媒性物質てカッシリングするために
特定の試剤を使用し、このカップリング試剤を先ず抗原
性物質か両親媒性分子かのいずれかと反応させて反応性
中間体または前駆体を製造し、次にこれをさらに反応さ
せて最終のりがンｒまたは増感剤複合体を製造すること
ができる。かがるカップリング試剤の例としてはアシル
イソシアネート、４′″フルオロ−３−二トロフェニル
アシケ、オヨびマレイン酸とその誘導体（アミン基と反
応させてｗ、Ｎ′−置換マレイミドを得ることができる
）が挙げられる。抗原を選ばれた両親媒性物質例えばホ
スファチジル−エタノールアミン、−七リンまたは−イ
ノシトールと先ず反応させ次に脂質混を合物中に加えて
この混合物からリポソームを形成し得るということはこ
の場合極めて好都合である。

何故なら、このカップリング反応は、必ずしも他の、例
えば酵素含有の系と相溶性であることを妥しない各４８
媒中で実施し得るからである。

別の方法として、りがンｒをあらかじめ形成されたリポ
ソームの表面に共有結合によって結合しまたは吸着させ
ることができる。リポソームをあらかじぬ形成する場合
その外部表面に、抗原が共有結合によって結合し得るよ
うないくつかの化学的官能性を持たせることができる。

これらのうち重要なものとしては、ホスファチジル−エ
タノールアミンから導かれるアミン基、ボス７アチジル
ーイノシトールによるヒドロキシル基、および脂肪酸ま
たはホスファチジル−セリンによって与えられるヒドロ
キシル基が挙げられる。この鳴合抗原をあらがじめ形成
したリポソームにカップリングするには、二官能性カッ
プリング剤、例えばグルタルアルデヒー、ジイミドエス
テル、芳香族または脂肪族ジイソシアネート、ジカルボ
ン酸のビス−ｐ−ニトロフェニルエステル、芳香族ジス
ルホニルクロリドおよび二官能性ハロゲン化アリール例
えば１．５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、
ｐｌｐ′−ジフルオロ−ｍ　、　ｍ’−ジニトロジフェ
ニルスルホンを使用する在来の化学反応によることがで
きる。かかるカップリングに適用し得る適当な反応はＷ
ｉｌｌｉａｍｓ等１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＩｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　工ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　（免疫学および免疫化学における方法）、第１巻、
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社、ニューヨーク（１９６
７年）に記載されている。ある場合には、ＴＪｅｍｕｒ
＆およびＫ１ｎ５ｋｙ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｒ　１１　：　４０８５−
４０９４（１９７２）に示されるように、抗原をリポソ
ーム表面に吸着させることができる。

本発明の組成物はさらに、表面合体リガンドまたはりが
ンド類似体と結合パートナ−との結合に応答して小胞の
接近可能性を変化させる物質を含有する。この物質の主
要な例は、一括して補体と呼ばれる一群の化合物である
。補体は、細胞膜破壊またはリーシスを通ずる免疫複合
体により誘起される組織損傷の主要な体液性エフェクタ
ーの一つである。補体固定抗体の小胞、例えばリポソー
ムまたは細胞ゴースト表面のりガン−またはリガンド類
似体への結合により補体の固定が誘起されることか判明
している。その結果として、実際の膜破壊またはり−シ
ス、もしくはそれが無ければ無１易の筈の膜内の機能的
「孔」の生成を通じて生ずる膜の透過性の変化によって
、小胞内部に存在した検出系成分が放出され、または外
部媒質中のｈｖ、分か小胞内の噴出成分に接近すること
が可能となる。使用する補体の入手源となる動物種は、
公知の反応性によって抗体および抗体増感免疫原の源と
相容性でなければならない。補体とその効果の概論につ
いては、Ｒａｐｐ等、Ｍｏｂ−ｏｃｕｌａｒ　Ｂａ５ｉ
ｓｏｆ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ’　Ａｃｔｉｏｎ　（補
体作用の分子的基礎）Ａｐｐｌｅｔｏｎ−Ｃｅｎｔｕｒ
ｙ−Ｃｒｏｆｔｅ社（１９７０年）を参照されたい。ま
た補体の役割については先ｆ引用した他のリポソーム免
疫検定法に関する文献の多くに論じられている。

本発明の組成物には、少（とも二つの成分を含む検出系
が使用される。第一の成分は小胞内部にあり、少（とも
一つの追加的成分は第一の成分と反応して検出０Ｔ能な
応答を生ずることができ、この応答は結合パートナ−お
よび小胞変性物質と小胞との結合によって低下するもの
である。この主髪な例はルミネセンス検出系である。ル
ミネセンスは化学的な発光である。放射された光の測定
に基礎をおく分析は従来法に比して、高感度、広い直線
的範囲、−試験当りの低コスト、および比較的簡単で安
価な装置等の長所を有する。寿も興味を持たれているの
は化学ルミネセンス（ＣＬ　）および生物発光（ＢＬ　
）である。後皆は生物学的系に見いだされる特殊な形式
のルミネセンスに対して与えられた名称で、触媒作用を
するタンパク質がルミネセンス反応の効率を増加させる
。実際、ある鵬合にはタンパク質成分なしでは反応は不
可能である。一般論についてはＫｒ　ｉ　Ｏｋａ等（編
）、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅ　（臨床的および生化学
的ルミネセンス）　（Ｍａｒｃｅｌｌ）ｅｋｋｅｒ社、
Ｎ、Ｙｌ、ＮＹ（１９８２年）　；　ＤｅＬｕｃａ等（
編）、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｊｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈ
ｅｍｉｌｕｍｉｎｅ−ｓｃｅｎｃｅ　、　Ｂａ５ｉｏ　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＡ
ｐｐ’１ｉＣａｔｉＯｎｉｉ　（生物発光および化学ル
ミネセンス、基鍼化学および分析的応用）　（Ａｃａｄ
θｍ１ｃｐｒｅｓｓ社、Ｎ、Ｙ、、ＮＹ（１９８１年）
）；Ｍｏｒａｗｅｔｚ　２！ｆｌ（編）　、　Ｌｕｍ１
ｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　Ｂｉｏｌｏ−ｇｉｃａｌ
　ａｎｄ　５ｙｎｔｈθｔｉｅ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃ
ｕｌｅｓ　（生物学的および合成、曾３分子からのルミ
ネセンス）、＠８回Ｋｑｔｚｉｒ会議、Ａｎｎ、　Ｎ、
Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　３６６巻（１９８１年
））：およびＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆＩｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａＩＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌＡｐｐｌｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉ−１−ｕ
ｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　（生物発光および化学ルミネセ
ンスの分析的応用に関する国際シンポジウム紀要）（５
ｔａｔｅ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　＆　Ｐｕｂｘｉｓｈｉｎ
ｇ社、Ｗｅｅｔｌａｋ６Ｖｉ１．１ａｇｅ　、カリホル
ニア（１９７９年））を参照されたい。

溶液中におけるＣＬの過程には次の三つの段階がある：
（ａ）予備的反応による、鍵となる中間物の生成、（ｂ
ｌ　ｍ的中間物の化学エネルギーが電子的励起工不ルヤ
ーに転換される励起工程および（ｃｌ化学反応によって
生成した励起された生成物からの光の放射。一般に反応
物には酸化剤と還元剤とが含まれ鑵元剤か、酸化される
結果として発光する。

触媒、例えばヘムまたはペルオキシダーゼを含有する方
が好ましいことがしばしばある。この項に述べるＣＬ反
応はすべて、酸化剤の過酸化水素を検出するのが共通の
特徴である。このため臨床化学者にとっては特に興味あ
るものとなる。というのは現在多（の臨床的測定に使用
されて（・る比色的過酸化物検出法に代る方法となり得
るからである。

一般に過酸化水素は嘴も普通に使用される酸化剤である
。１吏用されるその他の酸化剤としてはエチルヒげロペ
ルオキシＰ１次亜塩素ｒｆ！塩、ヨウ素、過マンガン酸
塩および適当な触媒の存在における酸素が挙げられる。

中間体または最終生成物として酸化剤例えば過酸化水素
を生ずる共役酵素系をはじめとする酵素系が、本発明に
よるルミネセンス検出系用のかかる酸化剤の源として使
用されてきり。例としてグルコース／グルコースオキシ
ダーゼまたはグリセロール／グリセロールオキシダーゼ
反応による過酸化水素の生成かある。

過酸化水素との反応の結果としての化学ルミネセンスの
現象は元を発する数種の還元剤化合物（ルミネセンス発
光団）、特に環式ジアシルヒドラジげ妬おいて見いださ
れている。最も普通に使用されるもの−一つはルミノー
ル（５−アミノ−２，６−ジヒーロフタラジンー１．４
−ジオン）である。アミノ基の位置の移動は効率を低下
させる。例えばイソルミノール（６−アミノ−２，６−
ジヒドロフタラジン−１，４−ジオン）の効率はルミノ
ールの１０％である。環構造における置換はルミネセン
スに著しく影響する。ベンゼン核における電子吸引性置
換基はルミネセンスを減少させるがボ子供与性の置換基
は光効率を増加させ、５および８位の置換は６および７
位よりも有効である。複素環を置換すると発光は全く起
きな（なる。ルミノールの仔環同族体でルミノールより
６００％も効率の良いものが製造されている。

Ｍｅ　ｃａｐｒａ　、ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅ　ｏｆ　ＯｒｇａｎｉｃＣｏｍｐｏｕｎｄ
ｍ　（有機化合物の化学ルミネセンス）、Ｑ、　Ｒｅｖ
　（四半期報）（ロンドン）、２０　：　４８５（１９
６６）を参照されたい。ルシｒニンス（例えばビス−Ｎ
−メチルアクリゾニウムナイトレート）、アクリジニウ
ムフェニルカルボキシレート、シラ酸ジアリール例えば
ビス（トリクロロフェニル）オキプレート、ロフィンお
よびポリヒげロキシフェノール例えばピロガロールまた
は没食子酸を使用するものを含めてその他いくつかの化
学ルミネセンス系が開発されている。ルミネセンスおよ
びその化学的測定における役割りに関する優れた概観が
、Ｇｏｒｕｌｉｌ等、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ
　Ｂｉｏ−ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ
ｅ　ｉｎ　ｔｈｓ　Ｃ］、１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　（臨床研究室における生物発光および化学ルミ
ネセンスの応用）　、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈθｍ１２５：５
１２−５１９（１９７９）およびＷｈｌｔｅｈｅ　ａａ
　等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃ
ｅ　二　ＩｔｓＰｏｔｅｎｔｉａｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃ
１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（分析用ルミ
ネセンス：その臨床試験室における使用可能性）、Ｃ１
１ｎ、Ｃｈｅｍ、２５：１５３１−１５４６（１９７９
）によって得られる。

先に記したように、生物発光（ＢＬ）は生物学的系に見
いだされるルミネセンスの一形式である。

大部分のＢＬ系においては、酵素であるルシフェラーゼ
かＪＥＡＮのルシフェリンのルミネセンス的２化の触媒
となる。「ルシフェラーゼ」なる−役名は＄質例えばル
シフェリンの酸化の触媒となって発光を生ずる酵素を指
す。「ルシフェリン」なる−役名は、酸化されて電子的
に励起された一重項状悟となることができ、かつ基底状
態に戻る際に光を定する、遣元された化合物を指す。こ
れらの系のうち締もよ（研究されたものは螢のもので、
これＣＣ対する反応は次式で示される：この反応はグリ
シン緩衝液（ｐＨ７−８）中で約２５′ｃで行うのが最
も良い。その他のＢＬ系の大部分は〃σ洋有機物、例え
ば海洋バクテリアにおいて観察されている。例えばビブ
リオ　フィッシェリ（’Ｖｉ’ｂｒｉｏ　ｆｉｓａｈｅ
ｒｉ　）およびヘネケアハルヘイイ（Ｂｅｎｅｃｋｅａ
　ｈａｒｖｅｙｉ　）における反応系は次のように示さ
れる： この反応においてＲＣＨＯは長鎖脂肪族アルデヒｒであ
る。この反応は２５℃以下でＶ、　ｆｉｓａｈｅｒｉに
対してはＰＨ約６．４−７．２の範囲、Ｂ、　ｈａｒｖ
ｅｙｉに対してはｒｆｆ　５．６−６．８の範囲で最も
良く行われる。

これらの、およびその他のＢＬ系もＧ□ｒｕｓ等（上田
）およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ等（上田）　ＩＣ詳細に論
じられている。

［過酸化的に活性な物質」なる語は、考慮対象の物質の
正確な化学的活性を定義するものである。

ペルオキシダーゼは、過酸化水素が他の物質を酸化する
反応を促進する＃素である。ペルオキシダーゼは一般に
鉄ポルフイリン部分を組込んだタンパク質である。ペル
オキシダーゼは西洋わさび、じゃがいも、いちじく樹液
およびがぶ中に（植物ペルオキシダーゼ）、ミルク中に
（ラクトペルオキシダーゼ）、そして白血球中に（ベル
ドペルオキシダーゼ）存在する。このものはまた、微生
物中に存在し発酵によって製造することかできる。

あるｒ＠の合成ペルオキシダーゼ、例えばＴｈｅｏｒθ
１１およびＭａｅｈｌｙによりＡｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　
５ｃａｎｄ、、　４二４２２−４３４（１９５０）に開
示されたものもＨ２Ｏ２検出系に十分使用できる。より
不満足なものとしてはへミン、メトヘモグロビン、オキ
シヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモクロモゲン、アル
カリ性ヘマチン、ヘミン誘導体および過酸化物またはペ
ルオキシダーゼ様活性、すなわち他の物質の過酸化水素
その他の過酸化物による酸化を促進する能力を示すある
種の池の化合物等がある。

酵素ではないが過酸化的活性を示す他の物質としてはシ
リカゲルに吸着した第ニクロム塩（例えば硫酸クロム（
組カリウム）、スルホシアン酸鉄、タンニン酸鉄、７エ
ロシアン（Ｉｆ−鉄ｅがある。

前記したよつにルミネセンス検出Ｗおいテハ光エネルギ
ーが発生する。このエネルギーは別の波長の、または全
（異る型の、検出し得る応答な生ずる別の分子に転移す
ることかできる。例えば叶い先回を検出系に加えること
ができる。ルミネセンス発光団とけい先回とは、叶い先
回の励起波長の光が放射されるように選ぶことかできる
。従って選択した叶い先回によって規定される波長の叶
い光が検出される。この、またその他のエネルギー転移
機構をルミネセンス系と組み合せて検出し得る信号を自
由に変化させることができる。エネルギー転移系の一つ
の利点は、被測定試料の固有のまたはバックグラウンド
発光でルミネセンス系によって生ずる信号と容易に識別
ができないものの干渉を克服または防止し得ることであ
る。

さらに、種々の阻害剤、消光剤または調節剤を添加して
検出系の反応性または信号を変化させることができる。

酵素活性を阻害または低下する物質は既知であり、これ
を添加して酵素がリポソームから放出された場合これに
影非を与え、またはリポソームの透過性が変化した〕賜
金にこのリポソームを透］ｄするようにすることができ
る。例えは、シアンイオンは測定系にそれ以外の影＃ケ
及ばさすに、放出されたペルオキシダーゼの活性を低下
させることが認められた。またペルオキシダーゼ活性を
阻害する抗体が記載されている。ルミネセンスまたは叶
い光信号を消す物質を添加して、観測される逆潜伏現象
を増強することができる。このような消光物質および機
構かい（つか知られている。例えば上述のルミネセンス
／けい光エネルギー転移は、抗原／抗体結合が生じた場
合にそのけい光が消されるような叶い光物質を使用して
達成することができる。このことは在来の結合測定系と
関連して、Ｊ、　Ｃ’ｌｉｎ、　Ｐａｔｈ、、　３０−
二５２６（１９７７）に記載されている。酵素モジュレ
ータ−系はＢｏｇｕｓｌａｓ’に１等の米国特許第４．
１３４．７９２号明細書に記載されている。

不発明の測定方法には通常、リガンげ含有試料、リガン
ｒ増感、ペルオキシダーゼ含゛有リポソームに峙蹟的な
抗体および補体の組合せが含まれる。

適当なインキュベーション期間後、上記混合物をルミネ
センス性化合物および酸化剤としての過酸化水素と混合
する。これによって生じたルミネセンスを感光性検出器
例えば光電子増倍管、写真フィルムまたは半導体ダイオ
−１等によって測定する。

以下の実施例に本発明の開発において実施した実験を記
述する。可能な場合には常に市販の標準的な試薬級薬品
？使用した。

例　１ ルミネセンス注リポソーム系の逆浦伏 本例に示す実績は西洋わさびベルオキシタ゛−ゼを含有
するリポソーム（ＨＲＰ　／リポソーム）、化学ルミネ
センス性（ＣＬ　）化合物およびＯＬ化合物に対する酸
化削馨含付して成る反芯晶会物にリホソーム馨蔭解する
洗剤を作用させた場合のその混合物のルミネセンスの変
化を示すものである。

以下に述べる辿り極めて予想外の現象が覗際された。

西洋わさびペルオキシダーゼ含有リポソームは次のよう
にして調装した。クロロホルム−メタノール（容積比４
：１）１２ＩＩＬｅ中１ｆＪ　し’／　ｆ　７　（シグ
マケミカル仕、セントルイス、ミズーリー）１５ｑＩｙ
　、ジセチルホス７エート（シグマケミカル仕、上吊）
６ヤ、コレステロール１．１ψの混合物をなし型フラス
コの内聞とで蒸発し℃脂質フィルムを作成した。水アス
ピレータによる減圧下４０℃で４乾ｓフイルムが認めら
れるまで蒸発を行い、次にこのフィルムｆｃ　０．５　
ｍｍ　Ｋｇの減圧下で２時間さらに乾燥した。得られた
脂質フィルム？、緩＃ａ１ａｌ当り２．０％’の西洋わ
さびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（マイルズラボラトリ
ー社、エルカールト、インディアナ）を含有するトリス
緩慟液４．Ｑｍにより、棒磁石でかぎまぜながら４′′
Ｇで一夜水和した。トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（ＴＲＩＳ）の緩淘原液（トリス緩備液）はトリ
ス浴液（６０，５ｊｉ／１Ｘｐ８８．６　）　１００ｍ
２ＮａＣ６ｉ液ぐ５８．６＆／１）１５０酩と（昆合し
蒸留水でｉ、ｏｚとして最終濃度ぞトリス０．０５　Ｍ
ＸＮａＣ２Ｃ１，１５Ｍ　トすることによって装造した
。かくして生成したリポソームは、１．５　ｘ　５２ｃ
ｒｔ＋のセファロース６Ｂ（ファルマシアンアイ／　ケ
ミカルズ社、ビスカタウエイ、ニューシャーシイ）カラ
ム上側＊＠ｍａ１・０−でトリス緩伺液？浴離削とする
ゲル排除クロマトグラフィによって遊離ペルオキシダー
ゼと分離した。浴出Ｖｅｊ、ｉ、ａｍづつの４０画分馨
染めた。

ＨＲＰ　／リポソームシエギル７オード２５０型分元元
度計（ギルフォーに　インストルメント社、オベルリン
、オハイオ）？使用して４１．ＯｎｍｌＣおけ６吸元度
ピーク（を蜀りによる）の存在によって確認される辿り
画分１１−１４に単離された。画分１２と１５と？せ−
し４℃で窒素ふんい気下に貯蔵した。

ルミノール試楽曲１反を二次のようにして製造した。

ルミノール（アルドリッチ　ケミカル社、ミルクオーキ
ー、ライスコンジン）　２２１．５９１＋／＆　）　１
７ス緩＋ａｑａ５０ｔｎｌｖＣ（ｍｍシ、ｔｌｔ、ｌｃ
５　（１％　（Ｗ／Ｖ　）ＮａＯＨ４（岡馨）３０え℃
ルミノールを完全ｔＣ俗解させ２．５　×１　（３−２
ｙ、のルミノール浴奴とした。この俗、Ｈ３，５＋ｕｇ
ｙ　トリスｍ１旬？１３Ｅ４９．５”’と混甘しルミノ
ール嬢度２．５　Ｘ　１　ｖ−′Ｍのルミノール試楽浴
液トした。

Ｈ２Ｏ２試楽に５Ｕ条（Ｖ／Ｖ）Ｈ２０２水浴孜（フィ
ッシャ　サイエンティフィック社、オレンゾグルダ、ニ
ューヨーク）１４μｔＷトリスｍ　倫ｉｆ　５０ｍ１に
加えて調装した０ 合一したＨＲＰ　／　ＩＪボソーム画分（画分１２およ
び１６）を次のようにしてＨ２Ｏ２の存在でルミノール
の接触的酸化により検定した。トリス緩＃液中ＨＲＰ　
／　ＩＪボソームの一所の希釈度のもの１．　Ｑ　ｒｎ
ｌづつ？調製した。同じ一連の希釈度のものをトリトン
−Ｘ−１００（ローム　アンタ　ハース社、フィラデル
フィア、ペンシルバニア）１％（Ｗ／Ｖ）乞會むトリス
酸価液中で調装した。皓布択液１００μｔぞ、ターナ−
２０型ルきツメ−ター（ターナーデずイン杜、マウンテ
ンビュー、カリホルニア）内に位置しトリス緩伺欣中２
．５　Ｘ　１ｆＪ−”Ｍ　Ｈ，０２２００μｔと２．５
　Ｘ　１０−’　Ｍルミノール２ＬＩＯμＬと？入れた
刀１」々のポリプロピレンチューブに注入した。このよ
うにして、測定すべき特定の又応混付物内で反応を開始
させた後台混合物のルミネセンスＹ、０．５秒の□□□
ｍｕ＃間後６０秒間１ｇ号乞禎算してモニターシ１ｆ−
駕のルミネセンス単位としてｄ己録した。リポソームの
合ａ釈朋にメリし”（トリトンｘ−ｉｏｏで化学的に６
屏したＨＲＰ　／リポソームおよび）、１１１ｉ湯のＨ
ＲＰ／リホソームにつｂて畝側された４＊算ルミネセン
ス、ならびに俗解されたＨＲＰ　／　ＩＪポソームと無
傷のものとの信号の比（Ｌ／工）乞纂１衣に示す。

第　１　衣 １１５　１４０’　６７０　０．２１ １／１０　１８．８　３２４　［，１，０６１１５０１
，５、６４Ｌｌ−，０２ １／１００　０．７　５０．　０．０２１　／　５００
　ＦＪ、２４　６．２　［Ｊ、０４１１　０．１９　０
．２９　０．６６ 第１＆のデータは予期しなかった現象？夷証し℃いる。

無局のリポソームについて−６４１１されたルミネセン
スは化学的に冷解されたリポソームのよりも大きい。こ
れは、俗解されたリポソームのルミネセンス応答ソ燕場
リポソームのルミネセンス応答で除した比が１．０より
小さいとい５点で逆暦伏ゼ衣わしている。この咲祭は、
後の実施例で示すよ５に、無傷のリポソームからのルミ
ネセンスがｄ屏されたリポソームからのルミネセンスよ
り大きい特異的結合測定法の構成の基礎をなすものであ
る。

図１２ 次の実験はＩ＋！Ｉ　１において観察され報告されたよ
うな、無傷のリポソームのルミネセンスが化学的に浴燐
されたリポソームの「消光された」ルミネセンスより大
きいとい５ことが、遊離のペルオキシダーゼ゛が浴屏Ｒ
ｊ例えばトリトン−ｘ−’ｉｏｏ洗伊削の＃ψぞ受け着
花的に不活性化されることによって起るのか台か？検討
するために行ったものである。

先ｔ’ＸＨＲＰ２．Ｏｑｖｗ　トＩ）　スｇｄ［５，Ｕ
　ａＫ　浴’Ｗｆして、吸光率９１　ｍＭ−１６’Ｉｎ
−１’＆　、ｙ用して４０５　ｎｍにおける吸元度での
測定による一ＲＩ　Ｘ　１０−５　Ｍ）（ＲＰ　Ｏ）　
ＨＲＰ　ｍ　ａ　ｗ　ｍ　装した。コのＨＲＰ　ｍ［’
ａ＝　トＵス緩健孜中で一連の希釈莢に希釈した。トリ
トン−Ｘ−１０υ　１％（Ｗ／Ｖ）乞含有するトリス緩
備牧中で同じ一連の′８ｉ択度の液を調製した。これら
の冷液のそれぞれから１００μｔをとり、ターナ−２０
咲ルミノメータ−内に位置しトリス緩寓液中２．５　ｘ
　Ｉ　Ｌｌ−”　ＭＨ２０２２００μｔと２．５×Ｉ　
Ｑ−’　Ｍルミノール２００μｔとを入れた別々のｄ×
５０−のポリプロピレンチューブに注入した。

二のようにして測定すべき特定の反応混付物中でノえら
を開始させた倭・台混＠物内のルミネセンスを０．５砂
のＮ　を時間後６０秒間積算してモニターし６己録した
。４希釈度に３けるトリトン−ｘ−ｉｏ。

あり、およびなしでのＨＲＰ　％液について一測した偵
−４化字ルミネセンスならびにその比？第２表にボ丁。

＠　２　表 ＣＬｌｉ、ｉ　ＣＬ応答 ２Ｘ１υ−’　１８８６　１５９８　７．１８！：ｌ　
ｘ　１１１−”　５５５　２９５　１．２０ｄ　Ｘ　１
０−８２４７　２０２　１．２２ムｂＸＩＬｌ−８１２
６１０１１，２５ｕ　Ｌｌ、１　’　ｏ、ｉ　ｉ、ｏｕ トリトン−Ｘ−１００の存在する場合、Ｈ２Ｏ２による
ルミノールのペルオキシダーゼを触媒とする酸化の促進
が認めろ７’した。すなわちトリトン−Ｘ−１００＆Ｘ
ルきノールのベルオギシダーゼ接触酸化乞阻害せず従っ
て前例に述べた消光現象の原因ではない。

例　５ 次の笑験）工Ｈ２Ｏ２によるルミノールの遊離ベルオキ
シダーセ゛７ａｌ−触媒とする酸化において銭祭される
化学ルミネセンス１百号に対する全のリポソームの影暫
乞検討するために行った。これは逆（倚伏現慮が遊離ペ
ルオキシダーゼと空のリポソームとの共存によって生ず
るのか台かを確めるために何っだものである。

リポソームは次のようにして、Ａ偏した。元ず４：　Ｉ
　ＣＨＣｌ３／メタノール（Ｖ／Ｖ）ｉ５＋＋ｕ中ｄｉ
　Ｖシチンノ、５号、ゾセチルホス７エー）１．７５％
’およびコレステロール２．９ηの混合物乞５　Ｑ　ｍ
ｅなし型フラスコの同次面上で蒸発乾固してＩＪｆｆ双
フィルム乞作成した。蒸−＃５は別１と同様に減圧Ｆで
打つた。か＜Ｉ、Ｃｍた＋＋＃　質、ｙイルムをペルオ
キシダーゼを添加していないトリス緩備ｇ！１２．Ｏｒ
ｎ＆で棒磁石でかきませながら４′℃で一反水オロレ、
か＜ＬＣ生成したリポソーム外部を、Ｆ記のように使用
するためｄ　”Ｑに貯斌保存した。

ＨＲＰ　１　５．６　ＶＱをトリス緩憫歇５．０−に祭
り口し、蚊几−＄９１　ｍＭ−”　ｃ、ｘ−”　２　使
用して４０５　ｎｍにおける吸光度で測矩した磯度５　
Ｘ　Ｉ　ＣＪ−５Ｍ　ＨＲＰのＨＲＰ俗鏝乞調・持した
。矢にこの浴液０．２５１ｄとトリス緩淘欣２５ηＩ８
と混合希釈し℃濃度５．Ｘ１Ｌ］−’Ｍの冷液とし、そ
の浴液乞使用してｆｌｌ酵木のみ、（２ン酵湘グラスト
リトン−Ｘ−１００、＋３）ｍ索シラス仝リホソーム、
および（４）酵素プラストリドンおよび仝リポソームを
傳する試料を調製した。上６己混合物８よひ対ｊ偵物（
ＨＲＰ欠）それぞれの配合を第６表に示す。こｎらの冷
液１００ｇｔづつヲ、トリス鏝両孜中２．５　Ｘ　１０
−３ＭＨ２Ｏ，２００μ乙と２．５×１０−’Ｍルばノ
ール２００μｌと？入れ、ターナ−２０型ルミノメータ
−内に位置した別々のポリプロピレンチューブに圧入し
た。このようにして測定すべき特定の反応混合物中で反
応を開始させた後、ルミネセンスヲ０．５秒のＭ　ｑＬ
時間ｆ６［］秒間積算してモニターし、記録した。容管
におけるＣＬ応答？例１と同様にして勧測し、これも第
ろ辰に示す。

第　５　表 ＨＲＰ　トリス緩＃液　１％トリトン　リポソーム　Ｃ
Ｌ（ｂ）　０　５００　７００　０　１．９（ｃ）（Ｊ
８［ＪＬｌ　０２υυ　０．８（ｄ）　ｔＪ、　１０θ
　７０（Ｊ　２００　０．６（ｅ）５０　９５０　Ｕ−
０５，１ （ｆ）５１Ｊ　２５０　７０ｔｌ　０　４．２（ｇ）、
５Ｌｌ　７５０　Ｕ　２００　２．０（ｈ）５ＬＩ　５
０　７ｔＪυ　２［Ｊｏ　２．６（１）１００　９ＯＬ
Ｉ　Ｏ［）　１１．５（Ｊン　１００　２Ｌ］０　７Ｌ
ＩＩＪ　ｔＪ　１２．５（ｋ）１ｏ０　７ｏＤ　、０　
２００　５．１（１）１００　０　７００　２［Ｊｏ　
７．２第５次のデータから先ず、’ＨＲＰ１７言有しな
い試料（ａ）　−（ｄ）、持に仝のリポソーム？含む（
Ｃ）および（ｄ）に２いては１屯めて弱いルミネセンス
しか認められないことがわかる。試料（ｅ）　−（ｆ）
はＨＲＰ　５０μｔの存在において高い水準のルミネセ
ンス乞示す。これと対照的に、試料（ｇ）および（ｈｌ
（ニトリトン−Ｘ−１００の存在および不在においてそ
れぞれ、ＨＲＰ　５０μｔおよび空リポソームをぎ有し
ており、リポソームの存在しない揚台の備か半分のルミ
ネセンスを示した。試料（ｇ）と（ｈ）との比較からト
リトン−ｘ−’ｉｏｏ＋ｚリポソームの存在においてル
ミネセンス？少し増加させる効米乞何することがわかる
。試料（上）および（Ｊ）＋工ＨＲＰ　１υ０μｔの存
在において高水準のルミネセンス？示す０こｎと対照的
に試料（ｋ）および（ｔ）はトリトン−Ｘ−１００の存
在および不在に３いて−ｆ：れぞれ、ＨＲＰ　１０’Ｌ
ｌμｔと仝リポソーム？含有するか、表頁的により樹い
ルミネセンス２示した。試料（ｋ）　＃よびＣ１，）の
比較からトリトン−Ｘ−１０Ｕはリポソームの存在する
場合ルばネセンス？少しフ虫くする幼米ゲ何することが
わかる。要約すると、リポソーム外部の西４わさびペル
オキシダーゼに空リポソームを冷力０するとルミネセン
ス信号の減少が生ずる。インキュベーション混合物にト
リトン−ｘ−ｉｏｏが加えられると化学ルミネセンス信
号ハ強化される。

別　４ ルミネセンスリポソームテオフィリン測定テオフィリン
（１，３−ジメチルキチンチン）は気・ｇ支ぜん息のｆ
ｆ３僚にひろく使用される。この儀は冶僚鴫囲が１０−
２０μｊｌ　／　、ｎｌと狭く一方２０μ＆／ＩＮ？超
える纜度では仔壽とな９得るので、血清中の榮削譲度乞
ｄ１１密に蕾視する必要かある。以Ｆｌｌ′Ｉ：述べる
夾狭は不発明の逆潴伏ルミネセンス免疫侠定かテオフィ
リンの血消中嬢度の定着に使用し得ることヲ英証するも
のである。

４感１（ＲＰ／リポソームの調製 テオフィリン壇ａ！？　）（ＲＰ　７リホソームは次の
ようにし℃調製した。先ず４：１（Ｖ／Ｖ）クロロホル
ム／メタノ−ｎ、　１（）、Ｑ　ｖｎｌ　ＩＦ卯レしチ
ン７．５覆、シセチルホスフエート１．７ｒｌＩ！／、
コレステロール０、６　’Ｉ１ｇおよびテオフィリン複
合体０．１５％’の混合ｒ／Ｉ’ａ？なし型フラスコの
内表面上で乾固して例１と同４５ｒ＜にして脂質フィル
ムを作成した。使用したデオフイリン増感剤ハテオフイ
リン〜ジパルミトイルホスファチゾルエタノールアミン
複合体（テオフィリン−ＤＰＰＫ　）である。かかる複
合体ばＩ（ａｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ｒｅｓ、　Ｃ！ｏｍｍ、、　９５　：　１８７−１
９２（１９８０）に記載の方法によって製造することか
できる。二の同じテオフィリン−ＤＰＰを改−Ｒ法によ
つ１台成し分析してその同−注および純度を確めた。梢
＃仮合体は、調製的液体クロマトグラフにより４＋４ク
ロマトグラフで単一のスポラトラ示す画分として得た。

この複合体の同−注はＮＭＲ、ＵＶおよびＩＲスペクト
ル、および元素分析によって確認した。

ρ）＜シて作成した脂質フィルムを、２す／　ｍｅのＨ
ＲＰ乞宮臀するトリス優備液２．０Ｍにより、磁気７Ｊ
）＜はん子でかきまぜながら４℃で一便水相した。

生成したテオフィリン増感ＨＲＰ　／リボンーム乞、ｉ
、５ｘ３２ｃｍのセファローズ６８カラムでトリス緩１
＃液を浴雌削とし℃脂質懸濁液１．ＱｍＡをクロマトグ
ラフにかけ℃、遊離ペルオキシダーゼから分離した。１
．８ｒｎｌの溶出液フラクション４０１固を採取した。

テレフィリン増Ｍ　ＨＲＰ　／リポソームはフラクショ
ン１２−１４に、遊離ペルオキシダーゼは画分２７−５
４に見いだされた。

採取した浴用液画分はそれぞれ次のようにして、分光測
定法により試験してペルオキシダーゼの有無乞Ｉ眸認し
た。谷画分５　［Ｊ　ｌｉｔぞトリス緩衝液２００μｔ
と混合した。平行してそれぞれの台分５０μを唖ピ　ト
　リ　ト　ン　−Ｘ−１００１％　（Ｗ／Ｖ　）　ηビ
　含有するトリスｔ＆備ＫＬ　２００　ｌｔｔと混合し
た。それぞｎの混合液の一部２０μｔな、トリス緩衝液
５．０ｍｌとダイアコ−ル（ｇｕｉａｃｏｌ　）　（ｏ
−メトキシフェノール、マテソン、コレマンアンＦベル
社、ノーウッド、オハイオ）ｆ：、柴原液（２，４５ツ
ク７α６トリス緩鴫ｇ、）５０μｔと？入れた光路＊１
．０ｃｍのキュベツトに加えた。これらのキュベラｌ−
Ｙそ几ぞれイルフォード２５０型分元元度計内に置き、
６０％（Ｖ／Ｖ）ＨｚＯｉ水緩＆　（７イｙ　シーｒ−
ｔイエンテイフイツク社、ピッツバーグ、イ／シルバニ
ア）５０μｔとトリス緩僑液１００１１１ｇとを混合し
て調製したＨ２Ｏ２貯蔵俗液５０μｔを添７ＪＯして反
応？開々６させた。谷キュベツトの内容物乞、４ろ６ｎ
ｍで反（じ開始段６０秒間モニターした。この試験の結
末にルオキシダーゼが画分１２−１４および２７−５４
に存在することが確められた。ｌＩＩ記した追りリポソ
ームは画分１２−１４にのみ認めらｎるので、画分２７
−５４は遊離の西洋わさび々ルオキシず一部を含有して
いることが確められた。

その他の試条調製 テオフィリンＬ２５　、２．５　、５　、１０　、２０
　。

５０および１υＩＪｌｌｉ１ｍｌ’ｌ含荷するテオフィ
リン試４−＋＆工、テオフィリン（シグマ社、衿η出）
　５．３ヤ馨トリス緩淘液５　Ｑ　ｔｎｌに俗解したテ
オフィリン原液？さらにトリス緩伺漱で適宜希釈して調
製した。

仇テオノイリン恍体試楽（工市販の抗テオフイリンウ？
イ抗血消（刀しスタツＰ社、オースチン、テキテス、カ
タログ渣５３４）から次のようにして調製した。カレス
タッに抗血＋Ｗ　１００　ａｔ乞トリス緩１８　ｉｆ　
９００　ａｔ　Ｉｃ　＠　／ＪＯして１：１０（Ｖ／Ｖ
）抗体浴液原液とした。

輛体試楽は次のようにして調製した。凍結乾簾したモル
モットＬＩＩｌ浦を入れたガラス瓶（ベル７リーズ社、
ロゾヤーズ、アラスカ、カタログ７、％５８００５−１
’）にｍｖａ水ろ、Ｏｔｎｌ　ｔａ：　７ＪＯえて再構
成した。再構成した抽体苫有皿ｍ　Ｏ，５ｍｌをアジ「
−トリス鏝備液と′ｄ＃、＠シて１　：１０（■／■）
希釈液とし測定操作に使用した。このアシド−トリス緩
冑液はアジ化ナトリウム２　［１８，１智をトリス鏝ｇ
ｉＪ孜１０Ｌｌｉｌに俗解して作成した。

測定（ｌ！１１！昨および結果 先ず前記のテオフィリンｇ科それぞれ１Ｑｍ１２２組の
試躾當セットの−っの皆に分注した。次で仇体疹液涼漱
乞トリス優爾液に１　：５に希釈した漱５０μを乞第−
組の′ｇの谷′Ｕに入れ、抗体原液娶トリス緩＊ａに１
　：　１０　ＶＣ＠ＩＲＬ、ｆ、：４＠、５　Ｕ　ａｔ
ｋ第二組の管の台管に入れた。次に、テオフィリ／感作
リポソーム液（画分１３）をトリス緩＠液に１：４に希
釈したもの４０μｔを第一組の各管内の混合物に）ＪＤ
え、トリス緩衝液に１：１０に希釈したもの４０μｔｌ
：！！第二組の各管内の混合物に加えた。次で両方の組
ン６７”Ｇで５分間インキュベートした。５分間インキ
ュベート後、抽体試楽？トリス緩ｉ＃液に１：１０に希
釈したもの１００μｔを両組の谷′ｇ内の混−８′物［
７１０え、６７℃でさらに５分間インキュベートした。

また対照用試料馨、１０，５０．１００μ９／ｍｌテオ
フィリン試料１０μｔとテオフィリンを合有せぬブラン
クトリス緩衝液とを使用し、抗体および個体の代りにリ
ポソーム液の１：４希釈物４０μｔとトリス緩衝液１５
０μｔとを余力ａして調製した。こｎら調ｄｌ［の１０
０μｔづつヲトリ、ターナ−２０型ルミノメータ−内に
位置し２．５×１０−’　Ｍ　ルミノール試４２００　
ｔｔｌト２．５　Ｘ　１０−’ＭＨ２０２拭系２００μ
ｔと？入れた別々のポリゾロビレ／管に注入した。かく
して測定すべき特定のＰｊ、応混合吻中で反応？開始し
た後、ルミネセンスの強度を０．５秒の遅延時間後６０
秒間積算してモニターし記録した。結氷を第１Ｖ辰に示
す。

第　４　表 ０　１５７　５５．０　２５８ １．２５　１；９５７．５　− ２．５　１８１　６５．６　− ５　１８６　９８．５　− １０　２３４　１［）Ｌ］、１　２６８２０　２７４　
１２５．５　− ５０　２７２　１２６．２　２６６ １００　２５６　１１４．７　２５７ 肉試柴配付のいずれに対しても試料テオフィリン濃度壇
〃口と井孔ルミネセンスが増大することか認められる。

こＲｉｃ対し、対照液においては試料テオフィリン濃度
に関係無く一様に減少のないルミネセンスが生ずる。こ
のことは、少くとも１．２５μＩ／ＦＩＬＥという低濃
度および―注投与はＩＭＩ唾の５倍の濃度においてテオ
フィリン乞定量的に測定するための免疫検定用組成物お
よび方法への逆潜伏現象の応用を明快かつ単純に豆証す
るものである。

例　５ 本例は、反応混合物のルミネセンスを反応開始後一定時
間毎に記録するペルオキシダーゼのルミネセンス検定に
おいて無傷のリポソームおよびトリトンｘ−１００によ
り化学的に靜解されたリポソームについて観察される信
号に対する、ペルオキシダーゼ阻害剤であるシアンイオ
ンの影４Ｉを示すものである。

例１に、調製したリポソームを汐ｕ１にｉ己載の方法に
従いゲル排除クロマトグラフ法によって遊離ペルオキシ
ダーゼと分離した。流出リポソーム画分を合一シ繍調原
液として４℃で貯蔵した。リポソーム＋１ｌＩＩ陶原漱
をトリス緩衝液に１　：４０に希釈して使用用懸濁液を
調製した（無傷リポソーム）。

同様にして、リポソーム懸濁原液をトリトン−Ｘ−１０
００，２％（Ｗ／Ｖ）含有トリス緩衝液に１＝４０に希
釈した液を調製した（靜解リボソーム）。

トリス緩衝液中シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）１廐の
原Ｑ　（１ｍＭ　ＣＮ−ＴＲｌ５　）　４、ＮａＣＮ　
５．０　％ｌ　’ｌｒリス媛賛液１［］ＯａＪに浴解し
℃調製した。トリス後置液中シアン化ナトリウムの試楽
浴液は１　ｍＭＣ’Ｎ−ＴＲｌ５　カら、トリス緩＊ｇ
中ｉｃ　Ｎａ０Ｎ　ｔＪ、Ｕ　８５　。

（Ｊ、２　、０．５５　、０．．５および［］、７５ｍ
Ｍｙ含有するように調製した。

無傷の、および化学的にｆ６屏されたリポソームのルミ
ネセンスは、１／４０リホソーム布択漱１００μｔを、
トリス緩衝液５０’０μｔかシアン化物試榮靜欣の一つ
３００μｔかのいずｎかと、トリス＝ｍｙｉ中５　×１
０−３Ｍ　Ｈ２０’２　ｆｄ’ｔ（Ｚ　５０　ｔｔｔ　
ト、トリス暖備漱中ルミノール１０−２Ｍ＋７）ｉｆｉ
　５　Ｑμｔと？入れた別々のポリゾロビレ／管に注入
して測定した。これらの・ｇンメーナー２ｏ型ルミノメ
ータ−内に置いた。反応開始の１５分後にルミネセンス
ヲｄ己録した。第５次に、試薬中のシアン化（勿の−ｆ
！ｒｍ度（（：ＣＮ、］　ｍＭ　）に対する無傷のおよ
び化学的に俗解さｎたリポソームについて観察されたル
ミイセ／ス、並びに俗解および無傷のＨＲＰ　／　ＩＪ
ボソームからの１ｄ号の比（Ｌ／Ｉ比）を示す。

第５　衣 ０１υ５６　１３８８　０．７６ ０、Ｕ８３　１０．９　９２７　０．０１０．２０　１
７．５　９１５　０．０２１Ｊ、５５　２７．１］　９
６５　０．０５０．５ｕ　ン７．９　９９７　０．０５
０．７５　５０．１　１００４　０．０５１．００　２
１．’７’　９２１　０．０２シアン化物か存在しない
実験条件ではＬ／Ｉ比はＩＪ、７６であった。最低のシ
アン化物試楽娘度（肌ｔＪ　Ｂ　５　ｍＭ　）　Ｉｃお
いてＬ／Ｉ比は０．０１であった。無陽のリポソームの
ルミネセンスはｆ、験したシアン化物の凝度範囲では３
４９Ｄ以下しか１討害さ、Ｔ′Ｌなかった。化学的に俗
屏さｎだリポソームのルミネセンス？工この実験に使用
したシアン化物の＃度において９７％以上阻沓された。

すなわち＼これはシアン化物の存在が観測される逆溜伏
埃ｉ象？助長することを実証するものである。

例　６ 本例Ｖ工、逆壱伏比がシアンイオンなしでは認められな
いような条件下での、ペルオキシダーゼの１１害削であ
るシアンイオンの使用による逆管伏比ン示すものである
。

ｆ／！＋　４によって調製した西洋わさびペルオキシダ
ーゼ乞苫有、するテオフィリン増Ｉ盛リポソームを一連
の本央験に使用した。リポソームの使用用懸１蜀牧（エ
フラクション１５の一部乞とりトリス媛淘孜で希釈して
次のように調製した。画分１５の一部１２　μ！’＆）
ｌＪ　ス　緩（１ｉｔｉ＃：５８８１１Ｌｅに７１０　
え−（１１５０布択液を調製した（無傷リポソーム）。

同様に画分　１６　の一部　１２　ａｔ　ンピ°　ト　
リ　ト　ン　−　Ｘ　−１０００，７％（Ｗ／Ｖ　）を
言付するトリス緩衝液５８８μｔにカロえて１１５０布
択液ン調装した（６鱗リポソーム）。

１ｍムロ０Ｎ−ＴＲＩＳ２．１３ｍ１１７トリス緩爾Ｑ
４．（ＩＩｃ力Ｏえて、トリス唆１＃故中シアン化ナト
リウム０．６５ｍＭの試薬浴液を調製した。

ルミノール試染は例１に記したようにし℃調製したトリ
ス鏝１荀ｆ代中ルミノール２．５　Ｘ　１　［１−”　
Ｍの原液からこれ？トリス緩衝液に希釈に希釈して装造
した。ルミノール試薬の濃度は第６表に示す。

過酸化水素試薬は次のようにして調製した。６０％（Ｖ
　／　Ｖ　）　Ｈ２Ｏ２７ｋｌａｅ、５７１１ｔ％：　
トリス緩衝液１０、［］Ｉｄに祭加してＨ２Ｏ２５Ｘ　
１０−”　Ｍの原ｇｖつくった。次にこの原液？トリス
緩衝液で希釈して第６＆に示す炭団の過酸化水素試薬を
藺裂した。

無陽の、および化学的に醒解されたリポソームのルミネ
センスは無腸リポソームの使用用台／ｊｉｌｅ。

１　［］　１　ａｔまたは化学的に俗屏されたリポソー
ムの使用用ｍｅ　１　［Ｊ　（Ｊ　ａｔｋ、０．５５　
ｍＭ　ＣＮ−ＴＲｌ５ろ１１０　ａｔ、−ミノーー試渠
め一つ５′０μｔ、およびＨ２Ｏ２拭梨の一つ５０μｔ
Ｙ入れた別々のポリグロビレンチューグに圧入して測定
した。チューブはターナ−２０型ルミノメータ−内に置
いた。谷省内の〕又し６につき、遅延時間１１．５秒の
後６０秒間信号を積算してルミネセンス？モニターし記
録した。

また、シアン化物試檗の代りにトリス緩衝ＮＹ使用した
Ｒ照実験においても１．ｔＩＩｔｉ傷の、および化学的
ＩＣ＃解さｎたり示ソームのルミネセンスヲ記録した。

シアン化物不在の場合の鹸側したルミネセンス、試薬中
のルミノールと過酸化水素との鏝度、およびｄ解すポソ
ームとＳ傷すポソームの信号の比（Ｌ／Ｉ比）？第６表
実験（ａ）に示す。同様に、反応混合物中のシアン化ナ
トリウムの眞度か０．２ｍＭの揚会の実験で観測された
ルミネセンスを第６衣、実験（ｂ）　−（ｅ）に示す。

第６表 〔Ｈ２Ｏ２〕　〔ルミノール〕　ＣＬ　ｌ’［，１答　
ＣＬ　ｉ５答　Ｌ、４（ａ）　ｊｏ−３１０−２６５０
１１２５，６（ｂ）　１［）−”　１（Ｊ−２５，８６
７０，０９（ｃ）　５ＸＩＵ’−２１０−２６，ＩＪ　
７５６　ＬＪ、ＬＩＬ］８（ｄ）　１Ｌｌ−”　１［Ｊ
−１１，０４５６［Ｊ、Ｕ２（ｅ）　ＩＬＩ−”　ＩＬ
Ｉ−”　５．４　７１　［Ｊ、Ｕ５第６次のデータは、
逆首伏比が認められないような条件（実験（ａ））下で
ルミネセンス反応混合ｍにペルオキシダーゼの阻害剤を
添刀口すると（実験（ｂ）Ｌ　６屏リポソームからの信
号は無傷リポソームよりも大幅に減少することを示す。

反応混合物中にシアン化物が存在しない場合のＬ／Ｉ比
は５．６であったが（実ｍ　（ａ）　）、ペルオキシダ
ーゼに対する阻害剤すなわちシアン化物が存在する場合
Ｌ／Ｉ比は肌０９であった（実験（ｂ））。実験（ｂ）
　−（ｅ）はＨ２Ｏ２どよびルミノール讃度？変化させ
た場合の逆着伏乞示す。

列　７ 本圀では、西洋わさびペルオキシダーゼ馨苫有するリポ
ソーム馨テオフィリンの免疫慣定操作に期用し、無傷リ
ポソームからのルミイ・センス信号力・ｆ６ＰＪ１１Ｊ
ボンームのよりも大きい場合について述べる。ペルオキ
シダーゼはＨ２Ｏ２’ａ’酸化剤とするルミノールの酸
化によって測定した。ルミネセンスは反し６開姶の一足
時間後に信号？記録してモニターシた。ペルオキシダー
ゼの阻害剤（シアンイオン）乞ルミネセンス反応混合物
に７１０えておいた。

ｆ、桑ａ１１＃ 例４で調製したペルオキシダーゼ官有テオフィリン増感
リポソームを一連の本実験に使用した。

リポソーム懸陶液は円分１６（汐１１４）乞トリス壷倫
液で”／ＩＱに希釈して調装した（リポソーム試薬）。

抗テオフィリン抗血清および補体は汐ＩＩ４に記載した
のと同じものから得た。抗体試薬は抗テオフィリン抗血
消？トリスｌ、！倫欣で１／１０にａ択し℃調製した（
抗体試薬）。曲体試楽はモルモット血清をトリス緩貢故
で”／１０　Ｋ−希釈し℃調製した（ｆ出坏試楽）。

テオフィリン２．５．５．１０．２０．４Ｕ。

６Ｃ３％よび１０１）μｉ／Ｉｎｌのテオフィリン試朶
乞、９ｊＪ　４のテオフィリン原ｅ、乞トリス緩衝漱で
希釈して調製した。

Ｈ２０ｚ　５　Ｘ　１０−”　Ｍの試榮浴散乞、６Ｕ％
（Ｖ／Ｖ）　Ｈ２Ｏ２５７Ａｔｋ　）リスｔｌ倫７Ｒ１
０，ＯｍＡｖｃ奈ｊｔａしてａ１４装した（　Ｈ２Ｏ２
ｇ栗）。

ルミノール１υ−２Ｍの試楽浴液ン、５０係（Ｗ／　Ｖ
　）　ＮａＯＨ４ｍ’ｌ：　ＴＪＤえたトリス媛責液ｆ
１８０　ｍｌ中にルミノール１７９ηを浴屏して調製し
た。この耐液のＰＨ娶８ｉ塩酸で８．６に調節し、トリ
ス緩衝Ｉリロえて番積を１００・財とした（ルミノール
試栗）。

トリスｔｉｌｔ　所Ｄ　（ｐ）Ｉ　Ｂ、６　）中ＮａＣ
Ｎ　０．５５　Ｍ　（ｆ）　ｉＥ快俗ｇ、２例６と同様
にし℃調製した（シアン化物試栗）。

出１ノ定ｉｆ乍おまび結釆 別々の試験管内で、８Ｉｌ記のテオフィリン試料の一つ
２（］μｔ１　またはトリス（テオフィリンｏ　ａｙ／
ｍ１ｌ）２υμｔを、抗体試薬５０μｔおよび備体試・
袋ｉ　ｏ　ｕ　ａｔと共に５７”Ｏで５分間インキュベ
ートした。ｒｙｒＪ記の試料、抗体および仙俸試条の混
合→勿にリポソーム試・采５１Ｊ　ＩｔＬ’（９口え、
５７−０でさらに２分間゛インキュベーションヲ絖ケた
。Ｃｔ’Ｌ　ラの測定混合上のそれぞれから１ＤＯμｔ
づつ？とり、ターナ−２Ｕ　ｌｕルミノメータ−内に位
置した別々のホリグロビレンチューブに注入した。谷ポ
リグロビレンチューブにはシアン化物試＠６００βｔ、
　Ｈ２Ｏ２試楽５０μｔ１およびルミノール試薬５０μ
ｔを入れておいた。谷・ｇについて反応開始１１分後ル
ミネセンス乞ｕ己録した。

谷試料内のテオフィリン一度およびルミネセンス銭測頃
′ｌｔ′＄７表に示す。

第　７　表 〔テオフィリン〕 μｌ／ｍｌ　ルミネセンス ２６５ ２・５６４１ ５　５Ｂ９ １０　４５１ ２０　４７９ ４ｏ　！：＋５９ ６Ｌｌ　５９７ ＩＬＩＬＩ　６２５ 試料、仇体試栄、袖体試榮、リポソーム試薬、シアン化
物試薬、Ｈ２Ｏ２試楽およびルミノール試粟の混合物の
ルミネセンスと、ｆＣ科中のテオフイリンｄとの楽鰍一
応答関係は第７表に示すデータから明かである。

７１１８ 次の一連の実験Ｑ工、ペルオキシダーゼ含有テオフィリ
ン４感リポソームの免疫検定における、グルコースオキ
シダーゼ、グルコースおよａｍ索ｙ；ｘ使用しての酸素
からＨ２０２の発生、およびにルオキシダーゼの１討否
創であるシアン化物の使用を示すものである。

試薬調製 トリス緩イ旬漱中テオフィリン２．５　、５　、１０　
。

２０．４０．６０おＪ：び１００ｇ、９／ａの；ｒ−、
ｔフィリン浴液を例４のテオフィリン原液から調装した
。含テオフィリン靜牧１．０μづつをとり＋Ｅ常漱兎血
渭（アービンブイエンティフィック社、アーヒン、カル
ホルニア）１．０酩とＣ結合Ｌ　テ１．２５　。

２．５　、５’、　１１１　、２０　、３０　、オヨＵ
５Ｄｔｔ！／／Ｕのテオフィリン試料を得た。同様に、
トリス壺１１１１Ｊ故Ｌ（Ｊｒｎｌを１虐つ丈ヤ血消１
．ＯＭと？混合してテオフィリンＱｔ６１７ｍｌの試料
乞祠装した。

５０％（Ｗ／Ｖ　）　ＮａＯＨ５ｔ（ｌｔ’を力Ｏえた
トリス暖１１１ｔｉ液イタ４（Ｊｒｎｌにルミノール７
１９．８宝を浴解してルミノール８　Ｘ　１　ｔＪ−２
Ｍの浴液を調製し、トリス媛１＃液で最終ｄ檀を５　Ｑ
　ｍｌとした。この耐液は使用前０．４５μ「ミリボア
　フィルター」で濾過した。８　ｘ　１０−２Ｍのルミ
ノールｍ　ｙＷ、　１０．０　ｍｌ　トドリス暖衝液１
０．Ｏαとを混合し℃ルミノール４×１０−”Ｍの原版
を調製した。

クルコースオキシタ−セ（ベーリンｒルマンハイム社、
インディアナポリス、インディアナ。黒色アスペルギル
スからの凍結乾燥グレード１）の”０”ｆｌ　／　’ｎ
ｌ　餅Ｋｌｉ　ｋ　、グルツースオキシダーゼ４０η乞
トリス曖備液１０．０＋Ｊに浴解し℃調製した。

こり険藏１．Ｑ〃ｕをとり、トリス緩衝漱ソ、Ｑｒｎｌ
と混合してグルコースオキシダーゼ０．４・ｎｙ／　ｒ
ｎｌの原液？調製した。

１１１分　１　３　（Ｍ　４　）　０．２　５ｍ１ｋ　
ト　リ　ス掻（１山ｊ　４２．２５ｔｎｌと混合してテ
オフィリン増感リポソームの１／１゜希釈＃：乞調製し
た。

４　Ｘ　Ｉ　Ｌｌ−２Ｍのルミノール原り２．ＬＪｍｌ
ン、↓／１０リポソーム禰陶ｆｉ　２．Ｏｔｎｌおよび
グルコースオキシダーゼ肌４　ｖ／　ｓ＋ｅｍ　ｔ＆と
混合して、ルミノール、グルコースオキシダーゼ、およ
びテオフイリｙ　４）蓼すポソーム？含有する試系を調
製した（試榮１鬼グルコース（アルドリッチ社、ミルウ
ォーキー、ｆｙイスフｙシｙ）　１．８２１１にトリス
（＆＃／ｆ５　ＩＪ、０１１＋／ｌ：　［府解して０．
２Ｍのグルコース尚液を調製した。

このｔＪ、２　Ｍグルコース浴ｇｆ、０．５ｄＹ例５で
調製した１’　ｍＭ　ＣＮ−ＴＲｌ５２．υｔａｐニド
ａ合して、トリス４１１ｇＩＪ液中グルコース４　Ｘ　
１０−２Ｍ、、　ＮａＣＮ　（Ｊ、８ｍＭのＩＭ漱２つ
くった。

抗テオフィリン抗皿屑およびモルモット血清はし１１４
に記載したと同じ出所のものであう。つｔギ恍テオフィ
リン仇皿屑ＩＪ’、２５　ｍｌ　Ｙ　トＩＪス峻淘蔽４
．７５ｍｇと混合して仇テオフィリン血浦り１／２ｏ布
釈ＬＰｉン諺裂した。袖体の１７．．２５拮択漱はモル
モット血（＃ム（Ｊ　ｔａｌｌをトリス援１鳶孜υ、５
ｍｌと混合して調製した。

り丈ヤ恍テオフィリン抗血屑の１／２ｏ布杭穎１．［Ｊ
ｖＷ會モルモット皿消の”／１、．２５布欽液ｉ、ａｍ
およびトリス緩衝液中グルコース４　Ｘ　１（Ｊ’−”
　Ｍ、、ＮａＣＮ０．８　ｍＭの原液２．０ｔｒｌと混
合して、グルコース、シアン化物、抗テオフィリン抗血
清および油体を含イイする試薬を調製した（試楽２）。

測定操作および結果 ５０％（ｖ／ｖ）正常ウテグ血清中のテオフィリン試材
のそれぞれから２０μｔＷとり、別々にホリゾロビレン
チューブ内の試薬１２００Ｉｉ７に力口え混合した。こ
れに試楽２２００μＬを加え、屁会して反応を開始させ
た。次に谷ホリプロビレンチューブ？ターナ−２０型ル
ミノメータ−内に置き、測定開始１５分後にルミイ・セ
ンスヲ蜆祭、６己録した。

＃Ｊ８辰に谷試料のテオフィリン譲度どよびパ己録した
ルミ不センスヲ示ス。

第　８　表 ０　１６８ １．２５　１５２ ２．５　２２７ ５．０　２７０ １０．０　５６８ ２０、（Ｊ　４７１ ５ｔＪ、０　５１０ ５０．０　４９２ 谷試料中のテオフィリン颯と記録さｎたルミネセンスと
の間の楽磁応答＋ｆｆｉ係は射８衣に下すデータから明
かである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｉｌｌ　（ａｔ　リガンーに対する結合パートナ−１ｌ
   ｂｌ　少（とも二つの構成要素を有する検出系、ｆｃｔ
   　表面に合体したりがンｒまたはリガンド類似体と内部
   に前記検出系の第一の構成要素を有する選択的に接近可
   能な小胞、 ＋ａ　表面合体りがンＰまたはりがンド類似体と結合パ
   ートナ−との結合に応答して小胞の接近可能性を変化さ
   せる物質、および（θ）前記第一の構成要素と反応して
   検出し得る応答を生じこの応答は結合パートナ−および
   小胞変性物質と小胞との結合如よって低下するものとす
   る、前記検出系の少くとも一つの追加的構成要素 を含有して成る、試料中のリガンド測定用組成物。 （２）　結合パートナ−および小胞変性物質と小胞との
   結合の不在において検出し得る応答を小胞が示す前項ｉ
   ｌ＋に記載の組成物。 （３）　検出し得る応答が、結合パートナ−および小胞
   変性物質と該小胞との結合によって低下する前項（２）
   に記載の組成物。 （４）　小胞が脂質膜を含有して成る前項（１１に記載
   の組成物。 （５）脂質膜がリン脂質を含有して成る前項（４）に記
   載の組成物。 （６）　脂質膜がステロールを組込んでいる前項（４）
   に記載の組成物。 （力　脂質膜が、すがンドまたはりがンｒ類似体が結合
   する両親媒性物質を含有する前項（４ｊに記載の組成物
   。 （８）小胞が生理学的細胞膜である前項（１）に記載の
   組成物。 （９）検出系かルミネセンス系である前項（１）に記載
   の組成物。 α０）　検出系の第一の構成要素が過酸化的に活性な物
   質を含有して成り、少（とも一つの追加的構成要素がル
   ミネセンス発光団を含有して成る前項（１１に記載の組
   成′吻。 ０υ　過酸化物に活性な物質がペルオキシダーゼを含有
   して成る前項ａ１に記載の方法。 （１２１少（とも一つの追加的構成要素が過酸化的に活
   性な物質に対する基質である、ルミネセンス発光団に対
   する酸化剤をさらに含有して成る、前項（１１に記載の
   組成物。 （１３酸化剤が過酸化水素である前項（１３に記載の組
   成物。 （１旬　少くとも一つの追加的構成要素が、ルミネセン
   ス発光団に対する酸化剤を産生ずるに有効な酵素系をさ
   らに含有して成る、前項ｔＩＩに記載の組成物Ｏ ＯＱ　酵素系がグルコースオキシダーゼおよびグルコー
   スを含有して成る前項Ｈに記載の組成物。 Ｕω　検出系かエネルギー移送系をさらに金回して成る
   前項（１）に記載の組成物。 ０７＋　検出系かルミネセンス発光団を含有して成り、
   エネルギー移送系がルミネセンス発光団の波長におい−
   〔光エネルギーを吸収し別の波長において叶い光を発す
   るけい党則を含有して成る前項（１４）に記載の組成物
   。 （１８１小胞の接近可能性が変化した場合に前記検出系
   のルミネセンスを減少させる追加的物質を含有して成る
   前項（１）に記載の組成物。 ｕ９　追加的物質が検出系に対する阻害剤である前項ｔ
   １８）に記載の組成物。 （至）阻害剤がシアン化物を含有する前項ｄ３に記載の
   組成物。 Ｑυ　りがンＰがバッテンまたは抗原であり、結合パー
   トナ−がそれて対する抗体である前項（１）に記載の組
   成物。 ＠　小胞変性物質が補体である前項（１）に記載の方法
   。 Ｑ３　（ａｔ　りがンドに対する抗体、ｔｂ＋　補体、 ｔｅｌ　ルぐネセンス発光団 ｆｄｌ　過酸化水素および ｔｅｌ　りがンドまたはりがンｒ類似体をその表面に、
   ペルオキシダーゼをその内部に有し前記抗体および補体
   と結合する際に低下する検出し得る信号を発するリポソ
   ーム を含有して成る、試料中の１１がンげ測定用組成物。 ＋２４１　試料を前項（ｒ＋　−（４ｔ、（９１−（ｔ
   ３１　、　（［またはｔ１８）　−ｑのいずれかに記載
   の組成物と結合させて反応混合物を形成させ、該混合物
   内の検出し得る応答の低下を観測することから成る、試
   料中のりがン一の測定方法。